Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Ингибиторы протеиназ в регуляции плазменного и внутриклеточного протеолиза

АКБАШЕВА ОЛЬГА ЕВГЕНЬЕВНА

ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ В РЕГУЛЯЦИИ ПЛАЗМЕННОГО И ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ПРОТЕОЛИЗА

14.03.03 - патологическая физиология 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

2 9 СЕН 2011

Томск-2011

4855087

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор Суханова Галина Алексеевна доктор медицинских наук, профессор Серебров Владимир Юрьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Агафонов Владимир Иванович

доктор медицинских наук, профессор Кондакова Ирина Викторовна

доктор медицинских наук, профессор Высокогорский Валерий Евгеньевич

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится «^4> /^Д-^/З-Д-. 2011 г. в _ часов на

заседании диссертационного совета Д 208.096.01 при Сибирском государственном медицинском университете (634050, г. Томск, Московский тракт, 2)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета

Автореферат разослан « /г » 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

И. В. Петрова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение общих патогенетических механизмов развития заболеваний, типовых патологических процессов и реакций организма на воздействие патогенного фактора является одной из актуальных медико-биологических проблем. Протеолиз представляет особую форму биологического контроля, включает протеолитические ферменты, их неактивные предшественники, активаторы и ингибиторы, обеспечивает гомеостаз в норме и при развитии адаптационно-защитных реакций организма [Локшина Л.А., 2001; Carretero О.А., 2005; Purkayastha Р. et al., 2005]. При неуправляемом протеолизе происходит деструкция клеток, активация систем свертывания, фибринолиза, комплемента и кининогенеза [Веремеенко К.Н., 1994; Яровая Г.А., 2001; Abboud R.T., 2008; Steinhoff M.L. et al., 2005]. Протеолитические ферменты плазмы крови и тканей организма, как правило, способны усиливать действие на организм патогенных факторов: бактерий, вирусов [Alcorn J.F. et al., 2004], токсических веществ окружающей среды [Букреева Е.Б., 2003; Fehrenbach Н., 2003], что сопровождается патологией бронхо-легочной системы [Shapiro S.D. et al., 2003; Onclinx С. et al., 2006; Davies P.L. et al., 2010], желудочно-кишечного тракта [Harada N. et al., 2001; Исламова E.A., 2004], развитием онкологических заболеваний [Yang Р. et al., 2004; Michael I. Р. et al., 2005; Lindner I. et al. 2010].

В регуляции протеолитических процессов принимают участие ингибиторы внутриклеточных и внеклеточных протеиназ, действие которых достаточно хорошо изучено [Веремеенко К.Н., 1994; Локшина Л.А., 2001; de Roos В., 2008]. Ингибиторы протеиназ обладают противовоспалительным, антибактериальным, противовирусным и противоопухолевым действием [Na G.Y., 2004; Не S.H., 2004]. Выявлено большое количество вариантов реагирования ингибиторов протеолиза: от повышения их активности [Gangadharan В. et al, 2007; White I.R. et al, 2007; Aiglova K. et al, 2007; de Roos B. et al, 2008; He Q.Y. et al, 2008], до снижения [Crowther D.C. et al, 2004; Gooptu B. et al, 2008] и разнонаправленной реакции [Осипов В.Д, 2006; Петросян А.М. с соавт, 2007; Zelvyte I. et al, 2003]. Длительное повышение экспрессии ингибиторов протеиназ способствует старению организма [Pletcher S.D. et al, 2002]. Неоднозначность оценки роли

ингибиторов протеолиза в реакциях адаптации и развития патологических

\

процессов приводит к значительным трудностям при использовании их в качестве диагностических и прогностических критериев.

Установлено, что ингибиторная активность плазмы крови на 95% представлена ai-протеиназным ингибитором (а,-ПИ) и а2-макроглобулином (аг-МГ). агПИ относится к серпинам, известны полиморфные варианты гена [Пузырев В. П., Савюк В. Я., 2002; Silverman G.A. et al., 2001]. Генетический дефект cti-ПИ способствует развитию эмфиземы, хронической обструктивной болезни легких, фиброза печени с прогрессией к циррозу [Fumagalli М, 2008; Abboud R.T., 2008; Camelier А.А., 2008; Fregonese L, 2008]. Тем не менее, в ряде случаев обнаружены бессимптомные варианты дефицита агПИ с поздней манифестацией заболеваний легких и печени [Головюк Е.Л., 2002; Sotcan М., 2006; Hogarth D.K., 2008 Ferrarotti I., 2008]. Известны также многочисленные функции а2-МГ: ингибирование протеиназ, активация внутриклеточных путей сигнальной трансдукции, регуляция иммунной системы [Зорин Н.А., 2004; Misra U.K. et al., 2005; Suriyaprom К., 2007]. Однако функция съ-МГ четко не определена: его иногда относят к белкам острой фазы воспаления, про-, антиапоптотическим факторам, белкам теплового шока, внеклеточным шаперонам, радиопротекторам [Зорин Н.А. и др., 2004; Robert J. et al., 2005; Uskokovic А., 2007; Mihailovic M. et al., 2009].

Тканевые кислотостабильные ингибиторы (КСИ) представляют альтернативный путь регуляции внутриклеточного протеолиза по отношению к высокомолекулярным, плазменным ингибиторам [Оглоблина О.Г., 2000; Doumas S. et al., 2005; Zhuo L., 2004]. КСИ обнаружены во многих тканях, обладают антибактериальными, противовирусными и противоопухолевыми свойствами [Doumas S. et al., 2005; Bellemare A. et al., 2008; Reviglio V.E. et al., 2009]. Приводятся противоречивые данные о функциях КСИ при патологических процессах: их рассматривают как положительно, так и отрицательно реагирующими белками острой фазы [de la Motte et al., 2003; Opal S.M. et al., 2007; Wang Z. et al., 2008].

В последние годы большое внимание уделяется изучению роли ингибиторов протеолиза в биологических жидкостях [Nie J. et al., 2004; Zelvyte I. et al., 2004; Bizeto L. et al., 2008]. Плазменные ингибиторы обнаруживаются в секрете бронхов, желчи, спинномозговой и околоплодной жидкостях, дуоденальной слизистой [Hettinger А.М. et al., 2001; Vila N. et al., 2003; Doumas S. et al., 2005; Lea R.G. et al., 2007]. Значимость ингибиторов в

4

регуляции внутриклеточного протеолиза при развитии патологических процессов остается не изученной.

В связи с этим актуальным является комплексное исследование активности оц-ПИ, оь-МГ и КСИ, их взаимосвязи с клеточным метаболизмом, процессами адаптации к действию повреждающих факторов.

Цель исследования: изучить активность 0С|-ПИ, а2~МГ, КСИ биологических жидкостей, взаимосвязь с показателями метаболизма клетки, охарактеризовать варианты реагирования ингибиторов протеиназ при адаптивных и патологических процессах, сопровождающихся активацией плазменного и внутриклеточного протеолиза.

Задачи исследования:

1. Изучить активность осрПИ, а2-МГ, КСИ в плазме крови, секретах слюнных желез, индуцированной мокроты, межтканевой жидкости практически здоровых лиц, связь с активностью протеиназ и биохимическими маркерами состояния внутренних органов: аспартат-, аланинаминотрансферазами, а-амилазой, 5 '-нуклеотидазой, мочевиной, липидами, окислительными процессами, синтеза и деградации белков соединительной ткани.

2. Охарактеризовать ингибиторную активность плазмы крови, индуцированной мокроты, кожного экссудата, а также активность эластазо-, трипсиноподобных протеиназ, состояние кининогенеза, перекисного окисления липидов при заболеваниях бронхо-легочной системы: хронической обструктивной болезни легких и атопической бронхиальной астме.

3. Оценить активность ингибиторов на фоне активации плазменного и внутриклеточного протеолиза слюнных желез, слизистой кишечника, ткани печени и окислительной модификации белков при заболеваниях желудочно-кишечного тракта: синдроме раздраженного кишечника, язвенной болезни, язвенном колите, болезни Крона и фиброзе печени.

4. Выявить взаимосвязь ингибиторной активности с фенотипом ссрПИ, типом конституции больных, показателями деградации соединительной ткани и коллагенообразования, перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков.

5. Изучить роль ингибиторов при травмах кости, их взаимосвязь с активностью трипсиноподобных протеиназ, содержанием липидов, а также

влияние коитрикала на состояние протеолиза, перекисное окисление липидов, резорбцию костной ткани и остеогенез.

6. Оценить особенности реакции ингибиторов при онкологических заболеваниях человека. В условиях экспериментального опухолевого роста in vivo и in vitro выявить эффект контрикала по отношению к протеолитическим ферментам клеток мастоцитомы Р-815, печени, тимуса.

Научная новизна. Проведено комплексное исследование активности агПИ, а2-МГ и КСИ в биологических жидкостях в норме при адаптивных реакциях и заболеваниях, сопровождающихся активацией плазменного и внутриклеточного протеолиза. В рамках концепции согласованного действия ингибиторов протеиназ выявлены варианты их реагирования: адаптивный, дефицит и дисбаланс ингибиторов, коррелирующие со степенью активации протеолиза, перекисного окисления липидов, окислительной модификации белков и деградацией соединительной ткани. Впервые установлено, что адаптивный вариант характеризуется увеличением активности ai-ПИ, а2-МГ, КСИ и сопровождается умеренной активацией протеолиза. Дефицит ai-ПИ и а2-МГ приводит к более выраженной активации протеолитических процессов при хронических заболеваниях бронхо-легочной системы, желудочно-кишечного тракта. Дисбаланс ингибиторов с повышением коэффициента ar ПИ/а2-МГ и низкой активности а2-МГ характерен для фиброза печени и онкологических заболеваний. Ингибирование плазменного протеолиза путем внутривенного введения контрикала увеличивает активность агПИ, а2-МГ, снижает липолиз, перекисное окисление липидов, резорбцию и стимулирует остеогенез, приводит к торможению опухолевого роста.

Впервые дана оценка роли ингибиторов в индуцированной мокроте, являющейся секретом бокаловидных клеток, слюны, кожного экссудата, представляющего межтканевую жидкость, слизистой кишечника, ткани печени. Ингибиторная активность а,-ПИ и а2-МГ в биологических жидкостях значительно ниже, чем в плазме крови. Активность КСИ в кожном экссудате практически не отличается от активности ингибитора в плазме крови. Установлено, что активность aj-ПИ и КСИ плазмы крови коррелирует с показателями в слюне и кожном экссудате, в то время как активность а2-МГ плазмы крови не зависит от ингибиторных свойств других биологических жидкостей.

Новыми являются данные о том, что при хронических воспалительных заболеваниях с активацией плазменного и внутриклеточного протеолиза в первую очередь развивается дефицит а|-ПИ. Одновременное снижение активности а|-ПИ и а2-МГ плазмы крови и тканей сопровождается тяжелыми заболеваниями бронхо-легочной системы и деструктивными повреждениями кишечника. Универсальной реакцией при сдвиге метаболизма в сторону катаболичсских процессов является увеличение активности КСИ, которые в условиях дефицита антипротеиназных, защитных факторов осуществляют контроль плазменного и внутриклеточного протеолиза.

Теоретическая и практическая значимость. Получены данные фундаментального характера, расширяющие представления о роли ингибиторов протеолиза в регуляции метаболических процессов плазмы крови и тканей организма. Выявление вариантов реагирования ингибиторов при заболеваниях бронхо-легочной системы и желудочно-кишечного тракта может быть использовано для оценки состояния больных, хронизации патологического процесса. Перспективным является изучение активности ингибиторов и протеиназ индуцированной мокроты в качестве неинвазивных показателей при заболеваниях бронхо-легочной системы. Снижение активности с^-ПИ индуцированной мокроты курящих лиц рекомендовано использовать как маркер прогрессирования хронической обструктивной болезни легких. Дефицит оь-МГ плазмы крови является фактором риска фиброза и развития цирроза печени.

Полученные результаты являются основой для разработки новых подходов к лечению хронических воспалительных заболеваний с использованием лекарственных средств, обладающих способностью снижать активность внутриклеточных и плазменных протеиназ и повышать активность их ингибиторов. Возможность практического использования полученных данных подтверждена патентами РФ.

Положения, выносимые на защиту 1. Активация плазменного и внутриклеточного протеолиза при патологических процессах сопровождается разными вариантами реагирования ингибиторов протеиназ: адаптивный, дефицит и дисбаланс. Адаптивный вариант с увеличением активности агПИ, а2-МГ, КСИ проявляется при умеренной активации катаболических процессов. Дефицит

си-ПИ и а2-МГ связан с выраженной активацией протеолиза, окислительной модификацией белков, деградацией соединительной ткани. Дисбаланс ингибиторов характеризуется повышением активности агПИ и снижением активности а2-МГ. При дефиците и дисбалансе аг-ПИ и а2-МГ протеолиз находится под контролем КСИ.

2. Максимальная активность агПИ и а2-МГ характерна для плазмы крови, в кожном экссудате, слюне, индуцированной мокроте она составляет от 0,4% до 11% от показателей плазмы крови. Согласованное действие ингибиторов направлено на регуляцию активности как плазменных, так и внутриклеточных протеиназ: трипсиноподобных, эластазы, коллагеназы, катепсина Э.

3. Наиболее значимыми показателями являются агПИ и а2-МГ, которые имеют определяющее значение для прогнозирования заболеваний бронхо-легочной системы и желудочно-кишечного тракта. Нарушение баланса между ои-ПИ и а2-МГ увеличивает риск развития фиброза печени, рака легких, желудка. Повышение активности а2-МГ под действием контрикала определяет его противоопухолевый эффект.

Внедрение в практику. Основные результаты работы используются в учебном процессе кафедр патофизиологии, биохимии и молекулярной биологии, терапии, госпитальной терапии с курсом физической реабилитации и спортивной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России. По результатам работы получено 3 патента на изобретение «Способ диагностики стадии хронизации гепатита» (№ 2291440, 10.01.2007); «Способ диагностики цирроза печени» (№ 22914441, 10.01.2007); «Способ прогнозирования риска развития хронической обструктивной болезни легких у длительно курящих лиц» (№ 2359618, 27.06. 2009). Отдельные фрагменты работы поддержаны грантом ФЦП № 02.740.11.0083 «Разработка научно-технологической основы применения лазерных технологий в биомедицинских исследованиях, эффективных методов экспресс-диагностики основных социально-значимых заболеваний респираторной системы человека с использованием методов лазерной спектроскопии».

Апробация работы. Основные положения работы докладывались на ежегодных конференциях «Национальные дни лабораторной медицины» 1997-2008 гг., конференции молодых ученых России с международным участием (Москва, 1998), межрегиональной научно-практической

конференции «Медицина и экологические проблемы Северных районов Сибири» (Стрежевой, 1998), на съездах физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1997, Томск, 2000, 2002), на 5 национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2005), 6 международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2005), 12 Российской гастроэнтерологической неделе (Москва, 2006), 8 Международном Славяно-Балтийском научном гастроэнтерологическом форуме (Санкт-Петербург, 2006), III конгрессе евроазиатского респираторного общества (Астана, 2007), IV съезде и конференции Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008, Челябинск, 2009).

Результаты работы обсуждались на научных семинарах кафедр биохимии и молекулярной биологии СибГМУ, патофизиологии, на проблемных комиссиях «Актуальные проблемы патологической физиологии и общей патологии» и «Фундаментальные проблемы физиологии, биофизики, биохимии" Сибирского государственного медицинского университета (Томск, 2005,2011).

Публикации. По теме диссертации опубликована 61 работа, в том числе 1 монография и 22 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикаций результатов исследований на соискание степени доктора медицинских наук.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 235 страницах, содержит 82 таблицы, 29 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследований, обсуждения и выводов. Список литературы включает 461 источников, из них 95 отечественных и 366 иностранных.

Личный вклад автора. Автором определены цель, задачи, объём исследований, выбраны объекты и методы исследования, проведен аналитический обзор литературы. Более 90% фактического материала получено непосредственно автором. Анализ и обобщение полученных данных, формирование выводов и положений полностью выполнено лично автором.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Характеристика обследованных групп

Проведено проспективное, сравнительное исследование, включающее 1634 человек, обследованных в период с 1993-2009 год. Дизайн исследования представлен на рис.1.

Рис. 1. Дизайн исследования

Критерии включения в исследование:

1. Информированное согласие участников.

2. Для практически здоровых лиц (группа 1) - отсутствие острых

респираторных, хронических, онкологических заболеваний, язвенного и кашлевого анамнеза: 50 женщин, 69 мужчин в возрасте 40,6±6,7 лет и 30 детей (14 девочек и 16 мальчиков) в возрасте 12,3±4,3 лет. Группу 2 составили 29 курящих (индекс курения 34,9±1,4 пачка/лет) и 20 некурящих мужчин в возрасте 44,1±7,4 и 38,5±6,3 лет. В группу 3 включены 207 взрослых и 368 детей, участвовавших в программе по оценке здоровья населения Томской области в 1993-1994 г.

3. Заболевания бронхо-легочной системы (группа 4), верифицированные согласно критериям СОЬО 2003-2007. Группа пациентов с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) на 90% была представлена мужчинами, средний возраст 50,8±15,3 лет. Атопическая бронхиальная астма установлена у 45 женщин и 15 мужчин, в возрасте от 18 до 55 лет.

4. Заболевания желудочно-кишечного тракта (группа 5), верифицированные в соответствии с МКБ-10. Диагноз язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки установлен у 47 мальчиков и 41 девочки в возрасте от 8 до 15 лет (Н. ру1оп-ассоциированная - у 80 детей) и 110 взрослых (Н. ру1оп-ассоциированная - у 101 пациента), средний возраст которых составил 39,5±0,94 лет. Среди взрослых больных 17 человек имели гипер-, 38 - нормо-и 55 - астенический тип конституции. Язвенный колит легкой степени тяжести выявлен у 24 человек, средней степени - у 26, тяжелой степени - у 10 пациентов; болезнь Крона легкой степени тяжести - у 17 больных, средней -12, тяжелой - у 13 человек. В качестве группы сравнения обследовано 18 человек в возрасте 20-30 лет с синдромом раздраженного кишечника. Среди пациентов с фиброзом печени у 109 человек была I стадия заболевания, у 87

- II, у 33 - III, у 74 человек - IV стадия (цирроз).

5. Травма опорно-двигательного аппарата (группа 6): 42 мужчины и 18 женщин в возрасте от 20 до 52 лет: 30 человек с переломом кости и 30 человек - с множественными травмами. В комплексное лечение 15 человек из каждой подгруппы включали контрикал в дозе 30000 ЕД в течение 3 дней.

6. Онкологические заболевания (группа 7): 17 человек с опухолью легкого III стадии (у 4 больных выявлен плоскоклеточный рак умеренно дифференцированный, 3 - мелкоклеточный плеоморфный, 2- смешанный, у 8

- крупно клеточный рак); 15 пациентов с раком желудка III стадии (аденокарцинома); 11 человек с литической стадией гигантоклеточной

опухолью кости (ГКОК) и 9 больных с диагнозом хондросаркома III степени злокачественности, для которой характерна глубокая анаплазия.

Критерии исключения:

1. Наличие тяжелых сопутствующих заболеваний, острых или обострение хронических сопутствующих заболеваний.

2. Терапия глюкокортикоидами и нестероидными противовоспалительными препаратами на момент госпитализации.

3. Противовирусное лечение в анамнезе.

4. Инфекционные заболевания кишечника.

5. Наличие заболеваний опорно-двигательного аппарата с детского возраста, что могло бы повлиять на формирование типа телосложения.

Активность ингибиторов и протеиназ определяли в плазме крови, слюне, кожном экссудате, индуцированной мокроте, ткани печени и слизистой кишечника. Изучали показатели перекисного окислении липидов, окислительной модификации белков, деградации коллагена, фиброгенеза, фосфорно-кальциевого, липидного обмена, маркеров состояния печени, почек, поджелудочной железы, показатели гемостаза при выполнении локальной гипоксии путем передавливания предплечья манжетой сфигмометра.

Кожный экссудат получали путем экспозиции камеры с 0,9% раствором NaCL на коже предплечья. Индуцированную мокроту собирали после последовательно проводимых ингаляций раствора NaCL посредством ультразвукового небулайзера. Биоптаты ткани печени и слизистой оболочки кишечника были взяты с помощью чрескожной пункционной биопсии и колонофиброскопии, соответственно.

Экспериментальная часть работы выполнена с использованием 66 мышей линии BALB/c, самцов, весом 18-20 г. Клетки мастоцитомы Р-815 перевивали внутрибрюшинно. На 7 сутки роста опухоли мышам внутривенно вводили контрикал в дозе 750 Ед и через 2, 4, 6 часов, 1 сутки, 3 и 7 суток изучали показатели протеолиза в плазме крови и тканях животных. Активность агПИ и а2-МГ, катепсина D, эластазо- и трипсиноподобных протеиназ определяли через 2, 6, 24 и 72 часа инкубации культуры клеток мастоцитомы Р-815 in vitro. Пролиферативную активность опухолевых клеток оценивали по интенсивности включения Н3-тимидина в ДНК клеток [Хоробрых В.В. и соавт., 1983].

Методы исследования

Активность а г ПИ и а2-МГ определяли спектрофотометрическим методом Т.Ф. Нартиковой и Т.С. Пасхиной (1979) по торможению гидролиза трипсином синтетического субстрата М-бензоил-Ь-аргшшн-этилового эфира (БАЭЭ, ICN, Biomedicals Inc, USA). Активность КСИ определяли после обработки плазмы 4,2% раствором НС104 [Оглоблина О.Г. и соавт., 1984]. Активность ингибиторов рассчитывали в условных ингибиторных единицах (ИЕ/мл). Фенотипирование агПИ проводили методом изоэлектрического фокусирования [Король Л.Е. и соавт., 1986].

Активность эластазоподобных и трипсиноподобных протеиназ определяли по гидролизу синтетических субстратов: N-бутил-оксикарбонил-L-аланин-п-нитрофенилового эфира (ICN, Biomedicals Inc, USA) и БАЭЭ; активность коллагеназоподобных протеиназ измеряли по расщеплению коллагена I типа (Sigma, Germany) и выражали в мкмоль образующегося гидроксипролина [Шараев П.Н. и соавт., 1987]; для катепсина D использовали в качестве субстрата гемоглобин, для липазы - оливковое масло [Комаров Ф.И. с соавт., 1976; Меньшиков В.В., 1987]. Активность кининогенеза оценивали методом Пасхиной Т.С., Кринской A.B. по скорости гидролиза БАЭЭ, 5'-нуклеотидазы - по гидролизу аденозинмонофосфата.

Окислительную модификацию белков оценивали по содержанию карбонильных и битирозиновых производных [Дубинина Е.Е., Морозова М.Г., 2000]. Перекисное окисление липидов изучали по содержанию ТБК-активных продуктов и диеновых конъюгатов [Камышников B.C., 2001]. Активность каталазы и супероксиддисмутазы определяли в соответствии с методами М.А. Королюк (1988) и О.С. Брусова с соавторами (1976).

Содержание свободного, пептидно- и белковосвязанного гидроксипролина измеряли по цветной реакции с диметиламино-бензальдегидом [Шараев П. Н., 1981]. Содержание кальция, фосфора, мочевины, активность кислой и щелочной фосфатаз, а-амилазы, аланин- и аспартат-аминотрансфераз определяли с помощью диагностических наборов Lachema (Чехия) и Вектор-Бест (Новосибирск). Гемостаз оценивали на анализаторе реологических свойств АРП-01 фирмы «Меднорд» (Томск). Содержание фракций липидов измеряли методом тонкослойной хроматографии на пластинке «Силуфол» (Чехия) [Камышников B.C., 2001].

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием пакетов прикладных программ «Microsoft Excel» для OS «Windows ХР», «Statistica 6.0», SPPSS 11,5. Использовали критерии согласия Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Вилка, Стьюдента, Манна-Уитни, Вилкоксона, Краскала-Уоллиса и Ньюмена-Кейлса, корреляционные методы Пирсона и Спирмена. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05. Многомерный статистический анализ проводили с помощью дискриминантного метода и бинарной логистической регрессии.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Регуляция протеолиза осуществляется за счет согласованного действия ингибиторов протеиназ, отличающихся по механизму связывания ферментов, обеспечивающих разную степень их активности в биологических жидкостях человека. Нарушение взаимодействия ингибиторов и протеиназ определяет течение патологического процесса и прогноз заболевания.

Анализ активности ингибиторов и протеиназ в биологических жидкостях практически здоровых лиц показал, что в плазме крови наблюдается высокая активность оц-ПИ; активность а2-МГ и КСИ составляет, соответственно, 12,5% и 1% от значений осрПИ. В других биологических средах активность ингибиторов находится в пределах 0,4-11,2% от показателей плазмы крови (табл. 1).

Таблица 1

Активность ингибиторов в биологических жидкостях, (Х±т)

Биологические жидкости а,-ПИ, ИЕ/мл а2-МГ, ИЕ/мл КСИ, ИЕ/мл

Плазма крови, п=21 27,50±0,90 3,90±0,50 0,20±0,09

Кожный экссудат, п=21 0,47±0,02 р<0,05 0,46±0,01 р<0,05 0,25±0,01 р>0,05

Слюна, 0,22±0,08 0,05±0,02 0,03±0,01

п=21 р<0,05 р<0,05 р<0,05

Индуцированная мокрота п=20 0,14±0,06 р<0,05 0,02±0,01 р<0,05 0,02±0,01 р<0,05

Примечание: в таблицах X - среднее, ш - стандартное отклонение; р - статистическая значимость отличий по сравнению с плазмой крови

а!-ПИ имеет низкую молекулярную массу, в связи с чем он обнаруживается в секрете бронхов, спинномозговой жидкости, слезах, дуоденальной слизистой [Веремеенко К.Н, 1994; Не Б.Н. С1 а1, 2004; Wex Т.

14

et al., 2008]. а2-МГ, молекулярная масса которого составляет 780 кДа, проникает в ткани только при повреждении биологических барьеров, как правило, при воспалении [Widegren H. et al., 2008; Chang C.C. et al., 2008]. Очевидно, поэтому y практически здоровых лиц активность а2-МГ в слюне, индуцированной мокроте низкая.

Активность КСИ в плазме крови и кожном экссудате одинакова. В слюне и индуцированной мокроте она составила, соответственно, 15% и 10% от активности плазмы крови. КСИ в данных биологических средах, очевидно, представлены, как плазменными производными интер-а-ингибитора трипсина, так и тканевыми местносинтезируемыми ингибиторами [Doumas S. et al., 2005; He S.H. et al., 2003].

Система протеолиза является достаточно чувствительной к локальной гипоксии, курению, воздействию факторов экологического риска. При локальной гипоксии увеличивается время свертывания, в крови повышается активность трипсина в 1,4 раза, калликреина в 1,9 раз и агПИ в 1,4 раз. При курении также увеличивается активность ингибиторов и протеиназ. В индуцированной мокроте, являющейся продуктом деятельности бокаловидных клеток воздухоносных путей, происходит активация трипсина, cti-ПИ, а2-МГ, КСИ, соответственно, в 4,4; 2,4; 1,3 и в 2,5 раза относительно некурящих лиц (табл. 2).

Таблица 2

Активность ингибиторов, протеиназ и перекисное окисление липидов в

индуцированной мокроте курящих мужчин, (Х±т)

Показатели Некурящие, п=20 Курящие, п=29 Р

а,-ПИ,ИЕ/мл 0,14±0,04 0,34±0,04 <0,05

а2-МГ,ИЕ/мл 0,07±0,009 0,09±0,004 <0,05

КСИ, мИЕ/мл 10,41±1,39 25,30±2,20 <0,05

Трипсин, нмоль БАНЭ/мин мл 0,42±0,05 1,84±0,30 <0,05

Эластаза, нмоль БАНЭ/мин мл 0,57±0,02 0,62±0,01 >0,05

МДА, мкмоль/мл 0,8510,23 2,9510,54 <0,05

Каталаза, мккатал/л 148,2±24,2 50,8719,96 <0, 05

СОД, Ед/мл 10,58±1,09 10,6810,81 >0,05

р - значимость различий между группами

Активация протеиназ и ингибиторов сопровождается повышением

содержания МДА и снижением активности каталазы. Увеличение активности

15

протеиназ и содержания ТБК-активных продуктов характеризует усиление катаболических процессов слизистой бронхов под действием компонентов табачного дыма. Повышение активности а,-ПИ может защищать от апоптоза клетки бронхов в ответ на воздействие табачного дыма [Чучалин А.Г., 2008; АИоп^еИ.. е1 а1., 2008].

Ингибиторы протеолиза являются чувствительными индикаторами при воздействии экологически неблагоприятных условий среды. По данным мониторинга окружающей среды одним из факторов загрязнения территории Томской области является совместное воздействие радиоактивных и химических веществ [Рихванов Л.П. с соавт., 2006]. У населения, проживающего в зонах экологического риска, обнаруживаются заболевания желудочно-кишечного тракта, верхних дыхательных путей, кожи, почек, щитовидной железы [Матковская Т.В., 2004].

У лиц из экологически загрязненных населенных пунктов наблюдалось увеличение активности а|-ПИ, сь-МГ в 1,5-1,6 раза по сравнению с жителями районов, не входящих в зону влияния Сибирского химического комбината. Кроме того у жителей этих районов повышалась активность аминотрансфераз, 5'-нуклеотидазы, соответственно, в 1,4 и в 2,6 раз, что отражает повреждение мембран клеток. Особое значение имеет тот факт, что у лиц, проживающих на территории с повышенным радиационным фоном, обнаружено снижение активности а-амилазы до 2,3±0,4 мккат/л (референтные значения 16-33 мккат/л), что является признаком недостаточности поджелудочной железы и нарушения пищеварения. У 25% населения обнаружена низкая активность а]-ПИ, активность а(-МГ была понижена у 14% обследованных лиц.

Таким образом, ингибиторы протеиназ обладают защитным действием при активации протеиназ в условиях адаптации здорового человека к локальной гипоксии, курению, экологическим факторам риска развития заболеваний. Низкая активность ингибиторов протеиназ может быть показателем нарушений метаболизма, приводящих к развитию заболеваний.

Ингибиторы протеиназ при заболеваниях бронхо-легочной системы

Содержание ингибиторов протеолиза определяли в мокроте пациентов с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ). Активность агПИ и а2-МГ в мокроте больных снижается в зависимости от степени тяжести

заболевания и на IV стадии составляет, соответственно, 7% и 35% от контрольных значений (рис.2). 400 и

Я кот роль

□ 1аацин

□ 2аацим

□ Заацнн О4оадт

а!-ПИ а2-МГ КСИ

*- статистическая значимость отличий от контроля, р<0,05 Рис. 2. Активность ингибиторов протеиназ в индуцированной мокроте пациентов с хронической обструктивной болезнью легких.

Активность КСИ в мокроте, начиная с II стадии болезни, повышается и на IV стадии была в 3,5 раза выше контроля. Прогрессирование заболевания сопровождается возрастанием в индуцированной мокроте активности эластазо-, трипсиноподобных протеиназ и калликреина в 8,8; 2,5 и в 20 раз, соответственно, по отношению к контролю. В плазме крови больных ХОБЛ активность эластазоподобных протеиназ, а2-МГ и КСИ, повышается в 1,9; 1,2 и 1,4 раза, соответственно.

Увеличение активности эластазоподобных протеиназ, способных повреждать эластиновые волокна соединительной ткани легких, является одним из основных факторов развития обструктивного синдрома [ТЖ!атШо БЛ.е! а1., 2006]. В этом плане возрастание активности а2-МГ и КСИ плазмы крови рассматривается как защитная реакция, направленная на ограничение действия протеиназ. Следует отметить, что активность а ¡-ПИ плазмы крови увеличивалась лишь у 28% обследованных лиц, для 47% больных ХОБЛ характерно снижение активности агПИ.

Сдвиг метаболизма в сторону катаболических процессов при ХОБЛ характеризуется также увеличением показателей ПОЛ в мокроте (табл. 3). По мере прогрессирования заболевания в индуцированной мокроте больных

повышается содержание МДА, снижается активность каталазы и супероксиддисмутазы.

Таблица 3

Содержание малонового диальдегида, активность каталазы и

Малоновый Катал аза Супероксиддисмутаза

Группы диальдегид (мккатал/л) (Ед/мл)

(мкмоль/мл)

Контроль, п=15 0,85±0,23 148,82124,15 10,58+1,09

I стадия 2,80±0,49 49,8718,45 9,9810,59

п=10 р<0,05 р<0,05 р>0,05

II стадия 3,4110,56 45,29111,14 10,66+0,82

п=14 р<0,05 р<0,05 р>0,05

III стадия 4,82±0,67 47,53+9,17 8,5710,60

п=22 р<0,05 р<0,05 р<0,05

IV стадия 4,62+0,67 39,16+10,18 8,57+0,60

п=20 р<0,05 р<0,05 р<0,05

р - достоверность различий по сравнению с контролем

Корреляционный анализ показал наличие отрицательной зависимости между МДА и ai-ПИ (г=-0,3, р<0,05). Снижение активности агПИ на фоне стимуляции окислительных процессов может быть связано с повреждением метионина в активном центре ингибитора под влиянием активных форм кислорода [Веремеенко К.Н. 1994; Richardson D.E. et al.,2003].

В инактивации агПИ также участвуют протеиназы [Nie J., Pei D., 2004; Summers F.A. et al.,2008]. В целом, низкая активность ai-ПИ рассматривается как неблагоприятный фактор течения ХОБЛ, поддерживающий хроническую воспалительную реакцию и необратимую обструкцию воздухоносных путей [Janciauskiene S. et al., 2004; Abboud R.T. et al., 2008].

Типовая реакция развития дефицита агПИ при хронических заболеваниях легких проявляется также и при атопической бронхиальной астме, в патогенезе которой существенное значение имеет воспалительная реакция. У больных бронхиальной астмой снижается активность ai-ПИ в плазме крови на фоне повышения активности эластазоподобных протеиназ. Активность агМГ существенно не изменяется. Активность КСИ в плазме крови возрастает в 1,4 и 1,6 раз, соответственно, при легкой и средней степени тяжести заболевания. По-видимому, при заболеваниях бронхо-легочной системы увеличение активности КСИ является одним из механизмов саногенеза, направленных на ограничение повреждающего действия

протеолитических ферментов секретируемых эффекторными клетками воспаления [Taggart С.С. et al., 2005; Inoue K-I. et al., 2005].

В кожном экссудате, также как и в плазме крови больных бронхиальной астмой, снижается активность агПИ и увеличивается активность КСИ. Активность а2-МГ существенно не изменяется. Воздействие аллергена в зоне «кожного окна», приводит к выраженной местной активации протеолиза, проявляющейся увеличением активности калликреина в 3,9 раз при легкой степени и в 16 раз при средней степени тяжести заболевания. В ответ на аллерген в кожном экссудате возрастает активность а2-МГ. Это может быть связано с синтезом съ-МГ иммунокомпетентными клеткам, мигрирующими в зону воздействия аллергена [Armstrong Р.В., 1999; Зорин Н.А. с соавт., 2004]. Вероятно, в условиях активации протеолиза при аллергических реакциях сь-МГ является основным ингибитором, способным осуществлять контроль протеолитической активности.

В целом при хроническом воспалении в бронхо-легочной системе проявляются два варианта реагирования ингибиторов протеиназ плазмы крови и тканей: адаптивный и дефицит. Адаптивный вариант связан с увеличением активности а2-МГ плазмы крови и КСИ биологических жидкостей. Дефицит ингибиторов выражается снижением активности агПИ плазмы крови, мокроты и кожного экссудата, активности а2-МГ индуцированной мокроты больных и сопровождается более выраженной активацией протеолиза биологических жидкостей. При наличии аллергического компонента существенное значение в регуляции протеолиза имеет возрастание активности а2-МГ кожного экссудата.

Ингибиторы протеиназ при заболеваниях желудочно-кишечного тракта

Изучали активность ингибиторов, протеиназ и показатели внутриклеточного метаболизма при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, синдроме раздраженного кишечника, язвенном колите, болезни Крона и фиброзе печени.

Язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки. При язвенной болезни

двенадцатиперстной кишки увеличивается активность агПИ, КСИ в плазме

крови и слюне больных на фоне повышения активности эластазы, трипсина,

калликреина и, особенно, пепсиноподобных протеиназ (рис. 3). Активность

а2-МГ существенно не изменяется. При индивидуальном анализе результатов

установлено, что активность агПИ возрастает не у всех больных. Она была

19

повышена у 51% детей и 42% взрослых больных. Снижение активности агПИ выявлено у 30% детей и 44% взрослых больных. Низкая активность агПИ в плазме крови обнаружена у 45% больных астенического типа конституции, у 15 % больных с нормостеническим и 14,9% больных с гиперстеническим типом телосложения. Из истории болезни лиц с дефицитом агПИ выявлен наследственно отягощенный анамнез по язвенной болезни и частые рецидивы заболевания в осенне-весенний период.

I контроль QKCH Оа1-ПИ

300 250 ¿UÜ

íso юо

I

II

плазма крови

% 7000

1600

1200

иио

■100

*

¿I * н

ЭЛ

TP

кк

*- статистическая значимость отличий от контроля, р<0,05 Рис. 3. Активность КСИ, агПИ, эластазо-, трипсиноподобных протеиназ (ЭЛ,ТР), калликреина (КК) и пепсиноподобных протеиназ при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки (в % к контролю)

Дефицит ai-ПИ может быть связан с нарушением экспрессии гена и/или посттрансляционного процессинга белка. Для арПИ известно более 75 кодоминантных аллелей гена, продукты синтеза которых отличаются по электрофоретической подвижности. Наиболее распространен среди населения аллель М, продукты синтеза которого подразделяются на несколько субтипов, называемые фенотипами: М|, М2 и М3, различающихся по антиэластазной активности [Веремеенко К.Н., 1994; Silverman G.A. et al, 2001; Пузырев В.П., 2005; Barlow I, 2008].

В группе пациентов с язвенной болезнью субтип M|Mi был обнаружен у 24% больных, М;М3 - у 33%, а М2М2- у 43 % больных. Установлено, что для М2М2 фенотипа ингибитора характерна низкая активность агПИ (табл. 4), увеличение активности трипсина, пепсина, выраженная активация кининогенеза по сравнению с М(М3 фенотипом. Вероятно, преобладание фенотипа М2М2 среди больных язвенной болезнью связано с

неблагоприятным течением заболевания на фоне неконтролируемой активации протеолиза.

Таблица 4

Активность ингибиторов и протеиназ в зависимости от фенотипа оп-ПИ

Фенотипы а,-ПИ Активность а,-ПИ Трипсин Пепсин Кининогенез КСИ

М,М3 t норма t т т

М,М, норма норма TT TT TT

м2м2 н т tt ттт ттт

- увеличение активности, [ - снижение активности

Следует отметить, что снижение активности агПИ сопровождается максимальным увеличением активности КСИ. Предполагается, что при язвенной болезни в условиях активации пепсиноподобных протеиназ КСИ способны контролировать протеолиз, что подтверждает положительный коэффициент корреляции г=0,58 между данными показателями.

Язвенный колит и болезнь Крона. Язвенный колит характеризуется деструктивными изменениями слизистой оболочки толстой кишки, а при болезни Крона поражение кишечника носит более глубокий, трансмуральный характер [Корепанов A.M. и соавт., 2001; Халиф И.Л., 2004]. В качестве группы сравнения были обследованы пациенты с синдромом раздраженного кишечника (СРК), при котором отсутствуют изъязвления кишечника. Было установлено, что при СРК происходит увеличение в 1,4 раза активности агПИ и а2-МГ в плазме крови на фоне активации трипсина в 2,8 раз, эластазы в 1,95 раз (табл. 5).

Увеличение ингибиторной активности плазмы крови при синдроме раздраженного кишечника носит, очевидно, защитный характер, ограничивая повреждение соединительной ткани [Веремеенко К.Н., 1994; Kotlowski R., Bernstein C.N., 2008]. При язвенном колите и, особенно, болезни Крона ингибиторная активность плазмы крови снижается. Дефицит ингибиторов сопровождается более выраженной активацией эластазоподобных протеиназ в 3,2-4,6 раза, трипсиноподобных протеиназ в 2,3-3,3 раза, увеличением свободного гидроксипролина - показателя деградации коллагена.

Снижение активности ингибиторов при язвенном колите и болезни Крона связано, вероятно, с длительной активацией протеиназ в течение более года у 2/3 исследуемых, выраженными пролонгированными обострениями с постоянными рецидивами у большинства пациентов. Длительность

заболевания при язвенном колите до 1 года выявлена у 28,3%, 2-5 лет - у 38,3%, 6-10 лет - у 15% больных, более 10 лет - у 18,4% обследованных; при болезни Крона соответственно у 21,4%, 42,8%, 14,3% и 21,5% больных.

Таблица 5

Активность ингибиторов и протеиназ в плазме крови при заболеваниях _кишечника, Х±ш._

Показатели Контроль п=30 Синдром раздраженного кишечника, п=18 Язвенный колит п=31 Болезнь Крона п=42

а] -Протеиназный ингибитор, ИЕ/мл 26,4±0,9 35,7±1,9 р<0,05 21,0±1,3 р>0,05 15,1±0,8* р<0,05

аг-Макроглобулин, ИЕ/мл 3,9±0,1 5,4±0,4 р<0,05 2,6± ,1 р<0,05 1,9±0,2* р<0,05

Трипсиноподобные протеиназы, нмоль/мин мл 65,1±4,6 183,2±18,8 р<0,05 213,8 ±20,6 р<0,05 297,9±18,9* р<0,05

Эластазоподобные протеиназы, нмоль/мин мл 100,1±1,9 195,8±15,6 р<0,05 231,9 ±12,9 р<0,05 326,4±33,4* р<0,05

Коллагеназоподобные протеиназы, мкмоль/час-л 7,3±0,1 8,3±0,4 р>0,05 8,3±0,2 р>0,05 8,7±0,3 р>0,05

Свободный гидроксипролин, мкг/мл 0,60±0,03 1,03±0,10 р<0,05 2,05±0,09 р<0,05 2,57±0,11* р<0,05

Пептидносвязанный гидроксипролин, мкг/мл 0,48±0,02 0,34±0,03 р<0,05 0,20±0,01 р<0,05 0,18±0,01 р<0,05

Белковосвязанный гидроксипролин, мкг/мл 6,73±0,17 5,22±0,28 р<0,05 2,69±0,11 р<0,05 1,54±0,10* р<0,05

р - достоверность отличий по сравнению с контролем, * - значимость отличий язвенного колита и болезни Крона (р<0,05)

Дефицит ингибиторов проявляется и в ткани кишечника. Активность сср ПИ в слизистой кишечника при болезни Крона была на 34% меньше, чем при СРК, и на 26% ниже, чем при язвенном колите. Активность (Хг-МГ при болезни Крона снижается на 53% по сравнению с СРК и была на 36% меньше, чем у больных язвенным колитом. Кроме того, при болезни Крона выявлена активация внутриклеточного протеолиза: активность коллагенолитических протеиназ в биоптате слизистой кишечника была выше в 1,3 раза, активность трипсиноподобных протеиназ - в 1,8 раза, относительно группы больных с язвенным колитом. Полученные данные являются биохимическим подтверждением более выраженных, затрагивающие все слои, деструктивных повреждений стенки кишечника при болезни Крона [Адлер Г, 2001, Ьалугапсе 1.С. е1. а1, 2001]. Предрасполагающим фактором активации протеолиза и деструкции тканей, очевидно, выступает дефицит ингибиторов в слизистой кишечника и плазме крови больных.

При деструктивных заболеваниях кишечника исследовали также окислительную модификацию белков (ОМБ) плазмы крови и слизистой кишечника (табл. 6). Показано, что в плазме крови пациентов с СРК, язвенным колитом и болезнью Крона содержание карбонильных производных возрастает, соответственно, в 1,5 раза, в 3,6 раз и 1,7 раз относительно контроля.

Таблица 6

Показатели окислительной модификация белков плазмы крови при

заболеваниях желудочно-кишечного тракта, Х±ш.

Показатели контроль п=20 Синдром раздраженного кишечника п= 18 Язвенный колит п= 60 Болезнь Крона п=42

Карбонильные производные, о.п ./мл 1,5±0,1 2,2±0,6* 5,4±1,0* 2,5±0,4*

Битирозин, 10"3у.е. 10,0±0,03 9,0±0,05 12,5±0,03* 14,0±0,02*

Примечание: о.п.- оптическая плотность, у.е. - условные единицы,*- р<0,05

Наиболее надежным маркером ОМБ принято считать повышение уровня битирозиновых сшивок, устойчивых к утилизации протеиназами [Б1Магсо Т., &и1т С., 2007]. Содержание битирозина не изменяется при СРК и увеличивается при деструктивных заболеваниях кишечника: в 1,3 при язвенном колите и 1,4 раза при болезни Крона. С увеличением концентрации продуктов ОМБ снижается активность агПИ, что подтверждается отрицательными коэффициентами корреляции ингибитора с карбонильными производными и битирозином равными, соответственно, -0,7 и -0,9.

Взаимосвязь агПИ с показателями окислительной модификации белков проявлялась и в слизистой кишечника. Снижение активности ссрПИ в слизистой кишки по мере прогрессирования заболевания сопровождается возрастанием содержания карбонильных производных окислительной модификации белков. Так при тяжелой степени течения язвенного колита и болезни Крона содержание карбонильных производных было, соответственно, в 1,7 раз и в 1,6 раза выше, чем при легкой степени тяжести заболеваний (р<0,05).

При воспалительно-язвенных заболеваниях выявлено снижение активности а2-МГ в плазме крови и в слизистой кишечника. При анализе полученных результатов методом логистической регрессии рассчитано, что низкая активность а2-МГ увеличивает риск развития болезни Крона в 3,9 раза (р=0,005).

Кроме контроля протеолиза, а2-МГ выполняет функции сигнальной молекулы, запуская множество путей внутриклеточной трансдукции. Связываясь с сигнальными рецепторами MGSR (alpha2-Macroglobulin signalling receptor), а2-МГ опосредует фосфорилирование митогенактивируемого протеина (MAP) и транскрипционного фактора CREB [Qiu Z., 2004], увеличивает содержание цАМФ, инозитолтрифосфата (PI3), кальция, активирует белки Ras и Р13-киназа-зависимые пути пролиферации клеток [Misra U.K. et al., 1993,2002]. а2-МГ участвует в регуляции апоптоза посредством ингибирования каспаз [Ikari Y. et al., 2001], обладает антибактериальным, противовирусным действием [Zorin N.A., 2004]. Снижение его активности является, очевидно, неблагоприятной реакцией организма при развитии патологического процесса.

Таким образом, при деструктивных заболеваниях кишечника развивается дефицит ингибиторов протеиназ, сопровождающийся выраженной активацией плазменного и внутриклеточного протеолиза, деградацией белков соединительной ткани, окислительной модификацией белков плазмы крови и слизистой кишечника.

Фиброз печени. Активация протеолиза при хроническом воспалении рассматривается как патогенетический фактор прогрессирования фиброзного процесса [Chua F., Laurent G.J., 2006], основой которого является способность эластазы гидролизовать белки внеклеточного матрикса (ВКМ) и стимулировать фиброгенез через активацию PARs, запускающих синтез транскрипционных факторов посредством реципрокных взаимодействий между TGF-ß и EGFR/MEK/ERK сигнальными путями [Chua F., Laurent G. J., 2006; Кузнецова К.П., 1998; Iimuro Y„ Brenner D. A., 2008].

Показано, что при фиброзе печени активность эластазоподобных протеиназ плазмы крови повышается до 173,19±5,32 нмоль/мин-мл при контроле 100,14±1,93 нмоль/мин-мл. Активация протеолиза при фиброзе сопровождается дисбалансом ингибиторов: увеличением активности cti-ПИ и снижением активности а2-МГ. В плазме крови дисбаланс проявляется в одинаковой степени на всех стадиях фиброза (рис. 4. А). В ткани печени выраженный дисбаланс характерен для III-IV стадии (рис. 4. Б.). Выявление дисбаланса ингибиторов в плазме крови, который развивается раньше, чем в ткани печени, можно использовать как дополнительный показатель хронизации заболеваний печени и развития фиброза.

А. Плазма крови (в % к контролю) Б. Ткань печени (в % к I стадии)

Рис. 4. Активность ингибиторов и протеиназ в плазме крови (А) и ткани печени (Б) на НУ стадиях фиброза (*- статистическая значимость).

а2-МГ принимает участие в защите белков соединительной ткани от деструктивного действия протеиназ, таких как коллагеназа и эластаза, связывании цитокинов, регулирующих процессы коллагенообразования, рассматривается как лимитирующий фактор чрезмерной репарации и фиброзирования тканей [Маянский Д.Н., 1994]. Снижение активности а2-МГ может быть обусловлено активацией протеолиза, связыванием протеиназ и выведением комплекса из кровеносного русла [Зорин Н. А. и соавт., 2004]. Низкая активность а2-МГ, вероятно, является существенным фактором патологического образования соединительной ткани, что подтверждает факт снижения активности а2-МГ в ткани печени уже с II стадии хронизации процесса (рис. 4. Б).

В патогенезе фиброза принимают участие коллагеназоподобные протеиназы, которые относятся к матриксным металлопротеиназам. Матриксные металлопротеиназы ингибируют апоптоз звездчатых клеток, вызывают их трансдифференцировку в миофибробласты, синтезирующие белки ВКМ [Окатою К. с( а1„ 2005; 7Ьи У.К. ег а1., 2005]. Минимальная активность коллагеназоподобных обнаружена на IV стадии фиброза -циррозе (рис. 4. Б). Следует отметить, что в плазме крови активность коллагеназоподобных протеиназ была низкой на всех стадиях фиброза (рис. 4. А). Снижение активности коллагеназоподобных протеиназ, вероятно, приводит к торможению деградации коллагена и способствует фиброгенезу.

Дисбаланс агПИ и а2-МГ при развитии фиброзе печени сопровождается увеличением активности коллагеназы в ткани печени, особенно на III стадии

25

процесса. Максимальная активность коллагеназоподобных протеиназ обнаруживалась на фоне высокого содержания белковосвязанного гидроксипролина - показателя усиленного синтеза коллагена и фиброгенеза.

Таким образом, при заболеваниях желудочно-кишечного тракта выявляются три варианта реагирования ингибиторов протеиназ. Адаптивный вариант проявляется при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки и синдроме раздраженного кишечника. Дефицит ингибиторов выявлен в плазме крови и слизистой кишки при язвенном колите и болезни Крона. Дисбаланс ингибиторов с увеличением агПИ и снижением а2-МГ характерен для фиброза печени.

Ингибиторы протеиназ при травмах кости Умеренная активация протеиназ плазмы крови обнаружена при переломе кости: увеличение активности трипсина и калликреина в 2-2,5 раза; при множественных травмах развивается выраженная активация с повышением активности трипсина в 3 раза, калликреина в 13 раз. Активация трипсиноподобных протеиназ приводит к образованию вазоактивных кининов, нарушению микроциркуляции, развитию шока, повышению риска тромбоопасности и рассматривается как показатель интенсификации катаболических процессов в ответ на травму [Попов В.П. с соавт., 2002; Корепанов В.А. с соавт., 2000].

Активность а2-МГ возрастает как при умеренной, так и выраженной активации протеолиза (рис. 5. А), активность арПИ при единичном переломе кости возрастает в 1,7 раз, а при множественных травмах снижается и сохраняется низкой до 21 суток (рис. 5. Б).

150

100

Я 3 суни

□ 7 сут<и

□ 21 сутки

перелом кости политраома

200 %

153

10Э

50

перелом кости политравма

А. а2-МГ Б. а,-ПИ

Рис.5. Активность а2- МГ, агПИ плазмы крови при травмах (в % к контролю; *- значимость отличий).

Показано, что в плазме крови больных с переломами увеличивается содержание диеновых конъюгатов в 3,2-3,9 раз и малонового диальдегида в 1,5-2,0 раза. При множественной травме концентрация диеновых конъюгатов в 1,5-2,0 раза выше, по сравнению с единичными повреждениями кости.

Активация катаболизма и ПОЛ при травмах сопровождается повышением общей антиоксидантной активности, активности липазы, содержания свободных жирных кислот, холестерола и показателей резорбции кости: увеличением содержания свободного гидроксипролина, активности кислой фосфатазы и снижением активности щелочной фосфатазы - маркерного фермента остеобластов.

Корреляционный анализ выявил взаимосвязь между состоянием протеолиза и ПОЛ. Активность протеиназ находилась в положительной зависимости от содержания МДА и диеновых конъюгатов (гху=0,6-0,8). Активность осрПИ в большей степени взаимосвязана с общей антиоксидантной активностью (гху= 0,75-0,9).

Активация протеолиза является основанием для включения в терапию таких больных поливалентного ингибитора протеолиза контрикала. Описано успешное применение контрикала для лечения и профилактики вторичной пневмонии, при тяжелых бактериальных инфекциях, бронхиальной астме, препарат благоприятно действует на течение и исход острого инфаркта миокарда [Веремеенко К.Н., 1988].

При лечении больных с травмой опорно-двигательного аппарата был использован контрикал, который вводили внутривенно в дозе 30 000 Ед на 1 сутки после перенесенной травмы в течение 3 дней. На 3 сутки, 7 и 21 сутки определяли показатели и сравнивали их с показателями больных, не получавших контрикал.

Применение контрикала в комплексном лечении травматической болезни способствует снижению активности трипсина и калликреина в плазме крови больных. Введение контрикала больным с множественными травмами повышает активность агПИ (рис. 6. Б.). Ингибирование плазменного протеолиза под действием контрикала сопровождается изменением внутриклеточного метаболизма: снижается активность липазы, концентрация свободных жирных кислот, диеновых конъюгатов, содержание свободного

гидроксипролина - показателя резорбции кости и возрастает содержание белковосвязанного гидроксипролина - показателя остеосинтеза.

ИЗсужм

□ 7сужи

□ 21 суши

а2-МГ

А. Перелом кости Б. Множественные переломы

Рис. 6. Влияние контрикала на активность агПИ и а2-МГ при переломе кости и множественных травмах (за 100% приняты показатели больных, не получавших контрикал; * - статистическая значимость).

Таким образом, изменения метаболизма при травмах опорно-двигательного аппарата определяются степенью резорбции кости и общей реакцией организма, выражающейся в активации протеолиза. В этом плане особое значение имеет выявление больных с низкой активностью ингибиторов протеолитических ферментов, которые являются группой риска развития осложнений и требуют назначения специфической фармакологической коррекции биохимических нарушений.

Ингибиторы протеиназ при онкологических заболеваниях

Хроническое воспаление является одним из промоторных факторов формирования опухоли. Известно, что ХОБЛ увеличивает риск развития опухоли легких в 4-5 раз, а в сочетании с курением - в 7 раз. Наследственный дефицит а,-ПИ увеличивает риск развития опухоли в 2 раза. В структуре онкологических заболеваний второе место после рака легкого занимает рак желудка [Parkin D.M., 2006; Чиссов В.И., 2007; MacKinnon A.C. et al., 2010].

Определяли активность ингибиторов протеиназ в плазме крови больных с раком легких и у пациентов с аденокардиномой желудка III стадии, находящихся на лечении в НИИ онкологии СО РАМН. При этих опухолях увеличивается активность а,-ПИ плазмы крови и снижается а2-МГ на фоне увеличения калликреина в 1,9 раза. Для оценки дисбаланса ингибиторов при онкологических заболеваниях рассчитывали отношение активности агПИ к

180 " 160 :40 120 100 so 60 40 20 0

al-ПИ

02-МГ

al-ПИ

активности а2-МГ (арПИ/аг-МГ). Коэффициент возрастает в 2,0 раза при раке легкого и в 2,2 раза при раке желудка.

Повышение активности осрПИ в крови больных с новообразованиями, вероятно, обусловлено естественной реакцией на активацию протеолиза и рассматривается как защитный механизм от инвазии опухоли, в процессе которой принимают участие протеиназы. Механизм его увеличения связывают как с активацией протеолиза плазмы крови, так и с деструкцией опухоли, клетки которой, как предполагают, секретируют ингибитор трипсина [Wesermann F.H.,1990],

Снижение а2-МГ, очевидно, является неблагоприятным фактором течения онкологического заболевания, т.к. известно, что а2-МГ обладает цитотоксичностью по отношению к опухолевым клеткам [Коо Р.К., 1983; Lindner I. et al., 2010]. Непосредственное противоопухолевое действие а2-МГ заключается в ингибировании пролиферации трансформированных клеточных линий, а косвенное действие осуществляется через иммунную систему [Мишин Ю.В., 1988; Веремеенко К.Н., 1994].

Дисбаланс ингибиторов проявляется также при опухолях кости. Опухоли костно-суставной локализации составляют около 1% от общего числа онкологических заболеваний, из них на долю гигантоклеточной опухоли кости (ГКОК) приходится 8,6%, а хондросаркомы - 12%. По сравнению с ГКОК, хондросаркома имеет злокачественный, часто рецидивирующий характер [Ланцман Ю.В., 1990]. Коэффициент отношения агПИ/а2-МГ плазмы крови при ГКОК возрастает в 2,2 раза, а при хондросаркоме в 2,7 раза по сравнению с практически здоровыми лицами.

Увеличение коэффициента агПИ/а2-МГ плазмы крови при опухолях кости сопровождается резорбцией кости, что подтверждает повышение в плазме крови содержания кальция в 1,5-1,7 раза, активности кислой фосфатазы в 4 раза, фракций гидроксипролина: свободного в 1,9-2,5 раза, пептидносвязанного в 2,3-2,4 раза и белковосвязанного в 1,3-1,7 раза, относительно контроля.

В опухолевой ткани хондросаркомы выявлено, что активность щелочной фосфатазы - маркерного фермента остеобластов - на 68% меньше по сравнению с ГКОК (табл. 7). В то же время активность коллагеназоподобных протеиназ в ткани хондросаркомы была в 1,6 раз выше, чем в ГКОК. Очевидно, что рост этой опухоли в большей степени сопровождается

резорбцией кости по сравнению с ГКОК. В ткани хондросаркомы, по сравнению с ГКОК, снижена активность oti-ПИ. Снижение защитного действия ингибиторов в ткани опухоли на фоне активации протеолиза может выступать как фактор, благоприятствующий инвазии опухолевых клеток в здоровую ткань [Elliot P.R. et al„ 1998; Zelvyte I, 2003; Kloth J.N. et al, 2008].

Таблица 7

Активность ингибиторов и ферментов в опухолевой ткани (Х+т)

Показатели Гиганта клеточная опухоль кости, п=10 Хондросаркома п=6

Щелочная фосфатаза, Е/мг белка 583,5±22,2 189,2±17,2 р<0,05

Коллагеназоподобные протеиназы, мкмоль/ч мг белка 6,7±0,9 10,8±1,5 р<0,05

арПротеиназный ингибитор, мИЕ/мг белка 14,7±3,6 0,2±0,05 р<0,05

р - достоверность отличий между опухолями

Универсальность дисбаланса ингибиторов при развитии опухоли в организме подтверждают результаты изучения протеолиза в условиях экспериментального опухолевого роста. Коэффициент агПИ/а2-МГ плазмы крови мышей линии BALB/c, которым внутрибрюшинно были введены клетки мастоцитомы Р-815, возрастает и на 14 сутки роста опухоли превышает контрольные показатели в 3 раза.

Увеличение коэффициента а,-ПИ/а2-МГ плазмы крови сопровождается активацией внутриклеточного протеолиза: активность катепсина D в асцитной опухоли возрастает с 9,8±1,8 нмоль тир/мин-мг до 18,4±4,9 нмоль тир/мин-мг. Введение контрикала мышам-опухоленосителям приводит к снижению активности катепсина D опухолевых клеток до 11,9±0,6 нмольтир/мин-мг и уменьшению количества клеток мастоцитомы Р-815 с 41,0±5,8 млн/мл до 23,3±2,7 млн/мл. Показано, что введение контрикала мышам-опухоленосителям препятствует дисбалансу: увеличивает активность а2-МГ и снижает активность оц-ПИ. Коэффициент агПИ/а2-МГ понижается до уровня контроля.

При культивировании клеток мастоцитомы Р-815 в условиях in vitro активность а2-МГ также повышается (табл. 8). Увеличение активности а2-МГ происходит на пике пролиферативной активности клеток, через 24 часа от начала культивирования, что подтверждено повышением включения Н3-

30

тимидина до 533001100 имп/мин по сравнению с исходными значениями 13900+140 имп/мин.

Таблица 8

Активность ai-ПИ, а2-МГ и протеиназ в процессе роста культуры клеток мастоцитомы Р-815 in vitro _

Показатели Время культивирования

2 часа 6 часов 24 часа 72 часа

арПИ, ИЕ/мл 1,0610,05 0,6810,02* 0,9410,03 0,9110,04

а2-МГ,10"'ИЕ/мл 0,4110,03 0,5210,13 1,3510,09* 1,5310,08*

Катепсин D, нмоль/мин-мл 1,3110,12 22,3110,34* 1,41+0,25 0,97+0,08

Эластаза, нмоль /мин-мл 0,1110,02 5,2210,19* 0,1110,04 6,2310,15*

Трипсин, мЕ/мл 0,3110,09 1,1810,12* 0,9110,06* 3,4610,14*

*- статистическая значимость отличий по сравнению с 2 часами, р<0,05

Высокая активность а2-МГ сохраняется до 72 часов культивирования и сопровождается увеличением активности эластазо- и трипсиноподобных протеиназ. Повышение активности а2-МГ по мере роста клеток мастоцитомы Р-815 согласуется с данными литературы о способности опухолевых клеток синтезировать этот ингибитор как средство защиты от апоптоза [Зорин H.A., 2006; Montel V. et al., 2007; Elliot P.R., 2007].

Таким образом, особенностью реакции ингибиторов при онкологических заболеваниях является снижение активности а2-МГ плазмы крови на фоне увеличения активности арПИ, коллагеназо-, эластазо- и трипсиноподобных протеиназ. Дисбаланс ингибиторов протеиназ с увеличением отношения ар ПИ/а2-МГ наиболее выражен при злокачественном характере роста опухоли. Противоопухолевое действие контрикала сопровождается снижением активности протеиназ и увеличением активности а2-МГ.

Математические классификационные модели Для оценки наиболее информативных показателей при изучаемых патологиях и их вклада в математическую классификационную модель был использован пошаговый дискриминантный анализ. Для построения дискриминантных функций были использованы 9 показателей: агПИ, а2-МГ, КСИ, трипсино-, эластазо-, коллагеназоподобные протеиназы, свободный, пептидно- и белковосвязанный гидроксипролин. Рассчитаны

канонические линейные классификационные функции (КЛКФ) для изучаемых патологий в сравнении с контрольной группой.

Информативными показателями для синдрома раздраженного кишечника и язвенной болезни двенадцатиперстной кишки являются активность а2-МГ, содержание свободного и белковосвязанного гидроксипролина: КЛКФ 1=3,46-0,31-а2-МГ-0,54-СО-0,06-БСО. Для деструктивных заболеваний кишечника значимыми показателями оказались фракции гидроксипролина: КЛКФ2=-1,95-0,3 СО+1,12 ПСО+0,81 БСО.

И]-ПИ вошел в число информативных показателей в КЛКФ при фиброзе печени и был взаимосвязан с активностью эластазо-, коллагеназоподобных протеиназ и пептидносвязанным гидроксипролином: КЛКФ3=-1,59+0,028-а,-ПИ+ 0,006-эл-0,43-кол+0,84-пс0.

При онкологических заболеваниях наряду с сц-ПИ информативным показателем была активность трипсиноподобных протеиназ: КЛКФ4=0,79+0,05-агПИ-0,04-Тр.

Математическая модель, полученная дискриминантным анализом, позволяет диагностировать у пациента заболевание, для которого рассчитанное значение КЛКФ максимально приближено к соответствующему центроиду. Центроиды кластеров для моделей с КЛКФЬ КЛКФ2, КЛКФз, КЛКФ4, соответственно, равны -0,58; -1,12; 1,19 и 2,62. Качество распознавания данных патологий посредством сопоставления предсказанной и наблюдаемой классификации в обучающей матрице составило для КЛКФ, 88%, для КЛКФ2 - 92 %, а для КЛКФ3.4 - 97%.

Дискриминантный анализ не позволил выявить решающих правил диагностики ХОБЛ и бронхиальной астмы, вероятно в связи с однотипностью изменений исследуемых показателей. Однако методом логистической регрессии показано, что по активности а2-МГ можно предсказать наличие патологии в области бронхо-легочной системы. В данной модели, чем больше активность а2-МГ, тем меньше вероятность обнаружить ХОБЛ.

Дополнительно, методом логистической регрессии выявлено, что высокие показатели оц-ПИ на фоне низкой активности а2-МГ увеличивают вероятность обнаружить опухоль или фиброз. Установлено, что снижение активности а2-МГ увеличивает риск развития опухоли легких и желудка в 1,6 раз, а фиброза печени - в 1,7 раз.

Анализ полученных результатов позволяет выделить три типа реагирования ингибиторов протеолиза плазмы крови при патологических процессах: адаптивный, дефицит и дисбаланс ингибиторов (рис.8).

| Лктивоция^протеолиза |

плазма слизистая слюна индуцированная слизистая

неитрофилы опухоль крови кишечника_мокрота кишечника фиброоласти

•■ь трипсин I эластаза

лдтрилсин эластаза

калликреин.ПОП

АДАПТИВНЫЙ

I

{

'I4 коллагеназа эластаза, деградаций ВКМ, ГТОТУОМБ ,

фколлагеназа синтез ВКМ14

синдром сраженного кишечника

ДЕФИЦИТ

I

) [

X

^трипсин I эластаза, коллагеназс

т

язвенная болезнь

2,,

ДИСБАЛАНС

Е

>[итпи,*2-мг,кс^|^пилЦ-мг/^си

бронхиальная ([язвенный астма II колит

болезнь Крона

V-,

I

фиброз печени

опухоль

■Гс^МГ снижает риск

Рис 8. Варианты реагирования ингибиторов протеиназ

Адаптивный вариант реагирования, с увеличением активности а ¡-ПИ и а2-МГ, связан с умеренной активацией протеолиза, перекисного окисления липидов, незначительным повреждением соединительной ткани. При дефиците ингибиторов сдвиг метаболизма в сторону катаболических реакций сопровождается выраженной активацией протеолиза, деградацией внеклеточного матрикса, активацией перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков.

Снижение активности ингибиторов можно рассматривать не только как следствие хронической активации эластазо- и коллагеназоподобных протеиназ, но и как возможную причину нарушения контроля внутриклеточного протеолиза, в частности, слизистой кишечника, повышенной деградации соединительной ткани, развития язвенного колита и болезни Крона.

Определяющим фактором при фиброзе печени является снижение активности а2-МГ как в плазме крови, так и в ткани печени. Дисбаланс ингибиторов наблюдается также при онкологических заболеваниях. Снижение активности а2-МГ в этом случае способствует поддержанию

высокого пролиферативного потенциала неопластически

трансформированных клеток. Низкая активность а2-МГ повышает риск развития фиброза печени.

Результаты проведенного исследования являются основанием для использования а,-ПИ, а2-МГ и КСИ в качестве показателей в клинико-лабораторной диагностике хронических обструктивных заболеваний легких, деструктивных болезней кишечника и оценке прогрессирования фиброза печени. Выявление больных с низкой активностью агПИ и особенно, а2-МГ, необходимо для разработки патогенетически обоснованного лечения, мониторинга течения хронических заболевания и прогноза развития осложнений.

ВЫВОДЫ

1. Контроль над активностью протеолиза в организме практически здоровых лиц осуществляют ингибиторы протеиназ, локализованные в основном в плазме крови. В слюне, индуцированной мокроте активность а,-ПИ, а2-МГ значительно ниже и составляет от 0,4% до 11% от показателей плазмы крови. Наиболее высокая активность КСИ обнаружена в кожном экссудате и плазме крови, затем слюне и индуцированной мокроте. Активность агПИ и КСИ плазмы крови коррелирует с показателями в слюне и кожном экссудате, активность а2-МГ плазмы крови не зависит от ингибиторных свойств других биологических жидкостей.

2. Согласованное действие ингибиторов протеолиза наблюдается у практически здоровых лиц при локальной гипоксии, курении, воздействии экологических факторов риска развития заболеваний. Увеличение активности схрПИ, а2-МГ, КСИ сопровождается изменением клеточного метаболизма: активности аминотрансфераз, 5'-нуклеотидазы, а-амилазы, показателей перекисного окисления липидов.

3. При патологических процессах выявлены три варианта реагирования ингибиторов: адаптивный, дефицит и дисбаланс. При адаптивном варианте повышается активность агПИ, а2-МГ, КСИ на фоне умеренной активации протеолиза. Дефицитный вариант со снижением активности агПИ и а2-МГ протекает на фоне выраженной активации протеолиза, окислительной модификации белков и липидов, разрушения белков соединительной ткани. Дисбаланс ингибиторной активности связан со снижением активности а2-МГ и увеличением агПИ.

4. Дефицит а,-ПИ и а2-МГ при заболеваниях бронхо-легочной системы обнаружен в индуцированной мокроте и является показателем прогрессированием заболевания. Низкая активность ai-ПИ и а2-МГ сопровождается высокой активностью КСИ в плазме, индуцированной мокроте и кожном экссудате больных.

5. Снижение активности агПИ наиболее выражено при наличии М2М2 фенотипа и астенического типа телосложения больных. Дефицит а,-ПИ и а2-МГ при активации внутриклеточного протеолиза слизистой кишечника сопровождается усилением окислительной модификации белков, перекисного окисления липидов, деградацией коллагена соединительной ткани желудочно-кишечного тракта. Увеличение активности а2-МГ снижает риск развития болезни Крона и фиброза печени в 3,8 и 1,7 раза, соответственно.

6. Активация протеолиза плазмы крови при травмах кости сопровождается увеличением активности а2-МГ и уменьшением агПИ на фоне усиленной резорбции кости, липолиза и перекисного окисления липидов. Контрикал снижает активность калликреина и трипсина плазмы крови, предупреждает развитие дефицита а,-ПИ, приводит к снижению содержания диеновых конъюгатов, свободных жирных кислот, активности липазы и стимулирует остеосинтез.

7. Дисбаланс ингибиторов характеризуется повышением коэффициента агПИ/а2-МГ при фиброгенезе. Увеличение коэффициента агПИ/а2-МГ в 2,2-2,7 раз наблюдается при раке легкого, желудка, кости. Снижение активности а2-МГ увеличивает риск развития онкологических заболеваний. Низкая ингибиторная активность в опухоли сопровождается выраженной протеолитической деградацией ткани.

8. Противоопухолевое действие контрикала сопровождается увеличением активности а2-МГ плазмы крови мышей-опухоленосителей с мастоцитомой Р-815. Повышение активности агМГ в условиях in vitro протекает на фоне возрастания активности катепсина D, эластазо- и трипсиноподобных протеиназ опухолевых клеток.

Список публикаций по теме диссертации

1. Оценка состояния системы протеолиза в диагностике заболеваний / O.E. Акбашева, Г.А. Суханова, Е.В. Дюкова и др. // Клиническая лабораторная диагностика. - 1997,- № 6. - С. 21 - 22.

2. Суханова, Г.А. Ингибиторы протеолиза как показатели обратимости патологических процессов / Г.А. Суханова, O.E. Акбашева, Е.В. Дюкова // Материалы 3 съезда физиологов Сибири и Дальнего Востока, - Новосибирск. -Изд-во типографии СО РАМН, 1997. - С. 224-225.

3. Биохимические нарушения при радиационно-химических воздействиях факторов внешней среды / O.E. Акбашева, С.В. Рыжов, А.Э. Сазонов, Е.В. Дюкова // Тезисы докладов I Международного научного семинара в рамках международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Молодежь и наука - третье тысячелетие». Томск, ТГУ. - 1997. - С. 100.

4. Акбашева, O.E. Биохимическая диагностика резорбции кости при опухолях костно-суставной системы / O.E. Акбашева, И.А. Щепеткин, A.A. Жеравин // Международная конференция молодых ученых России с международным участием. «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины посвященной 140-летию ММА им. И.М. Сеченова. М., 1998. - С. 42.

5. Суханова, Г.А. Показатели протеолиза в оценки эффективности лечения язвенной болезни / Г.А. Суханова, O.E. Акбашева, Е.В. Пехтерева // Клиническая лабораторная диагностика. - 1998. - № 8 - С. 49.

6. Суханова, Г.А. Биохимические показатели состояния здоровья населения северных районов Томской области / Г.А. Суханова, O.E. Акбашева, Е.В. Дюкова // Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Медицина и экологические проблемы Северных районов Сибири» - Стрежевой, 28-29 мая, 1998 -С. 178-179.

7. Акбашева, O.E. Маркеры резорбтивного и остеобластного типов при опухолях костно-суставной системы / O.E. Акбашева, Е.В. Буэль, Г.А. Суханова // Клиническая лабораторная диагностика. - 1999. - № 9. - С. 15.

8. Акбашева, O.E. Активность протеолитических ферментов и их ингибиторов в плазме крови мышей при опухолевом росте / O.E. Акбашева, Г.А. Суханова // Бюллетень эксперим. биологии и медицины . - 1999. - Т. 128, №7. - С. 69 - 72.

9. Сравнительная биохимическая и морфологическая характеристика хондросаркомы и гигантоклеточной опухоли кости / O.E. Акбашева, И.А. Щепеткин, Г.А. Суханова, Н.В. Васильев и др. //Вопросы онкологии. - 2000. - Т. 46 № 3. - С. 298 - 300.

10. Показатели протеолиза в оценке резорбции при опухолях кости / O.E. Акбашева, Г.А. Суханова, И.А. Щепеткин и др. // Клиническая лабораторная

диагностика. - 2000. - № 11. - С. 22 - 33.

11. Акбашева, O.E. Фенотипы ai-протеиназного ингибитора и активность протеолитических ферментов плазмы крови при язвенной болезни / O.E. Акбашева, Е.В. Пехтерева, Т.М. Скороходова // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. - 2001.- № 2. - С. 44 - 46.

12. Антиоксиданты и ингибиторы протеолиза в оценке состояния здоровья человека / Г.А. Суханова, О.Е, Акбашева, Е.В. Дюкова, А.П. Кондратьев // Клиническая лабораторная диагностика. - 2001. - № 11. - С. 8.

13. Активность протеолитических ферментов и их ингибиторов в пролиферации мастоцитомы Р-815 in vitro / O.E. Акбашева, Ю.П. Вельский, Н.В. Вельская, Т.И. Панова //Вопросы онкологии. - 2001. - Т. 47, № 5.- С. 619 - 622.

14. Активность пепсиноподобных протеиназ и ингибиторов протеолиза при язвенной болезни детей / O.E. Акбашева, Г.А.Суханова, Е.В. Пехтерева, Л.П. Бушмелева // Сибирский журнал гастроэнтерологии и гепатологии. - 2002.-С.56-58.

15. Активность эластазы и ее ингибиторов при разной этиологии обострения у больных хроническим обструктивным бронхитом [текст] / Е.Б. Букреева, O.E. Акбашева, Г.А. Суханова и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2002. - приложение 1. - С. 55 - 57.

16. Роль ингибиторов протеолиза при заболеваниях бронхо-легочной системы / O.E. Акбашева, Г.А. Суханова, Е.Б. Букреева, Е.А. Дементьева // Материалы 4 съезда физиологов Сибири «Физиология организма в нормальном и экстремальном состоянии». - Томск, 2002. - С. 8 - 9.

17. Влияние контрикала на перекисное окисление липидов у пострадавших с травмой опорно-двигательного аппарата / В.П. Попов, O.E. Акбашева, A.A. Кашеварова // Материалы Всероссийской научно-практической конференции.-Новосибирск: Издатель, 2002. - С. 127 - 128.

18. Характеристика клеточного и биохимического профиля индуцированной мокроты и крови у курящих и некурящих здоровых людей / Л.И.Волкова, Е.Б. Букреева, В.В. Боярко, Н.Г. Полыца, Е.А. Дементьева, O.E. Акбашева // Пульмонология. - 2004. - № 2. - С. 78 - 83.

19. Применение эреспала у больных хронической обструктивной болезнью легких / Е.Б. Букреева, C.B. Нестерович, Е.А. Дементьева, Р.И. Плешко, O.E. Акбашева и др. // Пульмонология. - 2004. - № 2. - С. 102 - 108.

20. Дисперсионный и корреляционный анализ показателей обмена коллагена и конституциональных типов больных при язвенной болезни / O.E. Акбашева, Г.А. Суханова, Т.А. Загромова и др. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2004. -№ 9. - С. 69.

21. Акбашева, O.E. Биохимические показатели обмена коллагена при язвенной

болезни в зависимости от конституциональных типов больных / О.Е.Акбашева, Т.А. Загромова, С.Ю. Ермаков // Сборник научных трудов, посвященных 70-летию кафедры биохимии ГОУ ВПО ИГМА / под ред. Е.Г. Бутолина, П.Н. Шараева, С.Е. Переведенцевой. - Ижевск, 2005. - С. 53 - 56.

22. Акбашева, O.E. Активность ингибиторов протеиназ плазмы крови в зависимости от типа конституции в норме и при патологии / O.E. Акбашева, Г.А. Суханова, Т.А. Загромова // Бюллетень Сибирской медицины - 2005.- Т.4, приложение 1. - Тезисы V сибирского физиологического съезда - С. 4.

23. Изменение состояние хроматина и формирование проканцерогенного микроокружения при хронической обструктивной болезни легких в сочетании с курением / Б.В. Шилов, Е.Б. Букреева, O.E. Акбашева, H.H. Ильинских // Материалы международного симпозиума «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки». - Тюмень, 2005. - С. 100 - 101.

24. Диагностическая ценность биохимических маркеров фиброза в оценке хронизации гепатита / Е.В. Белобородова, Э.И. Белобородова, Р.Ф. Абдрашитов, O.E. Акбашева и др. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии и колопроктологии. Приложение № 28. Материалы 12-й Российской гастроэнтерологической недели. - Москва, октябрь, 2006. - T. XVI. - № 5. - С. 74.

25. Коллагенолитическая активность крови у больных хроническим вирусным гепатитом / Э. И. Белобородова Р. Ф. Абдрашитов, Е. В. Белобородова, Пурлик И.Л. / 8-й Международный Славяно-Балтийский научный форум «Санкт-Петербург-Гастро-2006». - Санкт-Петербург, май, 2006. - С. 20.

26. Эффективность терапии обострений хронической обструктивной болезни легких и биомаркеры воспаления / Н.В. Варвянская, М.С. Санжаровская, Н.С. Ямкина, И.Н. Печеркина, O.E. Акбашева и др. // Уральский медицинский журнал. - № 8. - 2007. - С. 8-10.

27. Активность воспалительного процесса в фазу стабильного течения ХОБЛ / Е.Б. Букреева, C.B. Нестерович, O.E. Акбашева и др. // Материалы III конгресса евроазиатского респираторного общества, Астана, 2007,- С. 159.

28. Акбашева, O.E. Показатели протеолиза и фенотипы агпротеиназного ингибитора при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки / O.E. Акбашева, В.Ю. Серебров // Вопросы биологической, медицииской и фармацевтической химии. - 2007. - № 2. - С. 41 - 44.

29. Акбашева, O.E. Показатели протеолиза плазмы крови и фенотипы ар протеиназного ингибитора при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки у детей / О.Е Акбашева // Биомедицинская химия. - 2007. -Том 3, № 3. - С. 338-344.

30. Загромова, Т.А. Активность ингибиторов протеиназ плазмы крови при язвенной болезни в зависимости от морфофенотипа конституции больных / Т.А.

Загромова, O.E. Акбашева, С.Ю. Ермаков // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2007. - № 4 - С. 30 - 35.

31. Диагностическая ценность определения сывороточных маркеров фиброза печени при хроническом вирусном гепатите / Э.И. Белобородова, Р.Ф. Абдрашитов, Е.В. Белобородова, В.А. Бурковская, O.E. Акбашева и др. // Клиническая медицина. - 2007. - Том. 85, № 9. - С. 61 - 63.

32. Акбашева, O.E. Диагностическое значение ингибиторов протеиназ при заболеваниях бронхо-легочной системы / O.E. Акбашева // Клиническая лабораторная диагностика. - 2007. - № 9. - С. 83.

33. Акбашева, O.E. Система протеиназы-ингибиторы и содержание гидроксипролина в плазме крови и ткани печени при фиброзе / O.E. Акбашева, Е.В. Белобородова, Н.П. Чежина // Вятский медицинский вестник. -2007.- № 4.- С.34-35.

34. Активность системы «протеиназы-ингибиторы» и перекисное окисление липидов индуцированной мокроты при хронической обструктивной болезни легких / O.E. Акбашева, Е.Г. Учасова, Т.С. Овчинникова, Г.Э. Черногорюк // Вятский медицинский вестник. - 2007. - № 4,- С. 33.

35. Активность протеиназ, ингибиторов и перекисное окисление липидов в сыворотке крови и биоптате кишечника при заболеваниях желудочно-кишечного тракта / O.E. Акбашева, А.Е. Деханд, Е.А. Преймачук, В.А. Бурковская // Вятский медицинский вестник. - 2007. - № 4. - С. 33 - 34.

36. Anti-inflammatory activity of Erespal (Fenspirid, Servie, France) at COPD / E. Bukreeva, S. Nesterovich, O. Akbasheva et al. // Abstract 17lh ERS Annual Congress, September, 15-19, 2007. - P. 75s

37. Etiology of inflectional process and inflammation peculiarities at COPD / E. Bukreeva, S. Nesterovich, L. Gudkova, O. Akbasheva et al. // Abstract 17th ERS Annual Congress, September, 15-19, 2007. - P. 404s.

38. Ингибиторы протеиназ в регуляции пролиферативного ответа опухолевых клеток / O.E. Акбашева, Г.А. Суханова, Ю.П. Вельский и др. //Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов Новосибирск: Изд-во «Арта», 2008. - С. 177.

39. Метаболизм коллагена при заболеваниях желудочно-кишечного тракта / А.Е. Деханд, O.E. Акбашева, Г.А. Суханова и др. // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов Новосибирск: Изд-во «Арта», 2008. - С. 422.

40. Функциональные свойства клеточного и гуморального звеньев иммунной системы при хронических заболеваниях печени / Е.В. Белобородова, Э.И. Белобородова, Н.В. Рязанцева, Г.Э. Черногорюк, М.И. Рачковский, И.Л. Пурлик, O.E. Акбашева и др. // Вестник Санкт-Петербургской государственной

медицинской академии им. И.И. Мечникова. - 2008. - № 3. - С. 79 - 84.

41. Диагностическое значение ингибиторов протеиназ плазмы крови при заболеваниях желудочно-кишечного тракта / O.E. Акбашева, Г.А. Суханова, В.А. Бурковская, Э.И. Белобородова // Материалы научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины». Москва, 2008. - С. 22.

42. Акбашева, O.E. Оксидативный стресс и протеолиз при язвенных заболеваниях желудочно-кишечного тракта / O.E. Акбашева, В.А. Бурковская, Э.И. Белобородова // Материалы конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины». - Москва, 2008. - С. 21.

43. Загромова, Т. А. Активность системы протеолиза плазмы крови при язвенной болезни в зависимости от морфофенотипа конституции больных / Т.А. Загромова, O.E. Акбашева, Э.И. Белобородова // Сибирский вестник гепатологии и гастроэнтерологии. - 2008. - № 22. - С. 31-33.

44. Влияние регуляторов энергетического обмена на клиническое течение и биомаркеры воспаления при лечении обострений тяжелой хронической обструктивной болезни легких / М.С. Санжаровская, Н.В. Варвянская, Н.С. Ямкина, И.Н. Печёркина, A.A. Смотрова, С.И. Антипов, Е.П. Рослякова, O.E. Акбашева и др. // Бюллетень Сибирской медицины. - 2008. - Т. 7, № 3. - С. 109-115.

45. Characterization of cellular and biochemical profiles of induced sputum from the herd-core smokers, not suffering from COPD / E. Bukreeva, S. Nesterovich, G. Sietova, O. Akbasheva // European respiratory Journal. Abstract 19th ERS Annual Congress -2009. - V. 34. Supp 53. - P.503s.

46. Морфологические и биохимические маркеры воспалительных реакций в слизистой оболочке бронхов при тяжелой форме бронхиальной астме и хронической обструктивной болезни легких / Е.А. Геренг, И.В. Суходоло, Р.И. Плешко, JI.M. Огородова, O.E. Акбашева и др. // Бюллетень Сибирской медицины. - 2009. - Том. 8, № 3. - С. 11 - 16.

47. Диагностическая чувствительность агпротеиназного ингибитора и а2-макроглобулина при заболеваниях желудочно-кишечного тракта / O.E. Акбашева, Г.А. Суханова, В.А. Бурковская и др. // Материалы Российской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» - Челябинск, 5-8 октября, 2009. - С. 173 -175

48. Диагностическое значение показателей протеолиза и оксидативного стресса при заболеваниях кишечника / O.E. Акбашева, Г.А. Суханова, Е.В. Дюкова и др. // Научные труды X международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке», «Инновационные технологии в биологии и медицине», Москва, РУДН, 9-12

декабря, 2009. - С. 1021 - 1022.

49. Роль клеточных и молекулярных мишеней в формировании различных паттернов воспаления при гетерогенных фенотипах тяжелой бронхиальной астмы / Е.А. Геренг, И.В. Суходоло, J1.M. Огородова, Р.И. Плешко, O.E. Акбашева и др. II Пульмонология. - 2009. - № 5 . - С. 78 - 82.

50. Механизмы прогрессирования фиброза печени при хроническом течении заболеваний вирусной и токсической этиологии / Е.В. Белобородова, Э.И. Белобородова, O.E. Акбашева и др. // Медицинский вестник Северного Кавказа. -2009.-№2.-С. 19-25.

51. Показатели обмена коллагена и эластина при заболеваниях желудочно-кишечного тракта / O.E. Акбашева, В.А. Бурковская, Э.И. Белобородова и др. // Сибирский вестник гепатологии и гастроэнтерологии. - 2009. - № 23. - С. 27-31.

52. Активность эластазо-, коллагеназоподобных протеиназ и их ингибиторов в плазме крови при метаболизме коллагена в условиях хронического течения заболеваний печени вирусной и токсической этиологии / Е.В. Белобородова, Э.И. Белобородова, O.E. Акбашева и др. // Бюллетень СО РАМН. - 2010. - Т.30, № 2. -С. 94-100.

53. Активация антипротеиназ в бронхиальном регионе - фактор толерантности формирования хронической обструктивной болезни легких у здоровых злостных курильщиков / Г.Э. Черногорюк, A.A. Михайлова, С.В. Федосенко, O.E. Акбашева и др. // Бюллетень СО РАМН. - 2010. - Т. 30, № 3. - С. 124 - 129.

54. Активность трипсиноподобных протеиназ и деградация коллагена слизистой оболочки кишечника при язвенных заболеваниях желудочно-кишечного тракта / O.E. Акбашева, В.А. Бурковская, А.Е. Деханд и др. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2010. - Т. XX. - № 2. - С. 31-38.

55. Протеолитическая деградация соединительной ткани при заболеваниях желудочно-кишечного тракта / В.А. Бурковская, O.E. Акбашева, A.B. Сморгон // Сибирский медицинский журнал. - 2010. - Т. 25, № 1. - С. 62 - 66.

56. Показатели системы протеолиза и метаболизма коллагена при хроническом течении заболеваний печени вирусной и токсической этиологии / Е.В. Белобородова, Э.И. Белобородова, O.E. Акбашева и др. // Терапевтический архив. -2010,№2. -С. 29-34.

57. Поражение печени при хроническом вирусном гепатите С на фоне опийной наркомании: морфологические аспекты / Е.В. Белобородова, Д.В. Подгорнова, И.Л. Пурлик, Э.И. Белобородова, Л.А. Петров, М.М. Волчановская, С.Г. Шкорлупа, И.А. Гончарова, O.E. Акбашева // Бюллетень Сибирской медицины. - 2011. - № 1. - С. 7-11.

Коллективная монография

58. Прогрессирование заболеваний печени вирусного и алкогольного генеза. Роль иммуногенетики и системы протеолиза / Е.В.Белобородова, Э.И.Белобородова, Н.В. Рязанцева, И.А. Гончарова, O.E. Акбашева и др. - Томск: Изд-во «Печатная мануфактура», 2008. - 150 с.

Патенты на изобретение

59. Пат. 2291440 РФ, МПК7 G 01 N 33/68. Способ диагностики стадии хронизации гепатита / Е.В. Белобородова, Э.И. Белобородова, Р.Ф. Абдрашитов, М.И. Рачковский, И.Л. Пурлик, O.E. Акбашева и др. - заявка № 2005128374/15, 12.09.05; опубликовано 10.01.2007.

60. Пат. 22914441 РФ, МПК7 G 01 N 33/68. Способ диагностики цирроза печени / Е.В. Белобородова, Э.И. Белобородова, Р.Ф. Абдрашитов, М.И. Рачковский, И.Л. Пурлик, O.E. Акбашева и др. - заявка № 2005128375/15, 12.09.05; опубликовано 10.01.2007.

61. Пат. 2359618 РФ, МПК7. А 61В10/00, G 01 N 33/68. Способ прогнозирования риска развития хронической обструктивной болезни легких у длительно курящих лиц / Г.Э. Черногорюк, A.A. Смотрова, Н.С Ямкина, O.E. Акбашева и др.- Заявка № 2008115077/14, 16.04.08; опубликовано 27.06.2009

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ai-ПИ - агпротеиназный ингибитор

а2-МГ - аг-макроглобулин

БСО - белковосвязанный гидроксипролин

ВКМ - внеклеточный матрикс

КСИ - кислотостабильные ингибиторы

МДА - малоновый диальдегид

ОМБ - окислительная модификации белков

ОФВ1- объем форсированного выдоха за минуту

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПСО - пептидно-связанный гидроксипролин

СО - свободный гидроксипролин

СОД - супероксиддисмутаза

СРК - синдром раздраженного кишечника

ХОБЛ - хроническая обструктивная болезнь легких

EGFR - рецептор эпидермального фактора роста

ERK - экстрацеллюлярно -регулируемая киназа

МАРК - митоген-активируемая протеинкиназа

МЕК -киназа MAPK/ERK

TGF-ß - трансформирующий фактор роста бета

Подписано к печати 29.07.2011. Формат 60x84/16. Бумага «Снегурочка». Печать XEROX. Усл. печ. л. 2,44. Уч.-изд. л. 2,21.

_Заказ 1036-11. Тираж 100 экз._

Национальный исследовательский Томский политехнический университет

Система менеджмента качества Издательства Томского политехнического университета сертифицирована NATIONAL QUALITY ASSURANCE по стандарту BS EN ISO 9001:2008

ИЗДАТЕЛЬСТВО^™. 634050, г. Томск, пр. Ленина, 30 Тел/факс: +7 (3822) 56-35-35, www.tpu.ru

Актуальность проблемы. Изучение общих патогенетических механизмов развития заболеваний, типовых патологических процессов и реакций организма на воздействие патогенного фактора является одной из актуальных медико-биологических проблем. Протеолиз представляет особую форму биологического контроля, включает протеолитические ферменты, их неактивные предшественники, активаторы и ингибиторы, обеспечивает гомеостаз в норме и при развитии адаптационно-защитных реакций организма [15, 49, 157]. При неуправляемом протеолизе происходит деструкция клеток, активация систем свертывания, фибринолиза, комплемента и кининогенеза [16, 95, 103, 113]. Протеолитические ферменты плазмы крови и тканей организма, как правило, способны усиливать действие на организм патогенных факторов: бактерий, вирусов [186], токсических веществ окружающей среды [10, 226], что сопровождается патологией бронхо-легочной системы [183, 213, 402], желудочно-кишечного тракта [38, 107], развитием онкологических заболеваний [96, 125, 148].

В регуляции протеолитических процессов принимают участие ингибиторы внутриклеточных и внеклеточных протеиназ, действие которых достаточно хорошо изучено [16, 49, 261]. Ингибиторы протеиназ обладают противовоспалительным, антибактериальным, противовирусным и противоопухолевым действием [448, 201, 244]. Выявлено большое количество вариантов реагирования ингибиторов протеолиза: от повышения их активности [114, 261, 244, 338, 401], до снижения [352, 242] и разнонаправленной реакции [15, 66, 69, 459]. Длительное повышение экспрессии ингибиторов протеиназ способствует старению организма [240]. Неоднозначность оценки роли ингибиторов протеолиза в реакциях адаптации и развитии патологических процессов приводит к значительным трудностям при использовании их в качестве диагностических и прогностических критериев.

Установлено, что ингибиторная активность плазмы крови на 95% представлена агпротеиназным ингибитором (арПИ) и аг-макроглобулином (а2-МГ). а!-ПИ относится к серпинам, известны полиморфные варианты гена [74, 430]. Генетический дефект осрПИ способствует развитию эмфиземы, хронической обструктивной болезни легких, фиброза печени с прогрессией к циррозу [368, 103, 120, 230]. Тем не менее, в ряде случаев обнаружены бессимптомные варианты дефицита а!-ПИ с поздней манифестацией заболеваний легких и печени [76, 102, 234, 387]. Известны также многочисленные функции а2-МГ: ингибирование протеиназ, активация внутриклеточных путей сигнальной трансдукции, регуляция иммунной системы [31, 310, 281, 206]. Однако функция а2-МГ четко не определена: его иногда относят к белкам острой фазы воспаления, про-, антиапоптотическим факторам, белкам теплового шока, внеклеточным шаперонам, радиопротекторам [31, 348, 409, 427].

Тканевые кислотостабильные ингибиторы (КСИ) представляют альтернативный путь регуляции внутриклеточного протеолиза по отношению к высокомолекулярным, плазменным ингибиторам [62, 460, 201]. КСИ обнаружены во многих тканях, обладают антибактериальными, противовирусными и противоопухолевыми свойствами [201, 257, 134, 394, 289]. Приводятся противоречивые данные о функциях КСИ при патологических процессах: их рассматривают как положительно, как и отрицательно реагирующими белками острой фазы [207, 316, 300, 99].

В последние годы большое внимание уделяется изучению роли ингибиторов протеолиза в биологических жидкостях [336, 123, 274]. Плазменные ингибиторы обнаруживаются в секрете бронхов, желчи, спинномозговой и околоплодной жидкостях, дуоденальной слизистой [354, 295, 201, 292]. Значимость ингибиторов в регуляции внутриклеточного протеолиза при развитии патологических процессов остается не изученной.

В связи с этим актуальным является комплексное исследование активности а ¡-ПИ, а2-МГ и КСИ, их взаимосвязи с клеточным метаболизмом, процессами адаптации к действию повреждающих факторов.

Цель исследования: изучить активность а]-ПИ, аг-МГ, КСИ в биологических жидкостях, взаимосвязь с показателями метаболизма клеток, охарактеризовать варианты реагирования ингибиторов протеиназ при адаптивных и патологических процессах, сопровождающихся активацией плазменного и внутриклеточного протеолиза.

Задачи исследования:

1. Оценить активность арПИ, аг-МГ, КСИ в плазме крови, секретах слюнных желез, индуцированной мокроты, межтканевой жидкости практически здоровых лиц, связь с активностью протеиназ и биохимическими маркерами состояния внутренних органов: аспартат-, аланинаминотрансферазами, а-амилазой, 5'-нуклеотидазой, мочевиной, липидами, окислительными процессами, синтеза и деградации белков соединительной ткани.

2. Охарактеризовать ингибиторную активность плазмы крови, индуцированной мокроты, кожного экссудата, а также активность эластазо-, трипсиноподобных протеиназ, состояние кининогенеза, перекисного окисления липидов при заболеваниях бронхо-легочной системы: хронической обструктивной болезни легких и атопической бронхиальной астме.

3. Изучить активность ингибиторов на фоне активации плазменного и внутриклеточного протеолиза слюнных желез, слизистой кишечника, ткани печени и окислительной модификации белков при заболеваниях желудочно-кишечного тракта: синдроме раздраженного кишечника, язвенной болезни, язвенном колите, болезни Крона и фиброзе печени.

4. Выявить взаимосвязь ингибиторной активности с фенотипом агПИ, типом конституции больных, показателями деградации соединительной ткани и коллагенообразования, перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков.

5. Оценить активность ингибиторов при травмах кости, их взаимосвязь с активностью трипсиноподобных протеиназ, содержанием липидов, а также влияние контрикала на состояние протеолиза, перекисное окисление липидов, резорбцию костной ткани и остеогенез.

6. Оценить особенности реакции ингибиторов при онкологических заболеваниях человека. В условиях экспериментального опухолевого роста in vivo и in vitro выявить эффект контрикала по отношению к протеолитическим ферментам клеток мастоцитомы Р-815, печени, тимуса.

Научная новизна. Проведено комплексное исследование активности ai-ПИ, а2-МГ и КСИ в биологических жидкостях в норме при адаптивных реакциях и заболеваниях, сопровождающихся активацией плазменного и внутриклеточного протеолиза. В рамках концепции согласованного действия ингибиторов протеиназ выявлены варианты их реагирования: адаптивный, дефицит и дисбаланс ингибиторов, коррелирующие со степенью активации протеолиза, перекисного окисления липидов, окислительной модификации белков и деградации соединительной ткани. Впервые установлено, что адаптивный вариант характеризуется увеличением активности ai-ПИ, а2-МГ, КСИ и сопровождается умеренной активацией протеолиза. Дефицит агПИ и а2-МГ приводит к более выраженной активации протеолитических процессов при хронических заболеваниях бронхо-легочной системы, желудочно-кишечного тракта. Дисбаланс ингибиторов с повышением коэффициента ar ПИ/а2-МГ и низкой активности а2-МГ характерен для фиброза печени и онкологических заболеваний. Ингибирование плазменного протеолиза путем внутривенного введения контрикала увеличивает активность ai-ПИ, а2-МГ, снижает липолиз, перекисное окисление липидов, резорбцию и стимулирует остеогенез, приводит к торможению опухолевого роста.

Впервые дана оценка роли ингибиторов в индуцированной мокроте, являющейся секретом бокаловидных клеток, слюны, кожного экссудата, представляющего межтканевую жидкость, слизистой кишечника, ткани печени. Ингибиторная активность осрПИ и а2-МГ в биологических жидкостях значительно ниже, чем в плазме крови. Максимальная активность в тканях характерна для КСИ: в индуцированной мокроте и слюне она равна 10-15%, а в кожном экссудате - практически не отличается от активности ингибитора в плазме крови. Установлено, что активность с^-ПИ и КСИ плазмы крови коррелирует с показателями в слюне и кожном экссудате, в то время как активность а2-МГ плазмы крови не зависит от ингибиторных свойств других биологических жидкостей.

Новыми являются данные о том, что при хронических воспалительных заболеваниях с активацией плазменного и внутриклеточного протеолиза в первую очередь развивается дефицит оц-ПИ. Одновременное снижение активности (Х1-ПИ и а2-МГ плазмы крови и тканей сопровождается тяжелыми заболеваниями бронхо-легочной системы и деструктивными повреждениями кишечника. Универсальной реакцией при сдвиге метаболизма в сторону катаболических процессов является увеличение активности КСИ, которые в условиях дефицита антипротеиназных, защитных факторов осуществляют контроль плазменного и внутриклеточного протеолиза.

Теоретическая и практическая значимость. Получены данные фундаментального характера, расширяющие представления о роли ингибиторов протеолиза в регуляции метаболических процессов плазмы крови и тканей организма. Выявление вариантов реагирования ингибиторов при заболеваниях бронхо-легочной системы и желудочно-кишечного тракта может быть использовано для оценки состояния больных, хронизации патологического процесса. Перспективным является изучение активности ингибиторов и протеиназ индуцированной мокроты в качестве неинвазивных показателей при заболеваниях бронхо-легочной системы. Снижение активности (Х1-ПИ индуцированной мокроты курящих лиц рекомендовано использовать как маркер прогрессирования хронической обструктивной болезни легких. Дефицит а2-МГ плазмы крови является фактором риска фиброза и развития цирроза печени.

Полученные результаты являются основой для разработки новых подходов к лечению хронических воспалительных заболеваний с использованием лекарственных средств, обладающих способностью снижать активность внутриклеточных и плазменных протеиназ и повышать активность их ингибиторов. Возможность практического использования полученных данных подтверждена патентами РФ.

Положения, выносимые на защиту

1. Активация плазменного и внутриклеточного протеолиза при патологических процессах сопровождается разными вариантами реагирования ингибиторов протеиназ: адаптивный, дефицит и дисбаланс. Адаптивный вариант с увеличением активности а]-ПИ, а2-МГ, КСИ проявляется при умеренной активации катаболических процессов. Дефицит а|-ПИ и а2-МГ связан с выраженной активацией протеолиза, окислительной модификацией белков, деградацией соединительной ткани. Дисбаланс ингибиторов характеризуется повышением активности а]-ПИ и снижением активности а2-МГ. При дефиците и дисбалансе агПИ и а2-МГ протеолиз находится под контролем КСИ.

2. Максимальная активность а!-ПИ и а2-МГ характерна для плазмы крови, в кожном экссудате, слюне, индуцированной мокроте она составляет от 0,4% до 11% от показателей плазмы крови. Согласованное действие ингибиторов направлено на регуляцию активности как плазменных, так и внутриклеточных протеиназ: трипсиноподобных, эластазы, коллагеназы, катепсина О.

3. Наиболее значимыми показателями являются агПИ и а2-МГ, которые имеют определяющее значение для прогнозирования заболеваний бронхо-легочной системы и желудочно-кишечного тракта. Нарушение баланса между а]-ПИ и а2-МГ увеличивает риск развития фиброза печени, рака легких, желудка. Повышение активности а2-МГ под действием контрикала определяет его противоопухолевый эффект.

Внедрение в практику. Основные результаты работы используются в учебном процессе кафедр патофизиологии, биохимии и молекулярной биологии, терапии, госпитальной терапии с курсом физической реабилитации и спортивной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России. По результатам работы получено 3 патента на изобретение «Способ диагностики стадии хронизации гепатита» (№ 2291440, 10.01.2007); «Способ диагностики цирроза печени» (№ 22914441, 10.01.2007); «Способ прогнозирования риска развития хронической обструктивной болезни легких у длительно курящих лиц» (№.2359618, 27. 06. 2009). Отдельные фрагменты работы поддержаны грантом ФЦП № 02.740.11.0083 «Разработка научно-технологической основы применения лазерных технологий в биомедицинских исследованиях, эффективных методов экспресс-диагностики основных социально-значимых заболеваний респираторной системы человека с использованием методов лазерной спектроскопии».

Апробация работы. Основные положения работы докладывались на ежегодных конференциях «Национальные дни лабораторной медицины» 1997-2008 гг., конференции молодых ученых России с международным участием (Москва 1998), межрегиональной научно-практической конференции «Медицина и экологические проблемы Северных районов Сибири» (Стрежевой 1998), на 3-4 съездах физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1997, Томск, 2000, 2002), на 5 национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва. 2005), 6 международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2005), 12 Российской гастроэнтерологической неделе (Москва, 2006), 8 Международном Славяно-Балтийском научным гастроэнтерологическом форуме (Санкт-Петербург, 2006), на III конгрессе евроазиатского респираторного общества (Астана, 2007), съездах Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008;Челябинск, 2009).

Результаты работы обсуждались на научных семинарах кафедр биохимии и молекулярной биологии СибГМУ, патофизиологии, на проблемных комиссиях «Фундаментальные проблемы физиологии, биофизики, биохимии» и «Актуальные проблемы патологической физиологии и общей патологии» Сибирского государственного медицинского университета (Томск, 2005, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликована 61 работа, в том числе 1 монография и 22 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикаций результатов исследований на соискание степени доктора медицинских наук.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 235 страницах, содержит 82 таблицы, 29 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследований, обсуждения и выводов. Список литературы включает 461 источников, из них 95 отечественных и 366 иностранных.

выводы

1. Контроль над активностью протеолиза в организме практически здоровых лиц осуществляют ингибиторы протеиназ, локализованные в основном в плазме крови. В слюне, индуцированной мокроте активность ОС]-ПИ, а2-МГ значительно ниже и составляет от 0,4% до 11% от показателей плазмы крови. Наиболее высокая активность КСИ обнаружена в кожном экссудате и плазме крови, затем слюне и индуцированной мокроте. Активность а!-ПИ и КСИ плазмы крови коррелирует с показателями в слюне и кожном экссудате, активность а2-МГ плазмы крови не зависит от ингибиторных свойств других биологических жидкостей.

2. Согласованное действие ингибиторов протеолиза наблюдается у практически здоровых лиц при локальной гипоксии, курении, воздействии экологических факторов риска развития заболеваний. Увеличение активности а!-ПИ, а2-МГ, КСИ сопровождается изменением клеточного метаболизма: активности аминотрансфераз, 5'-нуклеотидазы, а-амилазы, перекисного окисления липидов.

3. При патологических процессах выявлены три варианта реагирования ингибиторов: адаптивный, дефицит и дисбаланс. При адаптивном варианте повышается активность агПИ и а2-МГ на фоне умеренной активации сериновых протеиназ. Дефицитный вариант со снижением активности а]-ПИ и а2-МГ протекает на фоне выраженной активации протеолиза, окислительной модификации белков и липидов, разрушения белков соединительной ткани. Дисбаланс ингибиторной активности связан со снижением активности а2-МГ и увеличением агПИ.

4. Дефицит ссрПИ и а2-МГ при заболеваниях бронхо-легочной системы обнаружен в индуцированной мокроте и является показателем прогрессированием заболевания. Низкая активность агПИ и а2-МГ сопровождается высокой активностью КСИ в плазме, индуцированной мокроте и кожном экссудате больных.

5. Снижение активности oti-ПИ наиболее выражено при наличии М2М2 фенотипа и астенического типа телосложения больных. Дефицит oti-ПИ и а2-МГ при активации внутриклеточного протеолиза слизистой кишечника сопровождается усилением окислительной модификации белков, перекисного окисления липидов, деградацией коллагена соединительной ткани желудочно-кишечного тракта. Увеличение активности а2-МГ снижает риск развития болезни Крона и фиброза печени в 3,8 и 1,7 раза, соответственно.

6. Активация протеолиза плазмы крови при травмах кости сопровождается увеличением активности а2-МГ и уменьшением ai-ПИ на фоне усиленной резорбции кости, липолиза и перекисного окисления липидов. Контрикал снижает активность калликреина и трипсина плазмы крови, предупреждает развитие дефицита агПИ, приводит к снижению содержания диеновых конъюгатов, свободных жирных кислот, активности липазы и стимулирует остеосинтез.

7. Дисбаланс ингибиторов характеризуется повышением коэффициента а|-ПИ/а2-МГ при фиброгенезе. Увеличение коэффициента агПИ/а2-МГ в 2,2-2,7 раз наблюдается при раке легкого, желудка, кости. Снижение активности а2-МГ увеличивает риск развития онкологических заболеваний. Низкая ингибиторная активность в опухоли сопровождается выраженной протеолитической деградацией ткани.

8. Противоопухолевое действие контрикал а сопровождается увеличением активности а2-МГ плазмы крови мышей-опухоленосителей с мастоцитомой Р-815. Повышение активности а2-МГ в условиях in vitro протекает на фоне возрастания активности катепсина D, эластазо- и трипсиноподобных протеиназ опухолевых клеток.

Заключение

Анализ полученных результатов позволяет выделить три типа реагирования ингибиторов протеолиза плазмы крови при патологических процессах: адаптивный, дефицит и дисбаланс ингибиторов (рис. 29). Активация протеолиза J плазма слизистая слюна инДУ^иРованная слизистая неитр0сриль1 опухоль крови кишечника мокрота кишечника срибцюбласты

-трипсин эластаза ь,<|. три псин ■ ¡эластаза ппп калликреин,ПОЛ

- коллагеназа эластаза, деградации ВКМ, ПОЛ,ЬМБ л ,коллагеназа синтез BKMf трипсин I эластаза коллагеназс

АДАПТИВНЫЙ ь ДЕФИЦИТ С

ДИСБАЛАНС

Т т синдром аженного кишечника язвенная болезнь

1 ХОБЛ| I бронхиальная астма болезнь Крона I

Фиброз ечени язвенный колит опухоль

Ы-2МГ снижает риск

Рис. 29. Варианты реагирования ингибиторов протеиназ Адаптивный вариант реагирования, с увеличением активности агПИ и а2-МГ, связан с умеренной активацией протеолиза, перекисного окисления липидов, незначительным повреждением соединительной ткани. При дефиците ингибиторов сдвиг метаболизма в сторону катаболических реакций сопровождается выраженной активацией протеолиза, деградацией внеклеточного матрикса, активацией перекисного окисления липидов и окислительной модификацией белка.

Снижение активности ингибиторов можно рассматривать не только как следствие хронической активации эластазо- и коллагеназоподобных протеиназ, но и как возможную причину нарушения контроля протеолиза тканей, в частности слизистой кишечника, повышенной деградации соединительной ткани, развития язвенного колита и болезни Крона.

Определяющим фактором при фиброзе печени является снижение активности а2-МГ как в плазме крови, так и в ткани печени. Дисбаланс ингибиторов наблюдается и при онкологических заболеваниях. Снижение активности а2-МГ при онкологических заболеваниях способствует поддержанию высокого пролиферативного потенциала неопластически трансформированных клеток. Низкая активность а2-МГ повышает риск развития фиброза печени и опухоли в организме.

Результаты проведенного исследования являются основанием для использования агПИ, а2-МГ и КСИ в качестве показателей в клинико-лабораторной диагностике хронических обструктивных заболеваний легких, деструктивных болезней кишечника и оценке прогрессирования фиброза печени. Выявление больных с низкой активностью арПИ и особенно, а2-МГ, необходимо для разработки патогенетически обоснованного лечения, мониторинга течения хронических заболевания и прогноза развития осложнений.