Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Информативность факторов врожденного иммунитета в прогнозе течения инфекционных заболеваний

ПРОТАСОВ Олег Вячеславович

ИНФОРМАТИВНОСТЬ ФАКТОРОВ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА В ПРОГНОЗЕ ТЕЧЕНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 С О ЕВ 2012

Санкт-Петербург

2012

005010075

005010075

Работа выполнена в ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М.

Кирова» МО РФ

Научные руководители: доктор медицинских наук профессор

ИВ АНОВ Андрей Михайлович доктор медицинских наук НИКИТИН ЕСладимир Юрьевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор

МОСКАЛЕВ Александр Витальевич доктор медицинских наук ГУМИЛЕВСКАЯ Оксана Петровна

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Защита диссертации состоится «28» февраля 2012 года в /З'асов на заседании диссертационного совета Д 215.002.08 при ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ

Автореферат разослан (Си'ПГянваря 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук профессор МИТИН Юрий Алексеевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Проблема инфекционных заболеваний приобретает все большую актуальность в современной медико-биологической науке и практическом здравоохранении в связи с увеличением заболеваемости, их широким распространением среди трудоспособного населения, недостаточной эффективностью современных методов диагностики. Особо следует подчеркнуть сложность прогнозирования характера течения заболевания, выявления предрасположенности или резистентности к развитию хронических форм инфекции.

На современном этапе развития медицинской науки нет сомнений в том, что форма течения инфекционного процесса определяется сложным комплексом взаимодействия патогена и организма человека. Известно, что особенности формирования и течения хронической инфекции обусловлены, с одной стороны, гетерогенностью патогенов (вирулентность, коптагиозность, резистентность к антибиотикам), а с другой - состоянием иммунной системы организма, от адекватности функционирования которой, зависят характер течения и исход заболевания (Richardson М.М., 2006; Holden A.F. et al., 2007).

Цитокиновая регуляция имеет огромное значение, как в норме, так и при патологии. Интенсивное изучение цитокинов всегда было связано с многообещающей перспективой их клинического использования для лечения широко распространенных инфекционных заболеваний и иммунодефицитных состояний. В настоящее время в клинических исследованиях определение цитокинов используют как, достоверный диагностический инструмент прогнозирования, течения и исхода инфекционного процесса. ’

В настоящее время по данным ВОЗ в мире насчитывается более 170 млн. больных хроническим вирусным гепатитом С, а количество инфицированных достигает 500 млн. человек (Радченко В.Г. и соавт., 2004; Lauer G.M. et al., 2001, Afdhal N., Nunes D., 2004; Blackard J. et al., 2008). Вирусный гепатит С занимает лидирующее место среди гепатотропных инфекций в развитых странах, более 1-2% населения инфицировано данным заболеванием (Alter H.J., Seeff L.В., 2000; Afdhal N., Nunes D., 2004). Характерной особенностью вирусного гепатита С является высокая частота хронизации инфекции (>85%) (Mialies Р et al., 2000; Marcellin Р. et al., 2002; Ahmad A., Alvares F., 2004, Akbar H. et al., 2009). Имеется предположение о том, что важнейшую роль в хронизации и прогрессировании гепатита С играет дисбаланс между Thl- и ТЬ2-лимфоцитами и секретируемыми ими цитокинами (Царегородцева Т.М., Серова Т.И., 2003; На-следникова И.О. и соавт., 2005; Рязанцева Н.В. и соавт., 2006; Cramp М. et al. 1999; Boyer N. et al., 2000). ’

Заболеваемость населения инфекциями, передаваемыми преимущественно половым путем (ИППП) неуклонно растет с каждым годом (Арбузова И.А. и соавт. 2000; Тайц Б.М., 2000; Majeroni В.A., 2007; Carlson J.A. et al., 2011).

Известные трудности в диагностике сифилитической инфекции возникают при отсутствии клинических проявлений, характерных для скрытого периода заболевания и серологической резистентности (Sheffield J.S., Wendel G.D., 1999;

Rodney K.E. et al., 2006; Zhonghua Yi. et al., 2009). Известно, что течение и исход инфекции в значительной степени зависят от цитокинового ответа, роль которого при сифилисе до конца не изучена.

В настоящее время трихомониаз является одним из наиболее распространенных заболеваний, передаваемыми половым путем, которое по частоте встречаемости занимает первое место в мире. Ежегодно в мире болеют грихомониазом более 250 млн. человек (Баткаев Э.А., 2002). Анализ научных работ по проблеме иммунотерапии и особенностям иммунного статуса у больных с хроническим трихомониазом позволяет сделать выводы о недостаточно изученной роли факторов врожденного иммунитета (Ackers J.P., 1990; Fichorova R.N., 2009; Vela R.C., Benchimol М., 2011). Имеются лишь немногочисленные работы, посвященные изучению цитокинового статуса при данном заболевании (Горина Е.Ю., Бутов Ю.С., 2001). Определение цитокинов при трихомониазе может дать возможность прогнозировать исход инфекции и выбирать адекватную схему терапии.

Вышеизложенное определило цель и задачи настоящего диссертационного исследования.

Цель исследования: изучить информативность факторов врожденного иммунитета для прогноза течения инфекционных заболеваний вирусной, бактериальной и протозойной этиологии.

Задачи исследования:

1. Исследовать изменения врожденного иммунитета у больных хроническим гепатитом С на различных стадиях заболевания.

2. Установить диагностическую информативность факторов врожденного иммунитета при иммунологическом обследовании, больных сифилисом.

3. Выявить особенности изменений врожденного иммунитета при хроническом трихомониазе.

4. Сформулировать прогностические иммунологические критерии течения хронического вирусного гепатита С, сифилиса и эффективности проводимой терапии при хроническом трихомониазе.

Научная новизна исследования

Получены новые данные об информативности иммунологических показателей, позволяющие прогнозировать неблагоприятное развитие заболевания у больных ХГС. При слабой, умеренной, тяжелой степенях фиброза и цирроза печени установлены достоверные различия в содержании уровней TNF-a, IFN-у, IL-10 и иммуноглобулинов классов A, G, а также уровня фагоцитарного .числа, обусловленные профессией заболевания.

Впервые выявлены факторы иммунной системы (IFN-y, IL-ip и IL-2, ФЧ), которые позволят прогнозировать переход активной инфекции в серологическую резистентность при скрытом течении сифилиса.

Получены новые данные об особенностях иммунного ответа при хроническом трихомониазе. Определен спектр факторов иммунной системы, позволяющий прогнозировать эффективность терапии заболевания. Такими факторами являются содержание цитокинов IFN-y, IL-ip, IL-8 в сыворотке крови, а также относительное количество В-клеток с фенотипом CD19+.

Практическая значимость работы

Определен перечень факторов врожденного иммунитета в качестве критериев, информативных для прогнозирования течения ХГС. Использование данных прогностических критериев позволит своевременно выявить дальнейшее развитие патологического процесса и назначить соответствующую терапию.

Предложены иммунологические пок£1затели, являющиеся высокоинформативными критериями для оценки риска развития серологической резистентности при скрытых формах сифилитической инфекции. Применение данных иммунологических факторов даст возможность обоснованно выделить группу риска, нуждающуюся в динамическом наблюдении и назначения превентивной терапии.

Контроль за содержанием в сыворотке крови 1РЫ-у, 1Ь-ф, 1Ь-8 и клеток с фенотипом СО 19+ позволяет прогнозировать успешность этиотропной терапии больным с хроническим трихомониазом.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Увеличение уровней ТЫР-ос, 1РЬ1-у, 1Ь-10 и иммуноглобулинов классов А, в, а также снижение уровня поглотительной способности нейтрофи-лов являются критериями неблагоприятного течения ХГС.

2. Критерием прогноза развития серологической резистентности после перенесенного сифилиса служит снижение поглотительной способности ней-трофилов и повышение уровня 1РМ-у, 1Ь-1 р и 1Ь-2 в сыворотке крови.

3. Достоверное увеличение уровней ШЫ-у и 1Ь-1р, а также снижение клеток с фенотипом С019+ в сыворотке крови у больных хроническим трихомониазом ассоциируется с неблагоприятным прогнозом проводимой терапии. Пациенты с повышенными концентрациями клеток с фенотипом СЭ19+, 1Ь-8 и нормальными значениями 1РЫ-у и 1Ь-1Р характеризуются благоприятным прогнозом терапии и не нуждаются в коррекции схемы лечения.

4. Прогноз при инфекционных заболеваниях вирусной, бактериальной и протозойной этиологии определяется активацией иммунной системы в направлении наиболее эффективного (ТЬ1/ТЬ2) пути элиминации этиологического агента.

Реализация и внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в научную, учебную и диагностическую работу НИО нанобиотехнологий НИЦ ВМедА им. С.М. Кирова, кафедры и клиники инфекционных болезней, кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики, микробиологии ВМедА им. С.М. Кирова.

Апробация и публикация материалов исследования

Материалы диссертации доложены и обсуждены на XXVI Научнопрактической конференции с международным участием «Рахмановские чтения. Современная неинвазивная диагностика и аппаратная терапия в дерматовенерологии» (Москва, 2009); XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», симпозиум «Современная фармакотерапия заболеваний мочеполовой системы» (Москва, 2009); на заседании отделения Всероссийского научнопрактического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и Ленинградской области (Санкт-Петербург, 2010); Всерос-

сийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы трансфу-зиологии» (Санкт-Петербург, 2011).

По материалам исследования опубликовано 10 печатных работ, в том числе 5 в журналах реферируемых ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 148 страницах машинописного компьютерного текста, состоит из введения, 5 глав (обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав результатов собственных исследований), заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 193 источников, в том числе 104 отечественных и 89 зарубежных. Текст содержит 49 таблиц и 9 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Работа выполнена в период 2006-2011 гг. на базе НИО нанобиотехнологий НИЦ Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова.

Характеристика больных ХГС. Всего было обследовано 245 больных хроническим гепатитом С на различных стадиях заболевания, возраст больных составлял от 18 до 63 лет, из них мужчин было 210, женщин 35 человек. Большинство пациентов были жителями Санкт-Петербурга и Ленинградской области. Большая часть обследованных была представлена военнослужащими РФ (73%) и меньшая часть - гражданскими лицами (27%). Контрольную группу составляли здоровые лица 75 человек, у которых отсутствовали любые клинико-лабораторные и морфологические признаки поражения печени, а также соматические заболевания. Большинство обследованных в контрольной группе являлись лицами мужского пола - 65 человек, женщины составили 10 человек. Их возраст находился в пределах от 18 до 40 лет.

Диагноз ХГС был доказан обнаружением в периферической крови пациентов суммарных антител к ВГС (анти-HCV), и по данным биопсии печени. Кроме того, проводились дополнительные исследования крови на специфические маркеры вирусного гепатита С в ИФА, молекулярно-генетические исследования крови и ткани печени с использованием ПЦР, общеклинические анализы крови и мочи, биохимическое исследование крови. Выявление генома HCV (РНК) проводилось методом обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени. Для качественной детекции генома применялась тест-система “Ам-плиСенс HCV-FRT”, для количественной - «АмплиСенс НСV-MOHHTOp-FRT» (производства ЦНИИЭ, Россия). Исследования проводились на приборе ¡Cycler («Bio-Rad», США).

Морфологические исследования гепатобиоптатов включали полуколиче-ственную оценку гистологической активности (ИГА) и стадии (степень фиброза) патологического процесса в печени. Для этого использовали стандартизированную систему «METAVIR». В соответствии с этими индексами устанавливали гепатит с минимальной активностью (ИГА 1-3 балла), со слабо выраженной активностью (ИГА 4-8 баллов), с умеренной активностью (ИГА 9-12 баллов) и

с выраженной активностью (ИГА 13-18 баллов), а также степень фиброза (ФО — отсутствие фиброза, Ф1 - слабый (портальный) фиброз, Ф2 - умеренный (с иорто-портальными септами), ФЗ - тяжелый (с порто-центральными септами) и Ф4 - Цирроз) (Knodell R.G. et al., 1981; Desmet V.J. et al., 1994; Poynard T. et al., 1997). На основании морфологического обследования больные с хронической HCV-инфекцией были разделены на группы по стадиям хронического гепатита

- Ф1, Ф2, ФЗ и Ф4.

Характеристика больных сифилисом. Всего было обследовано 165 женщин больных различными формами сифилиса. Возраст больных составил от 16 до 45 лет. Больные с доказанной сифилитической инфекцией (вторичный и ранний скрытый сифилис) распределялись примерно поровну - 14,5% и 18,4%, соответственно. ’ ’

При обследовании пациентов использовались общие рутинные методы фи-зикального, инструментального и лабораторного исследований. Диагноз сифилиса у всех больных был установлен на основе анамнеза, эпидемиологического обследования, данных клинического и лабораторного обследования, а также подтвержден положительными реакциями в стандартных серологических тестах (РСК с кардиолипиновым и трепонемными антигенами, МРП, РПГА (ТРРА), ИФА). Медицинскую помощь получали 114 (63,8%) пациенток в связи с сохранением положительных серологических реакций после ранее перенесенного сифилиса. Помимо клинических проявлений сифилиса у ряда больных была выявлена сопутствующая, в том числе урогенитальная инфекционная патология. Для подтверждения наличия антител к антигенам Treponema pallidum в сыворотке в работе использовали метод иммуноблоттинга. Наборы для имму-ноблотта - recomBlot Treponema IgM и recomBlot Treponema IgG («Microgen», Германия). Данные тест-системы представляют собой линейный вариант имму-ноферментного анализа, предназначенный для подтверждения in vitro в клинико-диагностических лабораториях, наличия антител класса М и G против тре-понемных антигенов в образцах сыворотки крови.

Характеристика больных хроническим трихомониазом. Всего было обследовано 210 мужчин, обратившихся с жалобами на урогенитальные расстройства и подозрением на наличие урогенитальных инфекций (УГИ).

По результатам обследований группу больных с УГИ составили 175 пациентов. Из них у 155 больных диагностировалось хроническое течение инфекций. Диагноз хронического трихомониаза был установлен в группе, состоящей из 48 мужчин в возрасте от 20 до 55 лет. Целью данного этапа исследования являлось выявление взаимосвязи между исходом лечения и состоянием иммунной системы у больных хроническим трихомониазом до лечения. Ретроспективно было выделено две группы пациентов исход заболевания, которых был известен. Контрольную группу составили 18 здоровых мужчин. Изучение количественного состава субпопуляций лимфоцитов в периферической крови больных трихомониазом выполнялось на проточном цитометре Cytomics FC 500 («Beckman Coulter», США) с использованием различных комбинаций прямых моноклональных антител (CD3/CD19, CD3/CD4, CD3/CD8, CD3/CD16+56,

CD3/CD25, CD3/HLA-DR) и изотипических контролен («Beckman Coulter», США).

Больным трихомониазом проводили следующие микробиологические исследования: _

- микроскопию нативного материала из УГТ. Нативный препарат для исследования готовили из клинического материала по методике «раздавленная капля».

- микроскопию фиксированных и окрашенных мазков из УГТ. Окраска препаратов метиленовым синим, является стандартной процедурой диагностики (Приказ № 1570 Минздрав СССР ог 04.12.1986).

- культуральные исследования проводили с использованием питательной среды СВТ (НИИ им. Пастера, Россия).

Определение в сыворотке крови цитокинов: фактора некроза опухолей-а (TNF-а), интерферона-а (IFN-a), интерферона-'/ (IFN-y), интерлейкина-ip (IL-1Р), интерлейкина-2 (IL-2), интерлейкина-4 (IL-4), интерлейкина-6 (IL-6), интерлейкина-8 (1L-8), интерлейкина-10 (IL-10) проводили методом ИФА с использованием отечественных коммерческих тест-систем НПО «Протеиновый контур», Россия.

Степень активности кислородзависимых и кислороднезависимых микро-бицидных систем нейтрофильных лейкоцитов оценивали по НСТ-тесту (Викс-ман М.Е., Маянский А.Н., 1977) и ЛКТ (Пигаревский В.Е., Мазинг Ю.А., 1981). Определение параметров фагоцитарной реакции нейтрофилов крови проводили по методу Н.В. Васильева и соавт. (1972) в модификации В.Г. Морозова и В.Х. Хавинсона (1980).

Определение иммуноглобулинов классов М, G и А в сыворотке крови проводили методом ИФА с использованием коммерческих тест-систем ЗАО «Век-тор-Бест-Балтика», Россия.

Исходные данные подвергали статистической обработке на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ Statistica 8.0 для Windows. Применяли следующие математико-статистические методы: 1) описательная статистика количественных данных в группах; 2) сравнение групп с помощью рангового непараметрического метода U-критерия Манна-Уитни и параметрического t-критерия Стьюдента; 3) корреляционный анализ (коэффициент корреляции - г) двух признаков непараметрическим методом Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика факторов врожденного иммунитета у больных ХГС

При обследовании больных ХГС (группы Ф1, Ф2, ФЗ) отсутствовали вне-печеночные клинические проявления вирусного гепатита, уровень общего билирубина находился в пределах нормы. У 14,6% больных ХГС группы Ф4 были выявлены кожные знаки, геморрагии и желтуха.

Согласно данным гистологического исследования, обследованных пациентов с ХГС группы Ф1 можно рассматривать, как больных хроническим гепати-

том с минимальной или со слабовыраженной степенью активности патологического процесса в печени. Анализ частоты отклонений значений биохимических показателей крови от пределов нормы показал, что у больных ХГС в первой стадии заболевания отмечалось повышение уровня АлАТ (81%), АсАТ (62%), щелочной фосфатазы (ЩФ) (70%), сывороточного железа (80%), увеличение относительного содержания р- (57%) и у-глобулинов (57%). Тимоловая проба превышала нормальные значения в 31% случаев. Снижение относительного содержания альбуминов в группе со слабым фиброзом (Ф1) наблюдалось в 62% случаев.

Изучение цитокинового статуса у больных ХГС со слабым фиброзом (Ф1) не выявило существенных отличий в содержании НЫ-у, 1РЪ1-а и ТЫИ-а в сыворотке крови относительно группы здоровых лиц. В то время как уровни 1Ь-6, 1Ь-10, [Ь-1(] и ¡Ь-4 в сыворотке больных группы Ф1 статистически значимо повышались по сравнению со здоровыми лицами. Среди изученного спектра ци-токинов, у больных группы Ф1 наиболее часто отмечалось повышение концентрации 1Ь-4 (62,6%). Анализ концентрации иммуноглобулинов М, С и А в сыворотке крови больных группы Ф1 показал, что их содержание не выходило за пределы нормы. Наряду с увеличением поглотительной способности нейтрофи-лов, отмечалось повышение активности кислородзависимых и кислороднезави-симых систем бактерицидности, сопровождавшееся снижением переваривающей функции нейтрофильных лейкоцитов.

По результатам гистологического исследования, обследованных пациентов ХГС группы Ф2, также как и группу Ф1, можно рассматривать как больных хроническим гепатитом с минимальной или слабовыраженной степенью активности патологического процесса в печени. Значения биохимических показателей показали, что у больных ХГС в первой и во второй стадии заболевания отмечалось повышение уровня АлАТ (78%), АсАТ (49%), щелочной фосфатазы (63,5%), сывороточного железа (50%), увеличение относительного содержания Р- (33%) и у-глобулинов (50%). Тимоловая проба превышала нормальные значения в 23% случаев. В группе Ф1 и Ф2 наблюдалось снижение относительного содержания альбуминов в 62% случаев.

Изучение цитокинового статуса больных ХГС с умеренным фиброзом печени (Ф2) не выявило существенных изменений концентраций 1Р1ч[-у и №N-0 в сыворотке крови относительно группы здоровых лиц. В то время как уровни 1Ь-1р, 1Ь-4, 1Ь-6, 1Ь-10 и ТОТ-а в сыворотке больных группы Ф2 статистически значимо отличались по сравнению со здоровыми лицами. Среди изученного спектра цитокинов, у пациентов группы Ф2 наиболее часто отмечалось повышение концентраций 1Ь-1р (23,7%), 1Ь-4 (30%) и 1Ь-10 (36,5%). При сравнительном анализе с использованием и-критерия Манна-Уитни у больных группы Ф2 было обнаружено статистически значимое (р<0,01) повышение концентрации ^М по сравнению с контролем. У больных ХГС с умеренным фиброзом (Ф2) было выявлено достоверное повышение поглотительной способности и спонтанной активности систем кислородзависимого метаболизма, а также снижение переваривающей способности нейтрофильных лейкоцитов.

По данным гистологического исследования, обследованных пациентов с ХГС группы ФЗ можно рассматривать как больных хроническим гепатитом С со слабовыраженной степенью активности патологического процесса в печени. У больных ХГС в третьей стадии заболевания, также как и на предшествующих стадиях, отмечалось повышение уровня АлАТ (88,9%), АсАТ (61,1%), щелочной фосфатазы (68,7%), сывороточного железа (50%), увеличение относительного содержания [3- (28,6%) и у-глобулинов (42,9%). Тимоловая проба превышала нормальные значения в 60% случаев. Снижение относительного содержания альбуминов в группе с тяжелым фиброзом (ФЗ) наблюдалось в 21,4% случаев.

Исследования цитокинового статуса у больных ХГС с тяжелым фиброзом печени (ФЗ) не выявили существенных отличий в содержании №N-7, №N-01 и 1Ь-6 в сыворотке крови относительно здоровых лиц. В то время как уровни 1Ь-1(3, 1Ь-4, 1Ь-10 и ТОТ-а в сыворотке больных группы ФЗ статистически значимо повышались по сравнению со здоровыми лицами. Среди изученного спектра цитокинов, у пациентов с тяжелым фиброзом (ФЗ) наиболее часто отмечалось повышение концентраций 1Ь-10 (35,7%), 1Ь-1Р (50%) и 1Ь-4 (57,1%). При сравнительном анализе с использованием и-критерия Манна-Уитни, по сравнению со здоровыми лицами, у больных группы ФЗ было обнаружено статистически значимое (р<0,01) повышение концентрации ^А. Средние значения концентраций 1цО у больных с тяжелым фиброзом также были несколько выше, чем у здоровых, но различие между группами не было статистически значимым (р>0,05). У больных ХГС с тяжелым фиброзом (ФЗ), как и у пациентов других групп, фиксировалось повышение поглотительной способности фагоцитов и индуцированной активности кислородзависимых систем бактерицидное™ нейтрофилов ПК. При этом в целом у больных ХГС, наблюдалось снижение переваривающей способности нейтрофилов.

Гистологическая активность патологического процесса при циррозе печени, также как и в группе ФЗ была несколько выше, чем на начальных стадиях заболевания (Ф1, Ф2). В группах ФЗ и Ф4 встречались больные с умеренной гистологической активностью патологического процесса в печени, в отличие от групп Ф1 и Ф2.

Анализ частоты отклонений значений биохимических показателей от пределов нормы свидетельствовал о том, что у больных с циррозом печени (Ф4) отмечалось повышение уровня АлАТ (88,9%), АсАТ (77,8%), щелочной фосфатазы (57,1%), увеличение относительного содержания р-глобулинов (40%) и у-глобулинов (80%). Тимоловая проба превышала нормальные значения в 100% случаев. В отличие от других групп, у больных с циррозом (Ф4) в 100% случаев было повышено содержание глобулинов. Снижение относительного содержания альбуминов в группе Ф4 наблюдалось в 80% случаев. В свою очередь, концентрация сывороточного железа, в отличие от пациентов других групп, у большинства (66,7%) больных группы Ф4 находилась в пределах нормальных значений.

Изучение цитокинового статуса у больных ХГС с циррозом печени (Ф4) не выявило существенных отличий в содержании 1ПЧ-а, 1Ь-6 и 1Ь-4 в сыворотке крови относительно здоровых лиц. В то время как уровни 1РМ-у, II— 1 р, 1Ь-10, ЮТ-а в сыворотке крови больных группы Ф4 статистически значимо (р<0,01) повышались по сравнению со здоровыми лицами. Среди изученного спектра цитокинов, у больных ХГС с циррозом печени наиболее часто отмечалось повышение концентрации 1Ь-10 (55,6%). Исследование гуморального иммунитета показало, что у больных ХГС с циррозом печени, по сравнению со здоровыми лицами, наблюдается статистически значимое (р<0,001) повышение концентраций иммуноглобулинов основных 3-х классов (^М, ^А, ^в). В результате проведенных исследований было установлено, что у больных ХГС с циррозом печени (Ф4), по сравнению со здоровыми лицами, также как и у пациентов в группах ФЬФЗ, наблюдалось повышение активности ки-слородзависимых систем бактерицидности нейтрофильных лейкоцитов, наряду со снижением переваривающей способности фагоцитов.

Данные сравнительного анализа наиболее значимых исследованных факторов врожденного иммунитета наглядно представлены в диаграммах (рис. 1 и 2).

80

70

60

•5 50 2 с

40 30 20 10 0

Рис. 1. Изменения показателей цитокинов по стадиям ХГС.

В контроль ОФ1 ИФ2 ЯФЗ ЯФ4

Т№-а №N-7 1МР 1Ы0

Hi-

le

14

12

10

ггпв

Рис. 2. Изменения показателей иммунной системы по стадиям ХГС.

Также проводили корреляционный анализ между исследованными иммунологическими показателями и стадиями ХГС. При изучении корреляционных взаимосвязей между степенью фиброза и содержанием №N-7 (табл. 1) отмечена прямая статистически значимая корреляционная связь (г=0,25; р=0,05).

Таблица 1.

Корреляционные взаимосвязи между иммунологическими показателями и степенью фиброза у больных ХГС

Иммунологические показатели Коэффициент корреляции Спирмена (г) Уровень значимости (р) (п=67)

-у (пг/мл) 0,25 0,005*

1Ь-10 (пг/мл) 0,25 0,048*

ТЫР-а (пг/мл) 0,41 0,000**

^А (г/л) 0,26 0,018*

(г/л) 0,24 0,027*

ФЧ (абс.) -0,26 0,016*

Примечание: п - число анализируемых пар признаков; * - корреляция статистически значима (р<0,05); ** - корреляция статистически значима (р<0,001).

Данные сравнительного (рис. 1) и корреляционного (табл. 1) анализов в совокупности свидетельствуют о повышении уровня №N-7 на поздних стадиях фиброза (ФЗ, Ф4). В связи с этим, определение концентрации №N-7 в динамике у конкретного больного может быть использовано с целью контроля прогрессии ХГС.

Аналогичные изменения были выявлены у больных ХГС при анализе содержания 1Ь-10 в сыворотке крови, концентрация которого увеличивалась с ростом степени фиброза (рис. 1, табл. I). Обнаружена достоверная прямая

корреляционная взаимосвязь между содержанием IL-10 и стадией заболевания (г=0,25; р=0,048). Эти данные, а также отклонения от нормы концентрации IL-10 на поздних стадиях заболевания (ФЗ, Ф4) позволяют рекомендовать его в качестве маркера прогрессии ХГС. При корреляционном анализе (табл. 1) была зафиксирована прямая сильная взаимосвязь между фиброзом и уровнем TNF-а (г=0,41; р=0,000). Данные сравнительного анализа концентраций T'NF-a (рис.1) на различных стадиях ХГС, а также обнаруженные корреляционные взаимосвязи, свидетельствуют о повышении уровня TNF-a по мере прогрессирования заболевания. В связи с этим, тестирование в динамике содержания TNF-a в сыворотке крови больных ХГС может быть использовано для оценки прогрессии заболевания. При проведении корреляционного анализа содержания иммуноглобулинов (табл. 1) были установлены прямые умеренные статистически значимые взаимосвязи между стадией заболевания и концентрацией IgA (г=0,26; р=0,018), а также содержанием IgG (г=0,24; р=0,027) у больных ХГС. Корреляционный анализ изменений фагоцитарной системы показал, что ФЧ статистически значимо уменьшалось (г=-0,26; р=0,016) с ростом степени фиброза (табл. 1). В связи с этим, изменение уровня фагоцитарного числа, отражающее поглотительную способность нейтрофилов, может быть использовано в качестве критерия неблагоприятного течения ХГС.

Таким образом, зафиксированы отклонения от нормы уровней TNF-a, ILIO, IFN-y, IgA, IgG и ФЧ и обнаружены корреляционные связи между этими показателями и стадией заболевания. Поэтому изменения содержания вышеназванных факторов в динамике у конкретного больного на любой стадии болезни можно интерпретировать как прогрессирование ХГС (рис. 3).

Рис. 3. Критерии прогноза течения ХГС. Клинико-лабораторная характеристика больных сифилисом Основной задачей исследования состояния иммунной системы у больных сифилисом являлась оценка информативности факторов врожденного иммунитета. Изучение функционального состояния гуморального звена иммунитета связано с оценкой продукции основных классов иммуноглобулинов. Отклонений в концентрациях основных сывороточных иммуноглобулинов ^М, ^А, 1§£} выявлено не было. Определение цитокинового профиля при сифилисе выявило достоверное повышение (р<0,01) уровня №N-7 у больных с диагнозом сероло-

гическая резистентность. Данный показатель может служить критерием развития серологической резистентности (рис. 4).

О контроль

О вторичный сифилис ®ранний скрытый ■ серорезистентность

П--4 ШІМ-у

Рис. 4. Изменения уровней цитокинов у больных сифилисом.

Также было выявлено повышение уровня 1Ь-4 при всех исследованных формах сифилиса (рис. 4). Данное повышение может указывать на преобладание реакций гуморального иммунитета, которые, приводят не к элиминации трепонем, а к длительной персистенции возбудителя в макроорганизме (Максимова М.В., 2007).

Дополнительно с результатами ИБ были сопоставлены результаты изучения иммунологических показателей. Как оказалось, в случае положительных результатов ИБ данные иммунологического обследования совпадали с таковыми при раннем скрытом сифилисе (р>0,05). У пациенток с сомнительными результатами ИБ концентрация сывороточных цитокинов №N-7, 1Ь-1р и 1Ь-2 отличалась достоверным повышением (р<0,05) (табл. 2).

Таблица 2.

Уровень цитокинов у больных с различными результатами исследований в иммуноблоттинге

Показатель П оложительные, п=70 Сомнительные, п=44

1Ь-1р, пкг/мл 14,08±6,35 24,35±7,86*

1Ь 2, пкг/мл 15,13±4,15 22,02±4,73*

1Ь-4, пкг/мл 143,16±47,22 163,38±43,37

1Ь-8, пкг/мл 289,08±51,14 275,14±47,36

ПТМ-у, пкг/мл 332,16±139,93 875,89±56,03*

Примечание: * - достоверное различие (р<0,05).

При раннем скрытом сифилисе и серологической резистентности выявлено достоверное (р<0,05) снижение лейкоцитов в периферической крови по сравнению с группами контроля и больными с вторичным сифилисом (рис. 5).

4-

■

□ контроль

□ вторичный сифилис и ранний скрытый

* серорезисгентность

Лейкоциты

Рис. 5.Содержание лейкоцитов в периферической крови у больных сифилисом.

Увеличение активности нейтрофильного фагоцитоза по сравнению с контрольной группой имело место при всех исследуемых формах сифилиса, что можно связать с активацией фагоцитов в ответ на присутствие в организме инфекционного агента (рис. 6).

Наблюдается изменение функциональной активности фагоцитов, что выражается в снижении их переваривающей способности(р<0,05). Несмотря на то, что интенсивность и активность фагоцитоза соответствует уровню нормальных значений, отмечается снижение показателей индуцированного и повышение спонтанного НСТ-теста и ЛКТ у всех групп больных по сравнению с группой здоровых лиц.

1,8 ..

1,6 Г

1,4 4~

1,2 4-

И 1 4.......

0,8 +0,6 I 0,4 ■

0,2 0

пТ1

:1т

-I-

□ котроль

□ вторичный сифилис В ранний скрытый

* серорезистентность

ЛКТ

НСТ сдан. НСТ инд.

Рис. 6. Изменения функциональной активности фагоцитов при сифилисе. Низкий уровень фагоцитарного числа наблюдается в группе пациенток с серологической резистентностью, тогда как, в группах с вторичным и ранним скрытым сифилисом его уровень не отличался от нормальных значений (рис.

90 80 70 60

,п 3 контроль

я 40 □ вторичный сифилис

30 И ранний скрытый

20 ■серорезистентность

10 0

ФЧ

Рис. 7. Изменение уровня фагоцитарного числа при сифилисе.

Таким образом, наиболее информативным из показателей клеточных факторов неспецифической резистентности явилось фагоцитарное число, а из гуморальных факторов - №N-7,1Ь-1р, 1Ь-2.

Данные иммунологические показатели можно использовать в алгоритме иммунологического обследования при сифилисе (рис. 8).

Клинико-лабораторная и серологическая диагностика сифилиса (скрининг + верификация)

Положительный

результат

(сифилис)

Отрицательный

результат

—. Определение Сифилис ' исключается

№N-7,1ыр, 11,-2, ФЧ Ч _ ,

Выраженных изменений иммунологических показателей не выявлено

1ПМ-уТ. 1ЫРТ, 1Ь-2|. ФЧ і

Вероятность развития ^ Вероятность развития '

серорезистентности серорезистентности

низкая высокая

V V у

...г........J ч при сифилисе.

Освоенности иммунного статуса при хроническом трихомониазе Изучение изменений показателей врожденного иммунитета при хроническом трихомониазе проводилось с целью прогнозирования исхода терапии. По

результатам ретроспективного анализа были выделены две группы пациентов, успешность терапии которых была известна:

1-я группа - 25 человек, у которых после однократной стандартной анти-протозойной терапии наступило полное выздоровление;

2-я группа - 23 человека, у которых после однократной стандартной анти-протозойной терапии полного выздоровления не наступило.

Схемы этиотропного лечения соответствовали требованиям Приказа МЗСР РФ №173 от 28.02.2005 г. «Об утверждении стандарта медицинской помощи больным трихомонозом» и предписаниям инструкций разрешенных к использованию в РФ лекарственных средств.

Исходя из результатов проведенного нами иммунологического исследования мужчин с хроническим трихомониазом, выявлено достоверное повышение ¡РМ-у и 1Ь-1(3, а также снижение относительного количества клеток с фенотипом С019+. У лиц, получавших терапию, были обнаружены разнонаправленные изменения этих показателей. В группе пациентов, у которых 1РЫ-у и 1Ь-1|3 имели тенденцию к повышению, а содержание клеток с фенотипом С019+достоверно имел более низкие значения, наблюдался отрицательный ответ на соответствующую терапию, и проводилось дополнительное лечение. Группа пациентов с достоверным повышением клеток с фенотипом С019+, 1Ь-8 и нормальными показателями 1ПЧ-у и 1Ь-1р характеризовалась положительными результатами терапии. Лечение завершалось в установленные сроки с полным исчезновением клинических проявлений и нормализацией лабораторных показателей. Таким образом, выявлены две возможные тенденции б регуляции иммунного ответа при хроническом трихомониазе, имеющие прогностическое значение. В первом случае иммунный ответ характеризуется преимущественной склонностью к ТЫ-типу, что коррелирует с неблагоприятным прогнозом терапии. Тогда как при благоприятном прогнозе терапии наблюдается развитие иммунного ответа по ТЬ2-типу, связанному с преимущественной стимуляцией гуморальных факторов иммунной защиты (рис. 9).

Рис. 9. Влияние цитокинов на эффективность лечения хронического три-хомониаза.

выводы

1. Все стадии ХГС (Ф1-Ф4) характеризуются достоверным увеличением уровней 1Ь-10,1Ь-1 р, ТЫР-а, спонтанного НСТ-теста и фагоцитарного числа по сравнению со здоровыми лицами. Характерными чертами для пациентов со слабой, умеренной и тяжелой формой фиброза являются повышенные уровни 1Р-4, поглотительной способности нейтрофилов и пониженная переваривающая функция фагоцитирующих клеток. Для больных с циррозом печени характерно повышение №N-7 и снижение ФЧ до «нормальных» значений.

2. Выявленные взаимосвязи между изменениями уровней 1Ь-10, Т№-

а, 1РЫ-у, ^А, 1§0, ФЧ и степенью выраженности фиброза печени, позволяют использовать их в качестве критериев неблагоприятного прогноза течения ХГС.

3. Особенностью скрытого течения сифилиса и состояния серорези-стентности является более низкое содержание лейкоцитов периферической крови. Критерием прогноза развития серорезистентности служит снижение поглотительной способности нейтрофилов и повышение уровня 1РЫ-у, 1Ь-1Р, 1Ь-2 в сыворотке крови, свидетельствующее о развитии иммунного ответа по ТЫ-типу.

4. У пациентов с хроническим трихомониазом, наиболее информативными явились изменения уровней 1РЫ-у, 1Ь-1р, 1Ь-8, а также содержания клеток с фенотипом С019+.

5. В группе пациентов, у которых №N-7 и 1Ь-1р имели тенденцию к повышению, а относительное количество клеток с фенотипом С019+, достоверно снижались, наблюдался отрицательный эффект проводимой терапии. Увеличение концентрации №N-7 и 1Ь-1р свидетельствовало о преобладании ТЫ- типа иммунного ответа на фоне хронической инфекции. Такие пациенты нуждались в дополнительном лечении.

6. Группа пациентов с достоверным повышением содержания клеток с фенотипом С019+, 1Ь-8 и нормальными показателями №N-7 и 1Ь-1р характеризовалась благоприятным прогнозом терапии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для прогнозирования возрастания выраженности фиброза при ХГС у конкретного больного в динамике рекомендуется определять содержание в сыворотке крови цитокинов 1Ь-10, ГРМ-у, ТЬ'Р-н, концентрации иммуноглобулинов классов А, в и поглотительную способность нейтрофилов. Повышение содержания в сыворотке крови цитокинов 1Ь-10, №N-7, ТОТ-а, концентрации иммуноглобулинов классов А, в и снижение ФЧ указывает на прогрессирование заболевания.

2. Для прогнозирования развития серологической резистентности после лечения сифилиса рекомендуется определять уровень 1РМ-у, 1Ь-1р, 1Ь-2 в сыворотке крови и фагоцитарное число. При повышенной концентрации №N-7, 1Ь-1р, IЬ-2 и пониженным значением ФЧ у. больных сифилисом возрастает риск

развития серорезистентности. Необходимо динамическое наблюдение с целью оценки серонегативации и своевременной коррекции лечения.

3. Для прогнозирования эффективности этиотропного лечения больных с хроническим трихомониазом рекомендуется определять содержание в сыворотке крови IFN-y, IL-lß, IL-8 и клеток с фенотипом CD19+.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Протасов О.В. Значение анализа генетических полиморфизмов факторов иммунитета в профилактике и диагностике инфекционных заболеваний / О.В. Протасов, М.В. Сердюцкая, А.М. Иванов, Т.А. Камилова, А.Б. Криворучко, A.B. Апчел // Вести. Рос. Воен.-мед. акад. - 2009. - прил. №1 (25), часть I. -С. 246 (365).

2. Криворучко А.Б.Совершенствование процедуры контроля качества культуральной диагностики урогенитального микоплазмоза / А.Б. Криворучко,

А.М. Иванов, Н.В. Раздольская, О.В. Протасов // Вестн. Рос. Воен.-мед. акад. -

2008. - прил. №1 (25), часть II. - С. 377 (976).

3. Иванов А.М. Полиморфизм рецепторов врожденного иммунитета / А.М. Иванов, А.В. Апчел, Т.А. Камилова, М.В. Сердюцкая, О.В. Протасов, М.Г. Вершинина // Вестн. Рос. Воен.-мед. акад.- 2009. — N1 (25). - С. 172-184.

4. Сердюцкая М.В. Клинико-лабораторные и серологические особенности сифилиса у беременных / М.В. Сердюцкая, A.B. Самцов, А.М. Иванов, Д.В. Заславский, Е.В. Ходосевич, В.Н. Вербов, О.В. Протасов // Дальневосточный вестник дерматологии, дерматокосметологии и сексопатологии. - №2 (5). -

2009.-С. 18-22.

5. Протасов О.В. Иммунологические особенности хронического три-хомониаза у мужчин / О.В. Протасов, A.B. Апчел // Студенческая наука - 2009: материалы научной конференции студентов. - Издание СПбГПМА. - 2009. - С. 33.

6. Арсентьева H.A. Изменение уровня цитокинов в зависимости от стадии заболевания у больных хроническим гепатитом С (ХГС) / H.A. Арсентьева, О.В. Протасов // Медицинский Академический журнал. - 2010. -№5 (10). - С. 133.

7. Протасов О.В. Эффективность применения иммуномодулятора ликопида в комплексной терапии хронического трихомониаза / О.В. Протасов // Медицинский Академический журнал. - 2010. - №5 (10). - С. 147148.

8. Цыган В.Н. Генетический полиморфизм цитокинов / В.Н. Цыган, А.М. Иванов, Т.А. Камилова, В.Ю. Никитин, О.В. Протасов, С.А. Ар-тюшков // Вестн. Рос. Воен.-мед. акад. - 2010. - №2 (30). - С. 211-219.

9. Иванов А.М. Иммунологическая эффективность нммуномоду-лятора Ликопида в комплексной терапии трихомониаза / А.М. Иванов,

В.Ю. Никитин, А.В. Болехан, М.Е. Мешкова, О.В. Протасов // Российский аллергологический журнал. - 2010. - Вып.1, №5. - С. 126-127.

10. Сухина И.А. Спектр цитокинов в сыворотке крови больных хроническим гепатитом С на различных стадиях заболевания / И.А. Сухина, В.Ю. Никитин, А.В. Болехан, Е.А. Малахова, О.В. Протасов // Актуальные проблемы трансфузиологии: материалы Российской научно-практической конференции -СПб., 2011.-С. 105-107.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АлАТ — аланинаминотрансфераза

АсАТ - аспартатаминотрансфераза

ВГС - вирус гепатитй С

ИБ - иммуноблот

ИФА - иммуноферментный анализ

JIKT — лизосомально-катионный тест

НСТ спон. - спонтанный НСТ-тест

НСТ инд. - индуцированный НСТ-тест

ПК - периферическая кровь

ПЦР — полимеразная цепная реакция

ФЧ - фагоцитарное число

ХГ - хронический гепатит

ХГС - хронический гепатит С

HCV - вирус гепатита С

IFN - интерферон

IL - интерлейкин

Th 1 - Т-хелперы 1 типа

Th2 - Т-хелперы 2 типа

ТРРА - реакция пассивной агглютинации частиц (Treponema pallidum particle agglutination test)

TNF-a - фактор некроза опухоли-a

Подписано в печать25.01.12 Формат 60x84/16

Объем 1 пл. Тираж 100 экз. Заказ № 76

Типография ВМА,

194044, СПб., ул. Академика Лебедева, 6.