Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Индуцированный ренальный апоптоз и его регуляция при повреждении почки

На правах рукописи

БЕЛОУС Юрий Александрович

ИНДУЦИРОВАННЫЙ РЕНАЛЬНШ АПОПТОЗ И ЕГО РЕГУЛЯЦИЯ ПРИ ПОВРЕЖДЕНИИ ПОЧКИ

14.03.03- патологическая физиология

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва - 2010

3 I МАР 2011

4841707

Работа выполнена в Российском Университете Дружбы народов и Луганском государственном медицинском университете

Научные консультанты:

Заслуженный деятель науки России доктор медицинских наук, профессор Галина Александровна Дроздова

Заслуженный деятель науки и техники Украины, доктор медицинских наук, профессор

Ирина Александровна Комаревцева

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор профессор кафедры патофизиологии 1-го Московского медицинского университета им. И.М. Сеченова

доктор медицинских наук, профессор профессор кафедры обшей патологии и патологической физиологии РУДН

доктор медицинских наук, профессор ведущий научный сотрудник лаборатории общей патологии НИИ педиатрии ГУ НЦЗД РАМН

Воинов Владимир Антипович

Олег Алексеевич Шевелев

Алла Георгиевна Кучеренко

Ведущая организация: Российский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова

Защита состоится

" £ "&-А

2011 г, в/у часов на заседании

диссертационного совета ¿f212.203.06 в Российском Университете Дружбы народов (г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского Университета Дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6.

Автореферат диссертации разослан " 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 212.203.06 доктор медицинских наук,

профессор Г.А. Дроздова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Несмотря на многочисленные исследования в областях патофизиологии и биохимии в последние годы, однако, полностью еще не выяснены индукторы активации апоптоза и компоненты его сигнальных механизмов. Биохимические механизмы регуляции апоптоза очень сложны и, как показали исследования последних лет, практически не изменились в процессе эволюции, что дает основание судить о фундаментальной биологической роли апоптоза [Kim Y.S., 2009].

Можно выделить два направления в изучении апоптоза. С одной стороны, исследуются существующие сигнальные и рецепторные пути, регулирующие апоптоз. Эти данные можно использовать, применяя эндогенные медиаторы. С другой стороны, ведется поиск веществ, способных направленно воздействовать на процессы апоптоза, подавляя или активируя его. Главной задачей исследователей, изучающих апоптоз, является установление путей возможной регуляции активности апоптоза, т.е. не просто факторов его индукции или угнетения, а именно поиск -модуляторов апоптоза.

Механизмы развития апоптоза, его индукторы и супрессоры изучаются на экспериментальных моделях. Одной из классических экспериментальных моделей апоптоза в почечной ткани является - острая почечная недостаточность (ОПН).

Острая почечная недостаточность проявляется сложным симптомокомплексом патофизиологических изменений в почках. Одним из них является апоптоз [Sanz A.B., et al., 2008]. В связи с изучением апоптоза возникла необходимость пересмотра ряда концептуальных основ в патофизиологии почечных патологий.

ОПН приводит к ишемии/гипоксии в органах и клетках, которая, в свою очередь, вызывает апоптоз через изменения в митохондриях, вследствие образования свободных радикалов, изменения транслокации ионов кальция, изменения проницаемости митохондриальной мембраны и выделения апоптогенных факторов, таких как цитохром с и белков семейства Bcl-2 [Hutchens М.Р., et al., 2008]. Имеются данные о вовлечении опиоидных рецепторов в протекторные механизмы ишемия/реперфузионного синдрома, так называемый феномен «ишемического прекондиционирования» [Комаревцева И.А., 2004; Tegeder I., Geisslinger G., 2004]. Вместо прежних представлений о гибели клеток многоклеточного организма как отрицательном по значимости явлении, сформировался новый взгляд, согласно которому гибель части клеток в пределах организма является закономерным и необходимым процессом и само существование многоклеточного организма подразумевает баланс жизни и смерти на уровне составляющих его клеточных популяций [Chen Н., et al., 2008].

При острой почечной недостаточности (ОПН) ишемического, токсического или обструктивного генеза апоптоз развивается в клетках

канальцев. В этих случаях имеет место и некроз клетки, и еще неизвестно, какой из этих двух инициированных механизмов гибели клеток является ведущим. При различных фазах ОПН скорость апоптоза неравномерна: он может персистировать, или замедляться. Апоптоз при ОПН также может развиваться как адекватный ответ на повреждение. В этих случаях это рассматривается как физиологический баланс контроля и сдерживания преувеличенной компенсаторной пролиферации [5пс1ш М.В., е1 а1., 2008].

При острой почечной недостаточности изменяется экспрессия и внеклеточных, и внутриклеточных факторов регуляции апоптоза |Ъака У., е1 а!., 2009].

Актуальность проблемы заключается в возможности коррекции этого процесса при различных заболеваниях, в том числе почечных.

Идентификация морфологических и биохимических маркеров апоптоза должна в перспективе способствовать более глубокому пониманию механизмов патогенеза заболеваний, улучшению дифференциальной диагностики и созданию принципиально новых направлений терапии.

Основной целью нашего исследования стало изучение лигандов опиатных рецепторов, как возможных модуляторов уровня апоптоза в почках на модели острой почечной недостаточности. Кроме этого, нас интересовал сигнальный путь, через который мог бы реализовываться проапоптотический и антиапоптотический эффекты опиоидов.

Цель исследования: установить уровень апоптоза и роль его модуляторов в развитии экспериментальной модели повреждения почки -острой почечной недостаточности.

Задачи исследования

1. Разработать модели стимулированного ренального апоптоза в условиях экспериментальной острой почечной недостаточности (ОПН) (преренальной-гемодинамической; ренальной-паренхиматозной) с биохимической верификацией патологического процесса.

2. Изучить степень развития апоптотических процессов количественно по ДНК-фрагментации в сопоставлении с морфологической детекцией при использованием ядерного красителя Хехст в почечной ткани в условиях развития экспериментальной ОПН.

3. Выяснить наличие экспрессии индуцибельной синтазы оксида азота по содержанию стабильных метаболитов оксида азота - нитрит- и нитрат-анионам в клетках почек при различных моделях ОПН.

4. Изучить активность сфингомиелинового метаболического пути в почках в сигналпередающих системах апоптоза при экспериментальных моделях ОПН.

5. Изучить 'Н-протонные механизмы клеточного объема по данным ЯМР-релаксации тканевой воды в почках в условиях ОПН и под действием модуляторов апоптоза.

6. Выявить биохимические механизмы модуляции апоптотических процессов в почках синтетическим лей-энкефалином - даларгином - при различных моделях ОПН.

7. Установить роль опиоидных рецепторов в регуляции К+атф - каналов митохондрий в почках в условиях стимулированного апоптоза.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Активация опиатных рецепторов вызывает различные эффекты на уровень апоптоза в почках: в физиологических условиях у интактных животных -проапоптозный и антиапоптозный в условиях стимулированного апоптоза на экспериментальной модели ОПН.

2. Проапоптозный эффект опиоидов (даларгина) реализуется через ц-опиатные рецепторы и является КО-независимым, тогда как антиапоптозное действие опиоидов в условиях стимулированного апоптоза при ОПН является МО-зависимым процессом запускаемом через ор опиатные рецепторы с участием АТФ-чувствительных митохондриальных К+-каналов.

3. Модуляторами опиатно-рецепторного сигнального пути апоптоза при экспериментальной ОПН является ангиотензиновая и простаноидная системы, сфингимиелин-сфингозиновый каскад и оксид азота, триггерным механизмом апоптоза которых, является перераспределение внутри- и внеклеточной фракции тканевой воды в почках.

Научная повизпа работы

Разработан метод для анализа состояния системы оксида азота в тканях и биологических жидкостях по его конечным метаболитам — нитрит- и нитрат-анионам. Установлена активация метаболического пути сфингомиелина в клетках почек при экспериментальной ОПН. Выявлена роль оксидантного стресса в стимуляции апоптотических процессов в клетках почек в разных моделях ОПН.

Впервые обнаружена модуляционная способность даларгина, налоксона, каптоприла, нитроаминогуанидина, индометацина на программу клеточной гибели. Раскрыт антиапоптотический механизм действия даларгина через активацию К+АТФ-каналов митохондрий и активацию N0-синтазы в условиях развития ОПН.

Впервые получены ЯМР-характеристики почечной ткани в условиях стимулированного апоптоза и при модуляции программы клеточной гибели различивши препаратами.

Практическая значимость работы

Вклад бифункционального характера действия оксида азота, развития оксидантного стресса и активации метаболитов сфингомиелина в стимулировании апоптотических процессов при экспериментальной ОПН позволит углубить знания о данном явлении на молекулярном уровне, установить роль программированной клеточной гибели в патогенезе почечной патологии. Модуляционные эффекты исследованных препаратов на процессы апоптоза могут быть полезными при фармакологических исследованиях, связанных с использованием препаратов в

экспериментальной и клинической практике.

Изучение показателей ЯМР-релаксации протонов тканевой воды при различных моделях ОПН с позиции апоптоза, с одной стороны, позволит раскрыть 'Н-протонные механизмы клеточного объема, а с другой, подведет патогенетическую базу под диагностику степени апоптоза методом ЯМР-релаксометрии.

Понимание роли оксида азота в сигналпередаюших системах апоптоза раскроет пути его фармакологической коррекции донаторами или блокаторами эндогенного оксида азота в клинической практике.

Апробация материалов диссертации

Результаты исследований, вошедшие в диссертацию, были доложены на Международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (г.Москва, 2004г.), 15-й Европейской конференции молодых ученых (ФРГ, г. Берлин, 2004 г.), 5-ом Межнародном конгрессе студентов-медиков (Польша, г. Катовицы, 2000 г.), 4-ом Межнародном конгрессе студентов-медиков (Польша, г. Катовицы, 1998 г.), IX Конгрессе международного общества украинских врачей (Чикаго, 2002).

Внедрение результатов исследования в практику

Внедрение полученных результатов в практику осуществляется следующими путями:

Материалы диссертации опубликованы в печатных работах, докладывались на съездах, научных и научно-практических конференциях.

Результаты работы используются в учебном процессе при обучении докторантов, аспирантов и научных сотрудников методам биохимического анализа тканей и клеточных культур.

Характеристика ряда широко используемых лекарственных препаратов в плане влияния на процессы апоптоза (как индукторы, так и супрессоры) может иметь нацеленность на выход полученных данных в клиническую практику.

ЯМР-параметры ткани в динамике введения препаратов-антиоксидантов могут рассматриваться как положительный тест при оценке стабилизации гомеостаза в клетках почек.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 29 научных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов, списка литературы. Изложена на 308 страницах, содержит 85 таблиц, иллюстрирована 11 рисунками. Список литературы включает 523 наименования.

Личный вклад соискателя.

Диссертационная работа является самостоятельным научным исследованием. Автором проведен патентно-информационный поиск, сделан обзор литературы с обоснованием актуальности темы и необходимости этого научно-практического исследования, отработаны методы исследования. Самостоятельно проведены экспериментальные и лабораторные исследования уровня апоптоза, его индукторов, супрессоров, показателей ЯМР-релаксации. Автор самостоятельно проанализировал полученные результаты, провел статистический анализ и интерпретацию полученных результатов, написал все разделы диссертации и сделал выводы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В экспериментальной части работы были использованы белые крысы-самцы 16-18-ти недельного возраста, масса животных составляла ш=250±50 мг. Животных содержали в стандартных условиях вивария. В экспериментах было использовано 2618 животных.

Острую почечную недостаточность (ОПН) формировали двумя моделями. 1 модель - по типу ишемия/реперфузия - за счет пережатия почечной ножки в течение 30 минут. Операцию проводили под тиопенталовым наркозом в дозе 10 мг/мл, в стерильных условиях. У контрольных животных проводили двухсторонние надрезы кожи и мышц в области спины. 11 модель - «глицерольная» - путем двухстороннего внутримышечного введения 50% раствора глицерола из расчета 10 мл на 1кг

веса животного. Контрольным животным вводили соответствующий объем физиологического раствора.

Животных наблюдали в ранний период развития ОПН через 1 час после реперфузии (контроль-2) и в течение 1-х, 2-х, 3-х суток (ОПН-1,ОПН-2, ОПН-3). Забой животных проводили методом декапитации под легким эфирным наркозом.

Введение модуляторов апоптоза проводили по следующей схеме. Даларгин (синтетический лей-энкефалин D-Ala 2 ,Lue \Arg 6 - энкефалин) вводили внутрибрюшинно в дозе 100 мкг/кг массы животного за 20 минут до операции (до инъекции глицерола) и в течение 1-х, 2-х, 3-х суток развития ОПН, одноразово. Интактным животным даларгин и остальные препараты вводили аналогично в течение 1-х, 2-х, 3-х суток, одноразово. Инъекцию налоксона в дозе 0,5 мг/кг вводили внутрибрюшинно за 20 минут до формирования ОПН (до введения глицерола) и в течение периода наблюдения, одноразово. Ингибитор iNOS (индуцибельной синтазы оксида азота) - аминогуанидин нитрат животным вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг. Инъекцию ингибитора осуществляли за 20 минут до развития ОПН и в течение первых трех суток ОПН, одноразово. Блокирование ангиотензин-превращающего фермента на фоне развития ОПН осуществляли путем предварительного введения каптоприла в дозе 1,3 мг/кг. Препарат вводили внутрибрюшинно в течение 1-х, 2-х, 3-х суток, одноразово. Для блокады циклооксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты использовали индометацин в дозе 5 мг/кг, который предварительно растворяли в спиртовом растворе. Селективное ингибирование Катф - каналов вызывали инъекцией глибенкламида в дозе 0,3 мг/кг.

При параллельном введении модуляторов апоптоза препарат №1 вводили за 40 минут до формирования ОПН, а препарат №2 - за 20 минут. В течение 1-х, 2-х и 3-х суток развития ОПН инъекция препарата №2 проводилась через 20 минут после введения препарата №1, одноразово. Интактным животным вводили препараты по аналогичной схеме.

Морфологические исследования ткани почек проводили общепризнанными гистологическими методами. Почки крыс фиксировали в растворе формальдегида, заливали в парафин, готовили срезы и проводили окраску при помощи гематоксилина-эозина.

Для подтверждения развития острой почечной недостаточности у крыс определяли уровень клубочковой фильтрации по клиренсу креатинина, уровень мочевины в сыворотке крови и активность гамма-глутамилтранспептидазы в плазме крови.

Морфологическую детекцию апоптоза проводили с использованием ядерного флюоресцентного красителя Хехст. Эксперимент был проведен в научной лаборатории Института физиологии им. A.A. Богомольца.

Для определения фрагментированной ДНК нами был использован удобный, достаточно чувствительный и дешевый метод спектрофотометрического определения фрагментированной ДНК в нашей

модификации. Метод основан на цветной реакции накопленных в клетках почек низкомолекулярных фрагментов ДНК, экстрагированных в раствор с низкой ионной силой, с дифениламиновым реагентом. Суть модификации заключалась в том, что из пробы предварительно удалялись некротические обломки ДНК. После проведения цветной реакции ДНК с дифениламином измеряли оптическую плотность проб при X = 570 нм. Количество фрагментированной ДНК (ф-ДНК) рассчитывали в процентах как отношение количества экстрагированной ДНК к общему количеству ДНК в пробе по формуле.

Содержание оксида азота определяли по его стабильным метаболитам нитрит- и нитрат-анионам с использованием реактива Грисса. Для проведения данного анализа нами была разработана методика, которая позволяет определять нитрит- и нитрат-анионы в одной пробе. Поскольку реакция диазотирования является специфической только для нитритов, то для определения нитратов необходимо их предварительное восстановление. В качестве восстановителя нами была использована цинковая пыль. В результате диазотирования в пробах развивалась окраска. Спектрофотометрирование проводили при к = 540 нм. Содержание нитрит- и нитрат-анионов рассчитывали по специальной формуле.

Выделение сфингомиелина из ткани проводилось нами поэтапно. На первом этапе извлекали общую липидную фракцию из почечной ткани по методу Фолча. На втором этапе выделяли фракцию фосфолипидов из общей липидной фракции по методу Васьковского. Содержание сфингомиелина определяли в элюатах проб после разделения фракции общих фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии на стандартных пластинках «Silufol» в системе растворителей хлороформ : метанол : вода (65:30:5). Фракцию сфингомиелина с пластинок элюировали смесью растворителей хлороформ : метанол (2:1). Количество сфингомиелина определяли по методу Чена. Пробу сфингомиелина сжигали до неорганического фосфата, затем проводили цветную реакцию с хромогенным реагентом. Оптическую плотность окрашенных проб измеряли при А= 700 нм. Содержание неорганического фосфата определяли по калибровочной кривой стандартного раствора КН2РО4.

Дтя выделения свободного сфингозина нами был использован метод, основанный на экстракции сфингоидных оснований диэтиловым эфиром, в нашей модификации. Модификация заключалась в отсутствии этапа гидролиза сфингомиелинов. Количественно пул свободного сфингозина определяли по методу Lauter - Trams, основанного на образовании окрашенного комплекса сфингозина и метилоранжа. Пробы спектрофотометрировали при к= 415 нм. Количество свободного сфингозина определяли по калибровочной кривой стандартного раствора сфингозина (Amersham).

Активность гамма-глутамилтранспептидазы в сыворотке крови крыс определяли с использованием специального набора. Данный фермент

катализирует реакцию переноса L-у-глутаминового остатка с хромогенного субстрата на глицил-глицин. При этом высвобождается п-нитроанилин, оптическую плотность которого измеряют фотометрически. Активность фермента определяли методом постоянного времени.

Исследования изменения клеточного объема в почках проводили методом ЯМР-релаксометрии на ядрах FT, in vitro (ЯМР-релаксометр фирмы «Bruker»). Почки на льду измельчали на тонкие срезы, затем их осушали. Почки взвешивали на электронных весах «Sartorius» (ФРГ) и для ЯМР-исследований были взяты одинаковые навески, масса которых составила 750+5 мг. Стеклянную пробирку (диаметр 10 мм) с тканью помещали в ячейку ЯМР-релаксометра для измерения релаксации протонов тканевой воды.

Т1 определялся по методу «inversion-recovery», используя 180°-Т- 90° - пульсовую последовательность по 40 точкам, а Т2 - по методу CPMG. После определения Т1 и Т2, показатели раскладывали на биэкспоненты, при наличии двухкомпонентных кривых, и рассчитывали Ра и Рв, характеризующие внутриклеточный и внеклеточный объем тканевой воды, соответственно. Эти данные, как и определение Т1 и Т2, обрабатывались автоматически персональным компьютером «Minispec» с помощью серийного интерфейса RS и 232С по программным пакетам фирмы «Bruker».

Таким образом, нами были использованы методики, позволяющие выявить биохимические изменения в ткани почек, плазме, сыворотке крови, моче в условиях развития почечной патологии и стимуляции

апоптотических процессов. Сочетанный подход морфологической и биохимической детекции апоптоза в почках позволил установить правильность выбранных моделей для изучения биохимических механизмов программы клеточной гибели при данной патологии. Использованные методы позволяют свести ошибку, связанную с подготовкой образца, к уровню погрешности самого измерения. Способы получения ткани, плазмы или сыворотки крови, мочи для биохимического анализа, а также условия обработки и сохранения образцов минимально влияют на результаты анализа и гарантируют его достоверность. Модифицированные методики пригодны для клинико-лабораторных исследований маркеров апоптоза в ткани и биологических жидкостях.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием оригинальной программы Microsoft Excel 97 традиционными методами вариационной статистики. Достоверность различия средних оценивали с использованием t - критерия Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

Детекция апоптоза в клетках почек при экспериментальной ОПН.

В наших исследованиях при разных моделях ОПН были выявлены морфологические признаки развития апоптоза. В срезах почек опытных животных (на 2 и 3-й сутки), окрашенных флюоресцентным красителем

нуклеиновых кислот Хехст 33342, присутствовало значительное количество клеток, подвергнутых апоптозу. Выявлены характерные для разных стадий апоптоза изменения ядер. На первой стадии апоптоза наблюдалась конденсация ядерного хроматина и его расположение по периферии ядра в виде колец, полуколец или серпов. Вторая стадия сопровождалась уменьшением размеров ядер, изменением их формы и фрагментацией. Фазово-контрастная микроскопия показала, что клетки с апоптотическими изменениями ядер часто были уменьшены в размерах и отделены от пласта почечных клеток. В срезах почек контрольных животных отмеченные выше изменения практически не выявлялись.

Нами было установлено, что ранняя фаза развития ОПН сопровождается повышенной фрагментацией ДНК в клетках почек. В экспериментальных группах I модели (ишемия/реперфузия) и II модели («глицерольная») наблюдается повышенное содержание фрагментированной ДНК по сравнению с группой контроля-1. I модель: на 1 сутки - в 3,5 раза, на 2 сутки - в 5,4 раза, на 3 сутки - в 4,4 раза. В группе 60-ти минутной постишемии (контроль-2) также установлено некоторое повышение деградации ДНК, но недостоверное. В группах ОПН II модели нарастание фрагментации ДНК происходило резче, чем в группах I модели. Динамика содержания фрагментированной ДНК в клетках почек имела максимум на 2 -3-й сутки (для 1 и 11 моделей). Следовательно, ранняя фаза развития ОПН сопровождается активацией апоптотических процессов в почках с пиком на 48-72 ч после реперфузии.

Наиболее интенсивно апоптотические процессы протекали у животных II модели, что соответствует максимальному количеству низкомолекулярных фрагментов ДНК, по сравнению с группами 11 модели.

Таким образом, наши биохимические и морфологические исследования подтвердили, что ранняя фаза развития ОПН в ткани почек сопровождается количественными и качественными изменениями, характерными для апоптотической формы клеточной гибели.

Изучение роли оксида азота в развитии апоптоза при различных моделях ОПН.

Апоптоз является сложно регулируемым процессом и количество сигнальных путей, запускающих его, а также эффекторных механизмов запуска и мессенджеров этого процесса очень велико. В почечной патофизиологии важную роль играют такие проапоптотические сигналы, как активные формы кислорода и активные формы оксида азота.

Особая роль в регуляции процессов клеточной смерти принадлежит оксиду азота (N0), который может выступать как фактор выживания или служить сигналом смерти, в зависимости от концентрации и типа клеток.

Параллельно с ростом числа клеточных функций, регулируемых N0, увеличивается и список заболеваний, связанных с нарушением синтеза и /или выделения N0. На сегодня точно не установлено цитотоксический или цитопротекторный эффект проявляет N0 при ОПН.

Нами было установлено, что после развития острой почечной недостаточности в экспериментальных группах 1 модели наблюдалось значительное увеличение концентрации стабильных метаболитов N0;" и Ь'03" в клетках почек по сравнению с группой контроля. При этом динамика изменения N0 оказалась неоднозначной: с увеличением уровня N0 от 1-х суток ко 2-м и некоторым снижением к 3-м суткам. В экспериментальных группах 11 модели ОПН также наблюдалась умеренная генерация N0. Динамика уровня К0Ч была аналогичной: от 1-х суток ко 2-м - плавное увеличение, а к 3-м суткам - плавное снижение показателя. Известно, что при развитии патологических процессов, протекающих на фоне ишемии и гипоксии клеток тканей, усиливается синтез N0, 1Ч02" , ИОз" и, одновременно, повышается активность нитритредукгазной системы, как адаптационные механизмы.

Изменение содержания нитрит- и нитрат-ионов в клетках почечной ткани при ОПН оказалось различным. Концентрация М02" в группах одно-, двух- и трехсуточных животных 1 модели была достоверно снижена по сравнению с контрольной группой, минимум этого показателя наблюдался на 3-й сутки. При «глицерольной» модели содержание нитрит-анионов понижалось, но недостоверно и было ниже базального уровня. Содержание нитрит- и нитрат-анионов в моче и плазме крыс оказалось также повышенным по сравнению с группой контроля. Так, при экспериментальной ОПН увеличение N0* в моче односуточных животных составило 17,2%, двухсуточных - 21,3%, трехсуточных - 25,9%. Мы также проанализировали суммарное содержание стабильных метаболитов оксида азота в безбелковых пробах плазмы. Установлено, что у экспериментальных крыс 1 и 11 моделей оно было достоверно повышенным по сравнению с группой контроля-1.

При сравнении общего содержания Н0Х в плазме крови и моче крыс было выявлено, что уровень >Ю2 ~ в плазме достоверно повышался от 1 к 3-м суткам, а в моче — на первые сутки наблюдалось понижение и только к третьим суткам превышение контрольных значений.

Следовательно, острая почечная недостаточность (ОПН) сопровождается повышенным содержанием оксида азота в клетках почек, моче и плазме. При этом уровень нитритов в ткани недостоверно понижается, а уровень нитратов - достоверно повышается. Данные результаты позволяют предположить, что в начальной фазе ОПН цитотоксический эффект оксида азота может преобладать над цитопротекторным вследствие образования пероксинитрита на фоне развития оксидантного стресса. Была выявлена позитивная корреляционная зависимость между деградацией ДНК и накоплением нитрит- и нитрат-анионов (гху=0,89).

Имеются литературные данные, что ингибирование ¡N05 у крыс перед формированием почечного ишемического повреждения приводит к определенной защите почек. С целью выявления бифункционального действия оксида азота при ОПН мы провели блокаду ¿МОБ-синтазы и

изучили степень деградации ДНК. Наши исследования установили, что фрагментация ДНК может быть предотвращена ингибицией ¡Ы08-синтазы, возможно, вследствие супрессии продукции пероксинитрита.

В экспериментальных группах ОПН 1 и 11 моделей инъекция блокатора ¡N08 количественно понизила уровень фрагментации ДНК в почках по сравнению с группами ОПН, однако, этот показатель не достиг базального уровня. Так, на 1- е сутки наблюдалось понижение деградации ДНК в 1,2 раза (1,3 раза), на 2-е сутки - в 1,3 раза (1,3 раза), на 3-й сутки - в 1,2 раза (1,2 раза) для групп 1 модели (11 модели). Такая динамика позволяет предположить, что ингибиция ¡N05 несколько снижает уровень апоптоза, по-видимому, за счет ослабления токсического действия пероксинитрита, а, следовательно, регуляторная роль оксида азота в условиях ишемии/реперфузии и гипоксии направлена на нормализацию клеточных процессов. Вместе с тем оксид азота, действуя на определенные сигналпередающие системы апоптоза, не в состоянии обеспечить полную многоуровневую защиту от негативных последствий индукции программы клеточной гибели, что подтверждается повышенным содержанием фрагментированной ДНК в клетках почек в условиях ОПН.

Ангиотензин И (АТ 11) играет важную роль в развитии и прогрессировании ОПН. Существует ли зависимость между уровнем АТ 11 и апоптозом в почках? Как в экспериментальных моделях, так и в клинических исследованиях установлено повышение внутрипочечного уровня АТ 11. Источниками АФК и N0 при ОПН являются не только поврежденная митохондриальная цепь переноса электронов, но и повышенная активация ангиотензина 11. Поэтому обсуждать вопрос о регуляции апоптоза в условиях блокады РАС следует с учетом тесного взаимодействия последней со свободнорадикальными процессами в почечной ткани, тем более, что о связи антиоксидантного эффекта данного препарата на почки при ОПН известно мало.

Блокада активности АПФ привела к некоторому снижению деградации ядерной ДНК в клетках почек в двух моделях ОПН. Так, на 1-е сутки после реперфузии фрагментация ДНК уменьшилась в 0,6 раза, на 2-е сутки - в 1,3 раза, на 3-й сутки - в 1,2 раза. В группах И модели показатели были следующими: 1-е сутки - в 1,2 раза, 2-сутки - в 1,4 раза, 3-й сутки - в 1,5 раза в сравнении с группами ОПН.

При анализе показателей системы N0 установлено, что под влиянием каптоприла несколько снизилось накопление и/или образование конечных метаболитов оксида азота. При этом уровень оксида азота сохранялся повышенным, т.е. блокада ангиотензин-преврашающего фермента полностью не ослабила активацию процессов синтеза N0 в клетках почек, подверженных ишемии/гипоксии.

Основным механизмом действия каптоприла на систему N0 у экспериментальных крыс явилась, очевидно, блокада АПФ. По литературным данным ангиотензин 11 осуществляет стимулирующее

действие на образование супероксидных радикалов, которые реагируют с NO, связывая его и образуя мощный оксидант - пероксинитратнуто кислоту. Очевидно, при блокаде АПФ наблюдается понижение образования активных форм кислорода и активных форм азота, что приводит к снижение накопления продуктов метаболизма N0. Предварительное блокирование ¡NOS до инъекции каптоприла не привело к достоверным изменениям содержания суммарных метаболитов N0 в почках по сравнению с группами ОПН + каптоприл как для 1, так и для 11 моделей ОПН. Но если сравнить группы параллельного блокирования и блокады АПФ с группами блокады iNOS , то прослеживается значительное достоверное увеличение уровня N0. Так, в группе контроля-2 (1 модель) прирост N0 составил 28,3% (31,2%), на 1-е сутки - 49,8% (44,5%), на 2-е сутки - 56,1% (55,2%), на 3-й сутки - 51,3% (48,4%) для групп ОПН+каптоприл, (для групп ОПН+бллЬЮЗ+каптоприл). В экспериментальных группах 11 модели аналогичные показатели были следующими: на 1-е сутки - 58,5% (53,3%), на 2-е сутки - 47,3% (51,6%), на 3-й сутки - 44,9% (50,4%) для соответствующих групп.

Очевидно, при блокаде АПФ наблюдается понижение образования активных форм кислорода и активных форм азота, что приводит к снижение накопления продуктов метаболизма N0. А сохраняющаяся гиперпродукция оксида азота может быть связана с накоплением брадикинина. На сегодня вклад брадикинина в эффект ингибиторов АПФ продолжает обсуждаться. Но по накопленным экспериментальным данным можно заключить, что благоприятные антиапоптозные эффекты ингибиторов АПФ, по-видимому, связаны не только с уменьшением активных форм кислорода и ослаблением ОС, но и вследствие повышения уровня брадикинина, влияющего на продукцию N0. Для подтверждения этой гипотезы мы провели серию опытов с интактными крысами. После инъекции каптоприла в клетках почек наблюдалось повышение содержания стабильных метаболитов оксида азота по сравнению с контрольной группой, с группами блокады ¡NOS, которое количественно приближалось к уровню N0 в экспериментальных группах ОПН. При этом наблюдалась активация апоптотических процессов. Так, на 1 сутки значение N0X повысилось на 32,4%, на 2-е сутки - на 36,5%, на 3-й сутки - на 38,4%, по сравнению с контролем. При этом содержание нитритов несколько понизилось. Тенденция к активации NO-системы в почках сохранялась и после предварительной блокады iNOS. Содержание стабильных метаболитов в этих группах соответствовало таковым показателям в группах с блокадой АПФ. Следовательно, блокада АПФ сопровождается у интактных крыс времязависимой активацией других изоформ NOS, которая, возможно, опосредуется через накопление брадикинина.

Следовательно, нами был установлен антиапоптозный эффект каптоприла, который выразился в уменьшении степени деградации ДНК.

Изучение эффектов простаноидов - сегодня считается одним из перспективных направлений, которое поможет понять механизмы регуляции

межклеточных коммуникаций, в том числе и в регуляции апоптотических процессов. Полагают, что поскольку простагландины тормозят апоптоз клеток, то ингибиция их синтеза нестероидными противовоспалительными препаратами (НПВП) может способствовать нормализации жизненного цикла клеток в зоне воспаления и подавлению неконтролируемой пролиферации опухолевых клеток. Особое внимание привлечено к НПВП как регуляторам апоптоза клеток. В условиях развития ОПН было отмечено значительное увеличение фрагментации ДНК на 1-3-и сутки под действием индометацина по сравнению с экспериментальными группами ОПН. Содержание ф-ДНК при параллельном блокировании ¡ЫОЭ и ЦОГ было также повышенным по сравнению с группами ОПН и практически не отличалось от показателей групп с применением индометацина. Следовательно, нами получен проапоптотический эффект индометацина в почках при экспериментальной ОПН. Мы подтвердили, что индометацин, как ингибитор преимущественно ЦОГ-1, реализует свои нефротоксические свойства и через инициирование апоптоза. Инъекция блокатора ЦОГ привела к значительному понижению содержания стабильных метаболитов оксида азота по сравнению с группами ОПН. Так в группе контроля-2 суммарное содержание >ЮХ уменьшилось в 1,5 раза, количество М03" - в 1,6 раза, а N02' не изменилось, по сравнению с группами ОПН. В экспериментальных группах прослеживалась такая же тенденция, уровень М0Х понижался в 1,7 раза на каждые сутки для 1 модели и - в 1,5 раза, соответственно, в группах 11 модели. При этом динамика изменения нитрит-ионов оказалась разной. В группах 1 модели содержание Ж)2" достоверно не изменялось, а в группах 11 модели - статистически значимо уменьшалось от 1 к 3-м суткам в 1,6 раза, в 1,9 раза и в 1,6 раза, соответственно.

Следовательно, блокирование циклооксигеназного пути арахидоновой кислоты на фоне развития ОПН приводит к значительному понижению (но не до базального уровня) содержания конечных метаболитов оксида азота в клетках почек, но при этом уровень N0;" остается неизменным только при ишемическом воздействии. Предварительное введение

нитроаминогуанидина достоверно не изменило содержание метаболитов оксида азота в группах ОПН+ бл. ¡ЫОБ +бл.ЦОГ по сравнению с группами ОПН+бл.ЦОГ, как для 1, так и для 11 моделей. Следовательно, модулирующее действие индометацина реализуется независимо от N0. Можно предположить, что регуляторная система оксида азота и продукты циклооксигеназного метаболического пути обладают синергичностью и взаимодополняемостью.

Именно развитием индометацин-индуцированного апоптоза можно объяснить высокое содержание ф-ДНК в клетках почек интактных крыс. Инъекция индометацина интактным животным в течение трех суток вызывала существенное повышение содержания метаболитов оксида азота по сравнению с контрольной группой. Так, на 1-е сутки уровень №)з" увеличился в 1,3 раза, на 2 и 3-й сутки — в 1,6 раза по сравнению с контролем.

Количество нитрит-ионов повышалось от первых к третьим суткам, ко вторым суткам уровень N02* еще соответствовал базальному, а на третьи сутки превышал его в 1,3 раза. Такое противоположное действие индометацина в норме можно объяснить, прежде всего, его блокадой ЦОГ-1, приводящей к снижению локального синтеза эндогенных структурных (физиологических) простаноидов. Изоформа фермента ЦОГ-1 отвечает за выработку простаноидов, участвующих в регуляции почечного кровотока. По-видимому, подавление активности ЦОГ-1 у интактных крыс вызывает стимуляцию системы оксида азота, как компенсаторный механизм улучшения гемодинамики почек.

Ингибирование ЦОГ может также привести к накоплению предшественника простаноидов - арахидоновой кислоте, которая стимулирует сфингомиелиновый цикл. Нами было установлено участие сфингомиелинового сигнального пути в активации апоптоза при ОПН (см. далее). Таким образом, мы выявили, что циклооксигеназный путь метаболизма арахидоновой кислоты играет значительную роль в регуляции апоптоза в клетках почек, предположительно, за счет воздействия на почечную гемодинамику (через простаноиды и N0) и на сфингомиелиновый сигнальный путь. Эта роль является существенной для поддержания гомеостаза почек в норме и важным моментом в развитии патологических процессов в этом органе.

Таким образом, нами установлено, что острая почечная недостаточность по типу ишемии-гипоксии в ранней фазе сопровождается развитием окислительного стресса, который стимулирует процессы клеточной гибели и способствует патофизиологии почечного повреждения.

Активация сфингомиелинового метаболического пути апоптоза в почках и его модуляция.

Генератором вторичных посредников, участвующих в регуляции апоптоза, является сфингомиелиновый цикл, основные компоненты которого - это сфингомиелин, церамид, сфингозин и ферменты сфингомиелиназа и церамидаза. Механизм этой активации до сих пор не изучен полностью, однако, в настоящее время в литературе появились сведения о зависимости активности основного фермента сфингомиелинового цикла сфингомиелиназы - от уровня окислительных процессов в клетке. Несмотря на несомненную связь апоптоза с окислительными реакциями, сведений о влиянии сфингозина на свободнорадикальные процессы при введении его животным в литературе мы не обнаружили.

Имеются единичные литературные данные, демонстрирующие изменение содержания сфингомиелина, церамида и сфингозина в индукционной фазе ОПН. При этом показано, что ишемия вызывает повышение уровня сфингозина и церамида приблизительно на 50 % и предполагается важное значение их уровня в индукционной фазе и развитии постишемической ОПН.

Достаточно мало изучены механизмы передачи апоптозиндуцируемого сигнала по сфингомиелиновому пути при ишемических повреждениях разных органов, в т.ч. почек.

Для определения наличия или отсутствия взаимосвязи сфингомиелиназной активности с апоптотическими процессами проводили исследования изменения содержания сфингомиелина и сфингозина в почках при экспериментальных моделях ОПН. Установлено, что в почках уже через 30 минут наблюдалось снижение уровня сфингомиелина в 1,4 раза по сравнению с контролем-1. На 1 -е сутки реперфузии содержание сфингозина уменьшилось еще больше - в 1,7 раза, на 2-е сутки - в 2,8 раза, на 3-й сутки -в 2,7 раза. В экспериментальных группах «глицерольной» модели прослеживалась аналогичная тенденция: на 1-е сутки распад сфингомиелина составил 37,3%, на 2-е сутки - 55,3%, на 3-й сутки - 54,8 % по сравнению с контрольной группой. Динамика изменения данного параметра указывает на максимальный гидролиз сфингомиелина на 2-3 сутки развития ОПН. Следовательно, экспериментальная ОПН сопровождается деградацией сфингомиелина в почках и установленная отрицательная корреляционная зависимость между гидролизом сфингомиелина и деградацией ДНК опосредовано указывает на взаимосвязь этих процессов при данных моделях ОПН.

Прослеживалось повышение концентрации сфингозина в почках контрольной группы -2 в 1,8 раза, в группах односуточных животных - в 1,7 раза, в группах двухсуточных животных - в 2,1 раза, в группах трехсуточных животных - в 2,0 раза (1 модель) по сравнению с контролем. В группах 11 модели прослеживалась аналогичная тенденция: на 1 сутки уровень сфингозина увеличился в 1,6 раза, на 2-е сутки - в 1,9 раза и на 3-й сутки - в 1,9 раза. Из полученных результатов следует, что наблюдаемая динамика повышения содержания сфингозина и распада сфингомиелина является противонаправленной и совпадает во времени, т.е. максимум показателя по сфингозину соответствует минимуму показателя по сфингомиелину, что достоверно коррелирует с высоким коэффициентом гху. Поэтому вполне вероятно, что источником накапливаемого сфингозина в клетках почек может быть сфингомиелин. Также была отмечена позитивная корреляционная зависимость между деградацией ДНК и накоплением сфингозина в клетках почек при ОПН. Полученные результаты дают основание предположить, что сфингозин может выполнять функции информационной молекулы в почках на ранней стадии развития ОПН.

Поскольку даларгин, налоксон, нитроаминогуанидин и каптоприл обладают антиоксидантными свойствами, а окислительные реакции играют существенную роль в индукции апоптоза, можно предположить воздействие данных препаратов на метаболизм сфингозина. В наших исследованиях введение даларгина вызывало достоверное снижение содержания сфингозина в почках по сравнению с группами ОПН. Так, на 1-е сутки уменьшилось в 1,3 раза, на 2-е сутки - в 1,3 раза, на 3-й сутки - в 1,4 раза для групп 1 модели. В

группе контроль-2 произошло незначительное понижение в 1,2 раза. В экспериментальных группах 11 модели уменьшение составило 23,5%, 22,8%, 26,4%, соответственно, у одно-, двух- и трехсуточных животных. При параллельном введении антагониста и агониста опиоидных рецепторов изменения содержания СФЗ не происходило, т.е. налоксон полностью устранял нефропротекторный эффект даларгина, что подтверждает участие опиоидных рецепторов в реализации антиапоптозного действия их лигандов.

Очень ярко был выражен цитопротекторный эффект антагониста опиоидных рецепторов по снижению содержания СФЗ в клетках почек по сравнению с группами ОПН. После инъекции налоксона содержание СФЗ понизилось в 1,3 раза на 1-е сутки, в 1,4 раза на 2-е сутки и в 1,4 раза на 3-й сутки в группах 1 модели. Через 1час после ишемии показатель уменьшился в 1,2 раза. В экспериментальных группах 11 модели наблюдалась аналогичная динамика понижения содержания СФЗ - на 21,2%, на 25,9%, на 27,3%.

Следовательно, при стимулированном апоптозе воздействие даларгина и налоксона приводит к снижению апоптотических процессов в почках за счет понижения уровня сфингоидных оснований. Продемонстрированная в этих условиях зависимость сфингозина с N0 указывает на то, что антиоксиданты даларгин и налоксон также понижают токсическое действие сфингозина.

Относительно влияния оксида азота на уровень сфингозина и, наоборот, в литературе существуют весьма противоречивые сведения. Данные наших экспериментов показывают, что блокада индуцированной синтазы оксида азота вызывает резкое накопление СФЗ в клетках почек по сравнению с контрольной группой и умеренное повышение относительно групп ОПН. Так, для групп 1 модели увеличение содержания СФЗ составило 31,6% на первые сутки, на вторые сутки - 25,1% и на третьи сутки - 26,5 % по сравнению с группами ОПН. В контрольной группе -2 количество СФЗ увеличилось на 21,5%. Следовательно, ингибиция iNOS сопряжена со снижением уровня СФЗ и вполне можно говорить об NO-опосредованном действии СФЗ при ишемии/гипоксии.

При помощи селективной блокады активности циклооксигеназы продемонстрировано косвенное участие СФЗ в реализации программы клеточной гибели в условиях развития ОПН. В наших экспериментах было установлено, что инъекция индометацина не влияла на накопление свободного сфингозина в почках экспериментальных животных. Так, содержание СФЗ в почках крыс 1 и 11 моделей достоверно не отличалось от такового показателя в группах ОПН. Блокада циклооксигеназного метаболического пути приводит к ингибированию синтеза простаноидов и сохранению повышенного уровня сфингозина в почках при ОПН. Было установлено, что в условиях развития ОПН циклооксигеназный метаболический путь арахидоновой кислоты косвенно способствует активации апоптотических процессов через накопление сфингозина,

являющегося одним из медиаторов апоптоза сфингомиелинового цикла, но не является NO-опосредованным.

Каптоприл, с выявленными у него антиоксидантными свойствами, понижал повышенный уровень СФЗ в почках крыс при ОПН. На сегодня установлено значительное негативное влияние активации ренин-ангиотензиновой системы на развитие почечных патологий. Так, в экспериментальных группах 1 модели понижение содержания сфингозина на 1-е сутки составило 18,8%, на 2-е сутки - 10,3%, на 3-й сутки - 14,3%, по сравнению с группами ОПН. В группе контроля -2 не наблюдалось достоверных отличий. Для 11 модели уровень СФЗ понизился в 1,2 раза, в 1,2 раза и в 1,3 раза на 1-е, 2-е и 3-й сутки, соответственно. Понижение уровня СФЗ в почках под действием каптоприла достоверно коррелировало с изменением содержания конечных метаболитов оксида азота, активностью СОД и протеолиза. Следовательно, блокада АПФ сопровождается угнетением сфингомиелинового цикла, что связано, в первую очередь, с улучшением окислительно-восстановительных процессов в клетке и понижением цитотоксического действия оксида азота.

Введение модуляторов апоптоза интакгным животным привело к неоднозначному нарушению метаболизма сфингозина в клетках почек.

Следовательно, можно предположить, что блокада опиоидных рецепторов в норме сопровождается менее выраженным накоплением продуктов распада сфингомиелинового цикла, независимо от метаболизма оксида азота.

Действие нитроаминогуанидина, направленное на повышение уровня СФЗ, сопряжено со снижением содержания стабильных метаболитов N0, что отличает данный модулятор апоптоза от даларгина и налоксона. Однонаправленное действие блокаторов активности АПФ и ЦОГ на повышение уровня СФЗ можно связать с активацией изоформ NOS и, как следствие, накоплением конечных продуктов NOx, что приводит к развитию нитрозативного стресса.

Итак, на основании полученных данных, мы можем сделать вывод, что при экспериментальной ОПН распад сфингомиелина сопряжен с увеличением количества сфингоидных оснований в почках. Противоположная динамика содержания сфингомиелина и сфингозина в клетках почек косвенно свидетельствует об активации сфингомиелиназы и непосредственно о накоплении продуктов сфингомиелинового цикла. Если суммировать результаты, полученные при экспериментальной ОПН и в опытах с интактными животными, то зависимость активности сфингомиелинового цикла от накопления продуктов оксида азота представляется весьма вероятной.

Биохимические механизмы модуляции апоптотнческих процессов в почках при активации опиоидных рецепторов при различных моделях ОПН.

Установлено, что эндогенная опиоидная система участвует практически во всех процессах жизнедеятельности организма. Опиатные рецепторы широко представлены на периферии. Они найдены в почках, что подтверждено нашими собственными исследованиями.

Агонисты опиоидных рецепторов могут проявлять прямое действие на процессы свободнорадикального окисления в ткани. Между тем опиатергической модуляции процессов программируемой клеточной гибели в экспериментальной и клинической литературе уделяется незаслуженно мало внимания.

Спектр действия синтетического лей-энкефалина - даларгина -довольно широкий и отражает функции регуляторных пептидов, направленные на поддержание гомеостаза. Препарат обладает гипотензивной, антистрессовой, антиишемической, антигипоксической и др. действиями. Можно предположить, что определенное воздействие, связанное с его антиоксидантными свойствами, даларгин будет оказывать и на апоптоз.

Синтетический лей-энкефалин существенно понижает степень деградации ядерной ДНК в экспериментальных группах животных (ОПН+дал) по сравнению с группами ОПН. Так, в группах I модели в первые сутки содержание ф-ДНК понизилось на 2,2 %, на вторые сутки - на 6,4 % и на 3-й сутки - на 11,9 % . В группах II модели прослеживалась аналогичная тенденция: 1-е сутки - на 2,3%, 2-е сутки - на 14,5 %, 3-й сутки - на 9,5 %. Следовательно, наметилась тенденция к улучшению функционального состояния клеток на 3-й сутки. В контрольной группе- 2 (для 1 модели) достоверных изменений не наблюдалось. При параллельном введении даларгина и налоксона не наблюдалось снижения фрагментации ДНК в группах как I, так и II моделей, содержание ф-ДНК соответствовало таковым показателям в группах ОПН. Т.е. предварительное блокирование ОР налоксоном устраняло антиапоптозный эффект даларгина, что указывает на рецептор-зависимый механизм действия агониста.

Противоположными оказались результаты в группах интактных животных (И-1, И-2, И-3) после введения агониста опиоидных рецепторов. По сравнению с контролем - 1 наблюдалось резкое увеличение степени деградации ДНК в клетках почечной ткани после инъекции даларгина. При длительном введении даларгина от 1 к 3-м суткам - плавное повышение содержания ф-ДНК.

Если сравнивать показатели групп И-1, И-2, И-3 с показателями экспериментальных групп ОПН, то прослеживается повышение значений. Для группы И-1 содержание ф-ДНК увеличилось на 3,9 % (8,3 %), И-2 - на 2,1 % (0,9 %) (недостоверно), И-3 - на 9 % (8,2 %) для I модели (для II модели), соответственно. Предварительная блокада опиоидных рецепторов полностью устраняла проапоптозное действие даларгина в клетках почек интактных крыс, что указывает на ОР-зависимое развитие апоптоза. Такое действие синтетического опиоида можно охарактеризовать как модуляция апоптоза через периферические опиоидные рецепторы.

Таким образом, мы столкнулись, с различными эффектами стимуляции опиатных рецепторов на апоптоз у интактных животных (т.е. в физиологических условиях) и при ишемии/гипоксии. Так как эффекты даларгина реализуются через два типа рецепторов - ар и -ц, мы предположили, что стимуляция апоптоза даларгином в физиологических условиях и его ингибирование при ОПН реализуется через разные опиоидные рецепторы.

Для подтверждения этого предположения мы применили глибенкламид блокатор АТФ-чувствительных К'-каналов, стимуляция которых даларгином осуществляется через 01- опиатные рецепторы.

Глибенкламид блокировал протекторное действие даларгина в группах модели ишемии/реперфузии, что указывает на участие С|-опиатные рецепторов в реализации антиапоптотического механизма через активацию АТФ-чувствительных митохондриальных К*-каналов.

Стимуляция апоптоза даларгином у интактных животных, по-видимому, реализуется через ц-рецепторы, на что указывает отсутствие блокирующего эффекта под действием глибенкламида.

Связан ли антиапоптозный эффект экзогенного опиоида с активацией N0—синтаз? Мы провели исследования влияния даларгина на уровень метаболитов оксида азота. Предварительная стимуляция опиоидных рецепторов даларгином способствовала значительному снижению суммарного уровня К0Х во всех экспериментальных группах ОПН. При этом уменьшение составило: в контроле-2 - 31,7%, на 1-е сутки — 42,5%, на 2-е сутки - 47,3%, на 3-й сутки - 27,3% в сравнении с группой контроля (1 модель). Для экспериментальных групп 11 модели наблюдалось следующее уменьшение концентрации М0Х: на 1 сутки — 22,5%, на 2 сутки - 15,6%, на 3 сутки - 15,3%. Динамика содержания окисленных метаболитов N0 была различной: содержание нитрат-анионов -М03~ под влиянием даларгина уменьшалось, но его значения не превышали таковых в группе контроля, а концентрация нитрит-анионов - N0/ - достоверно увеличивалась и превысила таковые контрольных значений (для 1 модели). Для экспериментальных групп II модели динамика содержания N0}" -ионов имела аналогичную динамику, а для N02* - ионов сохранилась тенденция к увеличению концентрации. Следовательно, выраженный антирадикальный эффект даларгина сопровождался существенным снижением синтеза и/ или освобождения N0. Также установлено противогипоксическое действие даларгина по снижению уровня лактата в почечной ткани крыс.

При параллельном введении крысам налоксона и даларгина наблюдалась отмена эффекта даларгина, что указывает на реализацию его эффектов через ОР. Следовательно, регуляция системы оксида азота в клетках почек возможна при участии опиоидных рецепторов. Предварительная блокада индуцибельной ЫО-синтазы не отразилась на содержании метаболитов оксида азота под действием даларгина, что указывает на его способность стимулировать другие изоформы ЫО-синтазы.

В группах интактных крыс после активации ОР экзогенным опиоидом содержание NOx в почках плавно увеличивалось от 1 к 3-м суткам по сравнению с группой контроля-1. Достоверные изменения наблюдались только на третьи сутки. Предварительное введение налоксона устраняло эффект даларгина, связанный с накоплением N0. Следовательно, повышение продукции оксида азота под действием экзогенного лей-энкефалина опосредовано через активацию ОР только при длительном введении (после трех суток).

Предварительная блокада iNOS-синтазы не отразилась на содержании метаболитов оксида азота под действием даларгина. Полученные результаты можно объяснить тем, что, опиатные рецепторы участвуют в поддержании уровня оксида азота за счет активации конститутивной NOS, которая существенна для обеспечения нормализации гемодинамики в почках. В условиях физиологической нормы сочетанное введение нитроаминогуанидина и даларгина не изменило уровень содержания метаболитов оксида азота в клетках почек интактных крыс.

Можно заключить, что биохимическая активность даларгина в норме сопряжена с запуском программы клеточной гибели предположительно через другие опиоидные рецепторы и не опосредована участием оксида азота, а в условиях стимулированного апопгоза, наоборот, направлена на выживаемость клеток и подавление в них апоптотических процессов через активацию oi-опиатных рецепторов с участием системы оксида азота.

Не менее интересный результат наших исследований, связанный с лигандами ОР, был обнаружен в опытах с введением антагониста ОР -налоксона перед почечным повреждением. Блокада опиоидных рецепторов (ОР) налоксоном привела к значительному снижению деградации ДНК в сравнении с группами ОПН. Так, для I модели в группе контроля-2 не наблюдалось изменений в содержании ф-ДНК, на 1-е сутки понижение составило 20,3%, на 2 -е сутки - 14,8%, на 3-й сутки - 20,8% от таковых показателей в группах ОПН-1,ОПН-2,ОПН-3, соответственно. В группах II модели на 1-е сутки -13,5%, на 2-е сутки - 18,4%, на 3-й сутки - 17,9%. После инъекции налоксона у интактных крыс наблюдалось повышение фрагментации ДНК, но менее, чем при введении даларгина. На первые сутки деградация ДНК повысилась в 2,5 раза, на вторые - 2,4 раза и на третьи - в 2 раза, по сравнению с контролем.

Следовательно, налоксон как антагонист даларгина также способствует понижению деградации ДНК в клетках почек в условиях стимулированного апоптоза, но его антиапоптозное действие выражено несколько слабее по сравнению с экзогенным лей-энкефалином. Есть основания полагать, что налоксон, хотя и относится к антагонистам ОР, но, проявляя свойства частичных агонистов, может оказывать влияние и на регуляцию программы клеточной гибели.

При предварительной блокаде iNOS инъекция налоксона не вызвала проапоптотического эффекта, направленного на повышение фрагментации

ДНК, и недостоверно понижала этот показатель по сравнению с группами ОПН+ налоксон. В экспериментах на интактных крысах было выявлено времязависимое увеличение деградации ДНК при введении блокатора iNOS и антагониста ОР. Повышение деградации ДНК с увеличением низкомолекулярных фрагментов оказалось в 1,5 раза, в 1,7 раза, в 1,7 раза (на 1, 2, 3-й сутки, соответственно) по сравнению с группами И+налоксон. Следовательно, в спектре модуляционной активности налоксона выявлено его разнонаправленное действие при блокаде iNOS на процессы апоптоза при ОПН и в условиях физиологической нормы.

Перечисленные эффекты могут быть обусловлены блокадой или связаны с активацией периферического пострецепторного внутриклеточного механизма. Реализация этих эффектов налоксона, очевидно, будет определяться вводимой дозой, а также различиями в аффинности и плотности распределения разных подтипов ц-ОР. Такой феномен свидетельствует о проявлении налоксоном частичных свойств агонистов.

Неселективная блокада ОР налоксоном отразилась на содержании нитрит- и нитрат-анионов в сторону их понижения по сравнению с группами животных при экспериментальной ОПН. Уровень метаболитов оксида азота при введении налоксона был несколько пониженным по отношению к группам ОПН для двух моделей. Так, произошло понижение суммарного количества N0 на 1 сутки - в 1,3 раза (1,2 раза), на 2 сутки - в 1,4 раза (1,2 раза), на 3 сутки - в 1,3 раза (1,3 раза), соответственно для 1 модели (11 модели).

Предварительная блокада iNOS привела к достоверному понижению содержания оксида азота в клетках почек в сравнении с группами ОПН+налоксон, как для 1, так и для 11 моделей. Следовательно, опиоид-рецепторное действие налоксона также опосредовано действием оксида азота и его можно объяснить способностью проявлять свойства частичных агонистов.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют, что неселективная блокада опиоидных рецепторов, предшествующая развитию ОПН, способствует понижению накопления и/или высвобождения оксида азота в клетках почек, которое носит защитный эффект.

Блокада опиоидных рецепторов у интактных крыс не вызывала достоверных изменений в содержании стабильных метаболитов оксида азота по сравнению с контрольными животными. Согласно литературным данным, блокада опиоидных рецепторов у интактных животных не оказывает никакого действия на состояние гемодинамики. Авторы это связывают с тем, что у интактных особей опиоидные рецепторы не заняты эндогенными лигандами, поэтому инъекция ингибиторов не вызывает у них гемодинамического ответа. Наши данные позволяют дополнить эти сведения и связать их с синтезом оксида азота, вазодилатирующий эффект которого хорошо известен.

Налоксон, при блокаде индуцибельной NOS, не влиял на уровень содержания NOx, но доля нитрит-ионов при этом понижалась по сравнению с группами И+налоксон. Таким образом, сочетанное введение блокатора iNOS и налоксона в норме указывает на реализацию эффектов последним времязависимо и независимо от уровня метаболитов оксида азота в клетках почек.

Следовательно, лишь длительная активация опиатных рецепторов в норме вызывает повышение/накопление метаболитов оксида азота. А блокада ОР не изменяет базальный уровень конечных продуктов оксида азота. Сочетанное введение блокатора iNOS, даларгина и налоксона в норме указывает на реализацию лигандами эффектов независимо от уровня метаболитов оксида азота в клетках почек.

Таким образом, опосредованная модуляция программы клеточной гибели даларгином в выбранных нами моделях направлена на защиту клеток почек от окислительного стресса. Нами установлено, что блокада iNOS не устраняла положительный эффект антиоксиданта, а была более эффективной. Поэтому можно заключить, что одним из сигнальных путей программы клеточной гибели в почках при ишемии/гипоксии является окислительный стресс и детоксикация АФК и АФА антиоксидантами может влиять на раннюю фазу апоптоза. Цитопротекгорный эффект лиганда был N0- опосредованным. Совершенно противоположными оказались результаты действия модуляторов апоптоза в условиях физиологической нормы. Механизм их действия реализовался независимо от уровня оксида азота.

'Н-протонные механизмы клеточного объема и ЯМР-релаксацня в почках под действием модуляторов апоптоза.

Время релаксации (Ti и Т;) является биохимическим показателем изменения объема клетки. Все ЯМР-параметры в различной степени взаимосвязаны и некоторые из них могут играть важную роль в идентификации тканей и диагностике болезней, связанных с нарушением программы клеточной гибели. По мере накопления знаний о ЯМР-свойствах тканей, которые ответственны за время Ti и Ti, возникает реальная перспектива более глубокого изучения влияния модуляторов апоптоза на релаксацию тканевой воды.

Применение модуляторов апоптоза привело к неоднозначным изменениям протонных механизмов клеточного объема в почках. При оценке ЯМР-показателей внутри экспериментальных групп (от 1 к 3-м суткам) прослеживались изменения в ЬГ-протонных механизмах, характерные для каждого препарата. После развития ОПН было зафиксировано увеличение спин-решеточной (Tj) и спин-спиновой (Т2) составляющих времени релаксации в клетках почечной ткани по сравнению с группой контроля.

Динамика изменения показателей Т1 и Т2 между группами ОПН-1,0ПН-2 и ОПН-3 оказалась однозначной: с увеличением от первых к третьим суткам. На продольную (Г,) - релаксацию в тканях оказывают

действие два фактора: содержание всей тканевой воды и способность участков макромолекул связывать воду в гидратный слой. В то же время параметр Тг определяется количеством участков, присоединяющих кристаллизированную воду, и толщиной гидрированного слоя. Удлинение ТУ и Тг- времени релаксации свидетельствует о медленном протонном обмене между свободной и гидрированной фракциями тканевой воды, а также об уплотнении слоя гидратной воды. В моделях ОПН перераспределение тканевой воды в почечной ткани происходило в сторону внутриклеточной, с достоверным повышением на 10,5 %, на 11,1 %, на 11,8% , соответственно в группах одно-, двух- и трехсуточных животных, по сравнению с контролем.

Следовательно, на ранней стадии развития ОПН в клетках почек наблюдается тенденция к набуханию клеток. Накопление Н внутри клетки приводит к увеличению объема и закислению среды. Известно, что на ранних стадиях ишемии/гипоксии в клетках накапливаются интермедиаторы цикла Кребса - лактат, пируват и цитрат, что указывает на активность ЫЛБРН-оксидазы и накопление активных форм кислорода. Анализ корреляционной матрицы выявил наличие достоверно значимых корреляций в почках между ЯМР-показателями и степенью фрагментации ДНК.

Известно, что при ОПН стимуляция апоптотических процессов носит периодический характер и наблюдается несколько пиков апоптоза. Первый пик апоптоза приходится на раннюю фазу ОПН - на 2-3-и сутки, второй пик - на 1-е сутки, третий пик - на 14-е сутки. Для подтверждения предположения о связи ЯМР-параметров с апоптотическими изменениями в клетке была исследована ЯМР-релаксация на 5-й и 7-й день развития ОПН. на 5-е сутки развития ОПН время релаксации Т[ и Тз было пониженным и перераспределение тканевой воды происходило в сторону внеклеточной по сравнению с группами ОПН-2 и ОПН-3 (первый пик апоптоза). Это указывает на уменьшение плотности гидрированного слоя и тенденцию к дегидратации клеток ткани почек. На седьмые сутки развития ОПН установлено повышение времени релаксации Т| и понижение времени релаксации Т; по сравнению с группами ОПН-2 и ОПН-3, что свидетельствует о росте кристаллической фракции воды. При этом доля внутриклеточной воды соответствовала таковому показателю в группах ОПН-2 и ОПН-3, следовательно, на 7-е сутки развития почечной патологии наблюдалось незначительное набухание клеток почек, соответствующее второму пику апоптоза. На 5-е сутки развития ОПН не наблюдалось максимального значения Ра.

Даларгин - синтетический лей-энкефалин - в течение трех суток развития ОПН вызывал достоверное понижение Т] и Т2 по сравнению с группами ОПН и контролем, при этом объем клеток понижался, но его показатель не выходил на базальный уровень. Динамика релаксации свидетельствует о росте кристаллической фракции воды. При этом доля внутриклеточной воды достоверно уменьшается от первых к третьим

суткам, соответственно, на 5,2 %, на 4,2%, на 6,3 % по сравнению с группами ОПН. Отмечена положительная корреляция между Т), Т2, Ра и фрагментацией ДНК.

При введении налоксона также установлено понижение Ть но при этом показатель Т2 достоверно не изменялся по сравнению с группами ОПН. Такое сочетание Т[ и Т2 характерно при накоплении в клетке липидной фракции. Перераспределение тканевой воды происходило в сторону внеклеточной, и также прослеживалась тенденция к снижению набухания клеток. Установлена положительная корреляция Ть Т2 и Ра с деградацией ДНК.

Инъекция каптоприла сопровождалась понижением как показателя Ть так и Т2 по сравнению с группами ОПН. Такая динамика показателей характеризуется быстрым протонным обменом и уменьшением плотности гидрированного слоя воды, что сопровождается дегидратацией ткани. При сравнении времени релаксации между одно-, двух- и трехсуточными группами животных была отмечена противоположная динамика: Т] релаксация повышалась, а Т2 - понижалась. Такое сочетание релаксационных показателей указывает на рост кристаллической фракции воды. Под действием каптоприла перераспределение тканевой воды происходило в сторону внеклеточной, т.е. наметилась тенденция к понижению наводненности клеток почек. Была выявлена положительная корреляционная связь между деградацией ДНК и ЯМР-показателями.

Блокада активности индуцибельной синтазы оксида азота сопровождалась понижением показателей Т| и Т2 по сравнению с группами ОПН, что указывает на быстрый протонный обмен между фракциями воды и уширение гидрированного слоя. Статистически значимо происходило перераспределения тканевой жидкости между внутри- и внеклеточным пространством в сторону последнего. Была также выявлена положительная корреляционная связь между величинами Т(, Т2, Ра и содержанием фрагментированной ДНК в клетках почек.

Следовательно, можно заключить, что даларгин, налоксон, каптоприл и нитроаминогуанидин, обладающие антиапоптотическим действием, изменяют внутриклеточный объем с тенденцией к его уменьшению. При этом показатели Т1 и Т2 для каждого препарата изменялись неоднозначно.

Мы изучили зависимость ЯМР-показателей от содержания стабильных метаболитов оксида азота в клетках почек при экспериментальной ОПН. Корреляционный анализ показал, что существует достоверная зависимость между ЯМР-показателями и содержанием метаболитов N0*. ОПН+дапаргин: Т1 -Шх(гху=0,37), Т2 - N0,(г,у =0,66), Ра -1Ч0Х (гху=0,78). ОПН+налоксон: Т1 - N0, (г ху =0,43), Т2 - N0, (г ху =0,98), Ра - Шх (г ху =0,92). ОПН+каптоприл: Т1 - N0, (г ху =0,90), Т2 - N0, (г ху =0,99), Ра - Шх (г ху =0,77). ОПН+нитроаминогуанидин: Т1 - N0* (г^ =0,96), Т2 - N0* (г ,у =0,84), Ра - N0, (г ху =0,96). По-видимому, в данных условиях объем клетки

опосредовано зависит от активности индуцибельной NOS, возможно, через регуляцию ионных каналов.

В исследованиях на интактных крысах инъекция даларгина сопровождалась понижением показателей времени релаксации Т. и Т2 по сравнению с контрольной группой. Такое сочетание временных параметров указывает на быстрый протонный обмен между фракциями воды и уширение гидрированного слоя. Перераспределение тканевой воды происходило в сторону внеклеточной фракции, т.е. прослеживалось некоторое набухание клеток почек по сравнению с контролем. Так, на 1-е сутки после инъекции даларгина увеличение Ра составило 4,2%, на 2-е сутки - 5,8 %, на 3-й сутки -8,3%, т.е. эффект был времязависимым. Была выявлена достоверная корреляция между ЯМР-параметрами и фрагментацией ДНК. И+даларгин: Tj -N0*0:^=0,77), T2-N0x(rxy=0,98), Ра - NOx (Гху=0,92).

Блокирование активности АПФ привело к некоторому понижению показателя времени релаксации Т| и Тг в клетках почек по сравнению с группой контроля. Такое сочетание времени релаксации указывает на повышение скорости релаксации и уширении слоя гидрированной воды. Каптоприл способствовал перераспределению тканевой воды в сторону внутриклеточной фракции и тем самым способствовал незначительному набуханию почечных клеток. Была выявлена корреляционная зависимость в динамике ЯМР-показателей и фрагментации ДНК И+каптоприл: (г ху =-0,98), Т2 - N0x(rxy=-0,88), Ра - NOx (гху=0,97).

Время релаксации Т]И Tj при введении блокатора индуцибельной NOS имело времязависимую тенденцию к понижению, что характерно для уменьшения плотности гидрированной фракции воды, параметр Ра плавно повышался относительно контрольных значений. И+нитроаминогуанидин: Ti - N0x(rxy=-0,68), Т, - N0x(rxy=0,97), Ра - NOx (rxy=0,88).

Также были установлены корреляционные связи между ЯМР-параметрами и уровнем стабильных метаболитов NOx, которые выявили неоднозначную зависимость для даларгина, каптоприла и нитроаминогуанидина. Так, на фоне введения даларгина динамика изменения ЯМР-характеристик и уровня NOx была сонаправленной. Каптоприл также имел отрицательную корреляционную связь по времени Т, и Т2, а изменение клеточного объема коррелировало положительно с уровнем NOx. Для нитроаминогуанидина корреляционная связь между ЯМР-параметрами и содержанием конечных метаболитов выявилась также положительной. Следовательно, проапоптотическое действие даларгина,

нитроаминогуанидина и каптоприла на почки интактных крыс сопровождается понижением показателей времени релаксации Т| и Т2 и повышением доли внутриклеточной воды Ра относительно контроля, т.е. процессы активации апоптоза сопровождаются некоторым набуханием клеток. Для даларгина и каптоприла эти процессы протекают на фоне повышения метаболитов оксида азота, а для нитроаминогуанидина - при понижении уровня NOx.

Индометацин и глибенкламид оказали иной эффект на ЯМР-показатели почек в условиях данных моделей активации апоптоза. Введение индометацина поддерживало повышенное значение показателей времени релаксации и достоверно не изменяло перераспределение тканевой воды по сравнению с группами ОПН. Сочетание параметров (повышенное) и Т2 (пониженное) указывает, что сигнал исходит от кристаллической фракции воды, т.е. наблюдается ее рост. Следовательно, индометацин поддерживает набухание клеток почек и при этом наблюдается положительная корреляция между ЯМР-показателями и степенью фрагментации ДНК. ОПН+индометацин: Т, - ф-ДНК (г ху = 0,68), Т2 - ф-ДНК(г ху = 0,98), Ра - ф-ДНК(гху = 0,54).

Инъекция глибенкламида сопровождалась понижением величины времени релаксации Т] и Т2, а доля внутриклеточной воды Ра достоверно не изменялась по сравнению с группами ОПН. Также как и с предыдущими модуляторами была установлена положительная корреляция между ЯМР-показателями и фрагментацией ДНК. ОПН+глибенкламид: Т1 - ф-ДНК (г ху = 0,51), Т2 - ф-ДНК(г ху = 0,64), Ра - ф-ДНК (г ху = 0,61). Следовательно, индометацин и глибенкламид достоверно не изменяют клеточный объем, т.е. поддерживают незначительное набухание клеток почечной ткани при ОПН.

Корреляционный анализ, проведенный между ЯМР-параметрами и уровнем конечных метаболитов оксида азота, установил достоверную положительную связь между этими показателями для глибенкламида и отрицательную корреляцию по времени релаксации - для индометацина. ОПН+глибенкламид: ^ - N0, (гху =0,87), Т2 - N0, (гху =0,94), Ра - N0* (гху =0,93), ОПН+индометацин: Т, - Шх (г =-0,78), Т2 - >ЮХ (г ху =-0,35), Ра -Шх (гху=0,82).

Следовательно, для модуляторов с апоптотическим действием изменение уровня Ж)х (в сторону понижения) не оказывает непосредственного влияния на клеточный объем (не наблюдается достоверного изменения) на фоне развития ОПН. Но динамика изменения показателя Ра сонаправлена с изменением N0,.

В клетках почек интактных крыс налоксон и глибенкламид - вызывали понижение показателей ЯМР-релаксации и сохраняли неизменным клеточный объем (Ра) по сравнению с группами контроля. Налоксон укорачивал время релаксации Т] и Т2, что свидетельствует об уплотнении гидрированной фракции воды. Доля внутриклеточной воды при этом достоверно не изменялась. Корреляционный анализ показал позитивную связь между параметрами Т1; Т2 и Ра и содержанием фрагментированной ДНК в клетках почек. Следует отметить, что степень апоптоза после инъекции налоксона была меньше приблизительно в 1,5-2 раза. Видимо, для лигандов ОР характерны разные механизмы запуска суицидальной программы, что отразилось на показателях ЯМР-релаксации. Судя по различному их действию на уровень оксида азота, можно предположить, что изменение клеточного объема связано с регуляторной функцией ЫОх.

Глибенкламид также, как и налоксон достоверно понижал показатели как Ть так и Т2, что свидетельствует об уширении слоя гидратной воды. Доля внутриклеточной воды достоверно не отличалась от такового показателя в контроле. Была рассмотрена корреляционная зависимость между ЯМР-параметрами и фрагментацией ДНК. В группах И+глибенкламид динамика этих параметров была сонаправлена и корреляция была позитивной. Была рассмотрена корреляционная зависимость между ЯМР-параметрами и фрагментацией ДНК. В группах И+глибенкламид динамика этих параметров была сонаправлена и корреляция была позитивной.

Блокада ЦОГ сопровождалась понижением времени релаксации, но при этом внутри групп И+индометацин происходило недостоверное изменение величины Т] в сторону понижения, а величины Т2 - в сторону повышения, что указывает на исходящий сигнал от липидной фракции. Поскольку в экспериментальных группах И+индометацин доля внутриклеточной воды соответствовала базальному уровню, а содержание фрагментированной ДНК повышалось, то наблюдалась отрицательная корреляция.

Мы также проследили зависимость между ЯМР-показателями и уровнем конечных метаболитов оксида азота. Установлено, что введение налоксона и глибенкламида вызывает изменение содержания конечных метаболитов ЫОх не влияет на клеточный объем почек.

Индометацин, вызывая повышение содержания метаболитов N0, в отличие от даларгина, нитроаминогуанидина и каптоприла не вызывал достоверного изменения доли внутриклеточной тканевой воды и, соответственно, изменения клеточного объема почек. Корреляционный анализ между ЯМР-параметрами и К0Х выявил отрицательную зависимость.

Таким образом, проведенные экспериментальные исследования показали, что параметры ядерной магнитной релаксации отражают физико-химические свойства клеток ткани и сообщают важную дополнительную информацию о состоянии гомеостаза при патологических состояниях, в частности, в почках. Изменение ЯМР-параметров под действием модуляторов про- и антиапоптотического действия подтверждает наше предположение об участии Н'-протонных механизмов в регулировании клеточного объема. Более глубокий анализ вклада различных механизмов апоптоза в изменение клеточного объема нуждается в дальнейшем глубоком и всестороннем изучении.

Выводы

1. Триггерные механизмы апоптоза у интактных животных реализуются через ц-опиатные рецепторы, на что указывает отсутствие изменения уровня фрагментированной ДНК под действием глибенкламида, блокирующее действие которого К+-АТФ - каналов реализуется через с^-опиатные рецепторы. При этом проапоптозное действие даларгина является МО-независимым и реализуется через циклооксигеназный путь

метаболизма арахидоновой кислоты, активацию сфингозин-опосредоваиной сигнальной системы, что приводит к дегидратации клетки и активации апоптоза. Блокада АПФ в почках не оказывает влияния на проапоптотический эффект даларгина.

2. Выявленные биохимические и морфологические признаки активации апоптотических процессов и их регуляторов в почках при ишемической и «глицерольной» моделях острой почечной недостаточности носят универсальный патофизиологический характер, т.к. по всем изученным показателям достоверной разницы между экспериментальными моделями ОПН не было установлено. Отмечено увеличение деградации ДНК на 2-3 -и сутки развития ОПН при обеих моделях ОПН.

3. Ингибиторный анализ К'дтф - каналов в почках установил роль митоптоза в сигналпередающих системах апоптоза в моделях ОПН. Блокада К+АТФ - каналов глибенкламидом способствовала повышению деградации ДНК в клетках почек, независимо от уровня оксида азота.

4. Протекторное (антиапоптозное) действие даларгина при ОПН, запускаемое через аропиатные рецепторы с участием АТФ-чувствительных митохондриальных К~-каналов является NO-зависимым и сфингозин-опосредованным и обусловлено угнетением этих систем и клеточной гидратацией, на что указывают результаты показателей стабильных метаболитов оксида азота, сфингомиелина и сфингозина, ЯМР-показатели тканевой воды, данные в экспериментальных группах с применением блокаторов NO-синтазы и глибенкламида.

5. Антиапоптотическое действие даларгина, налоксона, нитроаминогуанидина и каптоприла при ОПН-стимулированном апоптозе направлено на инактивацию метаболитов сфингомиелинового пути. Реализация данного эффекта носит NO-зависимый характер. Тогда как на проапоптотический эффект индометацина в почках при экспериментальной ОПН блокада iNOS не влияла.

6. Циклооксигеназный путь метаболизма арахидоновой кислоты играет протекторную роль в регуляции апоптоза в клетках почек. Индометацин, и у интактных животных, и у животных с экспериментальной ОПН вызывал гибель клеток через апоптоз (повышение содержания фрагментированной ДНК и накопление сфингозина), что указывает на защитный эффект простагландинов. Проапоптотическое действие индометацина не опосредовано оксидом азота.

7. Таргетным механизмом сигнал-передаюших систем модуляции апоптоза в почках являются Н -протонные механизмы клеточного объема (установленные по данным ЯМР-релаксации протонов водорода тканевой воды), приводящие к дегидратации клетки в условиях стимулированного апоптоза и гидратации - при его угнетении.

8. Установленный различный характер и сигнальные механизмы действия стимуляции опиатных рецепторов на физиологический уровень апоптоза (у интактных животных - через р-опиатные рецепторы) и

индуцированный апоптоз (у животных с ОПН - через а|-опиатные рецепторы) позволяет контролировать апоптоз фармакологической модуляцией опиатных рецепторов (активация или ингибирование) и управлять им в зависимости от его фонового уровня.

Список трудов, опубликованных по теме диссертации

1. Белоус Ю.А., Комаревцева И.А, Комаревцева Е.В. Антноксндантпая активность блокатора ангиотензиипревращающего фермента в почках// Вестник Российского университета дружбы народов. Серия: Медицина. -2007. - № 2. - С. 78-82.

2. Белоус Ю.А., Комаревцева И.А, Комаревцева Е.В. Влияние опиоидов на окислительный стресс и сфингознновый путь активавации апоптоза в почках // Вестник Российского университета дружбы народов. Серия: Медицина.-2007. - № 3. - С. 20-27.

3. Белоус Ю.А., Комаревцева И.А, Комаревцев В.Н. Влияние опиатов на стимулированный апоптоз в почках // Вестник Российского университета дружбы народов. Серия: Медицина. - 2008. - № 4. -С.67-71.

4. Дроздова Г.А., Мустяца В.Ф., Белоус Ю.А., Комаревцева И.А., Комаревцева Е.В. Влияние даларгина на активность супероксиддисмутазы и лактатдегидрогеназы в условиях гиперпродукции оксида азота // Астраханский медицинский журнал.- 2010. - № 3. - С. 33-35.

5. Белоус Ю.А., Комаревцева И.А, Комаревцева Е.В. Влияние опиоидов на ферментативную активность в почках при N0-индуцируемом апоптозе // Вестник Российского университета дружбы народов. Серия: Медицина. -2009. - № 2. - С. 89-92.

6. Комаревцева И.А., Белоус Ю.А., Савенко Д.В. Гшюфизарная регуляция системы половых гормонов у больных алкоголизмом, наркоманиями и токсикоманиями // Вопросы наркологии,- 2005. - № 2. - С.54-58.

7. Белоус Ю.А., Комаревцева И.А., Комаревцева Е.В. Метаболизм оксида азота в почках/ Вестпик Российского университета дружбы народов. Серия: Медицина. - 2006. - № 3. - С. 69-72.

8. Дроздова Г.А., Белоус Ю.А., Комаревцева И.А., Комаревцева Е.В. Н+-протонные механизмы клеточного объема при стимулированном апоптозе в почках //Астраханский медицинский журнал. - 2010. - Т. 5. - № 2. - С.65-70.

9. Комаревцева И.А, Комаревцева Е.В., Белоус Ю.А. Роль опиатов и К+ -АТФ каналов плазматической и митохондриальной мембран клеток почек в развитии апоптоза // Вестник Российского

университета дружбы народов. Серия: Медицина. - 2009. - № 2. - С. 83-88.

10. Белоус Ю.А., Комаревцева И.А, Комаревцев В.Н. Роль сфингозина в индукторных механизмах апоптоза при экспериментальной острой почечной недостаточности // Вестник Российского университета дружбы народов. Серия: Медицина. - 2008. - № 3. - С. 65-68.

11. Шевелёв О.А., Комаревцева И.А., Белоус Ю.А., Савенко Д.В. Применение ингибитора ангиотензин-превращающего фермента эналаприла при лечении хронического алкоголизма // Вопросы наркологии.- 2006. - № 4. - С. 29-34.

12. Комаревцева И.А., Дроздова Г.А., Белоус Ю.А., Мустяца В.Ф., Орлова Е.А., Комаревцева Б.В. Влияние даларгина на метаболизм оксида азота в почках // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2010. - № 4. - С. 28-31.

13. Belous Y. A. The relationship of endogenous opioids and water-sodium balance in alcoholics: methodology for new method of diagnostic alcoholic dependence / Savenko D.V. //4th International Medical Students Congress.-Poland, Katowice.- 2003,- p. 115.

14. Belous Y.A., Syed Mohammed Rasa Shah, Savenko D.V., Panasenko M.V. Endorphins, vasopressin and plasma atrial natriuretic factor during ethanol ingestion in humans // 5th International Medical Students Congress.- Poland, Katowice.- 2004,- P. 78.

15. Белоус Ю.А. Ингибиторы ангитензин-превращающего фермента и алкоголизм // Сб. тез. Второй международной конференции «Патофизиология и современная медицина». - Москва. - 2004. - С.42-44.

16. Белоус Ю.А. Динамика изменений концентрации сфингомиелина и фрагментации ДНК в клетках почечной ткани при экспериментальной острой почечной недостаточности // Украинский журнал экстремальной медицины им. Г.А. Можаева- 2003. - Т.2. - № 4. - С.77-79.

17. Белоус Ю.А. Анализ нитритов и нитратов в ткани при экспериментальной острой почечной недостаточности // Украинский журнал экстремальной медицины им. Г.А. Можаева. - 2004. - Т.З. - № 1.

- С.79-82.

18. Белоус Ю.А. Деградация ядерной дезоксирибонуклеиновой кислоты и её коррекция даларгином в условиях стимуляции апоптоза // Украинский журнал экстремальной медицины им. Г.А. Можаева. - 2004. - Т.З. - № 4.

- С.35-37.

19. Белоус Ю.А. Динамика протеолитической активности в тканях почек крыс в условиях окислительного стресса // Украинский медицинский альманах. - 2004. - Т.5. - № 5. - С.98-99.

20. Белоус Ю.А. Протеолитическая активность ткани почек при стимуляции апоптоза на фоне введения даларгина // Украинский медицинский альманах. -2004. - Т.5. - № 6. - С.106-108.

21. Комаревцева И.А., Белоус Ю.А., Петров Е.Г., Деркач Л.С. О роли оксидантного стресса в развитии апоптоза при экспериментальной острой почечной недостаточности // Украинский медицинский альманах.

- 2003. - Т.6. - № 1. - С.83-85.

22. Комаревцева И.А., Белоус Ю.А. Апоптоз и окислительный стресс при почечных патологиях // Украинский медицинский альманах. -2003. -Т.4. - № 4. - С. 68-73.

23. Комаревцева И.А., Белоус Ю.А. Коррекция активности ангиотензин-превращающего фермента как способ регуляции апоптоза // Украинский журнал экстремальной медицины им. Г.А. Можаева. - 2003. - Т.6. - № 4.

- С.103-105.

24. Белоус Ю.А. Влияние каптоприла на свободнорадикальные процессы в почках при экспериментальной острой почечной недостаточности // Украинский медицинский альманах. - 2003. - Т.6. - № 6. - С.116-119.

25. Белоус Ю.А. Влияние даларгина на содержание сфингозина, активность супероксиддисмутазы и апоптоз, индуцированный ишемией-релерфузией в почках // Экспериментальная и клиническая физиология и биохимия. - 2004. - №1. - С.34-41.

26. Белоус Ю.А. Взаимосвязь опиатных рецепторов и К^-АТФ каналов в регуляции апоптоза в почках // Украинский медицинский альманах. -2004,- Т.7. - №4. - С. 104-106.

27. Belous Yu.A. Apoptosis and nitric oxide in kidney // 15lh European students' conference for future doctors and young scientists : Abstract book. - Berlin. -2004.-P. 281.

28. Белоус Ю.А. Сфшгозин - активная молекула в проведении сигнала апоптоза при экспериментальной острой почечной недостаточности // IX Конгресс международного общества украинских врачей: Сб. научн. работ,- Чикаго.-2002,- С.274.

31. Ю.А. Белоус, Г.А. Дроздова, И.А. Комаревцева, В.Ф. Мустяца и др. FAS-независимый сигнальный путь активированного через опнатные рецепторы апоптоза //Врач-аспирант. - 2010,- №6. - С.129-135.

Перечень условных обозначений:

Вах- проапоптотический белок

Вс1-2- онкопротеин

cNOS - конститутивная NO-синтаза

DYm- мембранный потенциал митохондрий

FAS (CD95) - трансмембранный белок, стимулирующий апоптоз

IFN-g - интерферон

IL-lb - интерлейкин

iNOS - индуцибельная NO-синтаза

N0' - оксид азота

N02" - нитрит-анион

NO/ - нитрат-анион

NOS - синтаза оксида азота

NOx -суммарное содержание метаболитов оксида азота

0N00- - пероксинитрит

TNF-a - фактор опухоли

АК - арахидоновая кислота

АКМ- активированные кислородные метаболиты

АОЗ - антиоксидантная защита

АОС - антиоксидантная система

АПФ - ангиотензин - превращающий фермент

AT 11 - ангиотензин 11

АФА - активные формы азота

АФК - активные формы кислорода

ДАГ -диацилглицерол

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИКЭ - интерлейкин l-ß-конвертирующий энзим

ИФч - инозитол -3- фосфат

ЛДГ - Лактатдегидрогеназа

ЛПС - липополисахариды

НПВП - противовоспалительные нестероидные препараты

О2" - супероксид анион

ОМБ - окислительная модификация белков

ОПН - острая почечная недостаточность

ОР - опиоидные рецепторы

ОС- окислительный стресс

ПГ - простагландины

ПГЬ - простациклин

ПГЕ2 - простагландины

ПКГ- программируемая клеточная гибель

ПКс - протеинкиназа С

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПОС - прооксидантная система

Ра - доля внутриклеточной воды

РАС - ренин-ангиотензиновая система

рГЦ -растворимая гуанилатциклаза

цГМФ (сОМР) - циклический гуанидин-монофосфат

цАМФ (сАМР) - циклический аденозин-монофосфат

СМ - сфингомиелин

СОД - супероксиддисмутаза

СФЗ - сингозин

Т1- спин-решеточная или продольная релаксация

- спин-спиновая или поперечная релаксация ф-ДНК - фрагментация дезоксирибонуклеиновой кислоты ФЛ -фосфолипаза Ци А- циклоспорин А ЦОГ- циклооксигеназа ЯМР - ядерный магнитный резонанс

РЕФЕРАТ

Белоус Ю.А. Индуцированный ренальный апоптоз и его регуляция при повреждении почки,- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук по специальности 14.00.16 - патологическая физиология,- Российский Университет Дружбы народов, Москва, 2010.

Влияние ашниста опиатных рецепторов - даларгина на уровень апоптоза и стабильные метаболиты оксида азота в почках изучали на модели ишемия/реперфузия-стимулированного апоптоза. Даларгин ([D-ala(2), D-Ieu(5)]- энкефалин) вводили крысам в дозе 100 рг/кг 1 раз в день. Детекцию апоптоза проводили по определению ДНК-фрагментации.

Установили, что введение даларгина интактным животным вызывало стимуляцию апоптоза в почках, тогда как введение даларгина крысам до развития ишемии/реперфузии предупреждало стимуляцию апоптоза в почках. Проапоптотический и антиапоптотический эффекты даларгина ингибировались блокатором опиатных рецепторов - налоксоном.

Введение даларгина животным с ишемия/реперфузией в почках значительно уменьшало продукцию метаболитов оксида азота, что может быть одним из механизмов антиапоптотического действия даларгина в условиях ишемия/реперфузия-стимулированного апоптоза. Установлено, что активация и ингибирование ишемия/реперфузия-стимулированного апоптоза в почках реализуется через активацию КчАТФ- каналов.

Ключевые слова: апоптоз, опиоиды, оксид азота, К'-АТФ каналы, почки.

ABSTRACT

Belous Y.A. Induced renal an apoptosis and its regulation at kidney daraage.-Manuscript.

The dissertation for receiving doctor Medical sciences degree for speciality 14.00.16 - pathology physiology.- Russian University of Friendship of Peoples, Moscow.-2010.

The influence of dalarginum - opioid receptor agonist on the level of apoptosis and stabile metabolites nitric oxide in the kidneys of rats was investigated at ischemia-reperfiision model of the activation of apoptosis. Dalarginum ([D-ala(2), D-leu(5)]- enkephaline) was entered in a dose of 100 |ig/kg 1 day. Detection of apoptosis was carried out by determination of DNA fragmentation.

It was established that dalarginum injection at intact rats stimulated of apoptosis, but dalarginum injection before ischemia-reperfusion in the kidneys prevented of stimulation of apoptosis in kidneys. Proapoptotic and antiapoptotic effects of opiate receptor agonist was completely abolished by preliminary

injection of opiate receptor - antagonist naloxone.

Introduction of dalarginum resulted on significant decrease in the contents of stabile metabolites of nitric oxide, that can be one of mechanisms antiapoptotic actions of the dalarginum at ischemia-reperfusion model of the activation of apoptosis. It was established that activation and inhibition of apoptosis in kidneys by ligands of opioid receptors mediated by K+-ATP channels.

Key words: apoptosis, opioids, nitric oxide, K+-ATP channels, kidney.

ДЛЯ ЗАМЕТОК

Бумага офсетная. Формат 60*84/16. Объем 2,1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 110. Печать цифровая. Отпечатано в ООО «Полнграфсервис»

Актуальность темы. Несмотря на многочисленные исследования в областях патофизиологии и биохимии в последние годы, индукторы активации апоптоза и компоненты его сигнальных механизмов полностью еще не выяснены. Биохимические механизмы регуляции апоптоза очень сложны и, как показали исследования последних лет, практически не изменились в процессе эволюции, что дае т основание судить о фундаментальной биологической роли апоптоза [1].

Можно выделить два направления в изучении апоптоза. С одной стороны, исследуются существующие сигнальные и рецепторные пути, регулирующие апоптоз. Эти данные можно использовать, применяя эндогенные медиаторы. С другой стороны, ведется поиск веществ, способных направленно воздействовать на процессы апоптоза, подавляя или активируя его. Главной задачей исследователей, изучающих апоптоз, является установление путей возможной регуляции активности апоптоза, т.е. не просто факторов его индукции или угнетения, а именно поиск - модуляторов апоптоза.

Механизмы развития апоптоза, его индукторы и супрессоры изучаются на экспериментальных моделях. Одной из классических экспериментальных моделей апоптоза в почечной ткани является - острая почечная недостаточность (ОПН).

Острая почечная недостаточность проявляется сложным симптомокомплексом патофизиологических изменений в почках. Одним из них является апоптоз [2]. В связи с изучением апоптоза возникла необходимость пересмотра ряда концептуальных основ в патофизиологии почечных патологий.

ОПН приводит к ишемии/гипоксии в органах и клетках, которая, в свою очередь, вызывает апоптоз через изменения в митохондриях, вследствие образования свободных радикалов, изменения транслокации ионов кальция, изменения проницаемости митохондриальной мембраны и выделения апоптогенных факторов, таких как цитохром с и белков семейства Вс1-2 [3]. Имеются данные о вовлечении опиоидных рецепторов в протекторные механизмы ишемия/реперфузионного синдрома, так называемый феномен «ишемического прекондиционирования» [4]. Вместо прежних представлений о гибели клеток многоклеточного организма как отрицательном по значимости явлении, сформировался новый взгляд, согласно которому гибель части клеток в пределах организма является закономерным и необходимым процессом и само существование многоклеточного организма подразумевает баланс жизни и смерти на уровне составляющих его клеточных популяций [5].

При острой почечной недостаточности (ОПН) ишемического, токсического или обструктивного генеза апоптоз развивается в клетках канальцев. В этих случаях имеет место и некроз клетки, и еще неизвестно, какой из этих двух инициированных механизмов гибели клеток является ведущим. При различных фазах ОПН скорость апоптоза неравномерна: он может персистировать, или замедляться. Апоптоз при ОПН также может развиваться как адекватный ответ на повреждение. В этих случаях это рассматривается как физиологический баланс контроля и сдерживания преувеличенной компенсаторной пролиферации [6].

При острой почечной недостаточности изменяется экспрессия и внеклеточных, и внутриклеточных факторов регуляции апоптоза [7].

Актуальность проблемы заключается в возможности коррекции этого процесса при различных заболеваниях, в том числе почечных.

Идентификация морфологических и биохимических маркеров апоптоза должна в перспективе способствовать более глубокому пониманию механизмов патогенеза заболеваний, улучшению дифференциальной диагностики и созданию принципиально новых направлений терапии.

Основной целью нашего исследования стало изучение лигандов опиатных рецепторов, как возможных модуляторов уровня апоптоза в почках на модели острой почечной недостаточности. Кроме этого, нас интересовал сигнальный путь, через который мог бы реализовываться проапоптотический и антиапоптотический эффекты опиоидов.

Цель исследования: установить уровень апоптоза и роль его модуляторов в развитии экспериментальной модели повреждения почки - острой почечной недостаточности.

Задачи исследования

1. Разработать модели стимулированного ренального апоптоза в условиях экспериментальной острой почечной недостаточности (ОПН) (преренальной-гемодинамической; ренальной-паренхиматозной) с биохимической верификацией патологического процесса.

2. Изучить степень развития апоптотических процессов количественно по ДНК-фрагментации в сопоставлении с морфологической детекцией при использованием ядерного красителя Хехст в почечной ткани в условиях развития экспериментальной ОПН.

3. Выяснить наличие экспрессии индуцибельной синтазы оксида азота по содержанию стабильных метаболитов оксида азота - нитрит- и нитрат-анионам в клетках почек при различных моделях ОПН.

4. Изучить активность сфингомиелинового метаболического пути в почках в сигналпередающих системах апоптоза при экспериментальных моделях ОПН.

5. Изучить 'Н-протонные механизмы клеточного объема по данным ЯМР-релаксации тканевой воды в почках в условиях ОПН и под действием модуляторов апоптоза.

6. Выявить биохимические механизмы модуляции апоптотических процессов в почках синтетическим лей-энкефалином — даларгином - при различных моделях ОПН.

7. Установить роль опиоидных рецепторов в регуляции К+лтф — каналов митохондрий в почках в условиях стимулированного апоптоза.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Активация опиатных рецепторов вызывает различные эффекты на уровень апоптоза в почках: в физиологических условиях у ингактных животных — проапоптозный и антиапоптозный в условиях стимулированного апоптоза на экспериментальной модели ОПН.

2. Проапоптозный эффект опиоидов (даларгина) реализуется через р,-опиатные рецепторы и является МО-независимым, тогда как антиапоптозное действие опиоидов в условиях стимулированного апоптоза при ОПН является МО-зависимым процессом запускаемом через агопиатные рецепторы с участием АТФ-чувствительных митохондриальных К+-каналов.

3. Модуляторами опиатно-рецепторного сигнального пути апоптоза при экспериментальной ОПН является ангиотензиновая и простаноидная системы, сфингимиелин-сфингозиновый каскад и оксид азота, триггерным механизмом апоптоза которых, является перераспределение внутри- и внеклеточной фракции тканевой воды в почках.

Научная новизна работы

Разработан метод для анализа состояния системы оксида азота в тканях и биологических жидкостях по его конечным метаболитам — нитрит- и нитрат-аниоиам. Установлена активация метаболического пути сфингомиелина в клетках почек при экспериментальной ОПН. Выявлена роль оксидантного стресса в стимуляции апоптотических процессов в клетках почек в разных моделях ОПН.

Впервые обнаружена модуляционная способность даларгина, налоксона, каптоприла, нитроаминогуанидина, индометацина на программу клеточной гибели. Раскрыт антиапоптотический механизм действия даларгина через активацию К+ЛТФ - каналов митохондрий и активацию ЫО-синтазы в условиях развития ОПН.

Впервые получены ЯМР-характеристики почечной ткани в условиях стимулированного апоптоза и при модуляции программы клеточной гибели различными препаратами.

Практическая значимость работы

Вклад бифункционального характера действия оксида азота, развития оксидантного стресса и активации метаболитов сфингомиелина в стимулировании апоптотических процессов при экспериментальной ОПН позволит углубить знания о данном явлении на молекулярном уровне, установить роль программированной клеточной гибели в патогенезе почечной патологии. Модуляционные эффекты исследованных препаратов на процессы апоптоза могут быть полезными при фармакологических исследованиях, связанных с использованием препаратов в экспериментальной и клинической практике.

Изучение показателей ЯМР-релаксации протонов тканевой воды при различных моделях ОПН с позиции апоптоза, с одной стороны, позволит раскрыть ^-протонные механизмы клеточного объема, а с другой, подведет патогенетическую базу под диагностику степени апоптоза методом ЯМР-релаксометрии.

Понимание роли оксида азота в сигналпередающих системах апоптоза раскроет пути его фармакологической коррекции донаторами или блокаторами эндогенного оксида азота в клинической практике.

Личный вклад соискателя

Диссертационная работа является самостоятельным научным исследованием. Автором проведен патентно-информационный поиск, сделан обзор литературы с обоснованием актуальности темы и необходимости этого научно-практического исследования, отработаны методы исследования. Самостоятельно проведены экспериментальные и лабораторные исследования уровня апоптоза, его индукторов, супрессоров, показателей ЯМР-релаксации. Автор самостоятельно проанализировал полученные результаты, провел статистический анализ и интерпретацию полученных результатов, написал все разделы диссертации и сделал выводы

Апробация материалов диссертации

Результаты исследований, вошедшие в диссертацию, были доложены на Международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (г.Москва, 2004г.), 15-й Европейской конференции молодых ученых (ФРГ, г. Берлин, 2004 г.), 5-ом Межнародном конгрессе студентов-медиков (Польша, г. Катовицы, 2000 г.), 4-ом Межнародном конгрессе студентов-медиков (Польша, г. Катовицы, 1998 г.), IX Конгрессе международного общества украинских врачей (Чикаго, 2002).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 29 научных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов, списка литературы. Изложена на 305 страницах, содержит 85 таблиц, иллюстрирована 11 рисунками. Список литературы включает 523 наименования.

ВЫВОДЫ.

1. Триггерные механизмы апоптоза у интактных животных реализуются через и-опиатные рецепторы, на что указывает отсутствие изменения уровня фрагментированной ДНК под действием глибенкламида, блокирующее действие которого К+-АТФ - каналов реализуется через аропиатные рецепторы. При этом проапоптозное действие даларгина является МО-независимым и реализуется через циклооксигеназный путь метаболизма арахидоновой кислоты, активацию сфингозин-опосредованной сигнальной системы, что приводит к дегидратации клетки и активации апоптоза. Блокада АПФ в почках не оказывает влияния на проапоптотический эффект даларгина.

2. Выявленные биохимические и морфологические признаки активации апоптотических процессов и их регуляторов в почках при ишемической и «глицерольной» моделях острой почечной недостаточности носят универсальный патофизиологический характер, т.к. по всем изученным показателям достоверной разницы между экспериментальными моделями ОПН не было установлено. Отмечено увеличение деградации ДНК на 2-3 -и сутки развития ОПН при обеих моделях ОПН.

3. Ингибиторный анализ К+атф~ каналов в почках установил роль митоптоза в сигналпередающих системах апоптоза в моделях ОПН. Блокада К+лгф -каналов глибенкламидом способствовала повышению деградации ДНК в клетках почек, независимо от уровня оксида азота.

4. Протекторное (антиапоптозное) действие даларгина при ОПН, запускаемое через <тгопиатные рецепторы с участием АТФ-чувствительных митохондриальных К+-каналов является ГчГО-зависимым и сфингозин-опосредованным и обусловлено угнетением этих систем и клеточной гидратацией, на что указывают результаты показателей стабильных метаболитов оксида азота, сфингомиелина и сфингозина, ЯМР-показатели тканевой воды, данные в экспериментальных группах с применением блокаторов ЫО-синтазы и глибенкламида.

5. Антиапоптотическое действие даларгина, налоксона, нитроаминогуанидина и каптоприла при ОПН-стимулированном апоптозе направлено на инактивацию метаболитов сфингомиелинового пути. Реализация данного эффекта носит МО-зависимый характер. Тогда как на проапоптотический эффект индометацина в почках при экспериментальной ОПН блокада ¡N08 не влияла.

6. Циклооксигеназный путь метаболизма арахидоновой кислоты играет протекторную роль в регуляции апоптоза в клетках почек. Индометацин, и у интактных животных, и у животных с экспериментальной ОПН вызывал гибель клеток через апоптоз (повышение содержания фрагментированной ДНК и накопление сфингозина), что указывает на защитный эффект простагландинов. Проапоптотическое действие индометацина не опосредовано оксидом азота.

7. Таргетным механизмом сигнал-передающих систем модуляции апоптоза в почках являются нГ -протонные механизмы клеточного объема (установленные по данным ЯМР-релаксации протонов водорода тканевой воды), приводящие к дегидратации клетки в условиях стимулированного апоптоза и гидратации - при его угнетении.

8. Установленный различный характер и сигнальные механизмы действия стимуляции опиатных рецепторов на физиологический уровень апоптоза (у интактных животных - через ц-опиатные рецепторы) и индуцированный апоптоз (у животных с ОПН - через Сропиатные рецепторы) позволяет контролировать апоптоз фармакологической модуляцией опиатных рецепторов (активация или ингибирование) и управлять им в зависимости от его фонового уровня.

Заключение.

Сосредоточение значительных усилий исследователей на изучении апоптоза позволило в относительно короткий срок (с начала 90-х годов) осуществить прорыв в анализе его молекулярных механизмов. Особенно существенные успехи достигнуты в понимании структуры и функционирования РаБ-рецептора и связанных с ним молекул, факторов, контролирующих апоптоз (Вс1-2, Вах и т. д.), сериновых протеаз (каспаз). В то же время с полной определенностью не установлена природа эндонуклеаз, осуществляющих расщепление ДНК при апоптозе, и не выяснено, каким образом протеолиз, осуществляемый каспазами, приводит к активации этих эндонуклеаз.

Параллельно накапливаются сведения о месте апоптоза в развитии организма и деятельности его функциональных систем. Наконец, в последние годы началось широкомасштабное изучение места апоптоза и его нарушений в развитии патологических процессов. Показана его реальная роль в патогенезе нервных заболеваний, аутоиммунных, опухолевых процессов, почечной патологии и др. Эти направления исследований смыкаются с разработкой подходов к генотерапии заболеваний человека.

ГЛАВА II

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Серии эксперимента

В экспериментальной части работы были использованы белые крысы-самцы 16-18-ти недельного возраста, масса животных составляла т=250±30 мг. Животных содержали в стандартных условиях вивария, эксперимент над животными проводили в соответствии с Этическим кодексом Совета международных медицинских научных обществ по проведению эксперимента с использованием животных [231].

У животных формировали острую почечную недостаточность (ОПН) двумя моделями. 1 модель преренальная - по типу ишемия /реперфузия - за счет пережатия почечной ножки в течение 30 минут. Операцию проводили под тиопенталовым наркозом в дозе 10 мг/мл, в стерильных условиях. У контрольных животных проводили двусторонние надрезы кожи и мышц в области спины. 11 модель ренальная — «глицерольная» - путем двустороннего внутримышечного введения 50% раствора глицерола из расчета 10 мл на 1кг веса животного. Контрольным животным вводили соответствующий объем физиологического раствора.

Животных наблюдали в ранний период развития ОПН (олигурическая стадия): через 1 час после ишемии (контроль-2) и в течение 1, 2, 3-х суток (ОПН-1,ОПН-2,ОПН-3). Забой животных проводили методом декапитации под легким эфирным наркозом.

Введение модуляторов апоптоза проводили по следующей схеме. Даларгин (синтетический лей-энкефалин 0-А1а 2 ,Ьие 5,Аг§ 6 - энкефалин, ЗАО «БИОЛИК», г. Харьков) вводили внутрибрюшинно в дозе 100 мкг/кг массы животного за 20 минут до операции (до инъекции глицерола) и в течение 1-х, 2-х, 3-х суток развития ОПН, одноразово. Интактным животным даларгин и остальные препараты вводили аналогично в течение 1-х, 2-х, 3-х суток, одноразово. Инъекцию налоксона (антагонист даларгина, solution Naloxoni-M 0,4 мг в 1мл, ЗАО «БИОЛИК», г. Харьков) в дозе 0,5 мг/кг вводили внутрибрюшинно за 20 минут до формирования ОПН (до введения глицерола) и в течение периода наблюдения, одноразово. Ингибитор iNOS (индуцибельной синтазы оксида азота) - аминогуанидин нитрат (США «Sigma») животным вводили внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг. Инъекцию ингибитора осуществляли за 20 минут до развития ОПН и в течение первых трех суток ОПН, одноразово. Блокирование ангиотензин-превращающего фермента на фоне развития ОПН осуществляли путем предварительного введения каптоприла (0,025 г, г. Киев) в дозе 1,3 мг/кг. Препарат вводили внутрибрюшинно в течение 1-х, 2-х, 3-х суток, одноразово. Для блокады циклооксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты использовали индометацин (25 мг, г. Киев) в дозе 5 мг/кг, который предварительно растворяли в спиртовом растворе. Селективное ингибирование К+ЛТФ — каналов вызывали инъекцией глибенкламида (г.Харьков) в дозе 0,3 мг/кг [232].

При параллельном введении модуляторов апоптоза препарат №1 вводили за 40 минут до формирования ОПН, а препарат №2 — за 20 минут. В течение 1-х, 2-х и 3-х суток развития ОПН инъекция препарата №2 проводилась через 20 минут после введения препарата №1, одноразово. Ингактных животных кололи по аналогичной схеме.

Методики, применяемые в исследованиях: №1- методика определения содержания фрагментированной ДНК в клетках почек; №2 — методика определения содержания стабильных метаболитов оксида азота в клетках почек, плазме, моче; №3 — методика определения активности супероксиддисмутазы в клетках почек; №4 — методика определения активности лактатдегидрогеназы в клетках почек; №5 - методика определения содержания сфингомиелина в клетках почек; №6 - методика определения содержания свободного сфингозина в клетках почек; №7 - определение протеолитической активности в клетках почек; №8 - методика определения активности гамма-глутамилтранспептидазы в сыворотке крови, определения клубочковой фильтрации по клиренсу креатинина, определения мочевины в сыворотке крови ; №9 - методика определения Б^-протонных механизмов апоптоза в почках по данным ЯМР-релаксометрии.