Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Индуцированный хлоридом ртути аутоиммунный процесс у мышей как модель для тестирования иммуносупрессорных препаратов

На правах рукописи

КРАСИЛЫЦИКОВА Марина Сергеевна

ИНДУЦИРОВАННЫЙ ХЛОРИДОМ РТУТИ АУТОИММУННЫЙ ПРОЦЕСС У МЫШЕЙ КАК МОДЕЛЬ ДЛЯ ТЕСТИРОВАНИЯ ИММУНОСУПРЕССОРНЫХ

ПРЕПАРАТОВ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 1 НОЯ 2010

Старая Купавна, 2010

004612014

Работа выполнена в лаборатории структурной биохимии Учреждения Российской академии наук Институте биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор

Зацепина Ольга Владимировна

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор

Березовская Ирина Владимировна

доктор медицинских наук, профессор Ярилин Александр Александрович

Ведущая организация Учреждение Российской академии

медицинских наук

Научно-исследовательский институт ревматологии РАМН

Защита диссертации состоится «» ¡^(Л^ЫХ' 2010 г. в ^-^часов н заседании диссертационного совета Д 217.004.01 при ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ» по адресу: 142450, Московская область, г. Старая Купавна, ул. Кирова, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОАО «ВНЦ БАВ». Автореферат разослан« ,, г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Корольченко A.B.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Аутоиммунные заболевания относятся к одним из наиболее распространенных заболеваний, которые в развитых странах поражают до 5 -8% населения (Leffel et al., 2003). В основе патогенеза аутоиммунных болезней лежит развитие самоподдерживающегося иммунного ответа на собственные антигены организма, что приводит к деструктивным изменениям клеток и тканей, содержащих такие антигены (Галактионов, 2000). Несмотря на продолжающиеся многолетние исследования, точные причины возникновения аутоиммунных болезней до сих пор остаются неизвестными. К основным факторам, способствующим развитию аутоиммунных патологий, относятся генетическая предрасположенность (Rose, 2002), лекарственные средства и ксенобиотики, которые, в частности, включают органические и неорганические производные ртути (Frenkel et al., 1994; Ohsawa, 1997; Kimber, Dearman, 2002). Известно, что в подавляющем большинстве случаев (около 80%) аутоиммунные болезни поражают женщин вне зависимости от возраста (Fairweather, Rose, 2004).

В клинической практике для иммуносупрессии используются главным образом стероидные гормоны, циклоспорин, цитостатические иммунодепрессанты, антитимоцитарный глобулин. Значительные трудности в лечении тяжелых аутоагрессивных заболеваний связаны с тем, что применяемые для иммуносупрессии препараты дают многочисленные осложнения. Стероидные гормоны приводят к сахарному диабету, остеопорозу, язвенной болезни. Цитостатические иммуносупрессоры обладают миелотоксическим действием. Циклоспорин может приводить к почечной недостаточности (Vitko, Viklicky, 2004).

В связи с большим количеством побочных реакций, вызываемых вышеназванными препаратами, не прекращается поиск новых нетоксичных иммунодепрессантов, основное действие которых направлено на В- и Т-лимфоциты, так как считается, что именно В- и Т-клеточные клоны играют основную роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний (Rose, et al. 1993). Одним из препаратов, представляющим интерес для лечения системных аутоиммунных патологий, является отечественный пептидный препарат Тимодепрессин®.

Тимодепрессин представляет собой синтетический дипептид, состоящий из двух неприродных D - аминокислот (триптофана и глютаминовой кислоты) в последовательности -D-Glu-D-Trp. Он синтезирован в Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова.

Российской академии наук, а его свойства подробно изучены экспериментально и клинически (Deigin et al., 1999). При испытаниях показано, что Тимодепрессин уменьшает количество лимфоцитов, подавляет их активность, введение Тимодепрессина снижает колониеобразование в селезенке мышей, количество лимфоцитов в периферической крови и процент клеток, находящихся в S-фазе клеточного цикла. Тимодепрессин при различных схемах применения способен подавлять развитие реакции трансплантат против хозяина (РТПХ) (Poverenny et al., 1999). Препарат разрешен Фармкомитетом МЗ РФ к медицинскому применению в 2000 году. Положительный эффект лечения с помощью Тимодепрессина больных с аутоиммунными цитопениями (Виноградова и др., 2002) может служить основанием для рекомендации препарата при широком спектре заболеваний аутоиммунного генеза. Однако эффективность Тимодепрессина на моделях системных аутоиммунных заболеваний до настоящего времени не изучена.

В качестве экспериментальных моделей системных аутоиммунных заболеваний человека, как правило, используют животных, развивающих аутоиммунный процесс спонтанно, например, модель системной красной волчанки на мышах NZB/NZW (Burkhardt, Kalden, 1997). Результаты исследований последних лет показывают также, что адекватной моделью системных аутоиммунных патологий могут стать инбредные животные, у которых аутоиммунный процесс индуцирован регулярными инъекциями сублетальных доз соединений ртути. У мышей с гаплотипами Н-2% Н-2Ч и H-2f регулярные воздействия хлорида ртути в дозе 1, б мг/кг вызывают появление аутоантител к фибрилларину - белку ядрышка, участвующему в биогенезе рибосом (Reuter et al., 1989; ). Фибрилларин, наряду с другими белками и рибо- и дезоксирибонуклеопротеинами клеточного ядра, является мишенью антител при системных аутоиммунных заболеваниях человека (Сперанский, Иванова, 2002), а антитела к нему встречаются у 7-10 % больных системными аутоиммунными заболеваниями (Tormey et al., 2001).

Было показано, что мыши с гаплотипом Н-23 (линии SJL/J, B10.S и A.SW) более чувствительны по сравнению с линиями мышей, имеющими гаплотипы Н-2Ч, Н-2' (Hansson, Abedi-Valugerdi, 2003). У мышей линий SJL/J, B10.S и A.SW, как у больных людей, аутоиммунный процесс также сопровождается поликлональной активацией В- и Т-лимфоцитов, увеличением титра сывороточных иммуноглобулинов классов IgG и IgE и отложением иммунных комплексов в почках (Hultman et al., 1995; Roether et al., 2002).

Механизм индукции аутоиммунного процесса, вызываемого хлоридом ртути у мышей с чувствительным генотипом неизвестен. Наиболее распространенной является гипотеза о структурной модификации фибрилларина ртутью,

протеолиз и представление измененного пептида в комплексе с молекулами МНС I и II класса клеткам иммунной системы (Chen, von Mikecz, 2005; Kubicka-Muranyi et al., 1995; Kubicka-Muranyi et al., 1996). Другая гипотеза основана на способности тяжелых металлов нарушать иммунологическую толерантность, которая в нормальном организме контролирует состояние аутореактивности (McCabe, 2003; Moneim, 1994; Ziemba, 2005).

Интересен также факт, что наличие аутоантител к фибрилларину коррелирует с повышенным содержанием ртути в моче больных системной склеродермией (Arnett et al., 2000). В 2004-2005 гг научной группой Сильва с соавт. при обследовании работников золотодобывающих рудников в Бразилии, где в производственном процессе активно используют ртуть, обнаружено, что в их крови содержатся антиядрышковые аутоантитела в повышенных концентрациях (Silva, 2004; Silbergeld, 2005).

Возвращаясь к экспериментальным моделям аутоиммунных заболеваний, стоит отметить, что статус здоровья лабораторных животных может оказывать существенное влияние на результаты эксперимента. Животные, содержащиеся в обычных (конвенциональных) условиях, как правило, инфицированы специфическими для грызунов вирусами и микроорганизмами, вызывающими у них заболевания, протекающие, чаще всего в хронической форме без выраженных клинических признаков. Известно, что некоторые возбудители специфичных для лабораторных грызунов инфекционных заболеваний, например, вирус мышиного гепатита - чрезвычайно распространенный контаминант вивариев, являются сильными иммуномодулирующими агентами (Baker, 1998). Однако литературные данные о влиянии патогенной микрофлоры грызунов на течение аутоиммунного процесса, индуцированного хлоридом ртути у мышей, отсутствуют. Исключения влияния патогенной микрофлоры на иммунный статус животных можно добиться, сохраняя лабораторных животных в условиях, свободных от патогенной флоры (СПФ)

Как правило, целью экспериментов, проводящихся на лабораторных животных, является экстраполяция полученных данных на людей. Используя инбредных животных, исследователь имеет дело с определенным генотипом, и как следствие - фенотипом, что, несомненно, ценно для решения определенных задач. Однако учитывая, что в человеческой популяции представлен широкий диапазон генотипов, влияние различных факторов на популяцию в целом корректнее оценить на аутбредных (нелинейных) мышах. Аутбредные животные гетерозиготны по неопределенному числу генов и, подобно людям, генетически и фенотипически неоднородны. В связи с этим, аутбредных животных используют, в частности, для изучения токсикологических эффектов потенциально опасных реагентов (Гуськова, 2008).

Последние литературные данные о способности хлорида ртути индуцировать образование антиядрышковых аутоантител у аутбредных мышей (АЬесП-Уа1и§егсН,2009)ставят под сомнение существующее представление о преимущественной роли генотипа в индукции аутоиммунных патологий у мышей.

Одной из важнейших проблем доклинических испытаний является корректный подбор лабораторной модели для исследования эффективности лекарственных препаратов. Принимая во внимание дефицит моделей системных аутоиммунных патологий, индуцированный хлоридом ртути аутоиммунный процесс у мышей, представляет особый интерес.

Цель работы

Целью данной работы являлась разработка отечественной лабораторной модели системного аутоиммунного процесса, индуцированного хлоридом ртути у мышей, и ее использование для тестирования лекарственных препаратов.

Задачи исследования

1. Охарактеризовать модель аутоиммунного процесса, индуцированного хлоридом ртути у мышей линии ЭЛЬ/Л (включая, анализ образования аутоантител к фибрилларину и формирования иммунных комплексов в почках).

2. Проанализировать изменения титра аутоантител от времени, пола животного и присутствия патогенных возбудителей.

3. Провести исследование на описанной модели иммуносупрессорной активности широко применяющегося в клинической практике препарата циклоспорина (Сандиммун®).

4. Провести исследование на описанной модели иммуносупрессорной активности отечественного пептидного препарата Тимодепрессина®.

5. Проанализировать способность аутбредных (нелинейных) белых мышей развивать аутоиммунный процесс под действием Н§С12.

Научная новизна работы

Значительная часть результатов, представленных в данной работе, носит приоритетный характер. Впервые проведено изучение аутоиммунного процесса, индуцированного хлоридом ртути, у мышей линии ЭЛЬ/Л в течение длительного времени и снята еженедельная динамика аутоиммунного процесса индивидуально по каждому животному. Впервые показана разница в течении аутоиммунного процесса, индуцированного хлоридом ртути, при использовании конвенциональных животных и животных, свободных от патогенной микрофлоры.

Показано, что циклоспорин при профилактическом применении в дозе 50 мг/кг полностью подавляет образование аутоантител к фибрилларину у мышей линии SJL/J. Установлено, что модель отражает дозозависимость эффекта циклоспорина. Впервые проведено исследование иммуносупрессорного действия отечественного пептидного препарата Тимодепрессина на возможность подавления образования аутоантител к фибрилларину. Обнаружено, что Тимодепрессин значительно снижает аутоиммунный ответ у мышей в дозе 0,7 мг/кг при профилактическом применении и в дозе 0,35 мг/кг при терапевтическом применении. Впервые установлена способность мышей аутбредных стоков CFW и CD-I развивать системный аутоиммунный процесс под действием хлорида ртути.

Научно-практическое значение

Полученные результаты показывают, что модель может быть использована для тестирования иммуносупрессорных препаратов, а так же для изучения механизмов индукции аутоиммунного процесса под влиянием солей тяжелых металлов.

Апробация работы

Результаты работы докладывались и о бсуждались на Гумбольдтовской конференции (Санкт-Петербург, 2005) ; ХУВсероссийском совещании «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 2005); XIX зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2007); II съезде Общества клеточной биологии и Юбилейной конференции, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2007); 6th International Congress on Autoimmunity (Porto, 2008); 2-й Московской международной конференции «Иммунофизиология. Естественный аутоиммунитетв норме и патологии» (Москва, 2008); International Conference «Focus on Microscopy 2009» (Krakow, 2009); IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009); International Conference on Biomolecular Science in honor of the 75th anniversary of the birth of Professor Yuri Ovchinnikov (Moscow-Pushchino, 2009); семинаре отдела клеточной иммунологии ФБГУ «ГМЦ Институт иммунологии» ФМБА России; межлабораторном научном коллоквиуме ИБХ РАН 16 сентября 2010 года.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, 6 из них статьи в журналах, входящих в перечень изданий, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на страницах машинописного

текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы. Материал иллюстрирован.

таблицами и рисунками. Указатель литературы

включает «¿^отечественных и /Äf зарубежных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Животные. Эксперименты выполнены на мышах инбредных линий SJL / J, В ALB/си аутбредных стоков CFW, CD-16-8 недельного возраста. Каждая группа включала 6-10 животных. Мышей получали из питомника лабораторных животных «Пущино». Все животные в момент получения из питомника были свободны от патогенной микрофлоры (СПФ). Животные содержались в конвенциональных или барьерных условиях, получали стандартизованный корм и воду ad libitum.

Эксперименты проведены в соответствии с Правилами лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ Министерства Здравоохранения Российской Федерации № 267 от 19.06.2003), статьей 11-й Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации (1964) и «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985).

Индукция аутоиммунного процесса. Аутоиммунный процесс индуцировали инъекциями хлорида ртути. HgCl2 (Sigma, США) инъецировали подкожно в дозе 1, 6 мг/кг в 0,1 мл стерильного 0,9 %-ного раствора NaCl дважды в неделю в течение всего времени эксперимента.

Отбор образцов. Кровь брали ретроорбитальной венозной пункцией еженедельно или один раз в две недели в течение всего времени экспериментов. Для получения сыворотки кровь выдерживали 30 мин при комнатной температуре, а затем центрифугировали при 3000 об/мин Юмин. Поокончании эксперимента животных подвергали эвтаназии в С02-камере, проводили аутопсию. Почки выделяли и замораживали при -80°С.

Регистрация аутоантител и иммунных комплексов. Регистрацию аутоантител к фибрилларину в сыворотке мышей проводили иммуноцитохи-мическим методом на клетках NIH/3T3, HeLa или, используя коммерческие препараты клеток Нер-2 (Bio Rad Laboratories, USA),

с помощью FITC-конъюгированных антивидовых антител (ИМТЕК, Россия). Титром аутоантител к фибрилларину считали максимальное разведение сывороток, при котором они переставали окрашивать ядрышки -традиционный подход, используемый при анализе аутоиммунных сывороток в лабораторной и клинической практике (Hansson et al., 2003). Аутоантитела к фибрилларину выявляли методом иммуноблоттинга, как описано ранее (Мухарьямова и др., 1998).

Отложения иммунных комплексов в органах мышей выявляли на замороженных срезах с помощью метода прямой иммуногистохимии. Срезы органов толщиной 5 мкм изготовляли с помощью криотома (MICRO, Германия). Срезы фиксировали ацетоном и инкубировали с FITC-конъюгированными антивидовыми антителами (ИМТЕК, Россия). Титром иммунных комплексов считали максимальное разведение антивидовых антител, при котором они переставали выявлять иммунные комплексы в срезах.

Препараты клеток и криосрезы изучали под микроскопом Axiovert 200 (Carl Zeiss, Германия), используя объектив 40х PlanNeoFluar, и фотографировали с помощью монохромной 13-битной камеры Cool Snapc/ (Roper Scientific, США). Обработку изображений производили с помощью программы Adobe Photoshop (версия 9.0).

Иммуносупрессорная терапия. Препараты, дозы и режимы.

Циклоспорин (Сандиммун Новартис Фарма АГ) вводили внутрибрю-шинно в дозах 20; 50 и 125 мг/кг пять раз в неделю в течение трех недель. Выбор дозы 50 мг/кг веса определяли исходя из доз, рекомендованных к применению в клинической практике (до 5 мг/кг в сутки) (Белоусов и др., 1993) с учетом коэффициента пересчета при испытаниях фармакологических препаратов на лабораторных мышах (Гуськова, 2003). Дозы 20 и 125 мг/кг были выбраны для определения эффективного диапазона действия циклоспорина на данной модели. Учитывая, что в качестве растворителей циклоспорина в коммерческом препарате Сандиммун использованы этанол и касторовое масло, в эксперимент была введена дополнительная группа животных, получавших коктейль данных растворителей, но без циклоспорина. Стерильный 0, 9 % раствор NaCl, содержащий 3% этанола и 7% касторового масла вводили внутрибрюшинно пять раз в неделю в течение первых трех недель эксперимента, одновременно с HgCl2.

Тимодепрессин® (Пептос Фарма) вводили внутрибрюшинно в дозах 0,14; 0,35 и 0,7 мг/кг пять раз в неделю в течение трех недель. Выбор доз производили исходя из доз, рекомендованных к применению в клинической практике (10-50 мкг/кг в сутки) (Виноградова и др., 2002) с учетом коэффициента пересчета при испытаниях фармакологических препаратов на лабораторных мышах (Гуськова, 2003).

Иммуносупрессорные препараты вводили животным в профилактическом и терапевтическом режимах. Профилактический режим предполагал начало введения препарата одновременно с началом введения HgCl2, т.е. на стадии индукции аутоиммунного процесса. Терапевтический режим введения препарата предполагался после пяти недель введения HgCl2 , то есть на пике аутоиммунного ответа.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью ANOVA, в сопровождении тестов Краскал-Валлиса, Ван дер Вердена, Two-Sample Test, Van der Waerden One-Way Analysis. Изменения исследуемых показателей считали значимыми при р<0.05. Данные представлены как средние и 0. 95 доверительные интервалы.

Результаты исследования

1. Индукция аутоиммунного ответа HgCl2 у мышей линии SJL/J.

Эксперимент проводили на самках мышей линий SJL/J, содержащихся в СПФ условиях. В эксперименте использовано 8 животных. HgCl2 вводили в течение 4-х недель.

Иммуноцитохимический анализ сывороток крови мышей показал, что в крови мышей SJL/J возникают аутоантитела к фибрилларину (Рис. 1). На фотографии представлен характерный вариант окрашивания клеток NIH/3T3 сывороткой аутоиммунной мыши. Было проведено дополнительное окрашивание красителем на хроматин ДАФИ для определения границ клеточного ядра. Гранулярное свечение ядрышек совпадает с местами локализации фибрилларина.

Рис.1. Характерный вариант окрашивания клеток мыши ШН/ЗТЗ аутоиммунной сывороткой в условиях синтеза аутоантител к фибрилларину. А - иммуноци-тохимическая реакция; Б - окрашивание ядер красителем на хроматин ДАФИ; В- совмещение. Локализация антигена в ядрышках (стрелки) соответствует таковой для белка фибрилларина.

В качестве дополнительного доказательства специфичности продуцируемых аутоантител был проведен иммуноблотинг (Рис. 2). Сыворотки аутоиммунных мышей связывали белок с электрофоретической подвижностью около 34 кДа, совпадающей с подвижностью фибрилларина (Reuter R., 1989).

д Б В Рис.2. Выявление антител к фибрилларину в

сыворотках животных методом иммуноблота. А - сыворотка контрольной мыши SJL/J; Б, В- сыворотки мышей линии SJL/J через 4 недели введения хлорида ртути.

66.2 —

31.0 — 21.5 — 14.4 _

- 34 кДа

Иммуногистохимическое исследование криосрезов почек мышей ЭЛЬ/Л после 4-х недель введения хлорида ртути показало, что в клубочках откладываются иммунные комплексы (Рис. 3).

t

Рис.3. Выявление иммунных комплексов в криосрезах почек. Увеличение (х10). Стрелками указаны отложения иммунных комплексов в клубочках почек.

Л' ** <£*»

2. Анализ изменения титра аутоантител от времени, пола животного и присутствия патогенных возбудителей.

2.1. Конвенциональные условия

Эксперимент проводили на самцах и самках мышей линий SJL/J и BALB/c, содержащихся в конвенциональных условиях. Каждая группа включала б животных. HgCL, вводили в течение 19-ти недель, затем инъекции прекращали и наблюдали в течение еще 20-ти недель. Таким образом, обшэя продолжительность эксперимента составляла 9 месяцев. Контрольным животным вместо HgClj вводили 0,9 % NaCl.

Аутоантигела появлялись в крови у самок и самцов мышей линии SJL/J через 2 и 4 недели после начала инъецирования HgClj соответственно. Самцы и самки BALB/c, инъецированные HgCl2 в том же режиме, что и опытные мыши, а так же самцы и самки SJL/J, инъецированные 0,9 %-ным NaCl, не проявили специфического окрашивания ядрышка на клеточном уровне и реакции на иммуноблотах. Это говорит о том, что у мышей BALB/c с нечувствительным H-2d генотипом не происходит образования аутоантител к фибрилларину или к каким-либо иным внутриядерным антигенам при воздействии HgCl2, что полностью согласуется с литературными данными (Abedi-Valugerdi, Moller, 2000), а также о том, что у мышей линии SJL/J не происходит спонтанного образования аутоантител к фибрилларину.

Исследование динамики аутоиммунного процесса показало, что у самок мышей линии SJL/J титр аутоантител к фибрилларину достигал максимальных значений (40 000) через 4 недели после начала эксперимента (Рис.4). Максимальный титр антител к фибрилларину сохранялся в течение 6 недель. Затем (через 10 недель после начала эксперимента), несмотря на продолжающиеся инъекции HgCl2, титр аутоантител снижался, достигая к 11-ой неделе примерно 20 000. Эти изменения могут быть связаны с частичной элиминацией аутореактивных В-лимфоцитов, отвечающих за выработку антител к фибрилларину, поскольку общая «чувствительность» иммунной системы аутоиммунных мышей к чужеродным антигенам сохраняется (Roether et al., 2002). Прекращение инъекций HgCl2 сопровождалось дополнительным снижением титра аутоантител к фибрилларину (до 5 000), хотя в дальнейшем титр оставался неизменным вплоть до конца наблюдения.

У самцов мышей линии SJL/J динамика образования аутоантител к фибрилларину, в целом, соответствовала таковой у самок. Однако максимальное значение титра аутоантител (35 000) у самцов наблюдалось позднее и сохранялось в течение более короткого времени - с 7-ой по 9-ую неделю. После прекращения инъекций HgClj титр снижался до более низкого уровня, равного 1 000 (Рис.4). Различия в динамике синтеза аутоантител к фибрилларину у самок и самцов может быть связано с большей предрасположенностью женских особей к развитию аутоиммунного процесса (Сперанский и др., 2002; Rowley et al., 2005).

Различия в динамике синтеза аутоантител к фибрилларину у самок и самцов могут быть связаны с большей предрасположенностью женских особей к развитию аутоиммунного процесса (Сперанский и др., 2002; Rowley et al., 2005).

2.2. Барьерные условия

Эксперимент проводили на самках свободных от патогенной флоры мышей линий SJL/J, содержащихся в барьерных условиях. Н§С12 вводили в течение 19-ти недель.

Показано, что аутоантитела появляются в крови мышей через 3 недели после начала инъекций хлорида ртути. Максимальный титр аутоантител (1500) достигается к пятой неделе эксперимента и держится до 8-ой недели эксперимента (Рис. 5). Затем титр аутоантител спадает в два раза (700) и сохраняется на этом уровне до конца эксперимента.

Сравнение динамики аутоиммунного ответа, индуцированного Н§С12 у самок конвенциональных и свободных от патогенной микрофлоры (СПФ) мышей линии ЭЛЬ/Л, показало, что аутоиммунный процесс в обоих случаях можно разделить на три фазы: фазу индукции аутоиммунного процесса (до появления аутоантител в крови), фазу пика аутоиммунного процесса (период циркуляции аутоантител в максимальном титре) и фазу спада аутоиммунного ответа (падение титра аутоантител).

Рис.4. Динамика образования аутоантител к фибрилларину у конвенциональных мышей линии ¡ЭЛЬ/Л в зависимости от времени введения Н§С12 и пола животных. Ось абсцисс - продолжительность в неделях, ось ординат - титр аутоантител к фибрилларину (хЮОО). Стрелкой указано время прекращения инъекций Н§С12.

\

Рис.5. Динамика образования аутоантител к фибрилларину у СПФ мышей линии ЭЛЬ/Л в зависимости от времени. Ось абсцисс - продолжительность в неделях, ось ординат - титр аутоантител к фибрилларину (хЮОО).

Однако напряженность аутоиммунного ответа и длительность каждой фазы отличаются у конвенциональных и СПФ мышей. Так, фаза индукции аутоиммунного ответа у конвенциональных мышей короче (2 недели), чем у СПФ мышей (3 недели); максимальный титр аутоантител достигается к 4 неделе у конвенциональных и к 5 неделе у СПФ мышей. Титр аутоантител у конвенциональных мышей значительно выше (40000), чем у СПФ мышей (1500) и фаза пика аутоиммунного ответа у конвенциональных мышей длится дольше (б недель), чем у СПФ мышей (3 недели). Таким образом, можно заключить, что наличие специфичных для грызунов инфекций значительно усиливает аутоиммунный процесс. Поскольку при работе с конвенциональными животными нельзя избежать неспецифической стимуляции аутоиммунного процесса со стороны патогенной микрофлоры, дальнейшие исследования были проведены только на мышах, свободных от патогенной флоры. Статус здоровья мышей подтвержден мониторингом здоровья животных, проводившимся в лаборатории АпЬаЬ (Чехия).

3. Эффект циклоспорина на развитие аутоиммунного процесса, индуцированного хлоридом ртути у мышей линии ¡ЗЛ>/«1.

Эксперимент проводили на самках мышей линии ЭЛЬ/Л, свободных от патогенной микрофлоры в барьерных условиях. Каждая группа состояла из 7 мышей.

Нами было изучено действие иммуносупрессора циклоспорина, часто используемого для лечения аутоиммунных патологий человека (Ьап^огс! е1 а1., 1998), на аутоиммунный процесс, индуцированный Н§С12 у мышей линии &1Ь/Л. Механизм действия циклоспорина связан с избирательным и обратимым изменением функции лимфоцитов путем подавления образования и секреции лимфокинов и их связывания со специфическими рецепторами. Обратимое подавление продукции интерлейкина-2 и фактора роста Т-хелперов (СБ4+) приводит к подавлению дифференцировки и пролиферации Т-лимфоцитов, участвующих в иммунном процессе, снижению продукции интерлейкинов и других лимфокинов (Белоусов и др., 1993). Индукцию аутоиммунного процесса и введение циклоспорина проводили, как описано в разделе «Материалы и методы».

3.1. Профилактический режим применения

Циклоспорин в дозе 20 мг/кг значительно подавлял титр аутоантител к фибрилларину у мышей до 6-ой недели эксперимента (через три недели после окончания введения препарата) (Рис.б). К 8-ой неделе эксперимента титр аутоантител в этой группе животных достигал значения титра у контрольных животных.

Циклоспорин в дозе 50 мг/кг полностью предотвращал образование утоантител к фибрилларину на четвертой неделе эксперимента, когда контрольной группе титр аутоантител был уже высок (800). В течение □следующего времени наблюдения аутоантитела к фибрилларину появились в рови лишь у одной мыши, но в очень низком титре (150-160).

Циклоспорин в дозе 125 мг/кг оказался токсичен для мышей и вызвал мбель 70% животных после двух инъекций.

Рис.6. Эффект циклоспорина в дозах 20 и 50 мг/кг при использовании в профилактическом режиме. Ось абсцисс -продолжительность в неделях, ось ординат - титр аутоантител к фибрилларину (хЮОО). Планки погрешностей отражают 0.95 доверительный интервал. * указаны значения, различающиеся статистически значимо (р<0.05).

КОНТРОЛЬ

■ ЦС20|.|«кг ■ЦС50 мг/кг

[

Таким образом, циклоспорин в дозе 50 мг/кг при профилактическом применении оказывал очевидное ингибирующее действие на аутоиммунный :роцесс, индуцированный Н§С12 у мышей линии SJL/J.

3.2. Терапевтический режим применения

Полученные результаты показали, что циклоспорин при терапевтическом : рименении не обладает иммуносупрессорной эффективностью ни в одной из исследуемых доз (Рис. 7), что согласуется с литературными данными о неэффективности циклоспорина на фоне развившегося аутоиммунного процесса, при исследовании на других моделях аутоиммунитета (ВигкЬагсИ:, КаМеп, 1997).

Рис. 7. Эффекты циклоспорина в дозах 20, 50 и 125 мг/кг при использовании в терапевтическом режиме. Ось абсцисс - продолжительность в неделях, ось ординат - титр аутоантител к фибрилларину (хЮОО). Планки погрешностей отражают 0.95 доверительный интервал.

Комро!» |НиШ) ЦСГОмгкг ЦС ЗД ыгкг ЦС ЧЬигп

Введение мышам коктейля вспомогательных веществ препарата Сандим-мун® значительно усилило аутоиммунный ответ. Как видно на рис. 8., титр аутоантител к фибрилларину у этих мышей выше, чем у мышей,

получавших только HgCl2. К восьмой неделе эксперимента разница в титра::1 была пятикратной - 8000 против 1500. В литературе имеются ограниченны^ данные о способности минеральных масел, входящих в состав вакцин :; адъювантов, вызывать развитие аутоиммунного процесса у лабораторный животных. Так, сквален, пристан и Bayol F вызывают появление аутоантител к ядерным антигенам у мышей не-аутоиммунной линии BALB/c (Kuroda et al., 2004). Наши данные позволяют констатировать способность касторовогг масла, имеющего растительное происхождение, неспецифически усиливать иммунный ответ у мышей линии SJL/J.

i

[, ~ ____ Рис.8. Влияние растворителей цикло-

_____• спорина на аутоиммунный процесс,

■ Растворители цс Ц индуцированный хлоридом ртути у

мышей SJL/J. Ось абсцисс - продолжительность в неделях, ось ординат - титр аутоантител к фибрилларину (хЮОО). Планки погрешностей отражают 0.95 доверительный интервал. * указаны значения, различающиеся статистически значимо (р<0.05).

. I III

4. Влияние Тнмодепрессина на развитие аутоиммунного процесса, индуцированного хлоридом ртути у мышей линии вЛЬ/Л.

Эксперимент проводили на самках мышей линии ЭЛЬ/Л, свободных от патогенной микрофлоры в барьерных условиях. Каждая группа состояла из 8 мышей. Индукцию аутоиммунного процесса и введение Тимодепрессина® (рис. 9) проводили, как описано в разделе «Материалы и методы».

о от

^с

СН СН, ^0 H,N СН, С

СН, NH СН

Рис.9. Структура Тимодепрессина®.

О ©N8

4.1. Профилактический режим применения

Полученные результаты показали, что Тимодепрессин во всех трех дозах статистически значимо (р<0.05) снижал титр аутоантител к фибрилларину при профилактическом режиме применения (Рис. 10). При этом иммуносупрессорный эффект сохранялся в течение как минимум 10 недель после прекращения лечения. Дозо-зависимых эффектов не обнаружено.

16

Рис.10. Эффект Тимодепрессина в дозах 0,14; 0,35 и 0,7 мг/кг при применении в профилактическом режиме. Ось абсцисс - продолжительность в неделях, ось ординат - титр аутоантител к фи-брилларину (хЮОО). Планки погрешностей отражают 0.95 доверительный интервал. * указаны значения, различающиеся статистически значимо (р<0.05).

4.2. Терапевтический режим применения

При терапевтическом применении Тимодепрессин статистически 1ачимо снижал титр аутоантител в дозе 0,35 мг/кг в течение всего времени _аблюдения (Рис. 11). Линейной зависимости эффекта от дозы Тимодепрессина _ 2 наблюдалось, что является характерной особенностью многих пептидных препаратов.

Рис. 11. Эффект Тимодепрессина в дозах 0,14; 0,35 и 0,7 мг/кг при применении в терапевтическом режиме. Ось абсцисс - продолжительность в неделях, ось ординат - титр аутоантител к фи-брилларину (хЮОО). Планки погрешностей отражают 0.95 доверительный интервал. * указаны значения, различающиеся статистически значимо (р<0.05).

5. Индукция аутоиммунного процесса хлоридом ртути у аутбредных ышей CFW и CD-I.

Эксперимент проводился на самках мышей аутбредных стоков CFW и D-1, свободных от патогенной микрофлоры в барьерных условиях. Каждая зуппа состояла из 10 мышей. Индукцию аутоиммунного процесса проводили течение 8 недель. Аутоантитела появились у всех мышей стоков CD-I и FW через 4 недели после начала введения HgCl2. Динамика аутоиммунного процесса, индуцированного хлоридом ртути у мышей обоих аутбредных стоков, звпадает с динамикой аутоиммунного процесса у мышей линии S JL/ J (Рис. 12). '('як, через 4 недели эксперимента аутоантитела возникают у всех животных, аксимальный титр аутоантител достигается через б недель эксперимента, ри этом титр аутоантител у аутбредного стока CFW статистически значимо ыше титра аутоантител у стока CD-I и инбредной линии SJL/J.

I l Lul

D КОНТРОЛЬ ■ТД0.14 мг/кг ■ ТД 0.35 и г/кг ■ТД0.7 мг/кг

||

Контроль

■ ТД0.14 мг/кг

■ ТД0.35 мг/кг

■ ТД0.7 мг/кг

ll i ii Л

Рис.12. Сравнение динамики аутоиммунного процесса (титр аутоантител), индуцированного HgCl2, у аутбредных мыше_ CFW, CD-I и инбредных мышей SJL/J. Осг абсцисс - продолжительность в неделях, ос ординат - титр аутоантител к фибрилларг: ну (хЮОО). Планки погрешностей отражг ют 0.95 доверительный интервал. * и + указаны значения, различающиеся статисте чески значимо (р<0.05) от значений титр мышей CD-I и SJL/J соответственно.

1

Для того чтобы более точно убедиться в том, что аутбредные мыш продуцируют аутоантитела к фибрилларину, была проведена колокализаци аутоантигенов, узнаваемых мышиными сыворотками, с белком ядрышк фибрилларином. Для этого проводили двойное окрашивание клеток Hep 2 сыворотками аутоиммунных мышей и кроличьими поликлональным: антителами к фибрилларину или сывороткой больного ревматоидным артритом, узнающей фибрилларин в клетках человека. Показано, что места локализаци: антигена, выявляемые сыворотками мышей обоих стоков, совпадали с местам: локализации фибрилларина, выявляемого кроличьими антителами к белку, ил: сывороткой к фибрилларину, полученной от аутоиммунного больного (Рис. 13)

Рис. 13. Колокализация аутоантигена, узнаваемого сыворотками аутоиммунных мышей CD-I (а) и CFW (г), с белком ядрышка фибрилларином, узнаваемым коммерческими поликлональными антителами (б) или сывороткой аутоиммунного больного (д), в клетках НЕр-2. в, е - окрашивание хроматина ядер красителем ДАФИ. Як и стрелки - ядрышки. Масштабная линия, 2 мкм.

При исследовании гистологических срезов селезенок мышей аутбредного стока CFW, инъецированных хлоридом ртути в течение 8-ми недель, и ' контрольных животных, было показано, что у них статистически значимо ■ возрастает число герминальных центров в белой пульпе (Рис. 14). Так, у контрольных животных терминальные центры были выявлены лишь в 2,25±0,51 % фолликулов у четверти животных, в то время как у мышей, получавших инъекции хлорида ртути, терминальные центры обнаруживались в 48,9+16,4% фолликулов у всех животных.

3.0

2.6 «CFW

• СО-1 И

II ■■

2.0 "SJL/J

Ь 11

Это свидетельствует об усиленном синтезе иммуноглобулинов, что является це одной характеристикой аутоиммунного процесса, индуцированного .оридом ртути, описанным ранее только у инбредных линий мышей.

лс. 14. Срезы селезенки контрольной (А) и опытной (Б) мышей СР\У. Окраши-шие метиловым зеленым - пиронином (по Унна-Паппенгейму-Браше) хЮО. грелками указаны терминальные центры в белой пульпе.

выводы

1. Мыши линии SJL/J воспроизводят основные признаки аутоиммунна процесса, индуцированного HgCl2, включая образование аутоантител белку ядрышка фибрилларину и формирование иммунных комплексов почках.

2. Специфичная инфекция существенно усиливает аутоиммунный процео индуцированный хлоридом ртути у мышей линии SJL/J.

3. Растворители циклоспорина (этанол и касторовое масло), использующиес в коммерческом препарате Сандиммун®, значительно увеличивают тит аутоантител к фибрилларину у мышей SJL/J.

4. У мышей SJL/J циклоспорин подавляет титр аутоантител к фибрилларин в двух дозах 20 и 50 мг/кг при использовании в профилактическо: режиме и неэффективен в терапевтическом режиме.

5. Тимодепрессин в описанной модели эффективен как пр профилактическом, так и при терапевтическом применении. Получении результаты свидетельствуют в пользу целесообразности использовани Тимодепрессина для профилактики и лечения системных аутоиммунны патологий человека.

6. Способность аутбредных мышей двух стоков CFW и CD-I развиват аутоиммунный процесс под действием HgCl2 ставит под сомнени существующее представление о преимущественной роли генотипа индукции аутоиммунных патологий у мышей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты проведенных экспериментов свидетельствуют о целесоо->азности применения лабораторной модели аутоиммунного процесса, инду-фованного хлоридом ртути у инбредных мышей линии SJL/J, для первич->го скрининга иммуносупрессорной активности лекарственных препаратов.

Полученные результаты указывают на перспективность использования :птидного препарата Тимодепрессина для профилактики и лечения систем-.ix аутоиммунных заболеваний человека.

Полученные результаты также говорят о том, что хлорид ртути способен лзывать аутоиммунные реакции у аутбредных мышей двух стоков CD-I и FW. Эти наблюдения указывают на целесообразность контроля возможного 1звития аутоиммунных патологий у людей, подвергающихся регулярному >здействию соединений ртути.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи

1. Индукция аутоиммуноподобного процесса с помощью регулярных инъекций хлорида ртути мышам линии SJL/М.С.Красилыцикова, Ю.В.Аблаева, А.И.Сперанский, О.В. Зацепина//ДАН,-2006.-Том 409; № 1-С. 129-132.

2. Красилыцикова М.С., Зацепина О.В. Тяжелые металлы как индукторы аутоиммунных процессов у человека и лабораторных животных// Научно-практическая ревматология.-2007.-Nb 3-С.54-63.

3. Красилыцикова М.С., Дейгин В.И., Зацепина О.В. Способность циклоспорина А предотвращать образование аутоантител к фибрилларину у мышей// Иммунология.-2008.- № 3-С.166-170.

4. Исследование иммуносупрессорных свойств Тимодепрессина в экспериментальной модели аутоиммунных заболеваний/ М.С.Красилыцикова, В.П.Леонов, О.В.Зацепина, В.И.Дейгин// Иммунология.-2009.-№ 5-С.290-294.

5. Локализация и особенности состава иммунных отложений в почках мышей, развивающих аутоиммунный процесс под действием HgCl2/ А.С.Арефьева, П.А.Дыбан, М.С.Красилыцикова и др.// Цитология.-2010.-Том 52; Na 6.-С.477-486.

6. Красилыцикова М.С., Камаева А.Г., Зацепина О.В. Хлорид рту. вызывает образование антиядрышковых аутоантител у аутбреднь мышей// Иммунология.-2010.-№ 4-С. 195-199.

Тезисы

7. Induction of autoimmune antibodies to the nucleolar protein fibrillarin t long-term injections of S JL mice with subtoxic dozes of HgCl2. Technologit of the 21st century: biological, physical, informational and social aspects M.S. Krasilshchikova, E.R. Kunafina, A.I. Speransky, O.V. Zatsepina/ Humboldt-Kolleg Conference. -St.-Petersburg.- September 27 - 29, 2005. P.47.

8. Красилыцикова M.C., Сперанский А.И., Зацепина O.B. Ядернь антигены и аутоиммунные заболевания: индукция аутоантител к бел» ядрышка фибрилларину хлоридом ртути у лабораторных мышей лини SJL// Тезисы XV всероссийского совещания «Структура и функци клеточного ядра».- Санкт - Петербург.-, 18 - 20 октября 2005. Тезис: опубликованы в журнале «Цитология».- 2005.-Том 47; № 9-С.816.

9. Индуцированный хлоридом ртути аутоиммунный ответ у мыше линии SJL как модель аутоиммунных заболеваний человека М.С.Красилыцикова, А.С.Андрющенко, В.И.Дейгин, О.В.Зацепина/ Тезисы XIX зимней молодежной научной школы «Перспективны направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва.-, 7-9 февраля 2007.-С.19.

10. Регуляция клеточных функций: иммуногистология органов мыше! развивающий индуцированный аутоиммунный процесс в отношени белка ядрышка фибрилларина/А.С.Андрющенко, М.С.Красильщиков; Ю.Добруцки, О.В.Зацепина// Тезисы II съезда Общества клеточно биологии и Юбилейная конференция, посвященная 50-летию Институт цитологии РАН. -Санкт-Петербург.- 16-19 октября 2007. Тезис] опубликованы в журнале «Цитология».- 2007.-Том 49; № 9-С.710-711.

11.Krasilshchikova M.S., Zatsepina O.V., Deigin V.l. Protective effect ( Thymodepressin in experimental autoimmunity// 6th Internatiom Congress on Autoimmunity.-Porto.-September 10-14, 2008.-P.29.

12. Красилыцикова M. С., Дейгин В. И., Зацепина O.B. Циклоспорин предотвращает образование аутоантител к фибрилларину у мышей / / Тезисы 2-й Московской международной конференции «Иммунофизиология. Естественный аутоиммунитет в норме и патологии».- Москва.- 26-28 сентября 2008.-С. 109.

13. Conditions favoring analysis of immunodeposits in mouse kidney by CLS microscopy/A.S.Andryushchenko, M.S.Krasilshchikova, J.W.Dobrucki, O.V.Zatsepina// Focus on Microscopy 2009. - Krakow.-, April 5-8, 2009,-P.C27.

14. Красилыцикова M.C., Зацепина О.В., Дейгин В.И. Влияние Тимодепрессина на течение индуцированного аутоиммунного процесса у мышей// Тезисы IV Российского симпозиума «Белки и пептиды». -Казань. - 23-27 июня 2009.-С.271.

15. Search for markers of autoimmunity in mice using MALDI TOF MS profiling of sera /G.P.Arapidi, M.S.Krasilshchikova, O.V.Zatsepina, R.H. Ziganshin//International Conference on Biomolecular Science in honor of the 75th anniversary of the birth of Professor Yuri Ovchinnikov. - Moscow-Pushchino.- September 28-October 2, 2009.-P. 120.

16.HgCl2 induces autoimmunity in outbred mice/M.S.Krasilshchikova, A.G.Kamaeva, O.V.Zatsepina// International Conference on Biomolecular Science in honor of the 75th anniversary of the birth of Professor Yuri Ovchinnikov. - Moscow-Pushchino.- September 28-October 2, 2009.-P.259.

Актуальность проблемы. Аутоиммунные заболевания относятся к одним из наиболее распространенных заболеваний, которые в развитых странах поражают до 5-8% населения (Leffel et al., 2003).

В основе патогенеза аутоиммунных болезней лежит развитие самоподдерживающегося иммунного ответа на собственные антигены организма, что приводит к деструктивным изменениям клеток и тканей, содержащих такие антигены (Галактионов, 2000).

Несмотря на многолетние исследования, точные причины возникновения аутоиммунных болезней до сих пор остаются неизвестными. К основным факторам, способствующим их развитию, относятся генетическая предрасположенность (Rose, 2002), лекарственные средства и ксенобиотики, включающие, в частности, органические и неорганические соединения ртути (Frenkel et al., 1994; Ohsawa, 1997; Kimber and Dearman, 2002).

Известно, что в подавляющем большинстве случаев (около 80%) аутоиммунные болезни поражают женщин вне зависимости от возраста (Fairweather and Rose, 2004) и с трудом поддаются лечению. В клинической практике для лечения аутоиммунных заболеваний используют, главным образом, стероидные гормоны, циклоспорин, цитостатические иммунодепрессанты, антитимоцитарный глобулин. Значительные трудности в лечении тяжелых аутоагрессивных болезней связаны с тем, что применяемые для иммуносупрессии препараты вызывают многочисленные осложнения. Стероидные гормоны могут приводить к сахарному диабету, остеопорозу, язвенной болезни. Цитостатические иммуносупрессоры обладают миелотоксическим действием. Циклоспорин способствует развитию почечной недостаточности (Vitko and Viklicky, 2004).

В связи с большим количеством побочных реакций, вызываемых вышеназванными препаратами, не прекращается поиск новых нетоксичных иммунодепрессантов, основное действие которых направлено на В- и Т-лимфоциты, которые играют основную роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний (Roseetal., 1993).

Одним из препаратов, представляющим интерес для лечения системных аутоиммунных патологий, является отечественный пептидный препарат Тимодепрессин®.

Тимодепрессин представляет собой синтетический дипептид, состоящий из двух неприродных D-аминокислот (триптофана и глютаминовой кислоты) в последовательности y-D-Glu-D-Trp. Он синтезирован в Учреждении Российской академии наук Институте биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН (ИБХ РАН), а его основные свойства изучены экспериментально и клинически (Deigin et al., 1999). Препарат разрешен Фармкомитетом МЗ РФ к медицинскому применению в 2000 году. Положительный эффект лечения с помощью Тимодепрессина больных с аутоиммунными цитопениями (Виноградова и др., 2002) может служить основанием для рекомендации препарата для лечения широкого спектра заболеваний аутоиммунного генеза. Однако эффективность Тимодепрессина на моделях системных аутоиммунных заболеваний до настоящего времени не изучалась.

Одной из важнейших проблем доклинических испытаний лекарственных препаратов является выбор адекватной лабораторной модели для исследования. Результаты последних лет показывают, что моделью системных аутоиммунных патологий могут быть инбредные животные, развивающие аутоиммунный процесс под воздействием регулярных инъекций сублетальных доз соединений ртути. Наиболее часто для этих целей используют хлорид ртути, или сулему (HgCl2) (Mellergard et al., 2004). У мышей с гаплотипами H-2S, H-2q и H-2f регулярные воздействия хлорида ртути в дозе 1,6 мг/кг вызывают появление аутоантител к фибрилларину - белку ядрышка, участвующему в биогенезе рибосом (Reuter et al., 1989). Фибрилларин, наряду с другими белками и рибо- и дезоксирибонуклеопротеинами клеточного ядра, является мишенью антител при системных аутоиммунных заболеваниях человека (Сперанский и Иванова, 2002), а антитела к нему встречаются у 12-14 % больных (Tormey et al., 2001; Shoenfeld, 2008). У мышей линий SJL/J, B10.S и A.SW, как у больных людей, аутоиммунный процесс сопровождается поликлональной активацией В- и Т-лимфоцитов, увеличением титра сывороточных иммуноглобулинов классов IgGl и IgE и отложением иммунных комплексов в почках (Roether et al., 2002). Важен также факт, что наличие аутоантител к фибрилларину коррелирует с повышенным содержанием ртути в моче больных системной склеродермией (Arnett et al., 2000). В 2004-2005 гг научной группой Сильва при обследовании работников золотодобывающих рудников в Бразилии, где в производственном процессе активно используют ртуть, обнаружено, что в их крови содержатся антиядрышковые аутоантитела в повышенных концентрациях (Silva et al., 2004; Silbergeld et al., 2005). Принимая во внимание влияние соединений ртути(П) на развитие аутоиммунных патологий у людей и дефицит лабораторных моделей системных аутоиммунных патологий, аутоиммунный процесс, индуцируемый хлоридом ртути у мышей, представляет особый интерес.

Как правило, целью экспериментов, проводящихся на лабораторных животных, является экстраполяция полученных данных на людей. Учитывая, что в человеческой популяции представлен широкий диапазон генотипов, влияние различных факторов на популяцию в целом корректнее оценить на аутбредных (нелинейных) мышах. Аутбредные животные гетерозиготны по неопределенному числу генов и, подобно людям, генетически и фенотипически неоднородны. Однако способность нелинейных животных развивать аутоиммунные патологии под влиянием соединений ртути, включая ЩС12, на сегодняшний день изучена очень плохо.

Цель работы - разработка отечественной лабораторной модели системного аутоиммунного процесса, индуцированного хлоридом ртути у мышей, и ее использование для тестирования лекарственных препаратов, обладающих иммуносупрессорной активностью. Задачи исследования:

1. Охарактеризовать модель аутоиммунного процесса, индуцированного хлоридом ртути у мышей линии БЛ/Г (включая, анализ образования аутоантител к фибрилларину и формирования иммунных комплексов в почках).

2. Проанализировать изменения титра аутоантител от времени, пола животного и присутствия патогенных возбудителей.

3. Провести исследование на описанной модели иммуносупрессорной активности широко применяющегося в клинической практике препарата циклоспорина (Сандиммун®).

4. Провести исследование на описанной модели иммуносупрессорной активности отечественного пептидного препарата Тимодепрессина®.

5. Проанализировать способность аутбредных (нелинейных) белых мышей развивать аутоиммунный процесс под действием ЩС12.

Научная новизна. Значительная часть результатов, представленных в данной работе, носит приоритетный характер. Впервые проведено изучение аутоиммунного процесса, индуцированного хлоридом ртути, у мышей линии БЛ^Я в течение длительного времени и проанализирована еженедельная динамика аутоиммунного процесса индивидуально по каждому животному. Впервые выявлены различия в течении аутоиммунного процесса, индуцированного хлоридом ртути, при использовании конвенциональных животных и животных, свободных от патогенной флоры. Показано, что циклоспорин при профилактическом

10 применении в дозе 50 мг/кг полностью подавляет образование аутоантител к фибрилларину у мышей линии SJL/J. Установлено, что модель отражает дозозависимость эффекта циклоспорина. Впервые проведено исследование иммуносупрессорного действия отечественного пептидного препарата Тимодепрессина на возможность подавления образования аутоантител к фибрилларину. Обнаружено, что Тимодепрессин значительно снижает аутоиммунный ответ у мышей в дозе 0,7 мг/кг при профилактическом применении и в дозе 0,35 мг/кг при терапевтическом применении. Впервые установлена способность мышей аутбредных стоков CFW и CD-I развивать системный аутоиммунный процесс под действием хлорида ртути.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Результаты работы показывают также, что хлорид ртути способен вызывать аутоиммунные реакции у генетически разнородных аутбредных мышей двух стоков - CD-I и CFW. Эти наблюдения указывают на целесообразность мониторинга возможного развития аутоиммунных патологий у людей, подвергающихся регулярному воздействию соединений ртути и других ксенобиотиков.

8. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Индукция аутоиммуноподобного процесса с помощью регулярных инъекций хлорида ртути мышам линии SJL/М.С.Красильщикова, Ю.В.Аблаева, А.И.Сперанский, О.В. Зацепина//ДАН,-2006.-Том 409; № 1-С.129-132.

2. Красилыцикова М.С., Зацепина О.В. Тяжелые металлы как индукторы аутоиммунных процессов у человека и лабораторных животных//Научно-практическая ревматология.-2007.-№ 3-С.54-63.

3. Красилыцикова М.С., Дейгин В.И., Зацепина О.В. Способность циклоспорина А предотвращать образование аутоантител к фибрилларину у мышей// Иммунология.-2008.- № 3-С.166-170.

4. Исследование иммуносупрессорных свойств Тимодепрессина в экспериментальной модели аутоиммунных заболеваний/М.С.Красилыцикова, В.П.Леонов, О.В.Зацепина, В.И.Дейгин//Иммунология.-2009.-№ 5-С.290-294.

5. Локализация и особенности состава иммунных отложений в почках мышей, развивающих аутоиммунный процесс под действием ЩС12/А.С.Арефьева, П.А.Дыбан, М. С.Красилыцикова и др.// Цитология.-2010.-Том 52; № 6.-С.477-486.

6. Красилыцикова М.С., Камаева А.Г., Зацепина О.В. Хлорид ртути вызывает образование антиядрышковых аутоантител у аутбредных мышей// Иммунология.-2010.-№ 4-С.195-199.

Тезисы

7. Induction of autoimmune antibodies to the nucleolar protein fibrillarin by long-term injections of SJL mice with subtoxic dozes of HgC12. Technologies of the 21st century: biological, physical, informational and social aspects/ M.S. Krasilshchikova, E.R. Kunafma, A.I. Speransky,

O.V. Zatsepina// Humboldt-Kolleg Conference. -St.-Petersburg.-September 27 - 29, 2005,- P.47.

8. Красилыцикова M.C., Сперанский А.И., Зацепина O.B. Ядерные антигены и аутоиммунные заболевания: индукция аутоантител к белку ядрышка фибрилларину хлоридом ртути у лабораторных мышей линии SJL// Тезисы XV всероссийского совещания «Структура и функции клеточного ядра».- Санкт - Петербург.-, 18 -20 октября 2005. Тезисы опубликованы в журнале «Цитология».-2005.-Том 47; № 9-С.816.

9. Индуцированный хлоридом ртути аутоиммунный ответ у мышей линии SJL как модель аутоиммунных заболеваний человека/М.С.Красильщикова, А.С.Андрющенко, В.И.Дейгин, О.В.Зацепина// Тезисы XIX зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», - Москва.-, 7-9 февраля 2007.-С.19.

10.Регуляция клеточных функций: иммуногистология органов мышей, развивающий индуцированный аутоиммунный процесс в отношении белка ядрышка фибрилларина/А.С.Андрющенко, М.С.Красилыцикова, Ю.Добруцки, О.В.Зацепина// Тезисы II съезда Общества клеточной биологии и Юбилейная конференция, посвященная 50-летию Института цитологии РАН. -Санкт-Петербург.- 16-19 октября 2007. Тезисы опубликованы в журнале «Цитология»,- 2007,-Том 49; № 9-С.710-711.

11 .Krasilshchikova M.S., Zatsepina O.V., Deigin V.l. Protective effect of Thymodepressin in experimental autoimmunity// 6th International Congress on Autoimmunity.-Porto.-September 10-14, 2008.-P.29.

12.Красилыцикова M. С., Дейгин В. И., Зацепина O.B. Циклоспорин А предотвращает образование аутоантител к фибрилларину у мышей// Тезисы 2-й Московской международной конференции

Иммунофизиология. Естественный аутоиммунитет в норме и патологии».- Москва.- 26 - 28 сентября 2008.-С. 109.

13.Conditions favoring analysis of immunodeposits in mouse kidney by CLS microscopy/A.S.Andryushchenko, M.S.Krasilshchikova, J.W.Dobrucki, O.V.Zatsepina// Focus on Microscopy 2009. - Krakow.-, April 5-8, 2009.-P.C27.

14.Красилыцикова M.C., Зацепина O.B., Дейгин В.И. Влияние Тимодепрессина на течение индуцированного аутоиммунного процесса у мышей// Тезисы IV Российского симпозиума «Белки и пептиды». - Казань. - 23-27 июня 2009.-С.271.

15.Search for markers of autoimmunity in mice using MALDI TOF MS profiling of sera /G.P.Arapidi, M.S.Krasilshchikova, O.V.Zatsepina, R.H. Ziganshin//International Conference on Biomolecular Science in honor of the 75th anniversary of the birth of Professor Yuri Ovchinnikov. -Moscow-Pushchino.- September 28-October 2, 2009.-P.120.

16.HgCl2 induces autoimmunity in outbred mice/M.S.Krasilshchikova, A.G.Kamaeva, O.V.Zatsepina// International Conference on Biomolecular Science in honor of the 75th anniversary of the birth of Professor Yuri Ovchinnikov. - Moscow-Pushchino.- September 28-October 2, 2009.-P.259.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты проведенных экспериментов свидетельствуют об адекватности лабораторной модели индуцированного аутоиммунитета, основанной на способности инбредных мышей линии SJL/J развивать аутоиммунный процесс под воздействием хлорида ртути, для скрининга иммуносупрессорной активности лекарственных препаратов.

Полученные результаты указывают на перспективность использования пептидного препарата Тимодепрессина для профилактики и лечения системных аутоиммунных заболеваний человека.