Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунные механизмы формирования перинатальных гипоксически-ишемических поражений ЦНС у новорожденных

На правах рукописи

Серкина E.icna Вадимовна

ИММУННЫЕ МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВ \ШШ ИЕР1ШЛГЛЛЫ1ЫХ ninOkTIIMFCKII-HIIIEMIlHECklIX ПОРАЖЕНИИ ЦИС У НОВОРОЖДЕННЫХ

14.00.36 - Аллсргоюгня и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой (пенсии кандидата медицинских на\к

Москва-2008

003168675

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В Н Городкова» Федерального агентства но высокотехнологичной медицинской помощи

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ доктор медицинских наук, профессор

Сотннкова Наталья Юрьевна

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕН ГЫ доктор медицинских наук, профессор

Козлов Иван Генрихович

доктор медицинских наук, профессор Краснопрошина Людмила Ивановна

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

Федеральное государственное учреждение «Научный центр акушерства, гинекологии и перина!ологии имени академика В И Кулакова Федерального атентства по высокотехнологичной медицинской помощи»

Защита диссертации состоится 2008 г в /0 часов

на заседании диссертационного совета Д 208 046 02 при Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Г Н Габричевского» Федеральной службы по надзору и защите прав иогребителеи и благополучия человека (125212, Москва, ул Адмирала Макарова, д 10)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУН МНИИЭМ им Г Н Габричевского Роспотребнадзора, г Москва

Автореферат разослан« $ » 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

ЛИ Новикова

Общая характеристика работы и актуальность проб 1смы

На современном этапе доказана тесная взаимосвязь иммунной и нервной сисгем, направленная на поддержание постоянства внутренней среды организма Нарушение этого взаимодействия ведет к развитию ряда заболевании (Крыжаповский ГН, 1997) Особенно актуальной проблема изучения неироиммуннои регуляции является для новорожденных с перинатальными гипоксическими поражениями ЦНС (Таболин В А , 1997, Яцык Г В . 1998, Барашнев Ю И , 1998, 2001, Володин Н Н ,2001, Шабанов Н П , 2003, Ящи ТЫ К е( а1, 2005), поскольку данная патология занимавI одно из ведущих мест в структуре заболевании новорожденных (Барашнев ЮИ 1998, 2001, Володин НН, 2001, Шабатов Н П, 2003)

Известно, что гипоксия инициирует запуск каскада патологических процессов которые мотут, с одной стороны, приводить к гибели нервных клеток путем апогпша (Шабалов Н П, 2003), а с другой вызывать различные иммунопатологические сдвиги (ЬеуШпа ЕУ, 2001, Евсеев В А, Магамаева С В, 2004, Громада Н Е , 2007)

Проведенные ранее исследования иммунологических параметров у детей с перинатальными поражениями ЦНС (ПН ЦНС), свидетельствуют об изменении показателей клеточного, гуморального и врожденного иммунитета, нарушении продукции цитокиггов (Сгратулаг ПМ и соавт, 1986, Степнов МИ, 1993, Нестерова И В , 1994, Дорофеева Л К , 1994, Дегтярева М В , 1995, Беликова М Э , 1996, Голочшгова С А , 1996, Таболин В А и соавт, 1997. Романенко Е С 2003, Ларионова А В 2006) Кроме того, гипоксия может инициировать активацию клеток иммунной системы, в частности обладающих цитотоксическим потенциалом (Ларионова А В, 2006) Цитотоксические лимфоциты, являясь эффекториыми клетками, способствуют элиминации измененных меток организма вызывая их апоптоз Следует отметить, что в условиях гипоксии могут нарушагься регуляторньге механизмы, ответственные за адекватную элиминацию активированных клеток путем апоптоза, что может приводить к накоплению аутоагрессивных клоггов имму некомпетентных клеток, одггако эти процессы при ПП ЦНС остаются не изученными

Становление иммуниои системы детей в периоде новорожденное™ в значительной степени связано с особенностями течения беременности у матери (Сотникова НЮ, 1992, Морозова ИМ, 1998, Иванова НА, 2006, Панова И А, 2006, Чистякова ГН, 2007) При этом особое значение приобретают иммунные процессы, происходящие на поздних этапах антенатального развития в зоне плодово-материнског о контакта (Сотникова Н 10 , 2005) В частности, известно, что такое осложнение беременности как гестоз, не только часто приводит к формированию фетоплапентарной недостаточности, но и сопровождается выраженными нарушениями локального иммунного ответа на уровне плацешы, оказывающими нетативное влияние на развивающийся плод (Сотникова Н Ю , 2005, Панова И А , 2006) В связи с этим особую актуальность приобретает исследование апоптоза лимфоцитов и его эндогенной регуляции при ПП ЦНС, начиная с антенатального периода. Цель работы

Установить роль механизмов апоптоза лимфоцитов с циготоксической активностью и его эндогенной регуляции, в формировании перинатальных гипоксически-ишемических поражений ЦНС у доношенных новорожденных и разработать критерии ранней диагностики степени тяжести IIII ЦНС Задачи исследования

1 Охарактеризовать основные параметры Раь-зависимого апоптоза лимфоцитов с цитотоксической активностью и его эндогенной регуляции на уровне дсцидуалыюи оболочки плацент женщин, в пуповшшои и периферической крови у доношенных новорожденных с перинатальными гипоксически-ишемическими поражениями ЦНС (ПП ЦНС)

2 Дать сравнительную характеристику содержания вРАР в сыворотке нуповишюи и периферической крови к концу 1-го месяца жизни у здоровых новорожденных и детей с гипоксически-ишемическими ПП ЦНС

3 Оцепить экспрессию мРНК МГ-1 в лимфоцитах пуповинной и периферической крови к концу первого месяца жизни у здоровых детей и новорожденных с гипоксически-ишемическими ПП ЦНС

4 Установить наличие взаимосвязи у здоровых дегеи и детей с гштоксически-ишемическими ПП ЦНС между уровнем СИДР, ИЛ-6, экспрессией мРНК М1 -1 в лимфоцитах и параметрами апотоза в пуповиипои и периферической крови к исходу 1-го месяца жизни

5 Разработать критерии ранней диагностики степени тяжести гнпоксически-ишемнческих перинатальных поражении ЦНС

Научная новизна исследования

Определены впервые особенности апоптоза лимфоциюв с цитотоксичсской активностью и его эндогенной регуляции при перинатальных шпоксически-ишемических поражениях ЦНС начиная с антенагалыгаго периода

Установлено, что нарушения регуляции агюптоза лимфоцитов с цитотоксическои активностью в децидуалыюй оболочке плаценты различны при четкой и средней степени тяжести ПП ЦНС, и характеризуются при легкой степени - снижением уровня ФПОа, при среднетяжелых - повышением содержания и Вс1-2 в экстрактах децидуалыюи ткани

Показано, что у новорожденных с ПП ЦНС легкой степени тяжести происходит параллельное усиление экспрессии Гаь-АГ и 1351, на поверхности пуповинных Ц1Л и ЕК, а при средней степени тяжести они снижаются

Впервые выявлено, чго снижение содержания С056+С095Ь-г лимфоциюв в пуповиннои крови является ранним диагностическим критерием легкой степени тяжести, а повышение - критерием тпоксически-ишемических ПП ЦНС средней степени тяжести

Установлено, что в основе б токирования запуска апогпоза лимфоцитов с циготоксической активностью при 1ипоксичееки-ишемических ПП ЦНС средней степени [яжести лежит усиление жснрессии ими мРПК МГ-1 и значительное повышение уровня ИЛ-6 в пуповиннои крови

У здоровых дегеи и дстеи с перинатальными гипоксически-ишемическими поражениями ЦНС различной степени тяжести впервые выявлены корреляционные связи между показателями иммунного апоптоза и уровнем ИЛ-6, С!ГАР и экспрессией мРНК МТ-1 в лимфоцитах, причем их количество, характер и сила различны

Установлено, что уровень ОГАР повышается в пуповинной крови и нормализуется в периферической крови к концу 1-ю месяца жизни при легкой степени тяжести ГШ ЦП С, тогда как при средней степени тяжести уровень ОРАР в пуповинной крови не отличается от аналогичного показателя здоровых новорожденных, и возрастает к исходу первого месяца жизни в периферической крови

Показано, чю к концу первого месяца жизни у детей с гипоксически-ишемическими Ш1 ЦИС независимо от степени [яжести происходит нормализация показателей апонгоза лимфоцитов с цитотоксической активностью Практическая значимость рабо1ы

Получены новые данные об участии иммунных механизмов в формировании перинатальных поражении 1ЩС у новорожденных

На основании исследования иммунологических показателей разработан новый способ ранней диагностики степени тяжести перинатальных I[токсических поражении ЦНС у новорожденных детей

Параметры апоптоза лимфоцитов с циготоксической активностью и регулирующие их факторы могут быть использованы для оценки степени тяжести гипоксичсски-ишемических поражений ЦНС у новорожденных Внедрение результатов работы

Результаты диссертационной работы внедрены в практику акушерской клиники ФГУ «Ивановский научно-исследовагельский институт материнства и детства имени В II Городкова Федерального агентства но высокотехнологичной медицинской помощи»

Поюженкя, выноснмые ил защиту 1 Формирование перинатальных гипоксически-ишемических поражений ЦНС происходит на фоне нарушения апоптоза лимфоцитов с цитотоксической активностью и механизмов его регуляции па уровне плаценты при этом степень тяжести церебральной ишемии у новорожденных зависит от характера изменении процесса запрограммированной клеточной гибели лимфоцитов дегшдуальной оболочки плаценты

2 У новорожденных НП ЦНС легкой и средней степени тяжести также ассоциируются с различными нарушениями аиоптоза лимфоцитов с цитотоксической активностью, которые зависят о г уровня экспрессии мРНК МТ-1 в лимфоцитах и сывороточного содержания ИЛ-6 в пуповинной крови

3 Иммунологические параметры могут использоваться для ранней диагностики перинатальных поражении гипоксически-ишемических ЦНС легкой и средней степени тяжести

Апробация работы

Диссертация прошла апробацию на заседании Ученого Совета ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства им В H Городкова Росмедтехнологий» 10 сентября 2007 года Основные материалы и положения диссертации доложены и обсуждены на Республиканской конференции «Иммунология репродукции» (Иваново, 2005 г ) на обтастной конференции молодых ученых «Молодая наука -развитию Ивановской области» (Иваново, 2005 г), на IX и X Всероссийском научном Форуме им В И Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2005 г, 2006 г) на научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки - 2006» в рамках областного фестиваля «Мочодая наука - развитию Ивановской области» (Иваново, 2006 г), на конференции «Иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006 г), на 2-ой Республиканской конференции «Иммунология репродукции теоретические и клинические аспекты» (Сочи, 2007 г ), на Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и при патологии» (Санкт-Петербург, 2007 г )

Публикации: гго теме диссертации опубликовано 22 печатные работы

Объем и структу ра диссертации

Материалы диссертации изложены на 131 странице машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования» 4 глав собственного исследования, главы «Обсуждение результатов», выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 211 источник отечественных и зарубежных авторов Работа иллюстрирована 15 рисунками и 18 таблицами

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Материалом для исследования служила плацента, пуповинная кровь новорожденных детей и периферическая кровь детей в возрасте 1-го месяца

Исследования проводились в акушерской клинике, отделении 2-го этапа выхаживания недоношенных новорожденных, конеультативно-диашостической поликлинике и в лаборатории клинической иммунологии ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства им В Н Городкова Росмедгехнологий» Всего было обследовано

Таблица 1.

Клинические группы иабчюдеиия

Кон грольная группа (1 группа) Основная группа (11 группа)

36 плацент от женщин, родивших здоровых детей 47 плацент от женщин, родивших детей с ГШ ЦНС ншоксически-ишемическош т енеза легкой и средней тяжести

24 здоровых доношенных новорожденных 31 доношенный новорожденный с ПП ЦНС гипоксически-ишемического генеза легкой и средней тяжести

15 здоровых детей в возрасте 1-го месяца 26 детей с ПП ЦНС гипоксически-ишемического генеза легкой и средней тяжести в возрасте 1-го месяца

Все дети родились доношенными Новорожденные наблюдались клинически до 6 дня жизни и повторно осматривались в возрасте 1-го месяца Диагноз ПИ ЦНС у детей был поставлен на основании клинического осмотра невролога и данных нейросонографии и был подтвержден в 1 месяц жизни

Для проведения иммунологических исследовании получали обогащенные популяции лимфоцитов периферической крови стандартным методом скоростного центрифу1 ирования в градиенте плотности фиколл-верографина (Кго\уп К А, й а1, 1996) Мононуклеарные клетки из лейкоцитарного инфильтрата децидуальной оболочки плацешы выделяли стандартным безфермеигативным методом (СНетуъИоу V Р, й а1, 1993) Для оценки иммунологических показателей

использовали лимфоциты неповинной и периферической крови и децидуальной оболочки плаценты в конечной концентрации 2x106 кл/мл

Поверхностный фенотип лимфоцитов определяли с помощью моноклональных антител (мАТ) методом двухцветной проточной цитофлюоримегрии на приборе РАСЗсап (ВесЮп Пюкнвоп, США) (таблица 2 )

Таблица 2.

Характеристика моноклональных антител, испо »ыованиых в работе

МАТ Клон Фирма-производитель Флюорохром

CD95(Fas/AP DX2 CALTAG Laboratories, США РЕ

0-1)

CD45 ICO-46 НПЦ «МедБиоСпектр», Россия FIT С

CD14 ICO-174 НПЦ «МедБиоСпектр», Россия РЕ

CD95L, FasL Alf-2 1 CALTAG Laboratories, США РЕ

CD8 1CO-31 НПЦ «МедБиоСпектр», Россия FITC

CD16 ICO-116 НПЦ «МедБиоСпектр», Россия FITC

CD56 ICO 186 НПЦ «МедБиоСпектр» Россия FITC

Recombinant - CALTAG Laboratories. США FITC

Annexin V

Propidium lodid - CALTAG Laboratories, США РЕ

Мышиные - Becton Dickinson, США F1FC

IsGl

Мышиные - Becton Dickinson, США РЕ

IgG2a

В качестве флюорохромных меток использовали флюоресцеин изогиоционат (Г1ТС) и фикоэри грин (РГ)

Процедуру окрашивания и фиксации клеток проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика Для анализа неспецифического окрашивания использовали Simultest Control (мышиные IgGl-FITC + igG2a-Pb) ("Becton Dickinson" США) Клетки метили антн-С1)45 и анти-С014 мАТ для наложения оптимального окна дискриминации (гейта) для лимфоцитов на точечном графике прямого и бокового светорассеяния При анализе лимфоцитарный гейт включал не менее 95-98% клеток с фенотипом CD45+CD14- В каждом образце анализировали не менее 10000 клеток Анализ результатов проводили в профамме "LYSYS Н"

Экстракты децидуальной ткани получали из зрелой плаценты Децидуальную оболочку срезали небольшими пластинами и отмывали физиологическим

раствором, перемешивая на магнитной мешалке в течение 15 минут Кусочки децидуальной ткани взвешивали и гомогенизировали с использованием гомогенизатора до однородной массы К полученному гомогенату добавляли PBS в объеме, равном изначальному весу децидуальной ткани (на 1 г ткани - 1 мл PBS) Взвесь помещали в пластиковые пробирки Falcon и подвергали замораживанию при -20°С в течение суток Гомогенат размораживали, фильтровали через 8 слоев плотной марли и ультрацентрифугировали 30 мин при 4000 об/мин при температуре +4°С Надосадочную жидкость разливали мелкими аликвотами и замораживали при -20°С до проведения иммупоферментного анализа

Содержание цитокинов и растворимых форм их рецепторов, Bcl-2, р53, GFAP в экстрактах децидуальной ткани и в сыворотке крови оценивали методом ИФА на микропланшетном ридере Multiscan EX Labsystems (Финляндия) (таблица 3 )

Таблица 3.

Характеристика тест-систем для ИФА, использованных в работе

Исследуемый показатель Фирма-производитель

ФНОа BioSource International, США

sTNFRl BioSource International, США

sTNr RI1 BioSouice International, США

sFas Ligand Bender MedSystems, Австрия

Bcl-2 Bender MedSystems, Австрия

p53 Bender MedSystems, Австрия

ИЛ-6 Bender MedSystems, Австрия

GFAP BioVendor Laboratory Medicine. Inc. Чехия

Для количественной экспрессии мРНК в лимфоцитах использовали метод RT-PCR в режиме реального времени Процедуру выделения тотальной РНК из лимфоцитов проводили стандартным гуанидин-гиоцианат-фенол-хлороформным методом с использованием набора реагентов «Онкоекрин» ООО «ГеноТехнология» (Россия) Данная тест-система позволяет выделить тотальную РНК и получи гь при помощи неспецифической обрагной фанекрипции кДНК из клеток, лизированных в растворе, содержащем гуанидин тиоциаиат, цитрат натрия, саркозил и 2-меркаптоэтанол Полуколичественное определение экспрессии мРНК МТ-1 проводили с использованием стандартного протокола BIOSOURCE INTERNATIONAL Для определения интенсивности флюоресцентного сигнала

использовался прибор iCycler (BIO-RAD, США). Во всех случаях результаты были представлены как n-кратные различия транскрипционного уровня специфического гена в группе ПП ЦНС легкой и средней степени тяжести по отношению к соответствующим показателям в группе без Г1Г1 ЦНС.

Статистическая обработка данных проводилась с расчетом среднего арифметического и ошибки среднего арифметического с использованием программы Microsoft Excel из комплекта Microsoft Office 2000, корреляционный анализ из комплекта «Statistica 6.0».

Результаты работы и их обсуждение

Для уточнения роли материнских факторов в развитии ГШ ЦНС. изучали процессы апоптоза лимфоцитов с цитотоксической активностью и факторы его регулирующие на уровне децидуальной оболочки плацен ты.

Анализ данных показал, что при ПП ЦНС, не зависимо от степени тяжести, повышалась готовность к апоптозу децидуальных CD16+ ЕК, но снижалась у CD56+ лимфоцитов (р<0.001 в обоих случаях) (рис.1).

□ Контрольная группа □ Группа ПП ЦНС □ ПП ЦНС легкой степени ППП ЦНС средней тяжести

Рис.1. Экспрессия Fas на поверхности лимфоцитов с нитотоксической активностью децидуальной оболочки плаценты при ПП ЦНС

* - различия статистически достоверны относительно показателей группы женщин, родивших здоровых детей (* - р<0,05; ** - р<0.02; *** - р<0,01: **** - р<0.001).

Известно. что реализация программы Fas-зависимого апоптоза осуществляется за счет взаимодействия Fas и Fas лиганда (Suda Т.. 1997: Nagata S.. 1999; Ярилин A.A., 2000; Самуилов В.Д., 2001; Олейник Е.К.. 2004). Естественные киллеры являются особой популяцией клеток, которые, с одной стороны, могут запускать апоптоз различных клеток посредством взаимодействия FasL на своей поверхности с Fas-несущими клетками (Suda Т., 1997; Nagata S., 1999), а с другой

экспрессия FasL на поверхности ЕК может защищать их от инициации аиоптоза (Сотникова Н.Ю., 2005).

При ГШ ЦНС легкой степени тяжести выявили повышение экспрессии FasL на поверхности децидуапьных CD56+ ЕК (р<0.01), что может свидетельствовать о накоплении активированных CD56+ ЕК. которые могут оказывать неблагоприятное влияние на плод (King А., 1990; Chen С.Р. et.al.. 2005; Сотникова Н.Ю., 2005: Панова И.А.. 2006). Тогда как при ПП ЦНС средней тяжести наблюдалось снижение экспрессии FasL как на поверхности CD 16+ клеток, так и на поверхности CD56+ ЕК (р<0,01 в обоих случаях) (рис.2.). Следует отметить, что. несмотря на выявленные изменения экспрессии Fas и FasL на поверхности децидуапьных лимфоцитов с цитотокеическим потенциалом, уровень апонтируюших лимфоцитов не менялся ни в одной из анализируемых групп (р>0,05 во всех случаях).

□ Контрольная группа □ Группа ПП ЦНС ОПП ЦНС легкой степени О ПП ЦНС средней тяжести

Рис.2. Экспрессия FasL на поверхности лимфоцитов с цитотоксической активностью децидуальной оболочки плаценты при ПП ЦНС

* - различия статистически достоверны относительно показателей группы женщин, родивших здоровых детей (» - р<0,05; ** - р<0,02; *** - р<0,01; **** - р<0,001).

Мы предположили, что механизмы регуляции апоптоза децидуапьных лимфоцитов, обладающих цитотокеическим потенциалом, при ПП ЦНС легкой и средней степени тяжести различаются между собой.

По нашим данным, при церебральной ишемии легкой степени в экстрактах децидуальной ткани отмечалось низкое содержание ФНОа (р<0.05). который, как известно, является фактором, запускающим апоптоз (Fiers W et al, 1996; Locksley R.M. et al., 2001). Отсутствие изменений уровня рецепторов I и II типа к ФНОа в ткани децидуальной оболочки плаценты при ПП ЦНС (р>0,()5 в обоих случаях), по-видимому, связано с меньшей ролью инициации апоптоза через ФИО-зависимый путь (Fiers W et al., 1996). При церебральной ишемии средней степени тяжести

имеет значение повышение уровня растворимого lasL и

ангиагюитошческого белка Вс1-2 в экстрактах децидуалыюи гкани плаценты (р<0,02 и р<0,01 соответственно) Возможно, повышение sFasL связано с шеддингом I asL молекулы с поверхности ЕК (Hohlbaum Л et al. 2000), что может обуславливать выявленное нами снижение уровня TasL+ децидуальных ЕК.

1аким образом, при ПП ЦНС происходит нарушение процессов регуляции апопгоза лимфоцитов с цитотоксической активностью па уровне децидуалыюй оболочки плаценты, которое при легкой степени тяжести связано с низким уровнем ФНОа в децидуалыюй ткани, а при средней степени - с высоким содержанием sFasL и Вс1-2 Эш нарушения могут приводить к накоплению активированных клонов лимфоцитов с циютоксическои активностью и ткани плаценты, которые, в условиях повышенной проницаемости фетоплаценгарного барьера, могут поступать в кровоток птода и оказывать свое повреждающее действие, в том числе на ткани ЦНС

Известно, что повреждение нервной ткани сопровождается нарушением структурной целостности мембран клеток и выходом неироспецифических белков (НСБ) в интерстициальные пространства ткани головного мозга, а затем распространением их с током ликвора (Barone F С et al, 1993,1 урина О И и соавт, 1996, Berger R et al, 1999, Рогаткин СО и соавт, 2001. Чехонин ВП и соавг, 2004) При этом появление НСБ в периферической циркуляции свидетельствует о патологических процессах, происходящих в ткани мозга, и четко отражает объем повреждения нервной ткани (Гурина О И и соавт, 1996, Рогаткин СО и соавт, 2001, Чехонин В II и соавт, 2004) Нами было изучено сывороточное содержание основного структурного белка асгроцитов - глиофибрил ирного кислого протеина (GFAP) при перинатальных гипоксически-ишемических поражениях ЦНС

Как видно из представленных на рисунке 3 данных, содержание ОГАР в периферической циркуляции при легкой и средней степени гяжссти ПП ЦНС в динамике первого месяца жизни менялось по-разному

Так, у новорожденных с ЦИ легкой степени тяжести уровень GFAP в пуповшшои крови был достоверно выше, чем у детей контрольной группы (р<0,02), а к исходу 1-го месяца жизни его содержание снижалось (р>0,05)

□ Контрольная группа □ ПП ЦНС легкой степени а ПП ЦНС средней тяжести

нг/мл

0,03

0,09

0,06

0

Пуповинная кровь

1 месяц

Рис.3. Сывороточное содержание ОРАР у детей с Г1П ЦНС легкой и средней степени тяжести

*- различия статистически достоверны относительно показателей здоровых детей (* - р<0,05; ** - р<0,02; *** - р<0,01; **** - р<(),001).

В то время как при церебральной ишемии средней степени тяжести уровень ОРАР в пуповинной крови не отличался от параметров здоровых новорожденных

Рядом авторов высказывается предположение, что при ишемических инфарктах в зонах повреждения мозговой ткани отмечается резкое нарушение кровообращения и ликвородинамики, вследствие чего элиминация НСБ из этих участков мозга значительно затрудняется (Рогаткин С.О. и соавт., 2001; Чехонин В.Г1. и соавт., 2004), что возможно и лежит в основе выявленного нами феномена

К концу первого месяца у детей с ПП ЦНС средней степени тяжести, уровень ОРАР был достоверно выше, чем у детей контрольной группы (р<0,05). Эти изменения уровня ОРАР могут быть обусловлены вторичным аутоиммунным повреждением ткани мозга (В1еппо\у М. й а!., 1995: Турина О.И. и соавт., 1996; Рогаткин С.О. и соавт., 2001; Чехонин В.I I. и соавт., 2004).

Подтверждением связи процессов апоптоза лимфоцитов с повреждением ткани ЦНС могут быть выявленные нами корреляционные взаимосвязи между уровнем ОРАР и параметрами апоптоза лимфоцитов у новорожденных. Так, у здоровых детей количество связей между уровнем ОРАР и параметрами апоптоза незначительно, тогда как при ПП ЦНС их количество и сила увеличивается, особенно при легкой степени тяжести.

(р>0,05).

Выявленные нами нарушения регуляции иммунного апоптоза лимфоцитов децидуальной оболочки плаценты сохраняются и в пуповинной крови новорожденных с гипоксически-ишемическими ГШ ЦНС.

Следует отметить, что были выявлены значительные различия изучаемых показателей пуповинной крови при легкой и средней степени тяжести ГШ ЦНС (рис.4).

□ Контрольная группа РПП ЦНС легкой степени ОПП ЦНС средней тяжести

Рис. 4. Экспрессия Fas и FasL на поверхности пуповинных лимфоцитов с цитотоксической активностью при ПП ЦНС

*- различия статистически достоверны относительно показателей здоровых детей (* - р<0,05; ** - р<0,02: *** - р<0,01; **** - р<0,001).

У новорожденных с церебральной ишемией легкой степени тяжести отмечалось параллельное усиление экспрессии Fas-антигена на поверхности ЦТЛ и CD16+ ЕК (р<0,001 и р<0,05 соответственно) и уровня FasL+ ЦТЛ и CD56+ ЕК (р<0.01 и р<0,0()1 соответственно), а при средней степени тяжести все исследуемые параметры пуповинной крови, наоборот, снижались (р<0.05 для CD8+CD95+; р<0.05 для CD56+CD95+; р<0.01 для CD8+CD95L+: р<0,001 для CD16+CD95L+ и р<0,02 для CD56+CD95L+).

Различия отмечались и в показателях аннексиного теста (рис.5).

□ Контрольная группа ЕЭПП ЦНС легкой степени ОПП ЦНС средней тяжести

Рис.5. Параметры апоптоза лимфоцитов пуповинной крови у детей с ГШ ЦНС *- различия статистически достоверны относительно показателей здоровых детей (* - р<0,05; ** - р<0.02; *** - р<0,01; **** - р<0,001).

Так, при легкой степени тяжести они не отличались от параметров здоровых новорожденных (р>0 05 во всех случаях), а при средней степени тяжести наблюдалось уменьшение выхода в апоптоз лимфоцитов пуповинной крови (р<0,02 во всех случаях)

Эш данные согласуются со снижением экспрессии Fas и FasL на поверхности ЦТЛ и ЕК, что, по-видимому, свидетельствует о накоплении активированных клонов лимфоцитов, обладающих цитотоксической активностью

Существует мнение, что постоянный контакт между трофобластом и материнской кровью, которая его омывает, позволяет растворимому FasL находиться как в материнской крови так и в крови плода (Сотникова Н Ю , 2005), что может приводить к шеддингу TasL с поверхности лимфоцитов с цитотоксической активностью

Выявленные различия параметров апоптоза при IIII ЦНС легкой и средней степени тяжести позволили разработать критерий ранней дифференциальной диагностики легкой и средней тяжести ПП ЦНС по содержанию CD56+CD95L+ в пуповинной крови, позволяющий при значениях данного показателя равных или более 7,1% диагностировать легкую степень тяжести а при значениях равных или менее 4,4% диагностировать среднюю аегтень тяжести ПГ1 ЦНС с ючностыо 87,5% (приоритетная справка № 2007134504 от 18 09 2007)

По данным литературы, процесс формирования очагов повреждения нервной ткани при Г1Г1 ЦНС пролонгирован во времени и завершается к концу неонатального периода (Bona Е et al, 1999, Шабалов Н П и соавт, 2003) Учитывая эти данные, мы проанализировали показатели апогпоза лимфоцитов с цитотоксической активностью в периферической крови детей с ПГ1 ЦНС к исходу 1-го месяца жизни Мы не выявили различии в экспрессии FasL на поверхности лимфоцитов с цитотоксической активностью в периферической крови в анализируемых группах В то же время, как при легкой, так и при средней степени тяжести церебральной ишемии отмечалась низкая готовность к апоптозу CD16+ ЕК (р<0,01 и р<0,05 соответственно), что, по-видимому, может приводить к накоплению CD16+ лимфоцитов Это дает основания предполагать что при ПП ЦНС Fas-rasL-

зависимым апопгоз лимфоцитов с щпотоксическои активностью имеет большее значение в раннем неонатальиом периоде

Известно, что апоптоз по I'a.viasL зависимому пути может регулироваться цигокинами (Kavurma M M , Khachigian LM , 2003) в частности есть данные, что ИЛ-6 обладает антиапоптотичесим действием (Chauhan D et al, 1997, Ayroldi E et al, 1998, Mouawad R et al, 2000)

Проведенное исследование уровня ИЛ-6 в нуповинной крови показало, что у новорожденных с гипоксически-ишемичсскими ПП ЦНС легкой степени тяжести он был в 2 раза выше, чем у детей без данной патологии (2,7±0,16 пг/мл у здоровых детей и 5,82±1,16 ш/мл у детей с легкой степенью тяжести, р<0,05) а к концу 1-го месяца жизни его сывороточное содержание не отличалось от контрольных показателей (1,38±0,30 пг/мл у здоровых детей и 1,30±0,35 пг/мл при ЦИ I степени, р>0,05) Toi да как при средней степени тяжести уровень ИЛ-6 в сыворотке пуповиннои крови был в 12,6 раза выше, чем у здоровых новорожденных (34,05±10,39 пг/мл и 2,7±0,16 пг/мл соответственно, р<0 01), но также нормализовался к концу первого месяца жизни (1,38±0 30 пг/мл у здоровых детей и ],04±0,12 пг/мл при ЦИ И степени, р>0,05)

Согласно литературным данным, антиапоптотичсскии эффект ИЛ-6 может реализовываться как за счет даун-регуляции экспрессии Tas и I asL на поверхности клеток (Mouawad R et al, 2000), так и за счет угнетения синтеза антиапоптотического белка Bcl-2 (Teague ТК et al, 1997) Однако следует отметить, что эгох эффект является дозозависимым и реализуется при многократном повышении уровня ИЛ-6 (Mouawad R et al, 2000), что согласуется с выявленными нами нарушениями аноптоза тимфоцитов, обтадающих цитотоксическим потенциалом при ПП ЦНС средней степени тяжести

С целью подтверждения данного предположения был проведен корреляционный анализ взаимосвязей между уровнем ИЛ-6 и показателями апоптоза лимфоцитов с цш отоксическои активностью в пуповшшой и периферической крови у детей 1-го месяца жизни Установлено, что между уровнем ИЛ-6 и показателями апоптоза лимфоцитов с цитотоксической активностью имеются положительные корреляционные связи, причем количество этих связей и

их сила увеличивается у новорожденных с ГШ ЦНС, что подтверждает наше предположение о роли ИЛ-6 в выявленных изменениях иммунного апоптоза.

Помимо дитокинов в регуляции процессов апоптоза участвуют различные белки, в том числе металлотионеины (Won-Chul Suh et al., 1998). Индукция синтеза МТ клетками различного происхождения, в том числе нервной и иммунной систем, является универсальной реакцией на воздействие разнообразных стрессовых факторов, что в итоге приводит к защите клетки от оксидативного стресса и от запуска апоптоза (Abdel-Mageed A. et al., 1997; Won-Chul Suh et al., 1998; Baraboi V.A., Petrina L.G., 2003: Mocchegiani E. et al., 2003: Penkowa M. et al., 2005). По данным Y. James Kang et al. (2003), МТ воздействуют на запуск митохондриального пути апоптоза путем блокирования выхода цитохрома С из митохондрий в цитозоль клетки и активацию каспазы-3. Этот механизм реализуется при блокировании индуцированного гипоксией - реоксигенацией апоптоза клеток (Guang-Wu Wang et

Как видно из представленных на рисунках 6а и 66 данных, при ГШ ЦНС легкой степени тяжести уровень экспрессии мРНК МТ-1 в лимфоцитах пуповинной крови был несколько повышен и снижался к концу первого месяца жизни (КО для МТ-1 в пуповинной крови - 2,98±1.59. к концу 1-го месяца - 0,07±0,03). При средней степени тяжести в лимфоцитах пуповинной крови отмечалось значительное повышение содержания мРНК МТ-1, которое сохранялось и в 1 месяц (КО для МТ-1 в пуповинной крови - 10.44±4,48, к концу 1-го месяца - 2,07± 1,67).

а!.. 2001).

а) пуиовинная кровь

б) периферическая кровь в 1 месяц

15

3

9

6-

ПП ЦНС легкой ПП ЦНС средней

ПП ЦНС легкой ПП ЦНС средней

степени

тяжести

степени

тяжести

Рис. 6. Экспрессия мРНК МТ-1 в лимфоцитах пуповинной (а) и периферической (б) крови в 1 месяц у детей с ГШ ЦНС

За 1 принят уровень экспрессии гена в контрольной группе

Согласно имеющимся литературным данным, ИЛ-6, может

индуцировать сшпез МГ (Zhou IH, Cheng S, 1995). чго хорошо согласуется с выявленным нами многократным повышением уровня ИЛ-6 в пуповинной крови детей с IIII ЦНС средней степени тяжести

Анализ корреляционных связен между уровнем экспрессии мРНК МГ-1 и показателями апоптоза лимфоцитов с циютоксической активностью пуповинной и периферической крови, выявил следующую каргину в норме экспрессия мРНК МТ-1 сильно связана с парамеграми иммунного апоптоза как в раннем, так и к концу позднею неонагального периода, а при ПП ЦНС происходи] нарушение этих связей, чю согласуется с полученными нами ранее данными Учитывая ангиапоптотическое действие МТ, выявленная нами высокая экспрессия мРНК МТ-1 в лимфоцитах при ПП ЦНС средней степени тяжести может защищать активированные ЦТ Л и ЕК от запуска апоптоза, что создаст условия для их накопления, в том числе и в ткани мозга

Таким образом, у новорожденных с ПП ЦНС, также как и в децидуалыюй оболочке плаценты, наблюдается нарушение процессов эндогенной регуляции апоптоза лимфоцитов с цитотоксической активностью, которое зависит от степени тяжести церебральной ишемии При легкой степени тяжести наблюдаются компенсированные нарушения регуляции апоптоза пуповинных лимфоцитов с цитотоксической активностью, тогда как при среднетяжелых поражениях выраженные нарушения регуляции апоптоза лимфоцитов могут определяться высоким уровнем экспрессии мРНК МТ-1 в лимфоцитах и значительным повышением содержания ИЛ-6 в пуповинной крови Другим возможным механизмом, блокирующим апошоз лимфоцитов может быть материнский sFasL циркулирующий в пуповинной крови, что в конечном итоге может приводить к накоплению активированных ЦТЛ и ЕК, которые, проникая через гематоэнцефалический барьер, могут непосредственно повреждать ткань мозга. ВЫВОДЫ

1 Формирование перинатальных гипоксически-ишемических поражений ЦНС ассоциируется с нарушением апоитоза клеток с цитотоксической активностью При ПП ЦНС на уровне плаценты независимо от степени тяжести отмечается высокая

готовность к апоптозу СБ16+ и низкая С056+ ЕЖ Формирование ГШ ЦНС легкой и средней степени тяжести сопровождается различными нарушениями апоптоза лимфоцитов с цитотоксической активностью ле1кая - повышением содержания децидуальных С056+РачР+ ЕК и снижением концентрации ФНОа в экстрактах децидуальной ткани, средняя - снижением уровня С056+ГскЬ+ ЕК и увеличением содержания Вс1-2 и яРачР в экстрактих децидуальной ткани по сравнению с параметрами контрольной группы

2 В пуповинной крови при легкой степени тяжести ПП ЦНС новышаекя готовность к апоптозу ЦТЛ и СГ> 16+ ЕК, уровень С095Ь-позитивных ЦТЛ и С056+ ЕК, и сывороточное содержание ИЛ-6, при средней степени тяжести снижается готовность пу повинных ЦТЛ и С056+ ГЛ< к апоптозу, уровень апоптирующих лимфоцитов, экспрессия РаБЬ на поверхности ЦТЛ и обеих популяции ЕК, и многократно возрастает сывороточное содержание ИЛ-6

3 При ПП ЦНС изменения сывороточного уровня йГАР зависят от степени тяжести патологии и сохраняются до конца 1-го месяца жизни, а именно, при легкой - содержание СРАР в пуповинной крови выше, чем у детей контрольной группы, и нормализуется к концу 1-го месяца жизни, при средней - уровень ОРАР сопоставим с показателями здоровых детей в пуповинной крови, но возрастает в сыворотке периферической крови к исходу 1-го месяца жизни

4 По сравнению с показателем здоровых детей, у новорожденных с ПП ЦНС меняется синтез МТ-1 лимфоцитами при легкой степени тяжести в пуповинной крови отмечается высокий уровень мРНК МТ-1 в лимфоцитах и низкии к концу первого месяца жизни, при средней степени тяжести высокий уровень экспрессии МТ-1 наблюдавшийся в лимфоцитах пуповинной крови, сохраняется до конца первого месяца жизни, то может обуславливать тяжесть данной патологии

5 Выявлены корреляционные связи между показателями иммунного апоптоза, уровнем ИЛ-6, ОРАР и МТ-1, причем их количество, характер и сила различны у здоровых детей и детей с ПП ЦНС и зависят от степени тяжести данной патологии

6 Повышение содержания С056+С095Р+ в пуповинной крови при ПП ЦНС легкой степени тяжести и снижение его при средней степени тяжести является ранним

дифференцированным диагностическим критерием ГШ ЦНС у доношенных новорожденных

Практ ические рекомендации

1 Для оценки степени тяжести ПП ЦНС у новорожденных целесообразно определять в пуповинной крови относительное содержание ЦГЛ и ЕК, экспрессируютцих на мембране Fas FasL молекулы, параметры аннексинового теста, сывороточное содержание ИЛ-6, оценивать уровень экспрессии мРНК МТ-1 в лимфоцитах К концу 1-го месяца жизни в сыворотке периферической крови рекомендуется оценивать уровень ИЛ-6 и GFAP, определять внутриклеточную экспрессию мРНК МТ-1 в лимфоцитах

2 Для ранней диагностики степени тяжести Г1Г1 ЦНС рекомендуется определять содержание CD56+CD95L+ лимфоцитов в пуповинной крови, при значении которого равном или более 7,1% диагностируется легкая, а при значении равном или менее 4,4% средняя степень 1яжеети перинатальных гипоксических поражений ЦНС

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1 Серкина ЕВ Особенности популяционпого состава лимфоцитов пуповинной крови детей с перинатальной патологией, рожденных от матерей с гестозом // Молодые женщины в науке Тез докл Всерос науч конф, Иваново, 2-3 апреля 2004 г - Иваново Иван Гос ун-т, 2004 -340 с - С 263 -264

2 Серкина ЕВ, Панова И А, Кудряшова АВ, Сотннкова ШО Особенности иммунного реашрования новорожденных с перинатальными поражениями ЦНС гипоксически-ишемическото генеза при осложненном течении беременности у матери //Ж «Медицинская иммунология»-2005 - Т7 -№2-3 -С 190

3 Панова И А, Серкина Е В , Сотникова Н Ю , Кудряшова А В Характеристика локального иммунного ответа у женщин с тестозом, родивших детей с перинатальными поражениями ЦНС гипоксически-ишемического генеза // Russian Journal ot Immunology - 2005-Vol 9, Suppl 2-P 179

4 Серкина E В , Сотникова H Ю Кудряшова А В , Жукова Т П Характер продукции цитокинов in vitro клетками периферической крови у новорожденных с перинатальными поражениями ЦНС, рожденных от женщин с гестозом // Russian Toumal of Immunology - 2005 -Vol 9, Suppl 2 -P 228-229

5 Серкина Е В Сотникова Н Ю , Панова И А , Кудряшова А В Состояние локального иммунитета децидуальной оболочки плацент у женщин с гесюзоч, родивших детей с перинатальными поражениями ЦНС //Тезисы докладов 10-йПоволжской научно-практической конференции «Современные пути решения актуальных проблем акушерства и гинекологии» Саратов, 1-2 июня 2005 г - С 215-216

6 Серкина Е В , Сотникова Н Ю , Кудряшова А В Продукция дитокинов in vitro мононуклеарами периферической крови новорожденных детей с перинатальными поражениями ЦНС гипоксического генеза, родившихся у матерей с гестозом // Ж «Цигокины и воспаление» -2005 - Т 4 - №3 - С 144-145

7 Серкина Е В, Сотникова Н Ю, Кудряшова А В Оценка цитокинового профиля у новорожденных с перинатальными поражениями ЦНС, рожденных от матерен с гестозом // Материалы международной научной конференции «Актуальные проблемы адаптации организма в норме и патологии», Ярославль, 12-14 октября 2005 г - С 175-176

8 Серкина ЕВ Панова ИА, Кудряшова АВ, Сотникова НЮ Особенности иммунного реагирования в интерфазе «мать-птад» у женщин с гостозом, родивших детей перинатальными поражениями ЦНС разной степени тяжести // Современные проблемы материнства и детства Сборник научных трудов посвященных 25-летшо института /Под ред Посисеевой Л В, Назарова С Б - Иваново ОАО «Издательство «Иваново» - 2005 г - С 244-251

9 Серкина Е В , Сотникова Н Ю , Панова И А Мание С С Влияние инфицирования беременных женщин с гестозом на формирование перинатальной патологии ЦНС у новорожденных // «Перинатальные инфекции лечить или нет?» Сб научных трудов /Под ред проф И О Буштыревой, Ростов-на-Дону, 2006 г - С 30-31

10 Серкина Е В , Сотникова Н Ю , Панова И А Способ ранней диапюстики перинатальных поражений ЦНС гипоксически-ишемического генеза у новорожденных от женщин с гестозом // Russian Journal of Immunology - 2006 -V 9, Suppl 3 - P 117-118

11 Серкина E В , Сотникова H Ю Нарушения FAS-зависимого апоптоза цитотоксических лимфоциюв децидуальной оболочки плацент женщин, родивших детей с перинатальным поражением ЦНС гипоксически-ишемического генеза // Russian Journal of Immunology - 2006 -Vol 9, Suppl 3 - P 118

12 Серкина E В Сотникова II Ю Панова И А , Крошкина Н В , Садуни И Р Показатели Fas-зависимого апоптоза лимфоцитов децидуальной оболочки плацент у женщин с гестозом, родивших дет ей с перинатальными поражениями ЦНС гипоксически-ишемического i енеза //Ж «Медицинская иммунолог ия» - 2006 - Т 8 - № 2-3 - С 320

13 Серкина Е В , Сотникова Н Ю , Панова И А , Крошкииа Н В , Садуни И Р Роль иммунных реакций в децидуальной оболочке плацент у женщин с гестозом в формировании

перинатальной паююпш у новорожденных // Материалы 8 Всероссийскою научною форума «Мать и дигя» - Москва, 3-6 октября 2006 г - С 238

14 Серкина ЕВ Сотпикова НЮ Характер изменении Fas-инду цировашют о апоптоза лимфоцитов п)повинной крови у новорожденных с перинатальными типоксичеекпми поражениями ЦНС II Ж «Физиология и патология иммунной системы»- 2006- №10 (приложение I) - С 56-57

15 Серкина ЕВ Сотннхова НЮ Особенности апошоза гецидуальных лимфоцитов с цтотокспческой активностью у женщин, рочившнч детей с перинатальными пшоксическими поражениями ЦНС различной степени тяжести //Ж «Вестник Уральской медицинской академической науки» -2006 -№3-1(14) - С 200-223

16 Серкина Е В Особенности ГЛБ-зависимого апоппта лимфоцитов половинной крови у новорожденных с перинатальными поражениями ЦНС // Материалы научно-практической конференции студентов и мо юды\ ученых ИвГМЛ «Неделя науки - 2006» в рамках областного фестиваля «Молодая наука - развитию Ивановской обпасти», Иваново, 19-27 апретя 2006 г -С 125-127

17 Серкина Е В , Сотникова Н Ю , Писарева С Е Иммунный апоггтоз естественных киллеров \ детей 1-го месяца жизни с перинатальными поражениями ЦНС // Сборник материалов XI конгресса педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии», Москва, 5-8 февраля 2007 г -С 616-617

18 Серкина ЕВ Сотпикова НЮ Писарева СЕ Динамика показателей апоптоза цитогокснческич лимфоцитов у детей 1-го месяца лензни с перинатальными пп токсическим и поражениями ЦНС различной степени тяжести // Russian Journal ot Immunology - 2007 -Vol 9, Suppl 4 - P 115

19 Сотникова НЮ, Серкина В В, Кудряшова AB Роль апопгоза естественных киллеров децидуштыгой оботочки плаценты в формировании перинатальных типоксических поражений ЦНС // Russian Journal oflmmunolog) - 2007 -Vol 9, Suppl 4 - P 116

20 Серкина ЕВ, Сотникова НЮ Особенности Гач-зависимого апоптоза пуповинпых лимфоцитов с циютоксической активностью у новорожденных с перинатальным поражением ЦНС пшоксическото 1епеза //Ж «Вопросы практической педиатрии» -2007 -Т 2 , С 10-12

21 Серкина ЕВ Роль иммунного апогпоза в формировании перинатальных птоксическнх поражений ЦНС у новорожденных //Материалы научно-практической конференции стутенюв и молодых ученых ИвГМА «Неделя пауки - 2007» в рамках областного фестиваля «Молодая наука - развитию Ивановской области» 16-20 апреля 2007 г - С 133

22 Serkina Е V, Sotrakova N Yu, Kudryasliova А V The role of apoptosis ot decidual natural killers in the development ot perinatal hypoxic-ischemic CNS lesions of infants'/International

Symposium Interaction ot the nervous and immune systems 111 health and disease Abstracts, Saint-Petersburg, Russia.- 2007 - May 31 - June 2 - P 80 23 Приоритетная справка па изобретение «Способ ранней диагностики степени тяжести перинатальных гипоксических поражений ЦНС у доношенных новорожденных» № 2007134504 от 18 09 2007 года

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ:

АГ - антиген

АЗКЦ - антителозависимая клеточная цитотоксичность AT - антитела

ГЭБ - гемаголщефалический барьер

FK - естественные киллеры

ИЛ - интерлейкин

ИФА - иччуноферчентный анализ

ИФНу - интерферон у

мАТ - моноклональные ант итета

МНК - мононуклеарные клетки

мРНК - матричная рибонуклеиновая кислоы

МТ - металлонюнеины

ПП ЦНС - перинатальные поражения центральной нервной системы

ТФРр - трансформирующий фактор роста ß

1х- Т-хелпер

ЦИ - церебральная ишемия

ЦНС - центральная нервная система

ЦТЛ - цитотоксический Т-лимфоцит

ФНОа - фактор некроза опухоли а

ФПН - фетотацснтарная недостаточность

Вс1-2 - В-клеточной лейкемии'личфомы подобный протеин

CD - cluster of differentiation (кластер дифференцировки)

Fas - синтетаза жирных кислот

FasL -лиганд Fas

sFasL - растворимая форма FasL

F ITC - флюоресцеин изотиоционат

GAPDH - глицеральдегидфосфатдегидрогеназа

GFAP - глиофибрнллярный кислый протеин

PBS - фосфатный буфер

Подписано в печать 06 04 2008 Формат 60\84 1/16 Печать плоская Уч-изд л 1,16 Печ л 1,5 Уел печ ч 1.75 Заказ №142т Тираж 105 экз

Изд лицензия ЛР №010221 от 03 04 1997 Отпечатано в ОАО «Издательство «Иваново» 153012, г Иваново, ул Советская, 49 Тел 32-67-91 E-mail riaivan(?T:mail ru

Актуальность темы исследования.

На современном этапе доказана тесная взаимосвязь иммунной и нервной систем, направленная на поддержание постоянства внутренней среды организма (23). Нарушение этого взаимодействия ведет к развитию ряда заболеваний (23). Особенно актуальной проблема изучения взаимосвязи между нервной и иммунной системами является для новорожденных в условиях постнатальной адаптации (15, 23, 91, 92, 133), поскольку перинатальные поражения ЦНС занимают одно из ведущих мест в структуре заболеваний новорожденных (2, 7, 54). Более того, они являются частой причиной детской инвалидности (54). При этом заболевания нервной системы, приводящие к инвалидизации и дезадаптации детей, в 70-80% случаев обусловлены воздействием перинатальных повреждающих факторов (2). Одним из таких факторов является хроническая внутриутробная гипоксия, развивающаяся вследствие целого ряда осложнений беременности (18, 49, 50). Известно, что гипоксия инициирует запуск каскада патологических процессов, развитие которых в течение определенного промежутка времени может приводить с одной стороны, к гибели нервных клеток путем апоптоза (54), а с другой вызывать различные иммунологические сдвиги (137).

У новорожденных с перинатальными поражениями ЦНС изменения иммунологических показателей связаны как с нарушением регуляции иммуногенеза, так и с непосредственным влиянием гипоксии на состояние иммунной системы (137). Проведенные ранее исследования иммунологических параметров периферической крови детей с 1111 ЦНС, свидетельствуют об изменении показателей клеточного, гуморального и врожденного иммунитета, усилении процессов активации клеток иммунной системы, повышении ряда провоспалительных цитокинов (4, 9, 15, 16, 26, 32, 38, 45, 46, 47). Однако лишь единичные работы описывают особенности иммунологических показателей в зависимости от степени тяжести 1111 ЦНС (4, 26).

В последние годы значительное количество работ посвящено изучению нейронального апоптоза в экспериментах на животных (72, 87, 147, 205), однако, практически отсутствуют исследования, посвященные изучению апоптоза лимфоцитов у новорожденных детей с перинатальными гипоксическими поражениями ЦНС. Поэтому представляет интерес изучение апоптоза пуповинных и периферических лимфоцитов, в частности, обладающих цитотоксической активностью, у детей с ПП ЦНС различной степени тяжести.

Становление иммунной системы детей в периоде новорожденности в значительной степени связано с особенностями течения беременности у их матерей (18, 25, 30, 35, 53). По данным некоторых авторов, длительное воздействие антенатальных повреждающих факторов на плод, приводит к нарушению иммунобиологических взаимодействий в системе мать-плацента-плод, изоиммунозации организма матери и антигенной стимуляции организма плода, связанной с повышенной проницаемостью плаценты при хронических патологических состояниях матери (54). Это ведет к нарушению становления нейроэндокринной регуляции и иммунного гомеостаза новорожденного (54). В частности, известно, что такое осложнение беременности как гестоз, не только часто приводит к формированию фетоплацентарной недостаточности, но и сопровождается выраженными нарушениями локального иммунного ответа на уровне плаценты (35, 44, 53).

В связи с этим, особую актуальность приобретает исследование апоптоза лимфоцитов и его эндогенной регуляции не только у детей с ПП ЦНС, но и у женщин на уровне плаценты.

Недостаточно изученными также остаются эндогенные факторы, направленные на ограничение и восстановление очагов поражения нервной ткани. Изучение этих особенностей позволит уточнить механизмы формирования ПП ЦНС различной степени тяжести у новорожденных и разработать новые методы ранней диагностики ПП ЦНС.

Цель работы: установить роль механизмов апоптоза лимфоцитов с цитотоксической активностью и его эндогенной регуляции, в формировании перинатальных гипоксически-ишемических поражений ЦНС у доношенных новорожденных и разработать критерии ранней диагностики степени тяжести ПП ЦНС.

Задачи:

1. Охарактеризовать основные параметры Fas-зависимого апоптоза лимфоцитов с цитотоксической активностью и его эндогенной регуляции на уровне децидуальной оболочки (ДО) плацент женщин, в пуповинной и периферической крови у доношенных новорожденных с перинатальными гипоксически-ишемическими поражениями ЦНС (1111 ЦНС).

2. Дать сравнительную характеристику содержания GFAP в сыворотке пуповинной и периферической крови к концу 1-го месяца жизни у здоровых новорожденных и детей с гипоксически-ишемическими 1111 ЦНС.

3. Оценить экспрессию мРНК МТ-1 в лимфоцитах пуповинной и периферической крови к концу первого месяца жизни у здоровых детей и новорожденных с гипоксически-ишемическими ПП ЦНС.

4. Установить наличие взаимосвязи у здоровых детей и детей с гипоксически-ишемическими ПП ЦНС между уровнем GFAP, ИЛ-6, экспрессией мРНК МТ-1 в лимфоцитах и параметрами апоптоза в пуповинной и периферической крови к исходу 1-го месяца жизни.

5. Разработать критерии ранней диагностики степени тяжести гипоксически-ишемических перинатальных поражений ЦНС.

Научная новизна исследования:

Определены впервые особенности апоптоза лимфоцитов с цитотоксической активностью и его эндогенной регуляции при перинатальных гипоксически-ишемических поражениях ЦНС начиная с антенатального периода.

Установлено, что нарушения регуляции апоптоза лимфоцитов с цитотоксической активностью в децидуальной оболочке плаценты различны при легкой и средней степени тяжести ПП ЦНС, и характеризуются при легкой степени — снижением уровня ФНОа, при среднетяжелых — повышением содержания sFasL и Вс1-2 в экстрактах децидуальной ткани.

Показано, что у новорожденных с ПП ЦНС легкой степени тяжести происходит параллельное усиление экспрессии Fas-АГ и FasL на поверхности пуповинных ЦТЛ и ЕК, а при средней степени тяжести они снижаются.

Впервые выявлено, что снижение содержания CD56+CD95L+ лимфоцитов в пуповинной крови является ранним диагностическим критерием легкой степени тяжести, а повышение — критерием гипоксически-ишемических ПП ЦНС средней степени тяжести.

Установлено, что в основе блокирования запуска апоптоза лимфоцитов с цитотоксической активностью при гипоксически-ишемических ПП ЦНС средней степени тяжести лежит усиление экспрессии ими мРНК МТ-1 и значительное повышение уровня ИЛ-6 в пуповинной крови.

У здоровых детей и детей с перинатальными гипоксически-ишемическими поражениями ЦНС различной степени тяжести впервые выявлены корреляционные связи между показателями иммунного апоптоза и уровнем ИЛ-6, GFAP и экспрессией мРНЕС МТ-1 в лимфоцитах, причем их количество, характер и сила различны.

Установлено, что уровень GFAP повышается в пуповинной крови и нормализуется в периферической крови к концу 1 -го месяца жизни при легкой степени тяжести ПП ЦНС, тогда как при средней степени тяжести уровень GFAP в пуповинной крови не отличается от аналогичного показателя здоровых новорожденных, и возрастает к исходу первого месяца жизни в периферической крови.

Показано, что к концу первого месяца жизни у детей с гипоксически-ишемическими ПП ЦНС независимо от степени тяжести происходит нормализация показателей апоптоза лимфоцитов с цитотоксической активностью.

Практическая значимость работы: Получены новые данные об участии иммунных механизмов в формировании перинатальных гипоксически-ишемических поражений ЦНС у новорожденных.

На основании исследования иммунологических показателей разработан новый способ ранней диагностики степени тяжести перинатальных гипоксических поражений ЦНС у новорожденных детей (приоритетная справка № 2007134504 от 18.09.2007).

Параметры апоптоза лимфоцитов с цитотоксической активностью и регулирующие их факторы могут быть использованы для оценки степени тяжести гипоксически-ишемических поражений ЦНС у новорожденных. Положения, выносимые на защиту:

1. Формирование перинатальных гипоксически-ишемических поражений ЦНС происходит на фоне нарушения апоптоза лимфоцитов- с цитотоксической активностью и механизмов его регуляции на уровне плаценты, при этом степень тяжести церебральной ишемии у новорожденных зависит от характера изменений процесса запрограммированной клеточной гибели лимфоцитов децидуальной оболочки плаценты.

2. У новорожденных ПП ЦНС легкой и средней степени тяжести также ассоциируются с различными нарушениями апоптоза лимфоцитов с цитотоксической активностью, которые зависят от уровня экспрессии мРНК МТ-1 в лимфоцитах и сывороточного содержания ИЛ-6 в пуповинной крови.

3. Иммунологические параметры могут использоваться для ранней диагностики перинатальных поражений гипоксически-ишемических ЦНС легкой и средней степени тяжести.

Реализация результатов работы:

Результаты диссертационной работы внедрены в практику акушерской клиники ФГУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи».

Апробация работы:

Диссертация прошла апробацию на заседании Ученого Совета ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства им. В.Н.Городкова Росмедтехнологий» 10 сентября 2007 года. Основные материалы и положения диссертации доложены и обсуждены на Республиканской конференции «Иммунология репродукции» (Иваново, 2005 г.), на областной конференции молодых ученых «Молодая наука — развитию Ивановской области» (Иваново, 2005 г.), на IX и X Всероссийском научном Форуме им. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2005 г., 2006 г.), на научно-практической конференции студентов и молодых ученых ИвГМА «Неделя науки - 2006» в рамках областного фестиваля «Молодая наука — развитию Ивановской области» (Иваново, 2006 г.), на конференции «Иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006 г.), на 2-ой Республиканской конференции «Иммунология репродукции: теоретические и клинические аспекты» (Сочи, 2007 г.), на Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и при патологии» (Санкт-Петербург, 2007 г.).

По материалам диссертации опубликовано 22 печатных работ.

Структура и объем диссертации:

Материалы диссертации изложены на 131 странице машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 4 глав собственного исследования, главы «Обсуждение результатов», выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 211 источник отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 18 таблицами.

ВЫВОДЫ:

1. Формирование перинатальных гипоксически-ишемических поражений ЦНС ассоциируется с нарушением апоптоза клеток с цитотоксической активностью. При 1111 ЦНС на уровне плаценты независимо от степени тяжести отмечается высокая готовность к апоптозу CD 16+ и низкая CD56+ ЕК. Формирование ПП ЦНС легкой и средней степени тяжести сопровождается различными нарушениями апоптоза лимфоцитов с цитотоксической активностью: легкая -повышением содержания децидуальных CD56+FasL+ ЕК и снижением концентрации ФНОа в экстрактах децидуальной ткани; средняя - снижением уровня CD56+FasL+ ЕК и увеличением содержания Вс1-2 и sFasL в экстрактах децидуальной ткани по сравнению с параметрами контрольной группы.

2. В пуповинной крови при легкой степени тяжести ПП ЦНС повышается готовность к апоптозу ЦТЛ и CD 16+ ЕК, уровень С095Ь-позитивных ЦТЛ и CD56+ ЕК, и сывороточное содержание ИЛ-6; при средней степени тяжести снижается готовность пуповинных ЦТЛ и CD56+ ЕК к апоптозу, уровень апоптирующих лимфоцитов, экспрессия FasL на поверхности ЦТЛ и обеих популяций ЕК, и многократно возрастает сывороточное содержание ИЛ-6.

3. При ПП ЦНС изменения сывороточного уровня GFAP зависят от степени тяжести патологии и сохраняются до конца 1-го месяца жизни, а именно, при легкой — содержание GFAP в пуповинной крови выше, чем у детей контрольной группы, и нормализуется к концу 1-го месяца жизни; при средней - уровень GFAP сопоставим с показателями здоровых детей в пуповинной крови, но возрастает в сыворотке периферической крови к исходу 1-го месяца жизни.

4. По сравнению с показателем здоровых детей, у новорожденных с ПП ЦНС меняется синтез МТ-1 лимфоцитами: при легкой степени тяжести в пуповинной крови отмечается'высокий уровень мРНК МТ-1 в лимфоцитах и низкий к концу первого месяца жизни; при средней степени тяжести высокий уровень экспрессии МТ-1 наблюдавшийся в лимфоцитах пуповинной крови, сохраняется до конца первого месяца жизни, что может обуславливать тяжесть данной патологии.

5. Выявлены корреляционные связи между показателями иммунного апоптоза, уровнем ИЛ-6, GFAP и МТ-1, причем их количество, характер и сила различны у здоровых детей и детей с 1111 ЦНС и зависят от степени тяжести данной патологии.

6. Повышение содержания CD56+CD95L+ в пуповинной крови при ПП ЦНС легкой степени тяжести и снижение его при средней степени тяжести является ранним дифференцированным диагностическим критерием ПП ЦНС у доношенных новорожденных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Для оценки степени тяжести 1111 ЦНС у новорожденных целесообразно определять в пуповинной крови относительное содержание ЦТЛ и ЕК, экспрессирующих на мембране Fas FasL молекулы, параметры аннексинового теста, сывороточное содержание ИЛ-6, оценивать уровень экспрессии мРНК МТ-1 в лимфоцитах. К концу 1-го месяца жизни в сыворотке периферической крови рекомендуется оценивать уровень ИЛ-6 и GFAP, определять внутриклеточную экспрессию мРНК МТ-1 в лимфоцитах.

2. Для ранней диагностики степени тяжести 1111 ЦНС рекомендуется определять содержание CD56+CD95L+ лимфоцитов в пуповинной крови, при значении которого равном или более 7,1% диагностируется легкая, а . при значении равном или менее 4,4% средняя степень тяжести перинатальных гипоксических поражений ЦНС.