Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Иммуноферментный анализ галактозилтрансферазы на основе моноклональных антител в диагностике рака яичников

Н'Ч

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах' рукописи

МИХАЙЛОВ Андрей Дмитриевич

Е."5УНО*ЕР!.ЖНТ1ШЙ АНАЛИЗ ГАЛАКТОЗШГГРАНС§ЕРАЗЫ- НА ОСНОВЕ ШИОКЖШЛШН АНТИТЕЛ В ДИАГНОСТИКЕ РАКА ЯИЧНИКОВ.

(14.00.14 - Онкология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - \Ш г.

Работа выполнена в лаборатории экспериментальной диагностики опухолей Всесоюзного онкологического научного центра АМН СССР (директор - академик Н.Н.Трапезников).

Научные руководители: доктор биологических наук А.А.Глемжа кандидат.медицинских наук П.К.Иванов

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук Л.С.Бассалык доктор медицинских наук Н.Н.Голубева

. Ведуцев учреждение - Московский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский онкологический институт ш. П.А.Герцена КЗ РСФСР.

Защита диссертации состоится " " ¿ЯЯА/3/* 1992 г.

в /¿f часов на заседании специализированного Ученого совета

»

(К. 001.17.01} Всесоюзного онкологического научного центра АМН СССР (115478, Москва, Каширское ш., 24).

С диссертацией цокно ознакомиться в библиотеке ВОНЦ АМН ССС] Автореферат разослан ûexaèpf 199/ г.

Ученый секретарь специализированного ученого совета док»

тор медицинских наук, профессор

В.С.Турусов •

ürmtiitsi

* 'АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕШ. Уступая по заболеваемости лишь раку мои шейки матки, злокачественные опухоли яичшпсов аштин"одной из наиболее распространенных нозологических Форм гокачествепных новообразований у яешцин и прочно занимают пер-)9 место по относительной смертности. Одними из главных причин •ого являются: скрытое течение, неявная симптоматик'а, и, как 'ог, поздняя диагностика заболевания. Поэтому очевидно, что »актическому здравоохранению крайне необходимы простые, достойте, легковыполнимые методы для выявления больных злокачест-ШНЫШ опухолями ЯИЧ1ШКОВ. К ним относятся и методы In vitro [ализа опухолеасооциированных антигенов.

В литературе описаны попытки использования для диагностики iKa яичников раково-эмбрионального антигена (РЭА), хорионичес-!Го гонадогропина (hCG), опухолеасооциированных антигенов -125, СА-15-3 , MCA, TAG-72. Из них лишь СА-125 получил кли-[ческоо признание.

Активный поиск опухолевых маркеров позволил получить новые .нные о роли ферментов - гликозилтрансфераз, обеспечивающих :оспнтез углеводных компонентов гликоконъюгатов - гликопротеи-'В и гликолшидов, в том числе всех упомянутых маркеров. Уже :оло 20 лет в литературе периодически появляются сведения о 'змояном участии в развитии опухолевого процесса. Одному из х - галактозилтрансферазе (ГалТ, К.Ф.2.4.1.38'/, посвящена эта бота.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Основной целью настоящего исс-дования являлась разработка иммуноферментного диагностикума я определения галактозилтрансферазы, основанного на монокло-льных антителах и оценка его клинической значимости в'диаг-стике рака яичников.

В связи с этим были поставлены и решались следующие задачи:

1. Определить оптимальную схему выделения и наработать не-ходимое для дальнейших исследований количество галактозилт-нсФеразы человека. Охарактеризовать полученные препараты.

2. Получить гибридому-продуцент моноклональных антител КАТ) к галактозилтрансферазе человека; дать их биохимическую иммунологическую характеристику.

3. Разработать эффективный метод очистки ГалТ человека, с пользованием высокоспецифичных моноклональных антител к этому

е;

Ферменту. ' -.

4. Модифицировать • й адаптировать -к условиям *клиническ< применения радаоизотопный метод определения активности ГалТ.

5. Разработать на. оснрве комбинации г,¡оно- и яоликлоналы антител высокочувствительный/. специфичный и удобный метод иш

, нофермейтного определения .концентрации ГалТ в биологичеа жидкостях; провести контроль качества разработанного диагнос кума. '

. В. Выявить клиническую значимость определения активности и - концентрации ГалТ для диагностики рака яичников, в сравне: с тестами на известные опухолеассоциировашые антигена.

.' .НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЙ. Получена гибридоыа-продуц монокл'оналышх антител к галактозилтрансферазе; продуцируе ею антитела имеют уникальные параметры, позволяющие исполъ вать их как для высокоспецифичного количественного иммуномет ческого анализа, так и для эффективного хроматографическ препаративного выделения фермента. Впервые на основе коыбина моно- и поликлональных антител разработана имшунофермент тест-система для определения концентрации ГалТ, отвечающая с ременным требованиям контроля качества, предъявляемым к имму Ферментным диагностикумам.

У больных раком яичника обнаружено статистически достов ^ ное повышение как активности, так и концентрации ГалГ с выр кеной корреляцией меэду гестами. Выявлено, что клиническая с чимость тестов на ГалТ в выявлении рака яичников оказал: 'выше, чем у тестов на другие, известные в настоящее_время с холеассоцшрованныа антигены. Установлено, что совместное г меяение тестов на ГалТ и СА-125 существенно повышает чувсч тельность диагностики рака яичников.

Практическая ценность.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ.ЦЕННОСТЬ; Полученная гибридоиа-прс " цент моноклональных-антител к галактозилтрансферазе может I лужить основой '.для - дальнейшего, изучения роли ГалТ в разв! опухолевого процесса и .'метаболизма опухолеассоциированных ал генов. .'•'.' ' ■ . ' .

. Впервые показана возможность препаративною выделения

э.ктозилтрансфэразы человека иммунсаффшшой хроматографией на ¿мобилизованных моноклональных антителах. Разработанный имму-эаффшшохроматографический метод очистки ГалТ позволил значи-зльно сократить время очистки фермента и повысить его. выход.

. Разработан и апробирован в условиях клиники иммун&Фермонт-лй диагностику!» для количественного анализа ГалТ, показаны его эзможности для диагностики рака яичников, дана основа для оп-эделения показаний к его использованию при других локализациях пухолей. Полученные результаты о независимом изменении показа-элей ГалТ и гликопротеиновых опухолеассоциированных антигенов озволяют отрицать причастность экстраклеточной ГалТ к синтезу шкопротвтоъ.

В 198С и 1990 годах работа получила Финансовую поддержку а конкурсной основе от ШТК "Биоген".

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Диссертация апробирована на совместной аучной конференции лабораторий экспериментальной диагностики, абораторш клинической биохимии, отделения .гинекологии ВОНЦ МН СССР 29 октября 1990 г.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 146 трашщах машинописного текста и состоит из введения, обзора итературы, описания материалов й методов, результатов со$с-венных исследований, обсуждения и выводов. Работа иллюстриро-ана 20 рисунками и 8 таблицами. Библиографический указатель одержит ссылки на 212 источников на русском и английском язн-:ах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Для определения активности галактозилтрансферазы мы выбра радиометрический метод с использованием в качестве системы ра деления ионоббменной смолы. Порог чувствительности реакции с ределялся радиохимической чистотой УДФ-14С-М-адетилглюкозаш1-на к составлял около 1,7 нмоль/ыл/час.

• Для наработки первичных препаратов ГалТ мы выбрали схему использованием аффинной хромадографии на альфа-лактальбуъопге негативной ишуноаффинной хроматографии на поликлональных ант телах к сумме белков плазмы крови человека. Выделение ал Фа-лактальбумина состояло из 3 стадий: кислой преципитации к зеияа, гель-проникающей хроматографии на сорбенте Тоуореа Ш60 и хроиачофокусированин на колонке Mono Р HR5/20 в диапаз не pH 4-6; A-JIÄ-агароза синтезировалась из активированной Вг агарозы. ХроматограФическое выделение ГалТ с помощью а-ЛА-аг розы проходило последовательно в 2 этапа. Выделение поликл дальних иммуноглобулинов против суммы белков плазмы крови чел века проводилось аффиннохроматографически на белок-А-агароз сорбент синтеировался пришивкой иммуноглобулинов к эпоксиакт виро^анкой агарозе. Негативная аффлнная хроматография на а TH-human-arapo3s проходила в колонке 0.38x15 см. Для определ ния Физикохишческих свойств препарата использовалие SDS-электрофорез, изоэлектрофокусирование и аналитическая гел: проникающая хроматография высокого* разрешения на колон: Superóse RR10/30. Для контроля чистоты и подлинности мы испол: зовали тшуноэлектрофорез и иммуноферментное тестирование контрольными моноклональными антителами.

Поликлональные антитела (ПНАГ) к ГалТ получены после ими; низации морских свинок, тестирование иммунных ответов и прове] ка моноспецифичности поликлональной антисыворотки; Выделен] ПКАТ к ГалТ проводилось аффиннохроматографически на 6i лок-А-агарозе.

Получение моноклональных антител (ШАТ а-ГалТ). Тестиров; ния на положительные клоны проводились иммуноформентно, клош рование гибридомы проводилось методом предельных разведешп масштабирование клеток велось in vitro. Криоконсервация гибрщ ных клеток проходила в 10% ДОСО. Очистка МКАТ а-ГалТ провода лась методом аффинной тиофильной хроматографии на Т-геле. Д: характеризации ЖАТ а-ГалТ были определены типы легких и тякс лых цепей - иммуноферментно, изозлектрическая точка - изоэлек-; рическим фокусированием в агарозном геле, константа ассоциащ взаимодействия МКАТ-галактозшггрансФераза - после мечетшя }Ш а-ГалТ 1ЕВ1 на границе фаз с использованием иодогена - по Скетчарду.

В качестве активиоованной матрицы для получения аФФшшог сорбента с ШАГ а-ГалТ использовалась CNBr-активированная ara роза. Ишукоаффинная хроматография ГалГ проводилась на колош« l,6xlOi,ш, элюентом служил ЗМ KCNS.

Конъкгировшше ПКАТ а-ГалТ с пероксядазой хрена проводилос периодатныи методом по Nakane; тестирование иммунореактивност полученных коныогатов проводилось иммуноферментио. Контроль ка чества шмуноферментной тест-системы проводился в соответствк .с методическими рекомендациями МЗ СССР.

В работу включены результаты обследования 154 больных заболеваниями яичников и 51 здорового лица контрольной групп пы. Злокачественные опухоли яичников имели 96 больных; 46 боль ных имели доброкачественные и пограничные опухоли яичников; 1 человек были больны воспалительными заболеваниями.

о

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. 1. Выделение галактозилтрансферазы и получение к ней moho клональных антител.

Получение моноклональных антител к ГалТ мы считалй необхо-шм этапом в создании иммуноферментного теста для 1?оличест-яного определения фермента, поскольку только их высокая спе-$ичность могла обеспечить получение достоверных результатов, гественно, для этого было необходимо наработать достаточное яичество ГалТ. Первичное выделение препаратов галактозилт-зсферазы (ГалТ) проводилось четырехстадийно. На этапе первич-i обработки из 2. о литров асцитной жидкости, взятой от боль-3 раком яичника, с активностью ГалТ 0.65 нмоль/мл/мин, было пучено 12.4 г белкового концентрата с удельной активностью 26 эль/г/мин. Дальнейшая очистка белкового концентрата проводить в два этапа последовательно на альфа-лактальбумин-агарозе не. 1 и 2). В результате было получено 29 и 8 мг белка с зльными активностями 33 и 109 нмоль/мл/мин, что дает 13.8 и ■кратную очистку соответственно.

Последней стадией первичного выделеншя ГалТ была негатив-1 аффинная хроматография на иммобилизованных антителах против шы белков плазмы человека. Препарат при хроматографии выхо-i в виде единственного белкового пика (рис.ЗЬ В результате ютки было наработано 6,6 мг ГалТ с активностью 119 нмоль/мл/ I. Таким образом выход фермента составил 10.9%.

Получение препараты ГалТ были охарактеризованы Физико-хи-гески. В SDS-электрофорезе при окраске геля Coomasi R250 пре-)ат давал единственную полосу'в области 51 КД. Для альтерна-шого определения молекулярной массы Фермента была проведена ■аттическая гель-проникающая хроматография на Superóse 12 10/30. На предварительно откалиброванной колонке ГалТ выходив виде единственного пика (рис.4), соответствующего молеку-эной массе 46 КД. При.изоэлектрическом Фокусировании в уль-iTOHKOM геле акрила1пада.:. прейкраты давали до 14 различных юс (рис. что, f вvOCHOBñqMiJ. соответствует литературным

пшм и. Ьёидб'ГёльФ'Гв^у'.0;-внсо1^;Г'вФврогвнао<5'га Фермента. Для ггроля.юмуномпягчейкой.../ чистоты hjperiapáTa ГалТ. бил.проведс-н зекреСТньй 1шМуноэлёк^^офорез- против- антеолйсротки к ■'■ судаар- ■ <. бй®?км-'плазмц..крови:-.яелЦвёйа.;В;^

йцйи .но; была';о*бнаруженоу-. .'-что' доказывает-. отсу'тагшо. в'.прйпа- ■ ге.^примеси;сывороточных. белк'0,й'. -.)■■'' ••'■■--••'•.

Чтобы удостовериться в подлинности препарата, мы воспо зовались ыоноклональньши антителами к ГалТ человеческого мо ка, любезно предоставленными нам доктором Eric G. Berger (Ве кий университет, Биоцентр). В иммуноферментнол тестирова (антиген на твердой Фазе,, выяйление моноклональными антитела проявление антивидовьш коныогатом) была получена ела (00=0.350), но достоверно отличающаяся от контроля реакц Опыт однозначно подтвердил, что наш препарат иммунохимиче является галактозилтрансферазой человека. Однако построе тест-системы на одних только поликлоннальных антителах не мо Обеспечить ни высокой аналитической специфичности, поскольку молекуле ГалТ ■ обнаружены высокоимуногенные неспецифические тигенные детерминанты, ни технологичности, ни достаточно вы кой диагностической чувствительности. '

Для получения ыоноклональши антител бралась мышь, иест ратно иммунизированная ГалТ - титр антител сыворотки 1:2500 Спленоцдты селезенки этой мыши были слиты при помощи ПЭГ клетками несекретируадей миеломы SP2/0-Ag.l4. В процессе сел ции продуктов слияния на среде HAT было обнаружено 4 клона-п дуцента ыоноклональных антител (МКАТ). Клон, дававший мак Мальный титр антител, получил авторское название JIC3E11 и депонирован во Всесоюзной коллекции НИИ Цитологии АН СССР Ленинград) за порядковым ног,юром ДП-273.

Для выделения ШАТ мы воспользовались аффинной тиофиль хроматографией на "Т-геле" (рис. 6). Из 100 мл бессывороточ среды выделялось до 1.4 иг антител, это дает ооотввтстве концентрацию антител в среде 14 ыкг/мл, что достаточно ш: для культивирования гибридом на безсывороточных средах в сте онарной культуре. Полученные МКАТ были охарактеризованы laaij логически и Физико-химически. Определение типов легких и т; лых цепей иммуноглобулинов в ELISA показало, что секретируе Î4KAT относятся к классу Ig!-! и имеют легкув цепь типа каппа, определении специфичности этих антител юс реакция с сорбиро! ными раково-эыбриональнш антигеном (РЭА), орозоыукоидом, ч« веческш сывороточный альбумином а сывороткой крови доне различных груш не превышала Фоновую - по отношению к пров« ной гамме антигенов, МКАТ были специфичны. Изоэлектрическоа кусирование в агарозноы Ù.rt% геле, имеющем поры, достато' для миграции таких крупных белков, как иммуноглобулины клг М, позволило определить' значение лзоэлектрической точки ани - 8.0, .

Для определения константы ассоциации 50 мкг МКАТ было по-чено 1ЕВ1 гетерогеннофазовым иодогеновым методом. Определение нстанты ассоциации взаимодействия антиген-антитело основыва-сь на конкуренции меченого 1йв1 МКАТ продуцируемых ЛСЗЕ11 с кими же "холодными" антителами за сорбированную ГалТ. Рассчет оводился по Скетчарду константа аффинности данных .ЖАТ была ределена равной 1.8б*108. 3

Полученные характеристики антител позволили определить льнейшую стратегию работы: значение Касс показывало, что ан-тела, очевидно, подойдут и для иммуноферментной реакции, и я иммуноаФФинной хроматографии, поскольку Касс на слиаком ма-010е) и, следовательно, будет обеспечивать надежную элими-цию антигена из его источника, но и не слишком велика «10е) этому мошго предположить,что антиген будет сниматься с колон-в достаточно щадящих условиях; тот Факт, что антитела отно-тся к классу видимо, препятствует их использованию в ви-конъюгата с пероксидазой из-за значительной молекуллярной ссы и, следовательно, низкой скорости диффузии и большого емени, необходимого для установления термодинамического рав-весия в системе. Однако данные о специфичности подтверждали игодность ШАТ как для использования в тест-системе вместе с ликлональшаш антителами, так и для шмуноаффинной ' хроматог-фии, позволяв рассчитывать на высокую степень очистки при ом способе, й, наконец, значение изоэлектрической точки 8.0 вало практические указания для установления"рН среды при сор-ии на пластике - - не менее : 9.0, и при иммобилизации на Вг-активированной агарозе - не менее 9.5 .

2. Разработка иммуноаффшшохроматографического способа выделения ГалТ с использованием ЖАТ.

Поскольку способ очистки ГалТ на сорбентах с альфа-л^к-льбуминоы (несмотря на все его преимущества) не лишен таких достатков, как использование импортного (или самостоятельно удоемко очищенного) альфа-лактальбумина.и оптически чистого N цетилглюкозамина, он многостадиен и обеспечивает сравнительно высокий выход Фермента, то выглядело достаточно перспективным пытаться использовать для разработки более совершенйого мето-очистки ГалТ моноклоналыше антитела. МКАТ были иммобилизо-ны на СШг-активированной агарозе. Хроматограмма имела вид,' обращенный на рис. 7. Видно, что не вся активность ГалТ свивалась с колонкой (как, впрочем, и при хроматографии на альфа

-лактальбумин-агарозе - рис.2). В значительной степени повыск связываемость ГалТ с аффинным носителем удалось путем цикличе кого пропускания образца через колонку. Хроматография на МКАТ ГалТ, иммобилизованных на агарозе, давала степень очистки пе вичнообработанного асцита - концентрата ГалТ в 106 раз за од стадию, что значительно превышает степень очистки на альфа-ла тальбумине; выход на данной стадии составляет 20%. Несмотря высокую степень очистки, препараты, полученные таким путем, с держали некоторое количество примесей сывороточных белков, в; являемых при иымуноэлектрофорезе. Поэтому для финальной очист; мы пользовались негативной аффинной хроматографией на . ишуно: лобулинах кролика против суммы белков плазмы человека (рис.6 В таблице 1 представлены сравнительные данные по выделению Га по ранее описанной методике и новой, с использованием МКАТ. К<

Таблица 1. Результаты очистки галактозилтрансферазы (по активности).

МЕТОД

Трехстаднйный метод с использованием аффинной хроматографии на а-ЛА-агарозе jChatterJee '85].

Разработанный нами двустадийный метод основанный на нммуно аффинной хроыатогра-Графии на МКАГ-антн-ГалГ-агарозе

видно из таблицы, предложенный способ при схожей степени очист ки дает полуторократный выигрыш в выходе Фермента, имеет на од ну стадию меньше и основывается на биотехнологическом продукт! с постоянными свойствами - МКАТ к ГалТ. ■"'

3, Разработка кшуноферментного метода анализа галактозил-трансферазы на основе моноклональных антител. При разработке ишуноферментной тест-системы для определе ния галактозилтрансферазы, мы остановили выбор на "сендвич" ва' рианте. Было изготовлено 2 коныогата из иммуноглобулинов, выде ленных из различных антисывороток. Конъюгаты был] протестированы на сохранение иммунореактивности в ELISA - одш

Стадия 1 Стадия 2 Стадия 3 Финально

ст.оч.|выход I % 1 ст.оч.|выход 1 % 1 ст.оч.(выход I % 1 ст.оч.(выход 1 % 1

13.8 | 29 9.7 1 47 1 1.2 | 81 1 161 ] 10,9

1 105 | 20 1 1 1 1.23 | 79 1 1 1 1 1 1 1 129 | 16.0

[X них имел титр 1:400, другой 1:6400.

На стенки лунок полистиролового планшета сорбировались ЖАТ к ГалТ, планшет промывался от избытка несвязавшхся {.ЖАТ, I в лунки вносились разведения измеряемых образцов и стандарт-ше растворы антигена. Планшет инкубировался, лунки промывались I в них вносился конъюгат ЛКАТ с перонсидазой хрена. Посла.нн-субацш и"промывки реакция проявлялась раствором хромогена -зго окраска была пропорциональна количеству ГалТ в образцах.

Оптимизация аналитических параметров набора включала несколько этапов. Концентрация ШАТ для посадки варьировала от 1 цо 40 мкг/мл. Было установлено, что концентрации от 5 до 40 даг/нл дают примерно одинаковые положительные результаты, но при концентрации б мкг/мл наблюдается значительный разброс в пробах калибровочной кривой, поэтому была выбрана концентрация 10 мкг/мл - как наиболее экономичная из оптимальных. Рабочий диапазон определяемых концентраций антигена выявлялся на сериальных разведениях ГалТ от 20 мкг/мл до 0.1 нг/мл . Концентрации юске 0.5 нг/мл не отличались достоверно от нулевого стандарта; при концентрациях 250 нг/мл и выше калибровочная кривая выходила на "плато". Такой диапазон чувствительности требовал 100-кратного разведения образцов сывороток крови, и дальнейшая оптимизация тест-системы велась в направлении "загрубления" чувствительности и перевода рабочего участка калибровочной кривой в ■ область более высоких концентраций. '>

После подбора оптимальных концентраций ' компонентов тест-системы было необходимо установить оптимальные условия реакции. Экспериментально установленное время сорбции ШАТ на планшет было 18 часов; более продолжительная сорбция, например, в точение 70 часов, не меняла параметров реакции. По сравнению с комнатной температурой сорбция при +4°С давала меньший разброс оптической плотности между лунками. Время инкубации с антигенным препаратом было выбрано 60 мин при 37°С - при меньшем времени система не достигала равновесия и, Функционируя по сути дела, в кинетическом режиме, тлела весьма пологую калибровочную кривую и невысокие значения оптической плотности. Наибольшие сложности вызвал подбор условий инкубации конъюгата ПКАТ с перонсидазой хрена. При малом времени инкубации значительным влиянием обладала неравномерность прогрева плашки в инкубаторе, проявляющаяся в виде так называемого "краевого эффекта" и зна-' чительнных разбросов оптических плотностей в повторах проб. При времени инкубации дольше оптимального ' стремительно нарастала

неспецьФическая сорбция конъюгата и связанная с этим фоно! реакция. Компромисными условиями оказались инкубация в тече] 40 мин в воздушном инкубаторе при 37°С. Калибровочная крш одного из оптимизированных наборов показана на рис. 8 . Вида что калибровочный график практически линеен в пол/логарифмич< ких координатах, и наклон кривой не меняеется во всем диапа: концентраций.

Аналитический.контроль качества включал определение чу! твительности, воспроизводимости и достоверности. Чувствител ность (здесь и далее оптимизированных тест-систем) состав! при измерении в 3 постановках тест-системы 2.2±0.8 нг/мл; раЕ чий диапазон составил от 3 до 2000 нг/мл; воспроизводимость пробах с низкой, средней и высокой концентрацией антигена сс тавила соответственно (К.В.) 9.5, 8 и 7.7&. Таким'образом, к эФФициеыт вариации не превышает 10%, что можно считать удовле верительным для лабораторной модели.. Тесты на параллелизм "восстановление" использовались как показатели достоверное! Тест на параллелизм, иллюстрирующий независимость от рьзвел ния, дает калибровочный график, практически параллельный пол ченноыу при сериальном разведении сыворотки. Коэффициент корр ляции мовду ними составил 0.99. Это означает, что аятиг надежно определяется тест-системой вне зависимости от развед ния. Результаты теста на "восстановление" представлены в табл це 2. Таким образом, разработанная нами тест-система, основа у ная на моноклональных антителах к ГалТ обладает высок чувствительностью, специфичностью, дает достаточно широкий ди пазон определяемых концентраций, соответствует критериям к честна, предъявляемым к ищу ноФерментным диагностикумам и ы жет использывать.ся для определения уровня галактозилтрансфера в биологических жидкостях.

Табл.3 - Открытие ГалТ в тесте на "востановление"

Внесенная | концентрация 333+20 111+20 37+20 8+20

Открытая концентрация 345 105 50 32

% открытия 98 ! 80 | 1 87 114

. Определение значимости тестов на ГалТ в диагностике злокачественных опухолей яичника. .1. Радионуклидный анализ активности галактозилтрансферазы. езультаты определения активности ГалТ в крови здоровых щин, женщин с острыми воспалительными или с обострением хро-еских воспалительных заболеваний яичников, больных-с добро-:ествешшми и злокачественными заболеваниями яичникоь! разных тотипов представлены в табл. 3.

Табл.3.

Активность галактозилтрансферазы [нмоль/мл/час] в сыворотке крови обследованных лиц.

=И

Группы

Число обследованных

ГалТ М ± сигма

а=0.05 1зд 12 3

Здоровые лица 51 25. 6 + 4.9

Острые воспалительные

заболевания 13 31 9 ± 8.6 2. 41 *

, КИСТЫ 12 33. 6 ± 9.8 2. 73 *

, Фибромы, текомы и

миомы ' 17 34 2 ± 8.7 3. 46 *

. Аденомы 17 41 8 ± 15.5 4 45 *

- Доброкач. суммарно 46 36 9 ± 12.3 3 9 *

. Серозные аденокарц. . Муцинозные аденокарц. 39 48 5 18.8 5 55 * а

И 42 5 + 14.5 '4 75 «

. Аденокарциномы 8.1 »

смешанного строения 7 45 О + „6 84 я

. Альвеолярные и

солидные раки 8 46 О 12.0 3 56 »

3.Низкодифференцированные

карциномы 4 68 1 ± 7.2 13.2 й *

1.Эндометроидные и свет-

локлеточные карщшош 8 48 6 £ 10.'9 7 92 й *

2.Папиллярнососочковые £

карциномы 5 44!.0) 4.9 6 55 К-

- Раки суммарно 82 457' 8 * 15.6 6 51 « ■X

3.Злокачественные неэпи-

телиальные опухоли 8 4®. 5 а 15.г 3 95 *

=11

где

1 - статистически значило по отиоиенет к. сруппе здоро-

ВЫХ Л1Щ

2 - статистически значило по отношения) к лвдппе боль-

ных острыми воспалительными заболевалдгяж

3 - статистически значимо по отношению к группе 'боль-

ных с доброкачественными опухолями У больных с воспалительными заболеваниями1 яичников средне!) ачешга активности ГалТ выше, чем у здоровых сташетичес-

ки достоверно, хотя только у 30.7Я больных наблюдается повыли шй уровень активности ГалТ; Во всех случаях это были больны! обострением хронических заболеваний - анекстов и салышнгоо' рита.

У больных с кистами также отмечалось статистически дос верное повышенное среднее значение активности Фермента; ¡ больных имели повышенные активности. Схожие результаты были i лучены и в группе больных различными доброкачественными опу; лями, хотя процент больных с повышенным уровнем активности Г; был выше - 42%. Совершенно иная картина наблюдалась у болы цистаденоыамп - ■ среднее значение активности ГалТ превосхоя установленный предел нормы и уже 62.3% больных имело значе] активности Фермента выше контрольного, причем одна больная i розной папиллярной цистаденомой имела активность сывороточ] галактозилтрансферазы 91 нмоль/мл/час, что является довол: редким значением даяе при распространенных опухолях.

Наиболее высокие активности ГалТ в периферической крови еыявили у больных различными злокачественными заболевания! , При серозных, муцинозных и смешанных аденокарциномах, а та: при альвеолярносолидных раках, папиллярнососочковых, эндомен, "метроидных и мезонефроидных карциномах наблюдались сход: средние значения активностей фермента (от 42.5 до 4: нмоль/мл/час). Процент больных, имеющих повышенный по отноше; к контрольному, уровень активности Фермента, составил: для " ч розных аденокарцином - 84,6 , для муцинозных аденокарщшо) 62,5 , для аденокарцином смешанного строения (серомуцинозных 66,0 , для альвеолярносолидных раков - 75,0 , для Папиллярно^ сочковых карцином - 100 и для эндоматроидных и ыезрнефроид; карцином - 87.5 . У больных с низкодифференцированшми карци ыами среднее значение активности ГалТ составило 6: нмоль/мл/час - это в полтора раза выше, чем при других Фор: злокачественных опухолей.

Не было выявлено зависимости активности ГалТ от степ распространенности опухолевого процесса. Среднее значение ; тивности в группе больных I стадией составило 54,39±1 'нмоль/мл/час, II - 49,98115,48 , III - 53,96±20,29 и IV 47,06121,4. Статистически достоверных отличий мезду группами обнаружено. Получошшо данные показывают, что даке при забо вании в I стадии активности ГалТ достигают высоких значен что до определенной степени мог.ет быть шагом к более ранней агностике рака яичника.

Определение активности ГалТ у больных раком, доброкачеет-енныш опухолями и воспалительными заболеваниями яичника пока-ало достаточно высокую чувствительность и специфичность теста; сновшм его недостатком остается технологическое иесоверпенст-ю - использование радионуклида, дорогих тшноргных реактивоа, ¡ложность проведения.

2. Иммуноферментный анализ галактозилтрансФерагы.

Наряду с определением активности галактози^трапсфзрззы, н

!

гех se группах обследованных Л1Ш ш измеряли с nouer,ью разработанного наш иммуноферменгаого диагностику!^ на сскове 1ЖАТ сс-цертание ГалТ Результаты определения уровня ГалТ представлен:! п табл.5.

Табл.5.

Концентрация галактозилтрансферазы [нг/мл] в сыворотке крови обследованных лиц. '

-И

N Группы Число ГалТ a =0 05

обследованных M ± сигма t3fl 1 2 3

1. Здоровые лица 51 413±122

2. Острые воспалительные

заболевания • 11 5651133 3.3 «

3. Кисты И 586+117 3.9 •s

4. Фибромы, текомы и

шюмы 15 497t124 2.1 H

5. Аденомы 17 . 596+170 3.97 «

- Доброкач. суммарно 43 559+147 4.06 «

6. Серозные аденокарциномы 38 806+340 5.32 * * *

7. 3. Муцинозше аденокарц. Аденокарцинош 11 738+182 6.18 я * *

смешанного строения 7 710±95 5.93 * # *

9. Альвеолярные и о

солидные раки 6 687+178 4.46 «

10 Низкодифференцировашшэ

карцинош 4 851+82 6.88 * « «

11 Папиллярнососочковые

карцинош 5 634+213 3.2 «

12.Эндоыетроидкые и свет-

локлеточные карциномы 7 739±188 5.44 s * *

- Раки суммарно 78 764+267 6.09 if •ч *

13 Злокачественные неэпи-

И—тг телиальные опухоли 6 656+157 4.11 *

где 1 - статистически значимо по отнопешш к группе здоровых лиц

2 - статистически значимо по отноиегаш к группе боль-

ных острыми воспалительными заболеваниями

3 - статистически значимо по отношению к груше боль-

ных с доброкачественным! опухолями

Определенно содержат« ГалТ в сыворотке больных дало значительно более высокую вариабельность результатов, чем в случае активдаата ГалТ- Соответственно определялся иной спектр диагностических параметров метода. У больных острыми воспалительными и с обострениями хронических воспалительных заболеваний яичников среднее значение галактозилтрансферазы было как, и в случае активности Фермента, повышено. Вместе с тем, процент случаев с превышением верхней границы нормы (М+2сигмы= 656 нг/ мл) был ниже (15,4%) по сравнению с активностью ГалТ у этой группы. Ин-''' тересно, что во всех случаях повышенного ^одеркания ГалТ была повышена и активность Фермента.

Число больных с кистозными -заболев^-шями, имеющих повышенный уровень ГалТ, выше, чем при воспалительных заболеваниях -36,4%; иное полокекие в группе больных Фибромами, миомами и те-0 комамиь если средний уровень ГалТ и повышен, то ни одного случая превышения порогового значения ш не отметили. У больных ■аденомами уровень сывороточной ГалТ был значительно повышенным; довольно рчсоким был и процент превышения верхней границы нормы - 41,2. Не во всех случаях повышенная активность ГалТ соответствовала повышенному содержанию Фермента, но при всех случаях повышенного уровня сывороточной ГалТ активность также превышала норму, с

У больных злокачественными опухолями яичников наблюдался большой разброс концентраций ГалТ значений между группами в зависимости от гистологической Формы, чего нельзя сказать об активности Фермента. При серозных аденокарциномах средняя концен-' трация сывороточной ГалТ была значительно повышена; в этой ке группе наблюдались и наиболее высокие индивидуальные значения -до 2420 нг/ыл. Из 38 больных данной группы уровень, превышающий верхнюю границу нормы обнаружен у 30,'что составляет 78.9%-"несколько меньше, чем при измерении активности ГалТ в данной группе. У больных ыуцинозными цистадеиокарциномами среднее по группе значение ниже; ниже и диагностическая чувствительность -63.3%. Еще более низкие значения уровня ГалТ сыворотки крови и чувствительности обнаружены у больных, относимых к другим четырем группам: цистаденокарциноыам смешанного строения (1), аль. веолярносолидным ракам (2), папиллярнососочковым карциномам (3) и мезонефроидным'.-и эндометроидным карциномам (4). При этом в . группах' больных с альвеолярносолидными и папиллярнососочковыми ркками средние значения не имеют статистически достоверных от-'

личий ни от группы больных доброкачественными опухолями, ни от группы больных острыми воспалительными заболеваниями. Процент больных в группах с указанными заболеваниями, имеющих повышенный в сравнении с контрольным уровень ГалТ сыворотки, составил соответственно: 1-71.4%, 2 - 50Я, 3 - 60% и 4 - 57Л%. Как и в случае активности ГалТ, несколько особняком стоит немногочисленная группа больных с низкодиФФеренцировашшми карциномами: среднее значение в этой груше максимально и диагностическая чувствительность равна 100%. В целом, лри злокачественных опухолях эпителиального происхождении с выбраннйм дискриминационным значением, равным 656 нг/мл, чувствительность теста составила 77%, специфичность по отношении к контрольной группе - 100%.

Как и в случае измерения активности ГалТ, мы не отметили статистически достоверных различий между группами больных ряком яичников, объединенных по стадиям. Средние значения составили: для I стадии - 784+337, II - 7771246, III - 862+437 и IV - 763+ 230 нг/мл. Здесь мы также наблюдаем относительную незавлсии-!«ость от степени распространенности процесса и определенную Перспективу для более ранней диагностики.

Также как и для теста на активность, при использовании им-муноферментного диагностикума (ИМ) на ГалТ мы получили достаточно высокие ' показатели диагностических чувствительности и специфичности при раке яичника. Кроме того, метбд более прост, технологичен и дешев, и следовательно, более перспективен. Анализ показывает, что оба теста определяют одну субстанцию - га-лактозилтрансферазу (Е.Ш.2.4.1.38) человека. Разные ЫзДходы позволяют определять либо ферментативную активность, ййбо уровень антигена; радионуклидный способ, погллуй, более адекватен при препаративном выделении фермента, иммунофер.ментный дешевле, проще и технологичней - болыпо подходит для клинических целей.

3. Диагностическая значимость тестов на активность и содержание ГалТ в комплексе с определением опухоассоциированных антигенов - РЭА, СА-125, СА-15-3, СА-19-9, МСА - у больных заболеваниями яичника.

Сравнительные исследования с комерческимии ¡шмунометричес-кими тестами на раковоэмбриональный антиген (РЭА), опухолевые антигены СА125, СА15-3, СА1Э-9, муцинозный антиген (МСА) проводились на том же клиническом материале. Хотя данные антигены (кроме СА-125) не являются специфичными или ассоциированными с

раком яичников ' (определение таковых рекомендуется преимущественно при раках лселудочно-кшечного тракта /РЭА/, молочной железе /СА-15- 3 и МСА/ и подкелудочной железы /СА-19-9/) их определение как антигенов с „. глеводными детерминантами, контролируемыми, соответственно, в процессе синтеза галакто-зилтрансферазой, но.ло дать дополнительную информацию о механизм ее экспрессии при опухолевых и предопухолевых состояниях.

Первой задачей, выясняющей необходимость'дальнейшего рассмотрения данных, было определение независимости тестов. Для этого материал был разделен на 4 группы, в каждой из которых была определена корреляция между определениями различных маркеров. Из проведенных измерений явствует, что тесты можно считать независимыми. Единственным исключением является, видимо, пара СА-15-3 и МСА, показыЕзкщая во всех рассмотреных группах высокую корреляцию между собой. В принципе, мокно было ожидать определенной корреляции активности ГалТ и рассматриваемых антигенов. Основанием этому, могло служить то, что " галактс .зилтшнефераза непосредственно, участвует в биосинтезе данных антигенов глшеопротеиновой и гликолипидкой природы; отсутствие же выраженной корреляции может предполагать малую вовлеченность сывороточной ГалТ в процесс биосинтеза гликановыи цепей 1., 'соответственно, преимущественно внутриклеточный синтег углеводных детерминант антигенов. СА-125, СА-15-3, СА-19-9, F3i и МСА.

Анализ определения оваркаяьноГо антигена СА-125 заслуживаем отдельного внимания, поскольку на сегодня, это, пожалуй, единственный антиген, рекомендованный для диагностики рака яичников Сводные данные по имыунорадиометрическому определению СА-12! приведены в табл.8..

При. острых и обострении хронических восполительных заболе ваний среднее значение выше, чем в корме но статистически не достоверно вследствие больших индивидуальных колебаний. Две и 9 бгльных имели повышенный уровень антигена (62 и 109 ед/ыл).

У больных с доброкачественными опухолями яичников ни в од ной из.трех подгрупп не наблюдалось статистически достоверног отличия среднего значения от контрольного. У двух больных: од ной - серозной папиллярной цистаденоиой пограничного типа, hps гой - Фиброаденомой, уровни СА-125 были значительно повышень Повышение сопровождалось у обеих больных повышением активности а у первой также и концентрации ГалТ. Большой 1штерес буде

н=

Табл.8

Значения антигена СА-125, определенные в различных группах

N Группы

Число М± х

обследованных

Диапазон Пов. % значений Пов.

1. Здоровые лица

2. Острые воспалительный заболевания

3. Кисты

4. Фибромы, текомы и миомы

Ь. Аденочы

- Доброкачественные

суммарно

6. Серозные аденокарцинош 27

7. Муцинозные аденокарцинош

8. Аденокарцинош смешанного строения

9. Альвеолярные и солидные раки

10.Низкодифференцированные карциномы

11. Пагшллярнососсчко'вые карциномы

12.Эндометроидные и свет-локлеточные карциномы

- Раки суммарно

13.Злокачественные неэпителиальные опухоли.■

42 21,5±19,б 0,9 -94,3 2 4,76

20

Б

50

36,9±50,9 29,7

21,5411.9 29,7+17,4

26,5114,6 348 ± 285

226 ± 380

126 ± 205

360 1 313

550

123 ± 111

230 ± 235 278 ± 275

2,3 - 162 25 - 34,3

6.5 -36,6

8.6 - 258

6,5 - 258 6,3 -5010

12,6- 900

0,6 - 432

6,5 - 720

6,5 - 260

5,2,- 500 0,6 -5010

2 22,2

а *

О О

2 22.2

2 10

20 74.1

3

30

2 ' 50

3 75 а *

3 75

3 34

60 68

ч=

5 37,3±40,2 8,8 - 107 1 20

=Й

, где * - не достаточно наблюдений

- Пой. - число случаев повышения'

% Пов. - % повышения (диагностическая чувствительность) представлять мониторинг этих больных, так как совместное повышение уровней данных маркеров могло быть сдедствиом активного развития злокачественного процесса.

При всех видах злокачественных опухолей эпителиального происхождения, средние значения в группах, несмотря на чрезвычайно большие индивидуальные колебания, статистически достоверно отличались от уровня здоровых лиц, превышая его в 3 - 12 раз. Несмотря на имеющееся в литературе указание на преимущественное повышение этого антигена при серозных аденокарциномах , мы отмечали значительное превышение контрольного уровня и при других гистотипах; правда, следует за!,ютить, что наибольшие индивидуальные значения отмечались именно у больных серозными опухолями. Диагностическая чувствительность варьировала в зависимости от гистологической группы между 50 и 75%, составляя в целом по группе больных раком яичников 68%. Это нижа чувствительности, показанной тестами как на активность, так и на со-

И

держание ГалТ. 'В ряде случаев повышение уровня СА-125 было параллельно повышению активности и/или уровню ГалТ; в ряде случаев маркеры показывали независимое повышение, -и, следовательно, дополняли друг друга. Д-я рассмотрения дополняемости тестов на СА-125 и на ГалТ были посчитаны диагностические чувствительность и специфичность при их сочетанном использовании. Лишь в 57.7% случаев повышенным оказался уровень обоих маркеров (СА-125 и хотя бы одного из показателей ГалТ), хотя ни в одном случае здоровых лиц, больных восполительными заболеваниями или больных доброкачественными опухолями не было повышения одновременно двух маркеров (100% специфичность). С др^.'ой стороны, повышение хотя бы одного из маркеров при раке яичников наблюдалось (для пары СА-125 - ГалТ радиологически) в 86.6% и (для пары СА-125 - ГалТ ишуноферментно) в 82.2% случаев (повышение хотл бы одного из показателей ГалТ или СА-125 - в 88.8%).

Как видим, овариальный антиген СА-125, хотя и несколько уступает тестам на ГалТ по чувствительности, является достаточно ,эф$ активным тестом. Кроме того показано,.лто уровень СА-125 зависит от массы опухоли и распространенности заболевания, подходит для мониторинга. Чрезвычайно перспективно, на наш взгляд, сочетанное применение этих тестов, которое может дать значительные выигрыш в чувствительности диагностики рака яичника. .

Определение других опухолевых маркеров - раковоэмбриональ-ного антигена (РЭА), антигенов СА-15-3, СА-19-9 и МСА - велось у тэх же больных, что и при измерении ГалТ. Сводные результаты определения этих маркеров приведены в табл.9.

Табл.9

Концентрации опухолеассоциированних антигенов РЭА, .СА-15-3, СА-19-9 и МСА в сыворотке крови.

И Д Л= ' Л ,, JI— .и

МСА | М ± сигма

Группы

РЭА(риа) М ± сигма Пов/группа % Пов.

СА-15-3 | СА-19-0 | М ± сигмаМ ± сигма |

Пов/группа % Пов.

Пов/группа % Пов

Пов/группа % Пов.

Здоровые лица

5.5 ± 8.31

14.6 ±4.61

22.7 ±11.6

8.76.±7.63

Больные доброкачественными опухолями

5.37 ±3.92 1 / 15 6.7

14.2 ± 5.8 1 / 18 5.6

44.3 ±66.1 3/16 18.8

11.0 ±7.59 О / И О

1 2 3 4 5

Больные раком яичников 10.2114.26 8/28 28.6 43.3 +44.5 17 / 31 54.8 + 42.0 ±33.1 6/26 23.1 + 16.±12.6 4 / 13 30.8

Больные неэпит. злокач. опухол. яичников Н-'- ........ 8.18 ±8.93 1 / 5 20 1—^-П-5Г * lr=-J--Ч-Lt * л -а-=t * -J

, где * - недостаточно данных;

+ - показатели по группе с. лтистически достоверно отличаются от группы здоровых лиц (а=0.05)

(концентрация РЭА в нг/мл; остальных антигенов в ед/мл) ° Данные, пригеденша в табл.9 свидетельствуют о том, что все рассмотренные маркеры имеют повышенное, по сравнению с контрольным, среднее значение в группе больных раком яичников. Повышенным в данном случае, как и при описании других маркеров, считался уровень, превышающий сушу среднего и удвоенного стандартного отклонения; . дискриминационные уровни, таким образом, определены для РЭА - 11.9 нг/мл, для СА-15-3 - 23.85 ед/ил, для СА-19-9 - 45.9 ед/мл и-для МСА - 24 ед/мл. Раково-эмбриональный антиген несколько повышен в группе больных раком яичников, статистически недостоверно по отношению к группе здоровых лиц.

Статистически достоверное отличие от контрольной группы имело среднее значение уровня антигена СА-15-3 у больных раком яичника. Хотя данный тест считается ассоциированным с раком молочной келезы, он продемонстрировал определенную чувствительность - почти 55% - и при рака яичников. Средний уровень антигена при раке также достоверно отличался от среднего уровня при доброкачественных опухолях. Из 9 случаев рака яичников с нормальными уровнями ГалТ и СА-125, концентрация СА-15-3 также не была повышена ни-в одном; очевидно, поэтому, что данный тест не может служить дополняем более эффективных тестов на ГалТ и СА-125. О

Несмотря на тенденции повышения уровня СА-19-9 у больных доброкачественными опухолями яичников, достоверных отличий от контрольной группы мы не выявил!. Только у 6 из 26 больных раком яичгапсов уровень антигена СА-19-9 превышал дискриминационное значение. Из них'половина имела мущшозные аденокарциномы. В связи с малочисленностью наблюдения сделать определенные выводы не представляется возможным, однако сам Факт повышения содержания СА-19-9 у больных мущшозным раком яичшшоз заслуживает внимания. На основании проведенных исследований мопшо сделать вывод о том, что использование теста на СА-19-9 ни в качестве самостоятельного, ни в комплексе с другими маркерами для диагностики рака яичников неэффективно.

■ 20 вывода.

1. Получена, охарактеризована и депонирована во Всесоюзной коллекции института Цитологии гибридома-продуцент моноклональ-н ix антител к галактозилтрансферазе Определено, что монокло-наыше антитела относятся к классу IgM, имеют константу ассоциации около 2*10а и, благодаря своим уникальным характеристикам, применимы как для иммуноаФФинной хроматографии, так и для иммуноферментного анализа. - - ■ . '

2. Разработанный метод очистки с использованием иммуноаФФинной хроматографии на иммобилизованных коноклональных антителах позволяет достичь максимального выхода галактозилтрансфера-зы при одновременном снижении количества стадий и времени процедуры. Установлено, что независимо от способа очистки галакто-зилтрансфераза человека чаеет молекулярную массу около 51 КД и гетерагенна по изоэлектричееким точкам. ' -

3. Разработан, оптимизирован и прошел контроль качества имуноферментный диагностикуы для определения галактлозилтранс-Феразы т использованием моноклональных антител.1Диапазон определяемых с помощью диагностикума концентраций ГалТ составляет 2-2ООО нг/мл, общее время анализа -.22 часа, набор удобен в работе, основывается только на отечественных рактивах. ■ .

4. Тесты на активность и концентрацию галактозилтрансфера-зы имеют высокую (81 и 77% соответственно) диагностическую чувствительность в отношении рака яичников. Вместе с тем, при фактически идентичных .диагностических характеристиках, иммуноферментный диагностикум гораздо проще в исполнении, в одном тестировании определяет до 35 образцов, не использует радиоактивных изотопов, что позволяет рекомендовать его для клинического применения. Тест, на активность болео применим при препаративном выделении ГалТ. ; , "'•*-.' . -.'"V• • . ■ -

■ - 5'. Не обнаружено корреляции" между активностью и концентра-. ии"й ГалТ.с одной стороны и уровнями опухолеассоциированных ан-^iP'sBÖB CA-125, СА-15-3, СА-19-9, МСА и РЭА с другой, что может быть следствием прешушественно внутриклеточного синтеза олиго-сахаридных детерминант этих антигенов и малой вовлеченности в этот, процесс экстраклеточной галактозилтрансферазы. , .

6. Несмотря на то, что тест на овариальный антиген СА-125 имеет более низкую в сравнении с определением ГалТ диагностическую чувствительность - ; 683, их сочетанное использование с ГалТ позволяет, поднять •ч^гвствйтельнрсть in. vitro диагностики рака яичников. .До i'88., а'Уг.спецЙ$№й0ст1>.. дат ДООЙ«':;

7: 'Перечисленные; : антигены Г .за

искдючёнйкм же; Hörte"ßW'b"' Ьъхтки-Шя''.'к^йп^дЛст •'■