Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:Имунофан (Разработка, клинико-экспериментальное изучение и внедрение в практику)

Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Р Г Б О Л Минздрава РФ.

2 П -

На правах рукописи

Лебедев Василий Вячеславович Имунофан.

(Разработка, клинико-экспериментальное изучение и внедрение в практику).

14.00.10 - инфекционные болезни 14.00.25- фармакология

Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва, 1997

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Машилов В.П.

доктор медицинских наук, профессор Турьянов М.Х.

доктор медицинских наук, профессор Крылов Б.Ф.

Ведущая организация: Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова

Защита состоится " <В " и адау 1997 г. в " ¿сР " часов иа заседании диссертационного совета Д 074.19.01 в Центральном НИИ эпидемиологии МЗ РФ (111123. г. Москва, Новогиреевская ул., д. ЗА).

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке Центрального НИИ эпидемиологии Минздрава РФ.

Диссертация в виде научного доклада разослана " Л Р"

¿> ¿1/'>еА л_1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Пименова М. Н.

ГЛАВА 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность проблемы. Широкое распространение и увеличение случаев заболевания вирусным гепатитом В, дифтерией ( в период с 1993 по1995 гг.), бруцеллезом, оппортунистическими инфекциями, а также высокая частота и тяжесть инфекционных осложнений, возникающих на фоне иммунной недостаточности организма, появление антибиотикорези-стентных штаммов микроорганизмов и явно недостаточная эффективность этиотротшх противовирусных препаратов, предопределяет необходимость поиска и создания средств патогенетической и иммунокорригирующей терапии инфекционных болезней.

В зависимости от этиологического агента, его вирулентности и дозы возбудителя иммунная недостаточность протекает по транзиторному типу, например, в случае острого инфекционного поражения, или носит характер стойкого иммунодефицитного состояния, с нарушением продукции цито-кинов, дисбалансом субпопуляций Т- и B-лимфоцитов и функциональной недостаточностью мононуклеарных фагоцитов, что обычно наблюдается при хронических вирусных и бактериальных инфекциях ( В.И. Покровский, 1994).

Среди патогенетических факторов инфекционных болезней человека, важное место занимают вновь образующиеся медиаторы или модуляторы воспаления, которые в условиях нормальной жизнедеятельности организма существуют в физиологических концентрациях и ответственны за регуляцию функций на клеточном и тканевом уровне. Некоторые из них, такие как лимфокины, монокины и метаболиты арахидоновой кислоты - эйкоза-ноиды, одновременно, являются медиаторами клеток иммунной системы, а другие, например, активные метаболиты кислорода, обеспечивают функционирование кислородзависимой системы бактерицидности нейтрофилов. При инфекционном воспалении, в условиях гиперпродукции медиаторов, резкое увеличение концентрации цитокинов, прежде всего монокинов и лимфокинов, вызывает количественные и функциональные изменения им-мунокомпетентных клеток, а усиление продукции активных метаболитов кислорода оказывает на них прямое повреждающее действие (Д.Н. Маян-ский, 1994; Chensue S., 1996; J.W.M. van der Meer, 1996).

Таким образом, посредством вновь образующихся медиаторов, инфекционная воспатительная реакция всегда вовлекает в типовой патологи-

ческий процесс клетки иммунной системы организма и может являться одной из причин формирования вторичного иммунодефицитного состояния.

Важное патогенетическое значение цитокинов в развитии воспалительной и иммунной реакции организма вызывает особый интерес в плане их использования, как лекарственных препаратов для патогенетической и иммунокорригирующей терапии. Применение цитокинов или медиаторов в качестве фармакологических средств терапии иммунодефицитных состояний предполагает усиление или изменение того или иного звена иммунитета в системе каскадной регуляции иммунной реакции организма. При этом необходимо иметь ввиду, что действие одного цитокина или цитокиноми-метика на клетки-мишени в результате их активации обязательно вызывает продукцию других медиаторов и, соответственно, расширение спектра фармакологических эффектов. Такое расширение спектра действия при введении медиаторов в организм может вызывать серию параллельных или побочных эффектов (И.П. Ашмарин, 1984; Е.И. Чазов, М.И. Титов и др., 1984; Donahue, Rosenberg, 1983).

Другая причина появления побочных эффектов заключается в несоответствии между уровнем распределения медиаторов в органах и тканях при их введении в организм и созданием действующей концентрации цитокинов в зоне межклеточной передачи сигнала. В физиологических условиях медиаторы продуцируются непосредственно в межклеточное пространство, где оказывают влияние по паракринному типу действия. Такой тип передачи сигнала обеспечивает высокие концентрации медиатора среди клеток ближайшего окружения, как это например, происходит в системе межклеточного взаимодействия А-клеток, Т- и B-лимфоцитов. Паракринный тип передачи сигнала обеспечивает определенную избирательность действия цитокинов и имеет существенное значение в регуляции воспалительной и иммунной реакции организма. Напротив, поступая в кровь при парентеральном введении, цигокины утрачивают паракринный тип действия, распределяются по органам и тканям и приобретают не свойственный медиаторам эндокринный характер действия. Поэтому, введение в организм экзогенных цитокинов или цитокиномиметиков может вызывать нарушение специфики их действия с расширением спектра фармакологических и побочных эффектов. Вероятно по этой причине попытки лекарственного применения ряда цитокинов, таких как ИЛ-1, ИЛ-2, фактор некроза опухоли (ФНО) и некоторых других не получили широкого клинического применения (Nagarkatti P.S., Hammond-McGibben D.,1994).

Значительные успехи достигнутые в области разработки лекарственных препаратов для коррекции нарушений иммунной системы организма обусловлены открытием нового класса биологически активных соединений - тимических пептидных гормонов иммунитета (Goldstein A.L., Hooper J., 1970). Естественные гормоны Т-системы иммунитета представлены семейством тимозинов, тимопоэтинов и сывороточным тимическим фактором (тимулином). Данные гормоны продуцируются клетками центрального органа иммунитета - вилочковой железой и обеспечивают гуморальную регу-лятор>гую связь центральной и периферической иммунной системы организма (Bäsch R.S., Goldstein G., 1974; Lewis V.M., Twomey J.J. et al., 1978; Sunshine G.H., Bäsch R.S. et al., 1978; Goldstein G., Audhya Т.К., 1985).

Регуляторные тимические пептиды или гормоны тимуса, секретиру-ются в кровь и осуществляют дистанционное управление клетками периферической иммунной системы, вызывая стимуляцию их дифференцировки и созревания. Активированные лимфоидные клетки периферической иммунной системы, в свою очередь, продуцируют цитокины, которые инициируют пролиферацию и созревание субпопуляций Т- и B-лимфоцитов (Hadden J.W., 1992). Таким образом, пептидные гормоны тимуса контролируют рост и развитие лимфоидных клеток периферической иммунной системы посредством их прямого действия и влияния на продукцию медиаторов иммунитета.

Активация лимфоидных клеток пептидными гормонами тимуса, как и действие других регуляторных пептидов, осуществляется универсальным способом путем образования в цитоплазме вторичных мессенжеров: цАМФ и ионов кальция, инозилтрифосфата диацилглицерола с последующей генерации сигнала на разнообразные индукторы (Н.П. Мертвецов, 1986; Oates К.К., Goldstein A.L., 1984). Ряд пептидных гормонов тимуса, такие как тимозин-а 1 и тимопоэтин, помимо изменения продукции цАМФ вызывают стимуляцию синтеза вторичных медиаторов - простагландинов группы Е, действие которых, вероятно, реализуется через цГМФ (Garaci Е., Favelli et al., 1984; Faist E„ Markewitz A. et al., 1991).

Таким образом, влияние пептидов тимуса на функциональное состояние клеток периферической иммунной системы обусловлено биохимическими механизмами, свойственными пептидным гормонам. Такой универсальный механизм действия лежит в основе двух важных фармакологических эффектов пептидных гормонов иммунитета: эффекта малых доз и эффекта иммуномодулирующего действия.

Эффект малых доз выражается в том, что регуляторные пептиды или пептидные гормоны вызывают адекватное изменение функции клетки-мишени в очень низких концентрациях, порядка 1010 - 10s М (Е.И. Чазов, М.И. Титов и др., 1984; Н.П. Мертвецов, 1984; В.А. Ткачук, 1983). Регуляторные пептиды тимуса и их синтетические аналоги также вызывают фено-типическую трансформацию лимфоидных клеток в низких дозах близкого порядка (Low T.L.K., Goldstein A.L., 1979; Audhya Т., Scheid M.P. et al.,

1984). Активация клетки низкими дозами регуляторных пептидов достигается за счет генерализации сигнала путем образования вторичных мессен-жеров в цитоплазме клетки (В.А. Ткачук, 1983; Berridge M.J., Irvin R.F.,

1985). При этом итоговое усиление сигнала может составлять 106 - 107 раз, что позволяет тимическим пептидам, действующим в каскадной системе, работать при низких концентрациях.

Иммуномодулирующее действие пептидов тимуса выражается в адекватном изменении функционального состояния клеток Т-системы иммунитета. На фоне нарушенных функций иммунной системы организма введение полипептидов тимуса характеризуется тенденцией к восстановлению баланса субпопуляций Т-лимфоцитов и их функциональной активности. При этом сниженные показатели увеличиваются, а шперактивные процессы среди отдельных субпопуляций Т-лимфоцитов возвращаются до значений, близких к нормальному уровню ( Ю.М. Лопухин, Р.В. Петров, и др., 1977; Л.В. Ковальчук, Б.В., Цейтлин и др., 1981; Oates К.К., Goldstein A.L., 1984). Данное наблюдение явилось обоснованием для создания пептидных иммунорегулирующих препаратов первого поколения, таких как Тимозин -фракция 5, Тактивин, Тималин и некоторых других (Goldstein A., Low T.L.K., 1978; Ю.М. Лопухин, Р.В. Петров и др., 1978; В.Г. Морозов, В.Х. Хавинсон, 1978).

Клиническое изучение препаратов, полученных на основе экстрактов ткани тимуса, продемонстрировало выраженное улучшение количественных и функциональных показателей Т-системы иммунитета с достижением положительного терапевтического эффекта у больных инфекционной и неинфекционной патологией (Ю.М. Лопухин, 1982; В.Х. Хавинсон, В.Г. Морозов, 1981; Constanzi J., Daniels J. et al., 1979). Вместе с тем, препараты первого поколения, обладают рядом существенных недостатков, которые резко ограничивают возможности их производства и применения. Экстракты тимуса представляют собой неразделенную смесь пептидов и других биологически активных веществ, что не позволяет проводить их стандартизацию.

Создание лекарственных препаратов второго поколения на основе синтетических гормонов иммунитета (тимазин-а 1, тимопоэтин 1,2) позволило обеспечить их надежную стандартизацию и усиление иммунорегули-рующего действия (Ershler W.B., Hebert J.С. et al., 1985; Audhya Т.К., Scheid M P. et al., 1984).

Однако, масштабирование производства и применение лекарственных препаратов второго поколения оказалось затруднительным из-за сложности химического синтеза больших пептидов и наличия у них полифункциональных участков. Поэтому дальнейшие исследования касались изучения структурно-функциональной особенности и поиска активных фрагментов естественных гормонов иммунитета. Такие фрагменты были обнаружены в составе тимозина-а 1 и тимопоэтина I и II. На основе одного из таких фрагментов, включающего аминокислотные остатки 32-36 тимопоэтина, создан препарат третьего поколения - Тимунокс (Тимопентин), (Goldstein G., Audhya Т.К., 1985). Экспериментальное исследование подтвердило полное соответствие его иммунорегулирующей активности и действия на-тивного тимопоэтина. Клиническое изучение тимунокса продемонстрировало его безвредность, способность частично или полностью восстанавливать нарушенные показатели Т-клеточного иммунитета, терапевтическую эффективность при лечении острого и хронического стресса, рассеянного склероза, ревматоидного артрита, в качестве средства профилактики гнойно-септических осложнений в плане предоперационной подготовки хирургических больных и для достижения адъювантного действия при назначении некоторых вакцин (Е.М. В аз ни чая, JI.M. Тарасенко и др., 1992; Cognazzo A.. Seliak D. et al., 1991; Afeltra A., Galeazzi M. et al., 1991; Braga M., Di Francesco A. et al., 1992; Palestini M., Messina A. et al., 1990). Сравнительный анализ фрагментов различных тимических гормонов показал, что только синтетические активные фрагменты тимопоэтина способны воспроизводить иммунорегулирующее действие естественного тимического гормона на периферическую иммунную систему организма с достижением терапевтического эффекта, а другие, например короткие фрагменты тимозина-а 1 (Birr С., 1984), рестриктированы по иммунорегуляторной активности и не получили развития для их лекарственного применения.

Дальнейший поиск активных фрагментов естественных гормонов иммунитета для создания новых препаратов к настоящему времени представляется исчерпанным по причине крайне ограниченного представительства семейства естественных тимических гормонов и однотипности их действия.

В этой связи создание иммунорегуляторных пептидов нового поколения требует применения иного подхода и других методических решений. Такой подход видится в направленном синтезе иммунорегуляторных пептидов нового, четвертого поколения путем модификации последовательности аминокислотных остатков естественных гормонов иммунитета для усиления противоинфекционного иммунитета, повышения эффективности вакцинации, расширения регулирующего действия на другие системы защиты и инактивации патогенетических факторов, вызывающих повреждения и нарушения функционирования клеточных структур организма.

1.2. Цель н задачи исследования. Целью настоящей работы явилось совершенствование средств терапии инфекционных, онкологических и кожных заболеваний путем разработки пептидного лекарственного препарата нового, четвертого поколения, для коррекции иммунодефицитных состояний, усиления противоинфекционного иммунитета и резистентности организма к вирусной инфекции, повышения эффективности вакцинации, стимуляции антиоксидантной системы защиты, инактивации свободно-радикальных соединений и сокращения симптомов интоксикации и воспаления у больных.

В соответствии с целью работы решались следующие задачи:

1. Разработать химическую структуру нового регуляторного пептида путем фармакологического скрининга модифицированных аналогов фрагментов тимического гормона - тимопоэтина по критерию безвредности, специфической активности и стабильности.

2. Создать лекарственную форму, разработать технические условия изготовления, методы биологического и аналитического контроля лекарственного препарата.

3. Изучить действие препарата на количественные и функциональные показатели Т-клеточного иммунитета, продукцию иммуноглобулинов и специфических антител, иммуногенность вакцин, синтез медиаторов иммунитета (воспаления) и оценить его протективное влияние на организм при заражении некоторыми вирусами.

4. Определить влияние препарата на кислород-зависимую систему бак-терицидности нейтрофилов, окислительно-антиокислительную систему и перекисное окисление липидов.

5. Разработать клинико-иммунологические критерии оценки эффективности препарата и провести его клиническое изучение.

6. На основании результатов клинического изучения разработать инструкцию по применению препарата в медицинской практике.

1.3. Научная новизна. В работе предложено новое-решение проблемы патогенетической терапии инфекционных, онкологических и кожных заболеваний человека, основанное на создании лекарственного препарата, содержащего в качестве фармакологического вещества уникальный регуля-торный гексапептид, обеспечивающий коррекцию нарушенных показателей Т-клеточного иммунитета и кислород-зависимой системы бактерицидно-сти, усиление гуморального противовирусного и антибактериального иммунитета, стимуляцию антиоксидантной системы защиты и инактивацию повреждающих свободнорадикальных соединений в организме больного.

Впервые разработана и экспериментально обоснована методика направленного синтеза пептидных производных тимического гормона иммунитета, позволяющая путем модификации последовательности аминокислотных остатков изменять его иммунорегуляторную активность и расширять регулирующее действие на другие системы защиты и патогенетические факторы, вызывающие повреждения и нарушения функционирования клеточных структур организма.

Предложенная методика направленного синтеза пептидных производных тимического гормона - тимопоэтина впервые позволила создать гексапептид структурной формулы: аргинил-а-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин, обладающий свойством оказывать регуляторное действие на механизмы иммунной и неспецифической (окислительно-антиокислительной) системы защиты организма.

Полученный гексапептид, как синтетический производный тимического гормона иммунитета, выделен, согласно предложенной нами классификации [7], в группу иммунорегуляторных пептидов четвертого поколения и на основании совокупности его основных фармакологических эффектов определен как регуляторный иммуноксидредуктант.

Разработан состав лекарственной формы нового препарата, получившего наименование Имунофан (Тимогексин), критерии фармакологической оценки, специфического действия и показания для клинического изучения.

Впервые показана клиническая эффективность применения препарата нового поколения при лечении инфекционных, онкологических и кожных заболеваний людей.

1.4. Практическая значимость. Разработан новый лекарственный препарат Имунофан в виде 0,005% раствора в ампулах по 1,0 мл для лечения онкологических больных в схеме радикального комбинированного лечения и у больных с распространенным опухолевым процессом различной локализации в плане комплексной или симптоматической терапии;

при оппортунистических инфекциях (цитомегаловирусная и герпетическая инфекция, токсоплазмоз, хламидиоз, пневмоцистоз, криптоспороди-оз);

при хроническом вирусном гепатите В и бруцеллезе, дифтерии, дифтерийном бактерионосительстве;

при лечении тяжедообожженных с явлениями токсемии, септикоток-семии, у больных с септическим эндокардитом, длительно незаживающими ранами конечностей, гнойно-септическими осложнениями;

при бронхо-обструктивном синдроме, холецисто-панкреатите, ревматоидном артрите и лечении псориаза. Получены авторские свидетельства СССР NN997298; 1469616; 1482154; 3706037; 4850515; Патент РФ N2062096; Патент США N 4377511; патент Великобритании N 2086392В

1.5. Внедрение. В соответствии с приказом Министерства здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации N 283 от 09 июля 1996 года лекарственное средство под названием "Раствор Имунофана 0,005% для инъекций" в виде лекарственной формы "раствор" состава ВФС 42-2754-96 зарегистрировано в Российской Федерации и разрешено для медицинского применения и промышленного выпуска. Промышленный выпуск препарата осуществляет Научно-производственное предприятие "Бионокс", г. Москва на основании Регистрационного удостоверения N 96/283/5.

1.6. Апробация работы. Материалы исследования доложены на: советско-французском научном симпозиуме по медицинской биотехнологии (Москва, 1990); IV Всесоюзном съезде гастроэнтерологов (Москва-Ленинград, 1990); ЬХП сессии общего собрания АМН СССР (Москва,

1991); Всесоюзной конференции "Экологическая безопасность и техногенный риск предприятий" (Иркутск, 1991); 1-ом Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1992); международной выставке "Медицинская биотехнология в СССР" (Карсруэ, 1991): международном симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии (Алма-Ата,

1992); 1-ой международной конференции по иммунореабилитации (Цхалтубо, 1992); Всесоюзной научной конференции "Разработка и произ-

водство препаратов медицинской биотехнологии" (Махачкала, 1992); 1-ом международном конгрессе по иммунореабилитации (Сочи, Дагомыс, 1994); международном симпозиуме "Пищевые зоонозы" (Москва, 1995), II Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1995).

1.7. Публикации. По материалам исследования соискатель имеет 36 печатных работ в отечественных и зарубежных издшгаях, 5 авторских свидетельств СССР, 1 патент Российской Федерации и 2 патента за рубежом.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.}. Синтез опигопептидов и методы их аналитического контроля.

Синтез олигопептидов осуществляли методом последовательного наращивания аминокислотной цепи с помощью активированных эфиров. Защитные группы удалялись с помощью каталитического гидролиза над пал-ладиевым катализатором на угле и ацидолгоа. Тонкослойная хроматография проводилась в системах хлороформ-метанол-32% уксусная кислота 60:45:20 (система 1) и бутанол-уксусная кислота-вода 3:1:1 (система 2). Индивидуальность соединения подтверждали методом жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД) путем обратнофазовой гидрофобной хроматографии на колонках "Spherisorb ODC" в градиенте концентрации ацетонитрила (5-20%) с использованием 1% трифторуксусной кислоты в качестве гидрофобного контриона (рН-2,13). Регистрацию оптической плотности материала проводили в проточной микрокювете при 220 нм. Структуру и состав полученного олигопептида подтверждали путем определения аминокислотного состава и методом инфракрасной спектроскопии или спектроскопией ядерного магнитного резонанса при 500 Мгц.

2.2. Методы иммунологического исследования in vivo и in vitro.

В опытах использовали мышей-самцов линий CBA/CaLacSío, BALB/cJSto, C57BL/6 и гибридов (CBAxC57BL/6)Fl массой 18-22 г, в возрасте 2-3 месяца. Мышей получали из питомников РАМН "Столбовая" и "Рапполово". Первичную оценку иммунорегулирующей активности естественных и синтетических пептидов проводили по стандартному тесту 50% восстановления чувствительности фоновых розеткообразующих клеток селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатио-прина (Аз-РОК) согласно Bach J. и Camaud N. (1976). Уровень продукции пептидного гормона тимуса - тимулина определяли у мышей линии C57BL/6 на 12-14 день после операции тимэктомии по стандартной мето-

дике, предложенной Bach J., Dardenne M, et al. 1975. Реакцию пролифера-тивного ответа иммунокомпегентных клеток мыши и человека IN VITRO на митогены - ФГА ("Difco", США), Кон A ("Calbiochem", Швейцария) или интерлейкин-2 (ИЛ-2) (институт Органического Синтеза, Латвия или "Cetus", США), оценивали с помощью реакции бласттрансформации (РБТЛ).

Для количественного определения содержания ФНО-а использовали иммуноферментный сэвдвич-метод. Количество ФНО-а в изучаемых образцах выражали в весовых единицах на миллилитр объема.

2.3. Методы клиническо-иммунологического изучения Имунофана и общая клиническая характеристика больных.

В период с 1993 по 1996 год обследовано и находилось под наблюдением 909 больных (в возрасте от 18 до 70 лет), в том числе больных дифтерией - 277 чел.; СПИД-маркерными (оппортунистическими) инфекциями, такими как цигомегаловирусная инфекция, токсоплазмоз, герпинфекция, хламидиоз, кригггоспоридиоз, миксг-инфекция (ЦМВ + токсоплазмоз + хламидиоз + герпинфекция) - 202 чел.; острым и хроническим гепатитом В -102 чел.; бруцеллезом - 84 чел.; тяжелообожженных с явлениями острой ожоговой токсемии, септикотоксемии, ожоговой энцефалопатии и лиц с со-четанной травмой - 52 чел.; хирургических больных реанимационного профиля с гнойно-септическими осложнениями - 68 чел.; больных с бронхо-обструктивным синдромом - 26 чел.; онкологических больных - 52. чел.; больных псориазом - 46 человек. Имунофан назначали курсами по 1,0 мл 0,005% раствора подкожно или внутримышечно.

При комплексном обследовании иммунного статуса больных или практически здоровых доноров использовали следующие методы:

- лимфоциты и нейтрофилы выделяли из свежей крови, стабилизированной гепарином, при центрифугировании через градиент плотности раствора Фиколл-пак (Pharmacia) и отмывали раствором Хенкса.

- анализ субпопуляций лимфоцитов проводили при помощи проточного цитофлуоримегра.

Суспензию лимфоцитов инкубировали с моноклональными антителами фирмы Coulter (USA). Определяли субпопуляции лимфоцитов: CD2+ и CD3+ (зрелые Т-лимфоциты), CD4+ (Т-хелперы-индукторы), CD8+ (супрессоры-цитотоксические клетки), CD25+ (активированные Т-лимфоциты, экспрессирующие рецептор к интерлейкину-2), CD22+ (В-лимфоциты), CD71+ (рецептор трансферрина), CD16+ (естественные киллеры), HLA-DR+ (активированные Т-, B-лимфоциты, моноциты). Иммуно-

регуляторный индекс (ИРИ) рассчитывали по отношению содержания CD4+/CD8+ лимфоцитов.

- иммуноглобулины разных классов определяли с помощью иммуно-ферментного анализа с использованием конъюгатов анти-IgG, -IgA, -IgM, -IgE человека фирмы "Sigma" (США).

- комплекс методов тестирования функциональной активности фагоцитирующих клеток периферической крови человека осуществляли по их адгезивной способности, кислородзависимой бактерицидности в тестах люминолзависимой хемилюминисценции (JI3XJ1), реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест), активности миелопероксидазы (МПО), а также кислороднезависимой бактерицидности в тестах определения активности кислой фосфатазы (КФ) и уровня катионных белков (КБ). Исследование ЛЗХЛ проводили по методике В.М.Земскова с соавт. (1988), оценку редукции HCT по методу Rosen H., et al. (1987), активность МПО по методике Сандова М.З. Пинегина Б.В. (1991), адгезивную способность клеток по Rosen H., Gardon S. (1987).

Для определения основных специфических маркеров вирусных гепатитов HBsAg, HBeAg, auruHBs, антиНВе, amnHBs класса IgG использовали иммуноферментный анализ.

Для подтверждения клинического диагноза бруцеллеза использовали комплекс иммунологических методов исследований, включающих: реакции Хеддльсона, агглютинациии (Райта), гемагглютинации, Кумбса, пробу Бюрне на бруцеллезный жидкий аллерген.

У больных дифтерией исходный противодифтерийный антитоксический иммунитет оценивали методом реакции пассивной гемагглютинации (РПГА).

При статистической обработке данных использовали критерий t Стьюдента, представляя среднюю, ошибку средней (M ± ш) и доверительные интервалы, рассчитанные по формуле M ± tm при р<0,05. Различия в составе контрольной и лечебной групп пациентов изучали при помощи критерия X2 Пирсона (Вентцель Е.А., 1957).

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Экспериментальное изучение механизмов действия тимических гормонов и регуляторнмх синтетических пептидов.

3.1.1. Первичная иммуно-фармакологическая оценка регуляторных пептидов.

Иммунорегулирующее действие тимических гормонов характеризуется их способностью стимулировать созревание Т-лимфоцитов. Данное свойство тимических гормонов положено в основу фармакологического скрининга препаратов тимуса и синтетических гормонов иммунитета. Так, оценка иммунорегулирующей активности первого препарата тимуса Тимо-зина 5 проводилась по тесту 50% восстановления чувствительности фоновых розеткообразующих клеток селезенки тимэктомированных мышей к ингибирующему действию азатиоприна (Аз-РОК) (Goldstein A, Low et al., 1978). Данный тест оценки экспрессии маркера дифференцировки Т-лимфоцитов аналогичен определению Thy-1 антигена с помощью соответствующей антисьшоротки и является характеристикой зрелых Т-клеток (Poulter, Bredley et al., 1977). Результаты оценки продемонстрировали его способность стимулировать экспрессию Thy-1 маркера в дозе 9-25 мкг на 3x106 кариоцитов. На основании полученных данных препарат был оценен как перспективный для дальнейшего изучения и получил' клиническое применение.

В дальнейшем, совместно с группой авторов, была предложена модификация метода экстракции ткани тимуса, включающая выдерживание гомогената ткани в течение 12-16 часов и отбор на этапе гельхроматогра-фии целевого продукта, содержащего пептиды с молекулярной массой 1500-6000 Да [21,23,24]. Препарат, содержащий комплекс пептидов тимуса, получил наименование Тактивин. Применение нового приема экстракции ткани тимуса позволило увеличить активность полученного препарата по сравнению с Тимозином 5 в 10 раз по тесту Аз-РОК. Последующая работа была направлена на поиск новых индивидуальных иммунорегулятор-ных пептидов путем изучения их активности в сравнении с Тактивином.

3.1.2. Структурно-активностные взаимоотношения фрагментов гормонов иммунитета и создание нового гексапептида ( Имунофана ).

Изучение структурно-активностных взаимоотношений фрагментов семейства тимопоэтинов I, II, Ш продемонстрировало, что в составе их последовательности из 49 аминокислотных остатков специфическая актив-

ность реализуется одним активным участком, локализованным последовательностью 32-36 (арг-лиз-АСП-вал-тир) (Audhya Т., Scheid М.Р. et al., 1984). Единственная замена аминокислотного остатка в 34 положении вызывает глубокие изменения направленности действия тимопоэтинов. Так, фрагмент тимопоэтина 1, II (арг-лиз-АСП-вал-тир), получивший наименование тимопентин, вызывает экспрессию Thy-1 + и не влияет на созревание B-лимфоцитов. Напротив, фрагмент тимопоэтина III (арг-лиз-ГЛЮ-вал-тир), получивший наименование спленопентин, индуцирует созревание предшественников В-лимфоцитов .

Таким образом, структурно-активностные взаимоотношения участка 32-36 характеризуются высокой изменчивостью эффектов при минимальной модификации структуры.

Детальный анализ активного участка тимопоэтинов показал его высокую чувствительность к N- и С-концевой элонгации пептидной цепи (Kisfaludy L., Nyeki О. et al., 1983). В тоже время, фрагменты активного участка, укороченные со стороны N-конца полностью теряют биологическую активность, а редуцирование со стороны карбоксильного конца вызывает снижение специфической активности. Таким образом, фрагмент тимопоэтинов 32-36 в наиболее полном объеме сохраняет иммунорегулирующие свойства естественного гормона тимуса.

Высокая изменчивость иммунологических эффектов при минимальной модификации структуры участка 32-36 указывает на возможность получения его дериватов, способных к проявлению новых иммунорегулятор-ных свойств. Такие регуляторные пептиды могут быть получены путем замены аминокислотных остатков в структуре самого активного участка или элонгации фрагмента за счет негомологичного аминокислотного остатка. Основываясь на представленных соображениях осуществлен синтез ряда пептидов, среди которых наибольший интерес представил гексапептид структурной формулы аргинил-а-АСПАРТИЛ-ЛИЗИЛ-валил-тирозил-АРГИНИН. Анализ полученного гексапептида в тесте Аз-РОК показал увеличение его активности в 1000 раз по сравнению с Тактивином [17].

3.1.3. Влияние Имунофана на продукцию гормона иммунитета.

Возможность применения гексапептида в качестве лекарственного препарата для коррекции ИДС оценивали по его действию на продукцию естественных гормонов иммунитета. Следует отметить, что иммунорегули-рующее действие тимического гормона характеризуется его способностью стимулировать продукцию других пептидных гормонов иммунитета (Rinaldi-Garaci С., Garaci Е. et al., 1983). Такой тип действия отдельных ти-

мических гормонов наиболее отчетливо проявляется при их введении в организм на фоне ИДС. Химические гормоны при введении тимэктомирован-ным мышам вызывают восстановление продукции тимулина и не оказывают влияния на его продукцию у нормальных животных. Поэтому способность синтетического производного вызывать стимуляцию продукции гормона тимуса - тимулина служит указанием на однотипность его иммуноре-гулирующего действия по отношению к другим тимическим гормонам.

Таблица 1. Кинетика продукции тимулина у тимэктомированных мышей под влиянием пептидных гормонов тимуса и Имунофана в норме и на фоне ингибирования синтеза простагландинов индометацином.

Сроки Активность тимулина у тимэк- Активность ти-

Препарат определе- томированных мышеи мулина у мышей

ния в ча- в отсутствии на фоне инги- с сохраненным

сах индометацина бирования пге2 индометацином тимусом

Тактивин 1 2,2 ±0,6 2,2 ± 0,4 4,8 ±0,4

24 4,0 + 0,5 2,2 ±0,6 4,6 ± 0,6

Тимопоэтин I 1 5,4 ±1,1 2,4 ±0,3 н.д.

(фрагмент 27 - 43) 24 3,8 ± 0,9 2,3 ± 0,9 н.д.

Имунофан 1 5,8 ± 0,9 5,7 ± 0,4 4,8 ± 0,6

24 4,6 ± 0,6 4,9 ± 0,5 4,9 ± 0,3

Контроль 1 2,2 ± 0,3 2,2 ± 0,4 4,8 + 0,6

24 2,0 ± 0,5 2,2 ± 0,9 4,9 ±0,3

Примечание. Активность тимулина выражена значениями титра (-log2) сывороточного тимулина, обеспечивающего 50% восстановления АзРОК. Величины представлены какМ+tm прир<0,05.

В этой связи было изучено влияние полученного гексапептида на продукцию тимулина у тимэктомированных мышей линии С57В1/6 в сравнении с Тактивином и тимопоэтином I. Животным вводили внутрибрю-шинно Тактивин, тимопоэтин I или гексапептид (Имунофан) в дозе I мкг/мышь. Значения титра сывороточного тимулина определяли спустя 1 и 24 часа после инъекции раствора Результаты определения представленные в таблице 1 демонстрируют, что Имунофан подобно другим гормонам иммунитета - Тактивину и тимопоэтину I, восстанавливает продукцию тимулина до значений соответствующих показателю у нормальных животных.

Таким образом, Имунофан - синтетический производный гормона тимопоэтина, сохраняет специфическую активность естественного гормона

и на фоне ИДС способен восстанавливать продукцию тимического гормона иммунитета - тимулина.

3.1,4. Влияние Имунофана и пептидных тимических гормонов на продукиию простагиандинов.

Результаты собственных экспериментов и данные других авторов демонстрирует, что иммунорегулирующее действие гормонов семейства тимозинов и тимопоэтинов на клетки периферической иммунной системы опосредуется индукцией синтеза вторичных медиаторов - простагландинов группы Е2 (Gualde N., Rigutid М. et al., 1982; Oates K.K., Goldstein A.L., 1985). Роль ПГЕ2 в данной системе представляется одним из регуляторов роста и дифференцировки лимфоцитов. Специфическое действие ПГЕ2 проявляется в способности ингибировать пролиферацию Т-лимфоцитов и стимулировать их дифференцировку (Papiemik М., Homo-Delarche, 1983). В этой связи, простагландины выполняют роль функциональных антагонистов факторов пролиферации (например ИЛ2) и проявляют свойства факторов дифференцировки. Поскольку иммунная система располагает достаточно широким набором других факторов (медиаторов) дифференцировки, функциональная роль простагландинов определяется ограничением пролиферации лимфоцитов под действием факторов роста. Сопряженная индукция обоих типов регуляторов - индукторов пролиферации и дифференцировки, обеспечивает иммуномодулирующий эффект, который для тимических гормонов семейства тимозинов и тимопоэтинов ограничен продукцией простагландинов. Так, введение тимэктомированным мышам Тимозина 5 или тимозина-а 1 вызывает стимуляцию продукции ПГЕ2, увеличение синтеза тимулина и экспрессии Thy-1 маркера дифференцировки Т-лимфоцитов. Однако данный эффект полностью утрачивается на фоне ин-гибирования синтеза ПГЕ2 индометацином (Rinaldi-Garaci С., Favalli С. et al., 1983). Таким образом, иммунорегулирующее действие естественных тимических гормонов на клетки периферической иммунной системы возможно лишь при условии индукции вторичного медиатора - ПГЕ2.

Для определения участия простагландинов в реализации иммуноре-гулирующего действия синтетического производного тимопоэтина - Иму-нофана было изучено его влияние на продукцию естественного гормона тимуса - тималина у тимэктомированных мышей в условиях ингибирования синтеза ПГЕ2 индометацином (таблица 1). Индометацин, согласно методике (Garaci Е., Favalli С. et al., 1983) вводили внутрибрюшинно тимэктомированным мышам в дозе 100 мкг/мышь, которая обеспечивает ингибирова-ние синтеза ПГЕ2. Спустя 30 минут животные получали Тактивин, тимопо-

этин I (фрагмент 27-43) или Имунофан соответственно в дозе 1 мкг/мышь. Определение работающих титров тимулина по тесту Аз-РОК осуществляли согласно стандартной методике. Как следует из полученных данных Имунофан на фоне блока синтеза ПГЕ2 вызывает восстановление продукции тимулина. Напротив, комплекс пептидов тимуса - Тактивин и индивидуальный гормон - тимопоэтин, теряют специфическую активность в условиях премедикации индометацином.

Таким образом, Имунофан, в отличии от других гормонов тимуса, оказывает иммунорегулирующее действие на клетки периферической иммунной системы вне зависимости от продукции простагландинов. Активация пролиферации и дифференцировки Т-лимфоиитов под действием Имунофана, вероятно, осуществляется альтернативным способом, посредством включения продукции других факторов, контролирующих рост и развитие клеток.

Данное обстоятельство имеет исключительно важное значение для лекарственного применения Имунофана при иммунокорекции инфекционных больных с выраженными явлениями воспаления и в онкологической практике. Простагландин-независимый характер действия Имунофана может создать определенные преимущества по сравнению с применением ти-мических гормонов и позволит избежать выраженных осложнений со стороны очага воспаления, сократить супрессию противоопухолевого иммунитета, которая достигается усиленной продукцией ПГЕг малигнизированны-ми клетками и обеспечить эффективную сочетанную терапию противовоспалительными препаратами нестероидного ряда.

3.1.5. Действие Имунофана на продукцию интерлейкина-2.

С целью дальнейшего изучения механизмов иммунорегулирующего действия Имунофана представляло интерес определить его влияние на продукцию ИЛ-2, как универсального фактора пролиферации лимфоцитов. Для решения этой задачи мышам линии СВА вводили Имунофан в дозах 0,05 -1,25 мкг/мышь внутрибрюшинно, через 1,2 и 3 дня выделяли клетки селезенки и определяли продукцию ИЛ-2 in vitro. Концентрацию ИЛ-2 в надо-садочной жидкости (НЖ) определяли по способности усиливать пролиферацию клеток ИЛ-2-зависимой линии CTLL-2, оцениваемую по включению 3Н-тимидина.

Введение Имунофана в дозе 0,05 мкг/мышь приводит к усилению Кон А-стимулированного синтеза ИЛ-2 клетками селезенки через 1, 2 и 3 суток после введения препарата. Наибольшую стимуляцию (более чем в 7

раз) продукции ИЛ-2 наблюдали при использовании высокой дозы Имуно-фана на третьи сутки после его введения in vivo.

Особенный интерес представляло изучение действия Имунофана на синтез ИЛ-2 мононуклеарными клетками периферической крови здоровых доноров. Для решения поставленной задачи исследовали способность лимфоцитов продуцировать ИЛ-2 в ответ на стимуляцию Кон А. Содержание ИЛ-2 оценивали по способности образцов поддерживать рост ИЛ-2-зависимой цитотоксической клеточной линии (CTLL-2). В качестве контроля использовали раствор рекомбинантного ИЛ-2 с известной активностью. Полученные титровочные кривые сравнивали с помощью метода проббитов, вычисляя ED50. Часть образцов перед стимуляцией обрабатывали Имунофаном. Результаты определения демонстрируют, что Имунофан в дозе 0,05 мкг/мл почти в два раза усиливает синтез ИЛ-2 мононуклеарами человека с 8,9 ME/мл (контроль) до 16,0 ME/мл, соответственно.

В дальнейших экспериментах исследовали влияние Имунофана на чувствительность иммунокомпетентных клеток к ИЛ-2. С этой целью клетки селезенки мыши обрабатывали Имунофаном в разных концентрациях и добавляли к ним рекомбинантный ИЛ-2. Чувствительность лимфоцитов к ИЛ-2 определяли в тесте бласттрансформации. При оценке полученных экспериментальных данных было выявлено, что Имунофан стимулирует бласттрансформацшо клеток селезенки. Эффект препарата в дозе 0,25 мкг/мл являлся статистически достоверным (опытная группа - 19411 ± 436; контроль - 8351 ± 735) (A.B. Тутельян, 1993). "■

Представленные данные свидетельствуют о том, что регуляторньш пептид реализует свое действие на клетки иммунной системы через различные механизмы. С одной стороны, препарат стимулирует образование ИЛ-2 иммунокомпетентными клетками мышй и человека. С другой стороны, повышает чувствительность лимфоидных клеток к этому лимфокину, что, вероятно, реализуется посредством другого механизма действия, а именно, путем увеличения плотности соответствующих рецепторов.

3.1. б. Влияние Имунофана на митотическую активность лимфоцитов лиц, инфицированных ВИЧ.

Использование другой экспериментальной модели - МНК лиц, инфицированных ВИЧ, также продемонстрировало усиление РБТЛ на ФГА в присутствии Имунофан. Так, активация клеток Имунофаном в дозе 10 мкг/мл вызывало почти 3-х кратное усиление включения 3Н-тимидина по сравнению с МНК больных без обработки Имунофаном (55432 ± 4189 имп/мин МНК до обработки и 155846 ± 9472 имп/мин после внесения в

суспензию Имунофана). Причем, усиление митотической активности МНК лиц, инфицированных ВИЧ, под действием Имунофана достигало значений клинически здоровых доноров ( 140518 ± 4213 имп/мин МНК).

Полученные результаты представляют определенный интерес в связи с особенностями патогенетических механизмов расстройства функции Т-системы иммунитета и перспективы терапевтического применения регуля-торных пептидов у больных, страдающих ВИЧ-инфекцией. Так, результаты клинических испытаний препаратов на основе тимозина-а 1, тимопентина, экстрактов тимуса (Тимозин 5, Тактивин) у больных СПИД указывают на отсутствие выраженного терапевтического эффекта. Развитие резистентности к действию тимических гормонов у больных СПИД находит объяснение в наличии гомологии аминокислотных остатков пептидных гормонов тимуса, например тимозина-а 1, октапептида Т гликопротеина gp 120 HIV и внутреннего белка gag HIV (Sarin, Sun et al., 1986; Nguyen, Scheving, 1987). Существование гомологичных последовательностей между тимиче-скими пептидами и белками ВИЧ вызывает перекрестное реагирование с рецепторами, в том числе CD4, появление антител против естественных гормонов тимуса и, соответственно, нарушение каскадной системы регуляции иммунной реакции организма. Наличие высокой гомологии аминокислотных остатков и перекрестно реагирующих антител, вероятно, является основной причиной резистентности больных к терапии гормонами иммунитета.

Синтетические производные гормонов иммунитета, обладающие низкой степенью их гомологии, могут ускользать из конкурентных взаимоотношений с белками ВИЧ и перекрестным реагированием с антителами, обеспечивая выраженное иммунорегулирующее и терапевтическое действие.

3.1.7. Регуляторное действие Имунофана на продукцию фактора некроза опухоли.

Одними из важнейших медиаторов иммуногенеза являются факторы некроза опухолей (ос- и ß-), продуцируемые макрофагами и Т-клетками. Резкое усиление продукции ФНО, как медиатора воспаления, служит одной из причин нарушения сосудистой проницаемости, развития системной воспалительной реакции и расстройства иммунной реакции организма у больных с гнойно-септическими осложнениями, при хронических вирусных и бактериальных инфекциях, а также способствует усилению экспрессии генома ВИЧ. Фактор некроза опухоли является эндогенным пирогеном и способен поддерживать лихорадочные состояния человека.

В связи с этим, представлялось целесообразным изучить действие Имунофана на продукцию ФНО у больных с воспалительными реакциями различной степени тяжести. Для обследования была выделена группа хирургических больных с воспалительной реакцией без гнойно-септических осложнений и группа с воспалительной реакцией, осложненной сепсисом.

Результаты определения ФНО-продукции иммуноферментным методом в надосадочной жидкости МНК больных с гнойно-септическими осложнениями (ГСО) демонстрируют, что его уровень через 2 часа после назначения Имунофана снижается в 4 раза, а через сутки после курса препарата составляет 2% исходного уровня. При сопоставлении результатов чувствительности МНК больных с высоким и низким уровнем продукции ФНО выявлены существенные различия в действии препарата (рисунок 1).

| 250 т у.

! I Ш - острая воспалительная реакция и

200 | ■

о 1-------—------------|

0.05 025 1,25 МКГ/МЛ ;

I

Доза Имунофана |

!

Рис. 1 Влияние Имунофана на спонтанную продукцию фактора некроза I

опухоли мононуклеарными клетками больных. '

Примечание: за 100% принят уровень продукции ФНО клетками, не обработанными Имунофаном.

Таким образом, препарат обладает способностью модулировать продукцию медиатора ФНО в диапазоне значений близком к физиологическому уровню.

3.1.8. Регуляторное действие Имунофана на синтез различных классов иммуноглобулинов.

Для дальнейшей оценки механизма действия и показаний к применению Имунофана было изучено его влияние на синтез различных классов иммуноглобулинов МНК здоровых доноров и лиц с врожденным или приобретенным нарушением гуморального звена иммунитета.

Результаты исследования действия Имунофана на продукцию иммуноглобулинов разных классов мононуклеарными клетками здоровых доноров, индуцированных РУ/М показали, что добавление препарата к культурам лимфоцитов человека приводило к резкому увеличению синтеза иммуноглобулинов классов М, й и А. Напротив, продукция ^Е достоверно не изменялась при обработке Имунофаном клеток в дозе 0,5 и 5,0 мкг/мл, а в дозе 0,05 мкг/мл отмечалась выраженная супрессия IgE ответа [6, 7]. Таким образом, Имунофан оказывает разнонаправленное действие на продукцию ]£Е и иммуноглобулинов класса М, б и А. Следует отметить, что данные результаты получены на модели индуцированного синтеза иммуноглобулинов. Обработка интактных клеток здоровых доноров Имунофаном не вызывает существенных изменений продукции основных классов иммуноглобулинов [7]. В связи с этим, возникла необходимость определить его им-мунорегулирующее действие при патологических состояниях с нарушением продукции иммуноглобулинов._____ _________■

! Атопичеекий дерматит |

I ЙЕ

; Контроль 0,05 1.25 Контроль 0.05 1,25

I п - «отчество больных. * - р<0,05 по сравнению с контролем

|

| Рис. 2 Влияние Имунофана на продукцию 1д МНК больных селективным

; иммунодефицитом |д А (п=3) и атолическим дерматитом (п=6), % к

контролю.

Селективный иммунодефицит 1дА

Для этого использовали мононуклеарные клетки больных с первичным селективным иммунодефицитом и клетки больных атоническим дерматитом, с повышенной продукцией Как следует из экспериментальных данных представленных на рисунке 2, Имунофан стимулирует образование 1§А при его врожденной недостаточности и тормозит синтез ^Е в условиях его гиперпродукции у больных атопическим дерматитом.

Таким образом препарат вызывает коррекцию как врожденного, так и приобретенного нарушения продукции и ^Е. При этом, направленность его действия зависит от исходного уровня синтеза иммуноглобулинов, что представляется исключительно важным для коррекции гуморального иммунитета у больных с инфекционной патологией. Торможение гиперпродукции ^Е также имеет важное значение для расширения показаний к его клиническому применению у больных с опасностью развития аллергической реакции немедленного типа.

3.2. Экспериментальное изучение влияния Ииуиофана на инфекционный и вакцинальный процесс.

Иммунорегуляторное влияние Имунофана на показатели клеточного и гуморального иммунитета предполагает его возможность усиливать специфический иммунный ответ на вирусные антигены и обеспечивать про-тективное действие при заражении инфекционным материалом. Представляло интерес изучить влияние Имунофана на иммуногенную активность некоторых противовирусных вакцин, его протективное действие на организм при заражении вирусом и выживаемость потомства при внутриутробном заражении.

3.2.!. Влияние Имунофана на продукцию вирус-нейтрализующих антител при иммунизации вакциной инфекционного вирусного рииотрахеи-та - инфекционного пустулезного вупъвовагинита (ИРТ-ИПВ).

В период выполнения работы по созданию инакгивированной вакцины против ИРТ-ИПВ крупного рогатого скота (производство Свердловской НИВС) получена экспериментальная серил, которая не обладала достаточно высокой иммуногенностью, в вязи с чем была предпринята попытка усилить иммуногенную активность вакцины путем введения в схему вакцинации иммуномодулирующего препарата Имунофана [32]. Влияние препарата на эффективность вакцинопрофилактики против ИРТ-ИПВ у быков представлены на рисунке 3.

ШКонтроль (введение только вакцины) N=8

□ Опыт (ведение вакцины совместно с Имунофаном) N=8

Рис. 3 Влияние Имунофана на показатели титра и длительность циркуляции в ирус-не йтрализующих антител при иммунизации вакциной инфекционного вирусного ринотрахеита - инфекционного пустулезного вульвовагинита

Применение одной вакцины вызывает появление вирус-нейтрапизующих антител в титре 1:4 - 1:16 на 30 сутки после иммунизации. Однако, к 90 суткам значения титров специфических антител уменьшается до 0 - 1:4. Однократное введения животным за сутки до вакцинации Иму-нофана в дозе 1 мкг/кг массы тела через 30 дней вызывает увеличение показателя реакции нейтрализации на наличие антител к вирусу ИРТ-ИПВ до значений 1.32-1Л28. При этом высокие значения титров пролективных антител сохраняются в течение всего срока наблюдения.

Таким образом, включение Имунофана в схему иммунизации позволяет значительно увеличить уровень и длительность циркуляции вирус-нейтрализующих антител.

3.2.2. Влияние Имунофана на иммуногенноапь вакцины против клещевого энцефалита.

Исследования проводили на. мышах Balb/c, массой 12-14 г. В качестве вакцины использовали отраслевой стандартный образец вакцины клещевого энцефалита (культуральной, инактивированной, сорбированной, жидкой) (ВКЭ) серия 201 - производство Института Полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН г. Москвы. ВКЭ вводили в разведениях 1:10, 1:32, 1:100, 1:320 подкожно в объеме 0,5 мл. Имунофан вводили в количестве 0,05 мкг на мышь подкожного в объеме 0,3 мл. Вакцину и Имунофан вво-

дили мышам одновременно трехкратно с интервалом в один день. На каждое разведение вакцины брали 10-12 мышей. Вирус клещевого энцефалита штамм Абсетгаров вводили внутрибрюшинно в объеме 0,25 мл на девятый день после окончания иммунизации. Заражающая доза вируса клещевого энцефалита составила 320 LDJ0. Наблюдение за мышами проводили в течение 14 дней после заражения вирусом клещевого энцефалита.

Результаты опыта оценивали по трем показателям:

1) проценту выживших животных на каждое разведение вакцины

2) величине предельно допустимого разведения вакцины, обеспечивающего 50% выживаемость животных после заражения вирусом клещевого энцефалита, рассчитанной по формуле Reed-Muench (пр50)

3) величине минимальной иммунизирующей дозы ВКЭ, защищающей 50% животных (МИД50).

При разведении вакцины 1:10 выжили все мыши, получившие вместе с вакциной Имунофан, в то время как среди мышей, иммунизированных одной вакциной, выжило 80%. При разведении вакцины 1:100 одна вакцина защищает 20% мышей, а вакцина вместе с Имунофаном в 2,5 раза больше, т.е. 50% животных. При разведении вакцины 1:32 и 1:320 действие Имуно-фана на иммуногенность ВКЭ не было выявлено. Показатель ПР50 увеличился в 2 раза, а МИД50 снизился в 2 раза, т.е. для обеспечения 50% защиты животных в случае использования вакцины с Имунофаном можно брать вакцину либо в 2 раза более разведенную (показатель ПР50), либо той же концентрации, но в дозе в 2 раза меньшей (показатель МИД50), чем в группе без Имунофана [13,26].

Таким образом, включение Имунофана в схему иммунизации вакциной против клещевого энцефалита позволяет значительно повысить ее иммуногенность и выживаемость животных после заражения вирусом.

3.2.3. Экспериментальное изучение влияния Имунофана на инфекционный и вакцинальный процесс при бешенстве.

Исследования проводили на беспородных белых мышах массой 1214г. В опыте использовали культуральную антирабическую вакцину (КАВ) с. 117 - производство институт Полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН г. Москвы. Заражение животных проводили фиксированным вирусом бешенства (штамм CVS) путем интрацеребрального введения в объеме 0,03 мл на 8 день после иммунизации, рабочее разведение - 3-3,6 lgLDs0. Имунофан вводили подкожно сразу после заражения мышей вирусом бешенства в дозе 0,05 мкг в объеме 0,5 мл. Одновременно с заражением животных и введением Имунофана проводили первую иммунизацию мышей

антирабической вакциной по 0,1 мл подкожно. Для вакцинации использовали цельную КАВ и в разведениях 1/4, 1/16, 1/32, 1/64; на каждое разведение вакцины брали 14 мышей. Имунофан и вакцину вводили мышам 5 раз в течение 5 дней. Контролем служили две группы животных, зараженных вирусом бешенства, одной из которых вводили вакцину без Имунофана, другой - Имунофан без вакцины. За мышами наблюдали 14 дней после заражения вирусом бешенства. Результаты опыта оценивали по проценту выживших животных.

Обнаружено, что стимулирующее влияние Имунофана на иммуно-генность антирабической вакцины и повышение ее протективных свойств проявляется при использовании вакцины в разведениях 1/32, 1/64, то есть при введении малой дозы вакцины. Следует отметить, что введение одного Имунофана вызывает защиту 80% животных только на 5-11% уступает протекгивному действию не разведенной вакцины.

Таким образом, в эксперименте на животных выявлено стимулирующее действие Имунофана на иммуногенность антирабической вакцины и его способность оказывать протективное действие при заражении вирусом бешенства [14,27].

3.2.4. Экспериментальное изучение влияния Имунофана на иммуно-генную активность вакиины против гепатита А.

Исследования проводили на нелинейных морских свинках массой 300-350 г, каждая группа включала 10 животных [27]. В опыте использовали экспериментально-производственную вакцину против гепатита А (культуральная, концентрированная, очищенная, инахтивированная, жидкая) - Геп-А-ин-ВАК, серия 16 (производство НПО "Вектор" г. Новосибирск).

Вакцинацию проводили подкожно в объеме 0,5 мл в три точки в область задних лапок и спины. Имунофан вводили в дозе 1,5 мкг на морскую свинку подкожно в объеме 0,5 мл в область спины. Вакцину и Имунофан вводили одновременно трехкратно с интервалом в две недели. Уровень иммунитета против гепатита А оценивали по титру специфических сывороточных антител (АТ) к вирусу гепатита А (ВГА) и по числу сероположи-тельных животных. Кровь у морских свинок брали из сердца дважды в динамике иммунизации на 14-е сутки после 2-го и 3-го введений. В сыворотке крови определяли титр анти-ВГА-антител, используя диагностикум "ИФА-анти ВГА" (производство НПО "Диагностические системы" г. Нижний Новгород).

Таблица 2. Влияние Имунофана на иммуногенную активность вакцины против гепатита А.

Группы Сроки Средняя гсом. Титр АТ Частота

животных взятая крови тигров АТ серолол. жив.%

ГепА-ин-ВАК I 1,93+0,30 1:85 90

+ Имунофан II 2,97±0,25 1:933 100

ГепА-ин-ВАК I 1,40+0,34 1:25 70

(контроль) II 2,24+0,39 1:174 90

Как видно из таблицы, после 2-х кратного введения вакцины (1-й срок обследования) в группе морских свинок, получивших вместе с вакциной Имунофан (опытная группа), титры АТ в 3,4 раза превышают показатели в контрольной группе (1:85, 1:25, соответственно). После 3-х кратного введения препаратов уровень АТ в группе с Имунофаном в 5,36 раз выше, чем в группе животных, иммунизированных одной вакциной (1:933, 1:174, соответственно).

Таким образом, в эксперименте на морских свинках выявлено стимулирующее влияние Имунофана на иммуногенность вакцины против гепатита А. •

3.2.5. Влияние Имунофана на выживаемость потомства при заражении вирусом гриппа.

С целью дальнейшего изучения влияния Имунофана на формирование противовирусного иммунитета и оценки возможности его профилактического применения для сохранения плода при вирусных инфекциях проведено экспериментальное исследование выживаемости потомства у мышей при их внутриутробном заражении. вирусом гриппа А/Удм/крс/116/78 [12,14]. Результаты по изучению влияния Имунофана на выживаемость потомства в сравнении с протективным действием других препаратов, содержащих тимические пептиды, представлены в таблице 3.

Непосредственно перед заражением мышей линии Ва1Ь/с беременные самки получали Имунофан в виде подкожной инъекции 0,25 мл раствора в дозе 1 мкг/мышь. В качестве препаратов сравнения использовали Тимозин-5, Тактивин и тималин в той же дозе. Контрольным животным вводили равный объем физиологического раствора. Как следует из представленных данных заражение мышей вирусом гриппа вызывает гибель 96% величины помета. Назначение Имунофана непосредственно перед инфицированием мышей обеспечивает сохранение 95% помета и создает эффективную защиту плода при заражении вирусом гриппа. Учитывая способность Иму-

нофана усиливать продукцию вирус-нейтрализукяцих антител и выраженные иммунорегулирующие свойства следует полагать, что полученный протективный эффект обусловлен стимуляцией противовирусного иммунитета. Введение препаратов, содержащих естественные пептиды тимуса, также вызывает отчетливый протективный эффект, однако он значительно уступает влиянию их синтетического производного - Имунофана.

Таблица 3. Влияние Имунофана и препаратов, содержащих гормоны тимуса, на выживаемость потомства при внутриутробном заражении мышей вирусом гриппа.

Препарат Количество беременных самок Выживаемость помета в период 90 дней Количество голов помета

шт. %

Имунофан 20 196 95 206

Тактивин 20 126 67 188

Тимозин-5 20 120 62 193

Тималин 20 102 53 191

Физ. раствор (контроль) 20 6 4 166

Таким образом, Имунофан оказывает выраженное действие на развитие инфекционного процесса, стимулирует противовирусный иммунитет и образование вирус-нейтрализующих антител. Препарат усиливает иммуно-генность вакцины против вирусного ИРТ-ИПВ, клещевого энцефалита,, бешенства, гепатита А и обеспечивает выраженное протективное действие на организм при заражении вирусом бешенства и потомство при внутриут--робном заражении вирусом гриппа.

Обнаруженные свойства нового пептида подтверждают перспективность его применения для патогенетической терапии инфекционных болезней, что явилось предметом дальнейших исследований.

3.3. Доклиническое изучение Имунофана.

Проведение клинического изучения Имунофана, содержащего в качестве фармакологического вещества синтетический гексапептид, потребовало разработки его лекарственной формы и изучения острой и хронической токсичности для экспериментального определения безвредности и возможных побочных эффектов у человека.

В качестве лекарственной формы предложен 0,005% стерильный раствор для подкожных и внутримышечных инъекций в ампулах по 1,0 мл. В качестве стабилизатора раствор Имунофана содержит 0,5% глицина.

Дозы Имунофана определены по результатам изучения его острой токсичности и специфической активности "in vitro" и "in vivo". При подборе доз для проведения хронических экспериментов учитывали ЛД50 Имунофана при подкожном введении мышам и кроликам. Исходя из этого, терапевтическая доза Имунофана определена 0,7 мкг/кг массы тела (1/120000 от ЛД50), субтоксическая - 70 мкг/кг (1/1200 от ЛД50) и промежуточная (между субтоксической и терапевтической) - 7 мкг/кг (1/12000 от ЛД50). Препарат вводили животным подкожно. После изучения хронической токсичности Имунофана, местного раздражающего действия, определения его аллергенности, потенциальной мутагенной активности, способности Имунофана вызывать генные мутации на индикаторных бактериях в тесте Эймса (Salmonella) микросомы, на основе учета хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей, индуцированных Имунофаном и учета доминантных летальных мутаций, индуцированных Имунофаном в зародышевых клетках мышей, а также по результату изучения его канцерогенного действия и с учетом специфического действия Имунофан был рекомендован для проведения клинических испытаний у больных вирусными и бактериальными инфекциями, у онкологических больных и в клинике кожных болезней.

3.4. Клиническое изучение Имунофана.

Формирование хронических форм бактериальной инфекции обычно сопутствует появлению у больного стойкого ИДС с явлениями дезинтеграции клеточного и гуморального звена иммунитета (В.И. Покровский, 1993). Такие повреждения часто сопровождаются снижением резервной возможности нейтрофилов к бактериальному киллингу и завершенному фагоцитозу, развитием аллергических и аутоиммунных расстройств с усилением продукции реагинов ых IgE - антител и нарушением баланса субпопуляций Т-лимфоцитов. С целью коррекции иммунной системы у больных хронической бактериальной инфекцией - бруцеллезом, были проведены клинические испытания Имунофана при различных формах данного заболевания.

3.4.1. Клинико-иммунологическое изучение Имунофана у больных хроническим бруцеллезом.

Исследование проведено в отделе патологии взрослых ЦНИИЭ на базе 2-ой Клинической инфекционной больницы г. Москвы (Зав. отде-

лом, член-корр.

РАМН В.В. Малеев; доктор медицинских наук

А.К.Сулейманов ). Обследовано 84 больных с различными формами хронического бруцеллеза в стадии суб- и декомпенсации. Длительность болезни составляла от 1 до 15 лет и характеризовалась рецидивирующим течением с частыми обострениями. Наряду с клинико-анамнестическими данными диагноз бруцеллеза был подтвержден с помощью комплекса серологических методов: реакции Хедельсона, Райта, Кумбса, пассивной гемагг-лютинации, а также внутрикожной аллергической пробы Бюрне. Все больные получали базисную терапию, включая этиотропные, антигистаминные и нестероидные противовоспалительные препараты. Клиническое изучение Имунофана проводили в сравнении с бруцеллезной лечебной вакциной (БЛВ), как специфического иммунокорригирующего средства, получившего широкое практическое применение при лечении больных бруцеллезом. Имунофан назначали подкожно или внутримышечно 1 раз через 3 суток, курс лечения 8-10 инъекций для предотвращения рецидива проводили повторные курсы препарата через 4-6 месяцев.

Таблица 4. Показатели клеточного иммунитета больных хроническим

Группа обследуемых Лейкоциты 10% Лимфоциты Субпопуляшш лимфоцитов

% 10% СБ2 С020 СМ СЭ8 ИРИ

Больные до лечения(п=64) 6,4 ± 0,2 26,4+ 1,7 1,69 ±0,1« 80,2+1,4 7,6±0,5 0,11+0,01 34,0±1,5* 28,2±1,3 1,3+0,1*

1,3410,1 0.56±0,05* 0.48+0.05

Получавшие БЛВ (п=22) 6,2 + 0.2 25,5+0,3 1,6±0,09» 81,6±0,9 1,04+0,07 6,5±0,5 0,09±0,03* 33,4±1,7 30,2±0,9 1,0±0,1*

0,5+0,04 0.54+0.04

Не получавшие БЛВ (п=8) 6,9±0,2 29,3+1,1 1,6±0,08« 81,0±2,7* 7,9+1,0 0,13±0,03 39,0±2,2 0,52+0,05« 28,0±0,6 1,5+0

1.23±0,07 0,43+0,01«

Больные после лечения Иму-иофаном (п=34) 7,0+0,1 33,8+1,2" 2,3810,11«* 81,3+0,9 1,92±0,09«» 7,2+1,4 0,16±0,01" 38,3+1,5 24,8+1,4 0,61 ±0,05 1,5+0,1

0,88±0,05"

В том числе получавшие ИНД (л=14) 6,2±0,3 32.6±1,3 2,1±0,2 80,5+1,2» 1,9±0,1" 8Д±0,4 0,17±0,01" 43,7+0,9"« 0,99+0,09«« 24,0+2,5 0,7±0,05 1,4+0,1

Здоровые добровольцы (п=15) 5,9+0,2 33,9+1,3 2,0+0,1 73,9±2,2 1,55+0,04 8,6+0,7 0,18+0,02 40,2+1,4 26,9+1,7 0,56+0,03 1.6+0,1

0,84±0,03

Примечание: в числителе относительное, в знаменателе - абсолютное количество клеток.

* - отличия от уровня нормы достоверны (р < 0.05);

** - отличия от исходного уровня достоверны (р < 0.05);

*** - отличия от соответствующего контроля достоверны (р < 0.05).

Результаты иммунологического обследования, представленные в таблице 4, демонстрируют наличие у больных при поступлении в клинику лимфопении, тенденции к снижению абсолютного количества В-лимфоцитов (С020) при относительном увеличении количества зрелых Т-лимфоцитов (С02) с достовер!гам снижением Т-хелперов/индукторов (С04). Отмеченные нарушения Т- и В-клеточного иммунитета характеризуют наличие ИДС у больных хроническим бруцеллезом. После окончания курса иммунокорригирующей терапии с применением Имунофана отмечено увеличение абсолютного количества лимфоцитов и относительного содержания В-лимфоцитов, Т-хелперов/индукторов и ИРИ до уровня нормы. Напротив, применение БЛВ не оказывало положительного влияния на восстановление указанных показателей.

Таким образом, применение Имунофана у больных хроническим бруцеллезом с сопутствующим ИДС вызывает восстановление ряда показателей Т- и В-клеточного иммунитета, что следует оценивать как его имму-нокорригирующее действие.

Для оценки иммунокорригирующей эффективности Имунофана в комплексе с другими противовоспалительными препаратами (ингибиторами простагландинов), часто используемыми при лечении больных различными формами хронического бруцеллеза, особенно сопровождающихся поражением локомоторного аппарата, была выделена группа больных, получавших в процессе лечения индометацин (по 0,25 х 3 раза в день в течение 17 дней). Из полученных данных следует, что последний не блокирует иммунокорригирующее действие Имунофана и хорошо с ним сочетается (табл.4). При этом, Имунофан был эффективен как у больных, получавших БЛВ, так и у пациентов, не получавших этой вакцины в течение последнего года [28,29].

У больных хроническим бруцеллезом, получавших Имунофан, существенно сокращалась (в среднем на 7 - 10 дней по сравнению с лицами, которым осуществлялась внутривенная вакцинотерапия по Г.П. Рудневу) продолжительность субъективных симптомов болезни: боли в суставах, утомляемость, озноб, потливость. Во всех случаях назначения Имунофана больным побочные эффекты не отмечены [11,14,28,29].

С целью сравнительного изучения эффективности влияния Имунофана на гуморальное звено иммунитета проведено определение уровня специфических ^0-, ^А-, и ^Е-антител в динамике лечения больных хроническим бруцеллезом вакциной и Имунофаном [40, 42]. Результаты представлены на рисунке 4.

| | - только вакцина Ц^ - только Имунофан 1: п - титр специфических антител в сыворотке больных.

Рис. 4 Продукция специфических, антител ^ в, М, А и ^ Е класса у больных _хроническим бруцеллезом под влиянием вакцины или Имунофана._

Вакцинотерапия больных хроническим бруцеллезом стимулирует синтез иммуноглобулинов всех классов, в том числе и реагиновых антител, что указывает на усиление гиперчувствительности немедленного типа. При этом наблюдается резкое возрастание титров специфических антител А, М и Е-классов. Имунофан вызывает усиление продукции специфических антител основных классов иммуноглобулинов, сопоставимое с действием вакцины. При этом важно отметить что, стимуляция Имунофа-ном продукции ^-антител является минимальной, а среди больных с изначально высоким титром реагиновых антител, вызывает даже снижение их уровня.

Индукция синтеза специфических антител без дополнительного антигенного раздражения и аллергизации организма представляет важное им-мунотерапевтическое свойство регуляторного пептида - Имунофана, которое создает преимущество при подборе средств патогенетической терапии инфекционных больных.

Недостаточная эффективность этиотропных средств терапии хронического бруцеллеза в значительной мере обусловлена внутриклеточным па-разигированием возбудителя и его длительной персистенцией в клетках

РЭС и нейтрофнлах. Применение средств патогенетической терапии, обеспечивающих повышение функциональной активности нейтрофилов, создает возможности для усиления элиминирования возбудителя и более эффективной терапии хронического инфекционного заболевания. В этой связи, представлялось целесообразным изучить действие Имунофана на адгезивную способность и кислород-зависимую систему бактервдидности нейтрофилов периферической крови больных хрошшеским бруцеллезом [41].

При поступлении в клинику у больных хроническим бруцеллезом отмечена супрессия основных показателей функциональной активности нейтрофилов периферической крови, в основном их адгезивной способности и кислород-зависимой системы бактерицидности, что указывает на сниженную резервную возможность нейтрофилов к бактериальному кил-лингу и состояние незавершенного фагоцитоза. Применение Имунофана вызывает нормализацию функциональных нарушений нейтрофилов по их адгезивной способности и метаболической активности в тесте ЛЗХЛ и НСТ. Уровень адгезии нейтрофилов у больных после лечения повышается с 31,94 ± 14,81% до 49,84 ± 9,05% при показателях в донорской группе -52,08 ± 3,61%, то есть более чем в 1,5 раза и соответствует значениям физиологической нормы. Так как адгезия является центральным звеном последующих этапов фагоцитоза, ее усиление имеет важное значение для активации фагоцитоза и восстановления межклеточных взаимодействий им-мунокомпетентных клеток.____

50 , мВ

45

НОРМА

37.3

20 -

35

30

25 •

10 •

15 •

5

0 ■

ii

III

IV

недели

Рис. 5 Показатели экспресии активных (форм кислорода нейгрофилами крови больных хроническим бруцеллезом в динамике лечения Имунофаном.

На рисунке 5 показана экспрессия активных форм кислорода нейтро-фипами крови больных в динамике лечения Имунофаном. На фоне резкого снижения показателя активных форм кислорода у больных к четвертой неделе достигается восстановление кислород-зависимой системы бактерицидное™, которая нарастает более чем в три раза. Представленные результаты демонстрируют эффективную коррекцию Имунофаном показателей функциональной активности нейтрофилов: адгезивной способности и кислород-зависимой системы бактерицидности.

Таким образом, применение Имунофана в комплексе терапевтических мероприятий при хронических формах бруцеллеза обеспечивает сокращение продолжительности субъективных симптомов болезни коррекцию Т- звена иммунитета, нормализацию количества В-лимфоцитов, усиление синтеза специфических антител 1£>М, ^а-класса и восстановление функциональной активности нейтрофилов.

При анализе результатов, характеризующих действие Имунофана на фагоцитарное звено иммунитета, обращает внимание усиление кислород-зависимого метаболизма фагоцитов, в то время как активность ферментов бактерицидности - миелопероксидазы (МПО) и кислой фосфатазы (КФ) оставались в пределах нормальных величин. В этой связи следует полагать, что резервная возможность нейтрофилов к бактериальному киллингу под действием Имунофана усиливается за счет выработки ими активных форм кислорода.

Как известно, одним из основных источников активных форм кислорода служит дыхательный взрыв фагоцитов в ответ на действие антигенного раздражителя. В условиях хронической воспалительной реакции при гиперпродукции свободных радикалов последние могут ускользать из фаго-сом в цитозоль макрофага и вызывать его гибель, либо проникая в ближайшее окружение повреждать другие клетки организма. Таким образом, гиперпродукция свободнорадикальных соединений может поддерживать в течение длительного времени хронический воспалительный процесс с деструкцией клеточных элементов и формированием вторичного ИДС. Напротив, стабилизация уровня продукции свободных форм кислорода фагоцитами до значений физиологической нормы позволяет сохранить их резервную возможность к бактериальному киллингу и избежать повреждающего действия на клетки ближайшего окружения. Поэтому усиление выработки нейтрофилами активных форм кислорода под действием Имунофана не вызывает чрезмерного усиления образования активных форм кислорода и реакций ПОЛ. При этом препарат активирует пролиферацию и диффе-

ренцировку клеток периферической иммунной системы, вызывая восстановление нарушенных показателей Т- и В- звена иммунитета и фагоцитарной активности нейтрофилов.

3.4.2. Коррекция антиоксидантного и иммунного статуса онкологических больных препаратом Имунофан.

Избыточное радикалообразование, вызывающее повреждеше и нарушение функционирования клеточных структур организма, имеет особенно важное значение в развитии токсикозов при терапии онкологических больных. Так, применение химио-лучевой терапии вызывает у больных накопление высокотоксичных свободнорадикальных и перекисных соединений, которые усиливают явления токсикоза в виде нарастания вегето-сосудистых реакций, угнетения гемопоэза и прогрессирующей иммуносу-прессии. В этой связи, их инактивация представляет собой важный этап де-токсикационной терапии. Эффект детоксикации может быть достигнут путем повышения резервной возможности организма к инактивации свободнорадикальных и перекисных соединений. Данный метод основан на активации антиокислительной системы организма препаратами, которые сами не обладают антиоксидантными свойствами, но оказывают влияние на продукцию и перераспределение эндогенных белков - антиоксидантов: су-пероксиддисмутазы, церулоплазмина и лактоферрина. Эти белки осуществляют обезвреживание и элиминирование свободнорадикальных соединений и переводят супероксиданион радикал в перекись водорода, которую разлагает каталаза до воды. Таким путем осуществляется антиокислительная защита и выведение свободнорадикальных соединений из организма.

Анализ результатов исследования по восстановлению продукции активных форм кислорода нейтрофилами больных хроническим бруцеллезом до значений физиологической нормы предполагает возможность регуля-торного влияния Имунофана на антиокислительную защиту организма и активность эндогенных антиоксидантов.

Определение действия препарата на антиоксидантную систему защиты организма проведено у 52 онкологических больных в Московском Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском институте им. П.А. Герцена (отделение химиотерапии, зав. отделением - профессор В.И. Борисов; отделение лучевой терапии, зав. отделением - профессор А.В. Бойко; лаборатория модификаторов и протекторов противоопухолевой терапии, зав. лабораторией - доктор биологических наук Р.И. Якубовская, ведущий научный сотрудник Е.Р. Немцова).

Для изучения влияния Имунофана на активацию эндогенных антиок-сидантов в крови больных определяли содержание церулоплазмина, лакто-феррина и активности каталазы. Больные раком пищевода ПЫУ стадии заболевания при поступлении сохраняли показатели антиокислительной системы в пределах нормальных значений, кроме лактоферрина, уровень которого в крови превышал принятые значения нормы. На фоне действия Имунофана у больных наблюдали статистически значимое повышение концентрации в крови церулоплазмина с 0,61±0,04 до 0,73±0,03 усл. ед. и усиление активности каталазы с 339±65 до 560+77 усл. ед.. Отмечена также выраженная тенденция к нарастанию концентрации лактоферрина.

Таким образом, назначение Имунофана больным в период подготовки к лучевой терапии вызывает выраженную активацию антиокислительной системы, что повышает резервные возможности организма элиминировать свободнорадикальные соединения и перекиси в период лучевого воздействия. С учетом полученных данных, представлялось важным оценить детоксикационное действие Имунофана у больных раком пищевода по критерию его влияния на состав и функциональную активность клеточных элементов крови до и после курса лучевой терапии. Как следует из результатов представленных в таблице 8 у больных при поступлении выраженных нарушений со стороны гранулоцитов, моноцитов, лимфоцитов и эритроцитов не отмечено. Выраженных изменений процентного отношения субпопуляций Т-лимфоцитов в контрольной группе также не выявлено.

Назначение препарата в период подготовки больных к лучевой терапии не влияет на указанные показатели и вызывает только усиление выработки активных форм кислорода (НСТ-тест), повышая резервную возможность нейтрофилов к завершенному фагоцитозу.

Наиболее глубокие изменения количества и функциональной активности клеток крови отмечены у больных, получавших только лучевую терапию, которая вызывает резкое снижение числа лейкоцитов и активности фагоцитирующих клеток. Количество нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов падает в 2 раза по отношению к соответствующим показателям до начала лучевой терапии, при этом состав основных субпопуляций Т-лимфоцитов существенно не меняется. Введение в схему терапии Имунофана (группа - Имунофан и лучевая терапия) позволяет значительно улучшить показатели формулы крови по сравнению с группой "Лучевая терапия".

Таблица 5. Влияние Имунофана на состав и функциональную активность клеточных элементов крови больных раком пищевода

Показатели Исследуемые группы больных

клеточного контроль лучевая Имунофан Имунофан Норма

состава терапия и лучевая

п=34 п=12 терапия п=22 п=22

Лейкоциты 6,2+0,4 2,9+0,3** 3,6+0,4* 6,8+0,4 5,0+0,8

Ю'кл/л

Нейтрофилы 109кл/л 3,8±0,4 1,9+0,2** 2,5+0,3* 4,5+0,3 2,8+0,2

Моноциты 0,5±0,1 0,24+0,05 0,4±0,1* 0,5±0,1 0,3+0,1

109 кл/л *

Лимфоциты 1,8+0,1 0,6+0,2** 0,7±0,1** 1,7+0,1 1,6+0,1

109 кл/л

Эритроциты 1012 кл/л 3,6±0,2 3,2+0,3 3,2±0,2 3,7+0,1 4,2±0,5

НСТ-спонт., 1,4±0,2 н/д 1,9+0,1** • 1,8+0,2** 0,5±0,1

НСТ-индуц., 1,1±0,2 н/д 1,7+0,2** 1,7±0,3** 1,2±0,2

усл. ед.

И С 0,78 н/д 0,89 0,94 2,4

Адгезивная

способность 49±5 25,4±б** 54+6* 44+3 50+2

лейкоцитов %

CD3, % 54+3 56±7 61+5 61+4 68+7

CD4, % 34±2 35+5 33±4 35±3 45±5

CD8, % 26+3 23±5 28+3 . 27+2 25+6

Примечание, контроль - показатели- щеточного состава крови до начала лечения, п - количество больных в группе.

* - р<0,05 по сравнению с группой больных, получавших лучевую терапию, М±т.

* *- р<0,05 по сравнению с контрольной группой.

Иммунокорригирукмцее действие препарата проявляется в усилении способности клеток к завершенному фагоцитозу по критериям увеличения их адгезивной способности и метаболической активности в НСТ-тесте.

Одним из наиболее важных критериев эффективности иммунокорри-гирующей и антиоксидантной терапии онкологических больных является достижение ими после лучевого воздействия нормальных показателей окислительно-антиокислительной и иммунной системы. С этой целью был проведен анализ распределения больных с нормальными показателями

крови, получавших только лучевую терапию или Имунофан и лучевую терапию (см. табл. 6).

Таблица 6. Динамика показателей окислительно-антиокислительной и иммунной системы у больных получавших противоопухолевую терапию

Показатели Исследуемые группы больных

контроль (и-54) лучевая терапия (п=12) Имунофан и лучевая терапия (п—22)

ПОЛ 11,1% 8,3% 45,4%

Церулоплазмин 25,9% 25% 59,1%

Лактоферин 20,4% 50% 45,4%

Катал аза 13% 25% 59,1%

Адгезия нейтрофилов 29,6% 0% 50%

Примечание: в таблице представлены относительное количество больных с нормальными показателями крови к общему количеству больных в данной группе. Контроль - относительное количество больных поступивших в отделение с нормальными показателями крови к общему количеству больных, п - количество больных в группе.

Применение лучевой терапии ингибирует функциональную активность нейтрофилов и сокращает количество больных с нормальным показателем переписного окисления липидов (ПОЛ) по сравнению с контрольной группой. В тоже время в группе больных получавших лучевую терапию отмечена выраженная тенденция к увеличению относительного количества больных с физиологическим уровнем лактоферрина и активности каталазы. Назначение Имунофана в период подготовки и между курсами лучевой терапии вызывает нормализацию ПОЛ почти у половины пациентов, а приблизительно у 60% усиление активности каталазы и повышение продукции церулоплазмина до физиологических значений, что следует рассматривать как коррекцию окислительно-антиокислительной системы у данных больных. При этом, у половины больных достигается восстановление показателя фагоцитарной активности нейтрофилов.

Представленные результаты применения пептидного препарата Имунофан в комплексной терапии онкологических больных демонстрируют достижение двух эффектов: коррекцию окислительно-антиокислительного статуса и стимуляцию иммунной системы организма. Обнаруженные свойства оригинального пептидного препарата позволяют отнести его к новому

классу биологически активных соединений - пептидным иммуноксидредук-тантам.

Применение иммуноксидредуктанта - Имунофана в комплексной терапии больных раком пищевода повышает резервную возможность организма к инактивации свободнорадикальных и перекисных соединений путем перераспределения эндогенных белков - антиоксидантов и активации катал азы.

Курсовое назначение Имунофана до начала лучевой терапии и в период ее проведения позволяет существенно сократить лучевые реакции со стороны лейкоцитов, нейтрофилов, моноцитов и резко усилить их фагоцитарную активность. Включение Имунофана в комплексную терапию больных раком пищевода 1П-1У стадии позволило повысить переносимость лучевой терапии, обеспечить непрерывность лечения и уменьшение степени выраженности лучевого эзофагита.

3.4.3 Применение Имунофана в лечении гепатитов при злокачественных заболеванию кроветворной и лимфоидной ткани.

Необходимость многочисленных гемотрансфузий больным со злокачественными заболеваниями кроветворной и лимфоидной ткани на фоне выраженной недостаточности иммунной системы является причиной их частого инфицирования вирусом гепатита. У большинства больных гемо-бластозами вирусный гепатит протекает длительно с частым формированием хронического процесса. Так, приблизительно у 80% детей с гемобласто-зами формируется хроническое течение вирусного гепатита В, что также связано с выраженной иммуносупрессией вызванной онкологическим процессом и противоопухолевой химиотерапией (Л.И. Зиновьева, 1987).

Среди не вирусных поражений печени у больных со злокачественными заболеваниями выделяют гепатотоксическое действие химиопрепаратов (гепатопатии, токсический гепатит, цирроз). В случае химиотерапии гепа-тотоксическими противоопухолевыми препаратами (Метотрексат, Ь-аспарагиназа, 6-меркаптопурин) поражения печени наблюдаются не менее чем у 30-60% больных. Все вышеуказанное патогенетически обуславливает необходимость применения терапии Имунофаном, обеспечивающей инактивацию повреждающих агентов и стимуляцию противовирусного иммунитета.

Исследование проведено в Научно-исследовательском институте детской онкологии ОНЦ РАМН (Зав. отделом гемобластозов, профессор В.И. Курмашов; профессор Л.А. Махонова; доктор медицинских наук И.Е. Гав-рилова).

Под наблюдением находился 21 больной в возрасте 4-14 лет. В результате комплексного обследования 11 детям установлен диагноз острого лимфобластного лейкоза, 9 - злокачественной лимфомы и 1 - солидной опухоли. Все больные получали лечение химиопрепаратами по принятым в клинике программам. Течение заболевания у всех осложнилось развитием патологии со стороны печени: вирусный гепатит диагносцирован у 15 больных (14 - гепатит В и 1 - гепатит С), токсический гепатит у 6. У всех больных были как клинические (желтушные у 8, субклинические - у 13), так и лабораторные признаки поражения печени (увеличение уровня АлАТ, АсАТ, общего билирубина у 8, при нормальной белокпродуцирующей функции). Серодиагностика - НВэ антиген +4-16.

Онкологические больные исследуемой группы с вирусным и токсическим гепатитом получали Имунофан подкожно по 1,0 мл 0,005% раствора 1 раз в 4 дня. Курс лечения включал 20 инъекций препарата. Результаты лабораторного обследования больных до и после лечения Имунофаном представлены в таблице 7.

Таблица7. Динамика лабораторных показателей активности патологического процесса в печени при лечении Имунофаном онкологических больных вирусным и токсическим гепатитом.

Показатели активности Вирусный гепатит Токсический гепатит

До лечения После лечения До лечения После лечения

АлАТЕд/л 1329±377 203+51* 706±266 118±39*

АсАТ Ед/л 628+252 84±18* 208+55 48+10*

Общий билир. мкмоль/л 79±40 28+8* 16+3 9±2

Примечание: *-Р<0,05 по сравнению с соответствующей группой больных до лечения Имунофаном, М±т.

Как следует из представленных данных применение препарата позволяет значительно улучшить показатели активности патологического процесса в печени при вирусном и токсическом гепатите у тяжелых больных со злокачественными заболеваниями кроветворной и лимфоидной системы. В результате проведенного лечения у всех пациентов отмечено выраженное клиническое улучшение (сокращение симптомов интоксикации, желтушности, размеров печени и селезенки). Ни в одном случае не было зарегистрировано побочных реакций и осложнений. Всем больным острым лимфобластным лейкозом и злокачественными лимфомами удалось про-

должить лечение химиопрепаратами практически не нарушая намеченной программы [3,4].

Таким образом, результаты применения Имунофана при поражении печени вирусного и токсического генеза больным со злокачественными заболеваниями, свидетельствует о достоверном снижении активности патологического процесса печени, что позволяет продолжить лечение опухолевого процесса и тем самым повысить его эффективность.

3.4.4. Клинико-иммунологическая эффективность применения Имунофана у больных хроническим гепатитом В.

Как известно, развитие хронической вирусной инфекции, например хронического гепатита В, непосредственно зависит от состояния иммунной системы организма. Наиболее часто переход острой формы заболевания в хроническую отмечается у лиц для которых характерна недостаточность Т-системы иммунитета. Данное наблюдение, а также лимфотропное действие вируса гепатита В, указывает на существование патогенетического механизма хронизации патологического процесса, опосредованного нарушениями клеточного иммунитета. С другой стороны, формирование иммунной реакции на Т-зависимые антигены вируса гепатита В определяет уровень гуморального иммунитета, то есть продукцию противовирусных антител. В этой связи и с учетом иммунокорригирующего действия Имунофана на клеточный и гуморальный иммунитет при хронической бактериальной инфекции (бруцеллез), представлялось целесообразным определить его клинико-иммунологическую эффективность у больных хронической вирусной инфекцией - гепатитом В.

Исследование проведено у 102 больных в отделе патологии взрослых ЦНИИЭ на базе 2-ой Клинической инфекционной больницы г. Москвы (Зав. отделом, член-корр. РАМН В.В. Малеев; профессор A.B. Змызгова; канд. мед. наук С.Л. Максимов) и на кафедре инфекционных болезней Уральского медицинского института (Зав. кафедрой, профессор В.М. Бор-зунов) совместно с Гепатитным центром и Городской клинической больницей N40 г. Екатеринбург.

С учетом выявления хронического прогрессирующего вирусного поражения печени по данным клинического, вирусологического и морфологического методов исследования, снижения содержания субпопуляций им-мунорегуляторных клеток больным назначали Имунофан 1 раз через трое суток, курс лечения 8-10 инъекций. Для предотвращения рецидива больным рекомендовано амбулаторно проводить повторные курсы через 4-6 месяцев.

Результаты иммунологического обследования пациентов при поступлении в клинику обнаруживают умеренную лимфопению с тенденцией к снижению абсолютного количества В-лимфоцитов, Т-хелперов, и активности ЫК клеток при относительном увеличении количества зрелых Т-лимфоцитов. Отмеченные нарушения имеют выраженное сходство с показателями клеточного иммунитета у больных хроническим бруцеллезом и характеризуют наличие ИДС [20,26].

Непосредственно после применения Имунофана на 3 сутки у больных вирусным гепатитом В отмечено увеличение хелперных и супрессорных лимфоцитов, стимуляция Ж.-клеток на фоне увеличения общего количества лимфоцитов. Положительное влияние Имунофана отмечается в период всего срока терапии и сопровождается восстановлением баланса субпопуляций Т-лимфоцитов. Таким образом, Имунофан вызывает коррекцию показателей клеточного иммунитета у больных хроническим вирусным гепатитом, как и при другой хронической инфекции - бруцеллезе.

На рисунке 6 представлены результаты по изучению влияния Имунофана на показатели противовирусного иммунитета у больных с вирусным гепатитом В.

1

До Зсутии 7сутки 28сутки : До Зсутки 7сут«и 28сутки лечения ; | лечения

,! ! СЗНВе-антиген

'! 1 нНВе-антитела

:

Рис. 6 Влияние Имунофана на показатели противовирусного иммунитета у больных вирусным гепатитом В.

П НВэ-антиген ■ НВз-акгитела

На 3 сутки после назначения препарата наблюдается снижение частоты экспрессии НВе-антигена, который у всех больных исчезает к 7 суткам наблюдения. При этом к 28 суткам практически у всей группы больных

появляются анти-НВе антитела. Элиминирование НВе-антигена с появлением анти-НВе антител указывает на торможение репликации вируса гепатита В. На 7 сутки после начала терапии Имунофаном отмечается сокращение случаев экспрессии HBs-антигена, а к 28 дню достигается элиминирование вирусного антигена приблизительно у половины больных с появлением у 20% больных анти-HBs антител [5, 10].

На фоне стимуляции противовирусного иммунитета и торможения репликации вируса гепатита В у больных отмечается улучшение биохимических показателей активности патологического процесса. Так, уже на третьи сутки после назначения Имунофана у больных наблюдается снижение активности аминотрасфераз, а к 28 дню активность ACT сокращается с 401+ 182 до 242 ± 77 и AJIT с 747 ± 293 до 314 ± 84. Наряду с уменьшением активности аминотрансфераз сыворотки крови выявлено снижение уровня билирубина в 1,8-3 раза по сравнению с исходными данными [5]. Клинический эффект выражался в снижении частоты жалоб астеновегета-тивного и диспептического характера, исчезновении геморрагии, сокращении размеров печени и селезенки (табл.8).

Таблица 8. Динамика клинических проявлений хронического вирусного гепатита В у больных, получавших Имунофан и базисную терапию (контроль).

Группы Контроль Имунофан

больных 4 недели 4 недели 8 недель

Число больных 25 37 24

Слабость абс. 17 9 2

% 68 24,3 8,3

Геморрагии абс. % 6 24 2 5,4 1 4,2

Кожный зуд абс 7 3 I

% 28 8,1 4,2

Сплеиомегалия абс. 16 9 7

% 64 24,3 29,2

Таким образом, применение Имунофана у больных хроническим гепатитом В демонстрируют достижение выраженного клинического эффекта, сокращение активности хронического воспалительного процесса в печени, восстановление нарушенных показателей Т-клеточного и усиление противовирусного иммунитета с достижением частичного или полного элиминирования вирусных антигенов.

3.4.5. Клинико-иммунологическая эффективность применения Иму-нофана у больных оппортунистическими fСПИД-маркерными) заболеваниями.

Специфическая терапия СПИД-маркерных заболеваний, таких как цитомегаловирусная (ЦМВ) инфекция, токсоплазмоз, хламидиоз, пневмо-цитоз, герпетическая инфекция, криптоспоридиоз, листериоз и других оппортунистических инфекций, протекающих на фоне ИДС, малоэффективна и требует проведения комплексной терапии, включая препараты патогенетического и иммунокорригирующего типа действия. В этой связи представлялось целесообразным оценить эффективность Имунофана в комплексной терапии оппортунистических инфекций, протекающих на фоне ИДС и полиорганной патологии.

Работа проведена в отделении иммунодефицигных состояний Городской инфекционной клинической больницы (ГИКБ) №1 и стационара кафедры инфекционных болезней Омской Медицинской Академии на базе ГИКБ №1 (Зав. кафедрой инфекционных болезней ОГМА, профессор В.Н. Дроздов, зав. отделением ВИЧ-инфекции - доцент Э.Ф. Зайкова).

Критерием для включения 202 больных в исследование являлось наличие типичной клинической картины заболевания, подтвержденной лабораторными анализами. Каждому больному проводили комплекс лаборатор-но-инструментальных исследований: иммуноферментный анализ со специфической для каждого заболевания тест-системой с определением титров G, М и А, а при необходимости, с их качественной расшифровкой с определением индекса авидности, оптической плотности антител с использованием соответствующих тест-систем, а также определением цепной полиме-разной реакции, ДНК-вируса в моче, слюне, слезной жидкости, реакции иммунофлуорисценции и др.

Исследуемая группа больных (102 человека) на фоне базисной терапии получала лечение Имунофаном. Препарат применяли в виде внутримышечных инъекций один раз через 2 суток - 5 инъекций, затем один раз через 4 суток - 5 инъекций. При необходимости курс лечения мог быть увеличен до 15 доз.

Больные группы сравнения (100 человек) получали этиопатогенети-ческое лечение (базисную терапию) в том числе и иммуномодулирующий комплекс (адаптогены, энтеросорбенты, УФО- и гемосорбция).

Как известно, больные со СПИД-маркерными заболеваниями имеют в большинстве случаев полиоргакность патологии, в том числе центральной нервной системы - вегето-сосудистую дистонию, астено-

цефалгический синдром, энцефалопатию. В некоторых случаях при инфекции - микст наблюдают диэнцефальный синдром с кризами и рассеянный энцефаломиелит. Поражение пищеварительного аппарата у больных является характерным проявлением полиорганной патологии, которая выражается в виде эрозивного гастродуоденита, эзофагита, холецистохалангита, энтероколита и гепатита. Явления полиорганной патологии отмечают и со стороны поражения глаз (эндогенные увеиты, хориоретиниты, кератиты).

Лимфаденопатия, артралгомиапгия, синдром хронической усталости и субфебрилитет являются характерными для всех оппортунистических инфекций. Поэтому при оценки терапевтической эффективности применения Имунофана ее результат оценивали по основным синдромальным проявлениям оппортунистической инфекции.

При иммунологическом обследовании больных СПИД-маркерными инфекциями при поступлении отмечено снижение фагоцитарной активности по показателю фагоцитарного индекса и резервной возможности ней-трофилов к завершенному фагоцитозу по НСТ-тесту. Применение Имунофана у больных вызывало повышение фагоцитарного индекса до значений нормы, в то время как у больных получавших базисную терапию фагоцитарный индекс изменялся незначительно. Назначение Имунофана вызывает усиление кислород-зависимой системы бактерицидности нейтрофилов подобно тому, как это установлено при лечении хронического бруцеллеза.

Таким образом, назначение препарата больным стимулирует метаболические реакции фагоцитирующих клеток, что особенно важно при вирусных инфекциях хронического течения (ЦМВ, герпинфекция), сопровождающихся иммунокомплексными реакциями. Усиление фагоцитарной активности и восстановление баланса субпопуляций Т-лимфоцитов у больных получавших Имунофан сопровождается положительной динамикой со стороны ЦИК. Так, при поступлении обследуемых больных наблюдали повышение ЦИК до 350 усл. ед. и более. На фоне применения Имунофана отмечали нормализацию данного показателя в течение 3-4 недель. У больных получавших базисную терапию данный показатель приближался к значениям нормы в течение 6-8 недель. Применение Имунофана также способствовало восстановлению общего количества лимфоцитов. При этом, у больных отмечено улучшение баланса субпопуляций лимфоцитов, что демонстрирует увеличение ИРИ с 0,8 ± 0,1 до 1,75 ± 0,3 после завершения курса лечения Имунофаном.

Положительное влияние Имунофана на показатели иммунной реакции у больных сопровождалось его выраженным действием на клиническое

течение инфекционного процесса. Результаты клинической эффективности применения Имунофана в сочетании с этиопатогенетической терапией представлены в таблице 9.

Таблица 9. Длительность основных синдромальных проявлений у больных оппортунистическими инфекциями

СИНДРОМЫ Период клинико-лабораторных проявлений синдрома в днях

Группа сравнения Исследуемая группа

ЛИХОРАДКА 29,8+1,6 16,3+0,8*

ЛИМФ АДЕНОП АТИЯ 38,6±2,3 25,2±0,7*

АСТЕНО-НЕВРОТИЧЕСКИЙ, АСТЕНО-ЦЕФАЛ-ГИЧЕСКИЙ СИНДРОМ, ЭНЦЕФАЛОПАТИЯ 28,4±0,9 19,6±1,4*

ДИСПЕПТИЧЕСКИИ. БОЛЕВОЙ 19,8±0,2 8,6±1,2*

а) без органических поражений дегистивного аппарата 12,4+0,1 4,6±1,8*

б) с органическими поражениями: эзофагкт, эрозивный гастродуоденит 25,4±1,8 15,2+1,1*

в) длительность репаративного процесса 40,3+1,8 31,4+1,6

АРТРАЛГО-МИАЛГИЯ 12,8+0,5 6,2±0,7*

СРОКИ САНАЦИИ ДИСБАКТЕРИОЗА КИШЕЧНИКА 24,4±1,8 20,1+1,7

НОРМАЛИЗАЦИЯ БИОХИМИЧЕСКИХ ОТКЛОНЕНИЙ ПРИ ГЕПАТИТАХ 19,4±1,8 10,5±1,1

АКТИВНОСТЬ ОФТАЛЬМОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЯВЛЕНИЙ 38,6+1,06 19,4+1,3*

Примечание. * -р<0,05 по сравнению с группой сравнения, М±т.

Как следует из полученных данных, Имунофан усиливает антитоксическую базистерапию полиорганной патологии и сопутствующих заболеваний, что выражается в сокращении периода проявлений клинических синдромов. Кроме того, на фоне применения Имунофана больные отмечали исчезновение слабости, пелены и тумана перед глазами, нормализацию сна и настроения, улучшение аппетита. Побочных эффектов от введения препарата у больных не отмечено.

Таким образом, применение Имунофана у больных оппортунистическими инфекциями оказывает выраженный терапевтический эффект, сокращает период и уменьшает активность проявлений клинических синдромов заболевания, значительно улучшает субъективное состояние пациентов Препарат обладает антитоксическим, репаративно-противовоспалительным действием и положительно влияет на неврологические проявления, возникающие при СПИД-маркерных заболеваниях.

Выраженный клинический эффект сопровождается стимуляцией лимфопо-эза, кислород-зависимой системы бактерицидности нейтрофилов и нормализацией баланса основных субпопуляций Т-лимфоцитов. Усиление метаболических реакций фагоцитирующих клеток под действием Имунофана вызывает ускоренное выведение из организма ЦИК и торможение аллергического воспаления.

3.4.6. Клинико-иммунологическая оценка эффективности применения Имунофана у больных постреанимационного периода с гнойно-септическими осложнениями и тяжелообожженных.

Одной из главных задач терапии больных постреанимационного периода является профилактика и лечение инфекционных осложнений. Наиболее частой непосредственной причиной гибели пациентов, перенесших терминальные состояния, являются инфекционные осложнения. Летальность в результате инфекции у таких больных достигает 80,2% случаев (В.В. Ерофеев, 1993). Необычайная частота и тяжесть ожоговой токсемии, септикотоксемии и явлений ожоговой энцефалопатии вызывает летальный исход у 30% тяжелых ожоговых больных (Ю.И. Тюрников и др., 1994). Решение задачи повышения эффективности лечения больных постреанимационного периода помимо совершенствования средств этиотропной терапии, требует создания новых способов патогенетической и иммунокорри-гирующей терапии.

Следует отметить, что отличительной особенностью иммунологического статуса больных постреанимационного периода является полиморфизм проявлений иммунологических нарушений - от снижения активности некоторых параметров до гиперактивации отдельных звеньев иммунной системы (В.Н. Семенов и др., 1989; A.A. Лешин 1993). Возникающие иммунологические нарушения могут усугублять проявления патологических синдромов тканевой гипоксии и нарушения микроциркуляции в период развития ГСО у хирургических и тяжелых ожоговых больных. Ключевым цитокином, медиатором межклеточного взаимодействия иммунокомпе-тентных клеток, играющим в тоже время патогенетическую роль в возникновении воспаления, тканевой гипоксии и нарушении микроциркуляции в результате повреждения эндотелия сосудов, является кахектин или ФНО (Marks I.D., et al., 1990). В этой связи определение продукции и активности ФНО у больных до и после назначения Имунофана позволяет оценить его действие, как средства патогенетической терапии.

Клиническое изучение препарата у больных ГСО и тяжелообожженных проведено в Научном центре хирургии РАМН (лаборатория иммуно-

логии и регуляторных механизмов в хирургии, зав. лабораторией профессор Л И. Винницкий); научно-исследовательском Институте общей реаниматологии РАМН (профессор В.Н. Семенов, к.м.н. A.A. Лешин); 36 Городской больнице г. Москвы (зав. ожоговым отделением - Тюрников Ю.И.); Краевом Центре клинической иммунологии при Краевой клинической больнице N 1 г. Красноярск (зав. Краевым Центром иммунологии - Протопопов Б.В.) Всего в период проведения клинических испытаний наблюдалось 92 пациента с септическим состоянием возникающим в постоперационном или постшоковом периоде. Испытуемая группа больных, как и группа тяжелообожженных, получала раствор Имунофана внутримышечно или подкожно 1 раз в сутки - 7 - 10 инъекций, а в случае необходимости курс продолжали до 20 инъекций с интервалом в 1 день. В качестве группы сравнения изучали 30 больных с ГСО различной этиологии не получавших лечение Имунофаном. Обе группы больных получали этиопатогенетиче-ское лечение включающее массивную антибактериальную терапию, а также экстракорпоральную гемо- и плазмоспленоперфузию, плазмоферез и ге-мокарбоперфузию. Больные находились на лечении в отделении гнойно-септической реанимации от 40 до 60 дней и характеризовались наличием II-III степени эндотоксикоза (нарушение гемодинамики, функции приоритар-ных органов, наличием постгипоксической энцефалопатии). Тяжесть состояния оценивали по интегральной системе SAPS, оцениваемой в баллах. При поступлении в отделение реанимации значение индекса тяжести по системе SAPS колебалось от 6,8 до 12,7 балла. Груша тяжелообожженных составляла 52 человека с ожоговым шоком, острой ожоговой токсемией, септикотоксемией, а также лиц, с сочетанной травмой. Критерием для отбора больных была их крайняя тяжесть состояния, обусловленная наличием ожогового шока, разгаром токсемии; больные после повторных хирургических операций, а также больные с вероятностью развития ГСО. ^

При развитии ГСО у больных иммунологический профиль выглядел следующим образом: у 10,9% больных - активация звеньев иммунной системы, у 12,9% - глубокое угнетение, у 75,2% - дезинтеграция иммунной системы и только у 1% - не наблюдали существенных изменений в системе иммунитета. Наиболее тяжелое ГСО отмечено у больных с дезинтеграцией иммунной системы (угнетение клеточного и активация гуморального звена иммунитета).

Благоприятный исход в группе больных с ГСО получавшей традиционную терапию отмечен у 33% пациентов, а летальный исход у 67% больных. Наиболее высокий уровень летальных исходов констатирован среди

пациентов страдающих нагноившейся гематомой печени (100%), септической пневмонией (80%) и перитонитом (перфорация кишечника, несостоятельность анастомоза-78%).

Введение в схему комплексной терапии Имунофана позволяет сократить уровень летальности среди пациентов с перитонитом до 50%, септической пневмонией до 33% и нагноившейся гематомой печени до 33%. Общий показатель летальных исходов среди всей группы больных с ГСО реанимационного профиля уменьшился до 37%. За время применения препарата Имунофан ни у одного больного не было выявлено побочных реакций, системных, аллергических и других осложнений. Пациенты переносили препарат хорошо, субъективно отмечали его высокую эффективность и полезность. После 3-4Х кратного введения Имунофана у большинства больных отмечено уменьшение признаков интоксикации: лихорадки, тахикардии и тахипноэ [25].

Таким образом, применение Имунофана в комплексной терапии больных с ГСО позволяет значительно увеличить случаи благоприятного исхода заболевания, в том числе и среди пациентов с его наиболее тяжелыми клиническими формами. Клиническая эффективность препарата коррелирует с результатами иммунологического обследования больных с ГСО для которых характерна дезинтеграция иммунной системы и гиперпродукция кахектина (ФНО) [37,38].

Для оценки иммунорегулирующего действия препарата исходные показатели иммунного статуса пациентов были разделены на две группы: 1-группа, в которой иммунологический показатель был ниже физиологической нормы и 2- группа, у которой данный показатель превышал принятые нормальные значения. В дальнейшем оценивали увеличение или снижение показателя в каждой группе.

Как следует из представленных данных (табл. 10) назначение Имунофана больным со сниженными показателями иммунитета вызывает увеличение соответствующего показателя, а у больных с повышенными показателями отмечено их снижение. Таким образом, курсовое назначение препарата сокращает или устраняет дезинтеграцию иммунной системы у больных с ГСО и восстанавливает нарушенные показатели клеточного и гуморального иммунитета. На фоне восстановления иммунного статуса, у септических больных отмечается торможение гиперпродукции ФНО (рис. 1). Учитывая важную роль гиперпродукции ФНО в возникновении воспалительной реакции, тканевой гипоксии и нарушении микроциркуляции у больных ГСО, нормализация его продукции подтверждает регуляторное

действие Имунофаиа на генерацию патогенетического фактора инфекционного воспаления.

Таблица 10. Влияние Имунофана на измененные показатели клеточного и гуморального иммунитета больных по сравнению с группой больных, не получивших Имунофан.

Наимено

вание показа- Нормальные Получившие терапию включая Имунофан Получавшие терапию без Имунофана

теля и величины До После лечения До После лечения

группы больных лечения лечения

N X dX Pi N X dX Pi

I Leu 4500-8500 8 4000 +1200 0,05 2 3950 +5750 н/д

2 Leu абс./мкл 54 9720 -2040 0,05 28 11147 -217 0,05

1 Lym 1300-2400 46 896 +521 0,05 24 1016 +683 0,05

2 Lym абс./мкл 16 2965 -283 0,05 6 3270 + 183 н/д

1CD3 900-1300 15 600 +285 0,05 17 672 +289 0,05

2CD3 абс./мкл 6 1699 -189 н/д 9 1981 -466 0,05

1 CD4 600-800 16 457 + 125 0,05 15 298 +204 0,05

2CD4 абс./мкл 7 1542 -463 0,05 3 1192 -511 н/д

1 CD8 300-500 10 286 +37 н/д 9 233 +97 0,05

2CD8 абс./мкл 14 846 -102 0,05 10 764 -116 0,05

I CD 16 100-300 7 46 + 153 0,05 4 88 +58 н/д

2CD16 абс./мкл 13 577 -103 0,05 13 724 +153 0,05

1 CD22 300-900 3 52 + 194 н/д 2 75 + 125 н/д

2CD22 абс./мкл 19 558 -60 0,05 15 606 +110 0,05

1 Аф 43-72 32 40 +33 0,05 13 88 -10,62 0,05

2 Аф % 18 85 -7,11 0,05 - - - -

1 Ig G 6,0-12 3 4,12 +1,86 н/д 1 5,72 -0,01 н/д

2 Ig G г/л 19 16.8 -5,77 0,05 11 15,3 -2,9 0,05

llgM 2,0 - 5,0 5 1,52 +0,1 0,05 1 1,24 +0,39 0,05

2 Ig M г/л 15 6,32 -1,7 0,05 9 9,78 -6,39 н/д

1 СОЭ 4-12 - - - - - - - -

2СОЭ мм/час 62 31,2 -14,53 0.05 30 28,06 -0,69 н/д

Примечания: 1 - больные со сниженным показателем;

2 - больные с повышенным показателем;

Х - среднее арифметическое значения в группе;

<ЗХ - среднее значение изменения показателя в группе;

Рг - доверительная вероятность (н/д - изменения недостоверны);

АФ - активность фагоцитоза.

Общая иммунологическая характеристика тяжелообожженных и больных с ГСО реанимационного профиля в целом сохраняет общие признаки ИДС и дезинтеграции иммунной системы с наличием крайне тяжело-

го клинического течения, токсемии и сочетанными повреждениями ЦНС. Назначение препарата в комплексной терапии ожоговых больных с острой токсемией, септикотоксемией и с явлениями ожоговой энцефалопатии оказывало положительное терапевтическое действие, которое выражалось в улучшении субъективного состояния больных и сокращении симптомов интоксикации по сравнению с группой получавшей традиционную терапию. С учетом специфики терапии тяжелообожженных важное значение для оценки клинической эффективности препарата имеет изучение его влияния на эпителизацию и сроки подготовки к первой аутодермопластике. Так, назначение Имунофана больным с ожогами 11-ША степени и 20-30% площади поверхности тела позволяет сократить сроки эпителизации на 2,4 дня и период подготовки ожоговых ран к первой аутодермопластики с 20,5 до 16 дней.

Таким образом Имунофан обладает выраженной клинической эффективностью в комплексной терапии ожоговых больных с острой токсемией, септикотоксемией у больных с гнойно-септическими осложнениями и с явлениями ожоговой энцефалопатии. Терапевтическое действие препарата у больных реанимационного профиля с ГСО и у тяжелообожженных проявляется на фоне его иммунорегулирующего действия и нормализации продукции медиатора воспаления - ФНО..

3.4.7. Клиническая эффективность применения. Имунофана при острой инфекиии - дифтерии. ■

Результаты клинических испытаний пептидного имуноксидредуктан-та - Имунофана у больных хроническими инфекциями и' ГСО демонстрируют его выраженное иммуномодулирующее, детоксикационное и противовоспалительное действие. С учетом особенностей механизма действия и клинической эффективности при лечении хронической бактериальной инфекции представлялось целесообразным оценить его терапевтическую эффективность при острой инфекции - дифтерии.

Единственным средством специфической терапии дифтерии является гетерологичная противодифтерийная сыворотка (ПДС), которую обычно назначают в комплексной терапии с применением антибиотиков и стероидных гормональных препаратов. Однако, традиционный метод комплексной терапии токсических и осложненных форм инфекции недостаточно эффективны. Сокращение количества летальных исходов и осложнений, очевидно, является важнейшим показателем эффективности терапии больных дифтерией. В этой связи результаты лечения больных оценивали по еле-

дующим критериям: выздоровели без осложнений, наличию специфических ранних или поздних осложнений и по летальному исходу.

Работу проводили в инфекционных отделениях больницы скорой медицинской помощи, Городской больнице N5 (Городская централизованная лаборатория клинической иммунологии, зав. лабораторией - В.А. Болибок) г. Калуги; на базе городской клинической больницы N 40 и кафедры инфекционных болезней (зав. кафедрой, профессор В.М. Борзунов) Уральского медицинского института г. Екатеринбурга. Испытуемая группа, которая получала лечение Имунофаном составляла: по Калужскому региону 26 человек (из них 14 - с распространенной и токсическими формами), по Уральскому региону - 22 человека (из них 1В - с распространенной и токсическими формами), всего 48 человек.

Испытуемые группы больных получали Имунофан на фоне традиционной терапии с первого дня госпитализации по 1 мл 0,005% раствора внутримышечно 1 раз в сутки в течение 8-10 дней.

Группа сравнения по Калужскому региону состояла из 150 человек (24 - с распространенной и токсическими формами), по Уральскому региону - 45 человек (30 - с распространенной и токсическими формами дифтерии), всего 195 человек. Пациенты получали только традиционную терапию согласно методическим рекомендациям МЗ РСФСР "Клиника, диагностика и лечение дифтерии". - Москва - 1990.

В течение клинического наблюдения больных локализованной формой дифтерии развитие специфических осложнений и летальных исходов у больных не отмечено. Все пациенты обеих групп Калужского и Уральского регионов с локализованной формой дифтерии выздоровели без осложнений

[9J-

Больные с распространенной и токсическими формами дифтерии, для которых наиболее характерно развитие специфических осложнений и случаев летальных исходов, были изучены по критерию эффективности терапии традиционным методом и с применением Имунофана. Имунофан назначали в комплексной терапии, включающей использование ПДС. Однако, у пациентов, с выраженной аллергической реакцией на пробное введение ПДС, ее применение оказывается невозможным. Так, в период проведения работы, два пациента не получили ПДС из-за выраженной аллергической реакции. Данным больным назначен курс Имунофана совместно с антибиотиками и стероидными гормонами. Оба пациента с распространенной и токсической I формой дифтерии выздоровели без осложнений. Таким образом, назначение препарата возможно рекомендовано больным с выра-

женными аллергическими реакциями на введение гетерологичной противодифтерийной сыворотки. Результаты сравнения двух методов терапии представлены в таблице 11.

Таблица 11. Сравнительная эффективность терапии больных дифтерией традиционным методом и с применением Имунофана._

Форма дифтерии ТРАДИЦИОННАЯ ТЕРАПИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ ПРЕПАРАТА "ИМУНОФАН"

без. ослож 1 ранн. ослож 2 позд. ослож 3 летал, исход 4 всего больных дальность % без ослож. 1 ранн. ослож. 2 позд. ослож. 3 летал, исход. 4 всегсг больных егаль ность %

распространенная а) 6 0 0 2 8 25,0 1 0 0 0 1 0

6) 7 0 0 2 9 22,2 4 0 0 0 4 0

токсическая I а) 4 0 0 0 4 0 7 2 0 0 9 0

6) 2 1 0 1 4 25,0 3 0 0 0 3 0

токсическая И а) 3 2 0 2 7 28,6 О 0 0 0 0 0

б) 4 2 0 2 8 25,0 4 1 0 0 • 5 0

токсическая 1П а) 0 1 1 3 5 60,0 1 2 0 I 4 25,0

6) 3 0 3 3 9. 33,3 3 2 0 1 6 16,7

а) ВСЕГО: % от общ. числа: 13 54,2 3 12,5 1 4,2 7 29,2 24 29,2 9 64,3 4 28,6 0 0 1 7,1 14 7,1

б) ВСЕГО: % от общ. числа: 16 53,3 3 10,0 3 10,0 8 26,7 30 26,7 14 77,8 3 16,7 0 0 1 5,6 18 5,6

Примечание: а) - г. Калуга и Калужская область;

б) - г. Екатеринбург и Свердловская область

Как следует из представленных данных, среди больных групп сравнения Калужского и Уральского регионов без осложнений выздоровели только 54,2% и 53,3%, а количество летальных исходов составило 29,2% и 26,7%, соответственно [9]. Применение препарата Имунофан позволило резко сократить летальность по обеим регионам. Так, количество летальных случаев по Калужскому региону снизилось в 4,1 раза, а по Уральскому - в 4,8 раза. При этом, общее количество больных, выздоровевших без осложнений, увеличилось на 10,1% и на 24,5%, соответственно.

Полученные результаты лечения в испытуемых и контрольных группах достоверно отличаются по критерию х1 Пирсона (Р1 <0,1).

Таким образом, включение Имунофана в комплексную терапию больных распространенной и токсической формой дифтерии обеспечивает

снижение общего количества осложнений и сокращает в 4,1 - 4,8 раза количество летальных исходов заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Направленный пептидный синтез производных фрагментов химического гормона открывает возможность получения новых биологически активных веществ. Модификация аминокислотной последовательности гормона иммунитета - тимопоэтина, путем замены аминокислотных остатков в его активном участке и элонгации фрагмента негомологичной аминокислотой, впервые позволила создать синтетический гексапептид структурной формулы: аргинил-а-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин, обладающий свойством оказывать регуляторное действие на две защитные системы организма: иммунную и окислительно-антиокислигельную. На основании совокупности эффектов его действия, полученный гексапептид определен как регуляторный иммуноксидредуктант.

2. Регуляторное влияние гексапептида определяется в диапазоне низких доз и характеризуется его способностью восстанавливать нарушенные показатели иммунной и окислительно-антиокислительной системы организма. Детоксикационное и противовоспалительное действие регуляторно-го гексапептида опосредуется его участием в механизмах инактивации сво-боднорадикальных и перекисных соединений, нормализации пероксидации липидов и продукции медиаторов воспаления.

3. Коррекция окислительно-антиокислительной системы достигается влиянием препарата на продукцию эндогенных антиоксидантов и активность каталазы, что позволяет отнести его к группе антиоксидантов непрямого типа действия.

4. Регуляторный гексапептид оказывает влияние на Т-систему иммунитета подобно естественным тимическим гормонам и активирует их продукцию. Препарат оказывает регулирующее действие на образование медиаторов иммунитета и созревание Т-лимфоцитов. В отличии от тимиче-ских гормонов, иммунорегулирующая активность полученного пептида не зависит от продукции ПГЕ2 и его применение возможно в комбинации с противовоспалительными препаратами стероидного и нестероидного ряда.

5. Влияние пептидного иммуноксидредуктанта на напряженность противоинфекционного иммунитета характеризуется активацией его гуморального звена с резким нарастанием титра специфических противовирусных или антибактериальных антител и восстановлением фагоцитарной активности клеток (адгезивной способности и кислород-зависимой системы бактерицидности).

6. Препарат усиливает иммуногениость вакцин (против клещевого энцефалита, бешенства, гепатита А, вирусного ринотрахеита - инфекционного пустулезного вульвовагинита) и оказывает выраженное нротективное действие на организм и потомство при заражении вирусами. Влияние препарата на продукцию специфических антибактериальных антител эквивалентно действию лечебной бруцеллезной вакцины. В отличие от последней Имунофан не оказывает влияния на продукцию реагиновых антител класса

Е и не усиливает реакцию гиперчувствительности немедленного типа.

7. На основе синтетического гексапептида - фармакологического вещества, получено лекарственное средство под названием "Раствор Имуно-фана 0,005% для инъекций" в ампулах по 1,0 мл. для подкожных и внутримышечных инъекций. В качестве стабилизатора раствор Имунофана содержит 0,5% глицина.

8. Применение Имунофана в комплексе терапевтических мероприятий при хронических инфекциях: хроническом гепатите В, хроническом бруцеллезе и у больных оппортунистическими (СПИД-маркерными) заболеваниями, позволяет сократить продолжительность клинических симптомов болезни, длительность основных сидромальных проявлений и активность хронического воспалительного процесса; обеспечить полное или частичное восстановление Т-звена иммунитета, а также усиление противовирусного и антибактериального иммушггета, повышение активности фагоцитов и элиминирования ЦИК. Включение Имунофана в комплексную терапию больных острой инфекцией - распространенной и токсической формой дифтерии, вызывает снижение общего количества осложнений и уменьшает число летальных исходов заболевания.

9. Применение Имунофана у больных постреанимационного периода с гнойно-септическими осложнениями и тяжелообожженных оказывает иммунорегулирующее, антитоксическое и репаративно-противовоспалителыюе действие, сокращает явления постгипоксической и ожоговой энцефалопатии и позволяет увеличить количество благоприятных исходов заболевания.

10. В комплексной терапии онкологических больных Имунофан повышает резервную возможность организма к инактивации свободноради-кальных и перекисных соединений, улучшает показатели перекисного окисления липидов и позволяет существенно сократить лучевые реакции со стороны лейкоцитов, нейтрофилов, моноцитов, резко усилить их фагоцитарную активность, улучшить переносимость и обеспечить непрерывность лучевой терапии.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Баймуканова Г.К., Писарев В.М., Лебедев В.В., Певницкий Л.А., Белозеров Е С. Экологический иммунодефицит: разработка биотехнологических способов коррекции // Материалы Всесоюзной конференции "Экологическая безопасность и техногенный риск предприятий". - Иркутск. - 1991. - стр.9-II.

2. Баймуканова Г.К.. Писарев В.М., Певницкий Л.А., Лебедев В.В. Экспериментальное моделирование экологического иммунодефицита и его иммунокоррекция.// Тезисы докладов 1 съезда иммунологов России. - Новосибирск. - 1992. - стр. 28-29.

3. Гаврилова И.Е., Короткова О.В., Махонова Л.А., Лебедев В.В., Курмашов В.И. Иммунофан в лечении гепатитов при злокачественных заболеваниях кроветворной и лимфоидной ткани у детей. // Детская онкология. - 1995. - N 2-3. - стр. 24-26.

4. Гаврилова И.Е., Короткова О.В., Махонова Л.А., Лебедев В.В., Курмашов В.И. Иммунофан в лечении гепатитов при злокачественных заболеваниях кроветворной и лимфоидной ткани у детей. // Российская конференция по детской гематологии "От науки к практике" (ESPH1). - Санкт-Петербург. - 1995. - стр. 145.

5. Змызгова A.B., Кокорева Л.Н., Максимов С.Л., Лебедев В.В., Ива-нушкин Е.Ф., Шалыгина Н.Б., Назаренко В.В. Сравнительная оценка терапевтической эффективности тимогексина и препаратов интерферона у больных хроническим активным гепатитом В.// Сб. научных трудов к 30-летию ЦНИИЭ "Актуальные вопросы эпидемиологии и инфекционной патологии". - Москва. - 1993. - с.49-53.

6. Кремлев С.Г., Писарев В М., Лебедев В.В. Модуляция экспрессии вспомогательных молекул межклеточного взаимодействия и синтез иммуноглобулинов.// 1 съезд иммунологов России. - Новосибирск. - 1992. -с.251-252.

7. Лебедев В.В., Кремлев С. Г., Писарев В.М., Тутельян A.B. Влияние синтетического регуляторного пептида тимогексина на продукцию различных классов иммуноглобулинов.// Бюлл. экспер. биол. мед.- 1994.- N10,- с. 417-420.

8. Лебедев В.В., Титов М.И., Максимова Г.Ф., Портнова А.П., Моло-коедов A.C., Зайцевская Е.В., Хлябич Г.Н. Фенотипическая коррекция иммунного ответа L-тирозином у мышей, оппозитно- реагирующих на эритроциты барана.// Бюлл. экспер. биол. мед.- 1988,- N11.- с.583-585.

9. Лебедев В В., Болибок В.А.. Борзунов В В., Ефимов Н.В., Тенкачев В.З., Покровский В.И. Опыт применения иммунокорригирующего препарата "Имунофан" для лечения дифтерии.// Тер. архив. - 1996. - т.68.- N 2,-с.66-68.

10. Лебедев В.В., Сулейманов А.К., Тутельян A.B., Шелепова Т.М., Иванушкин Е.Ф., Назаренко И.В., Степанов О.Г. Биотечнологические и клгашко-иммунологические аспекты разработки и применения пептидных иммунокорригирующих препаратов четвертого поколения.// Сб. научных трудов к 30-летию ЦНИИЭ "Актуальные вопросы эпидемиологии и инфекционной патологии ". Москва. - 1993.-с.65-69.

11. Лебедев В.В., Покровский В.И., Писарев В.М., Смирнова М.П., Сулейманов А.К. Новый лекарственный препарат, содержащий синтетический регуляторный пептид и его клинико-иммунологическая эффективность при лечении вирусных и бактериальных инфекций.// Международный симпозиум по аллергологии и клинической иммунологии. - Алма-Ата. - 1992.-С.181.

12. Лебедев В.В., Писарев В.М.. Смирнова М.П., Кремлев С.Г., Максимов С.Л., Тутельян A.B., Степанов О.Г., Покровский В.И. Новые синтетические иммунорегуляторные пептиды - иммунологические аспекты при инфекционной патологии.// I съезд иммунологов России. - Новосибирск. -1992.-с. 270.

13. Лебедев В.В., Покровский В.И., Писарев В.М., Смирнова М.П., Сулейманов А.К., Шелепова Т.М. Тимогексин - новый лекарственный препарат, содержащий синтетический ' регуляторный пептид и клинико-иммунологические аспекты его применения при инфекционной патологии.// I Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". - Москва. -1992.-С.101.

14. Лебедев В.В., Тутельян A.B., Степанов О.Г., Шелепова Т.М., Авдеева Ж.Э. Имунофан - пептидный препарат нового поколения для иммунопрофилактики и лечения зоонозов.//Международный симпозиум "Пищевые зоонозы - сапьмонеллезы, кампилобактериоз, иерсиниозы, лис-териоз. Методы и средства диагностики, лечения и профилактики". - Москва,- 1995,- с.29-30.

15. Лебедев В.В., Сулейманов А.К., Максимов С.Л., Смирнова М.П, Шелепова Т.М., Степанов О.Г.. Разработка нового лекарственного препарата для лечения некоторых вирусных и бактериальных инфекций, содержащих синтетический регуляторный олигопептид.// Материалы конферен-

ции "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии".-Махачкала. - 1992. - с. 174-176.

16. Лебедев В.В., Хлябич Г.Н., Покровский В.И. Дифференцированная коррекция клеточного и гуморального иммунитета препаратами на основе пептидов и L-аминокислот.// Материалы Всесоюзной научной конференции "Актуальные вопросы биотехнологии". - Москва. - 1987. - с.13-14.

17. Лебедев В.В., Покровский В.И., Шелепова Т.М., Степанов О.Г. "Средство для лечения иммунодефицитных состояний".// Патент Российской Федерации N 2062096.

18. Лебедев В.В., Ермолин Г.А., Титов М.И., Максимова Г.Ф., Моло-коедов А.С., Бородулина Н.П., Зайцевская Е.В., Шелепова Т.М.. Сепетов Н.Ф., Волощук О.М. "Способ получения вещества, стимулирующего клеточный и гуморальный иммунитет". // Авторское свидетельство СССР N 1469616.

19. Лебедев В.В., Шелепова Т.М., Кауров О.А., Смирнова М.П., Покровский В.И. "Пептид для подавления инфекционности вируса иммунодефицита человека и стимулирования иммунитета".// Авторское свидетельство СССР N 4850515.

20. Lebedev V.V., Pokrovsky V.I., Ivanuskin E.F., Stepanov O.G., Shelepova T.M., Development and clinical evaluation of thymogexin - new drag, containing synthetic peptide in the patients with chronic hepatitis В.// 1st International conference on immunorehabilitation. - Sochi-Dagomys. - 1992. -p. 116.

21. Лопухин Ю.М., Петров P.B., Арион В.Я., Бреусов Ю.Н., Глады- . щева Т.В., Санина И.В., Лебедев В В., Кирзон С.С., Иванушкин Е.Ф.// "Способ получения пептидов". - Авторское свидетельство СССР N 997298.

22. Лопухин Ю.М., Арион В.Я., Санина И.В., Лебедев В.В.. Барыш-ков Ю.А.// "Способ получения полипептидов". - Авторское свидетельство СССР N 3706037.

23. Lopukhin J.M., Petrov R.V., Arion V.Y., Breusov J.N., Gladysheva Т.V., Sanina I.V., Lebedev V.V., Kirzon S.S., Ivanushkin E.F.// Preparation for control of T-system of immunity and method for producing same. - United States Patent N 4, 377,511.

24. Lopukhin J.M., Petrov R.V., Arion V.Y., Breusov J.N., Gladysheva T.V., Sanina I.V., Lebedev V.V., Kirzon S.S., Ivanushkin E.F.// Preparation for control of T-system of immunity and method for producing same. - United Kingdom Patent N 2086392 B.

25. Лешин A.A., Писарев В.М., Кремлев С.Г., Лебедев В.В., Тутельян A.B. Фактор некроза опухоли и возможности коррекции его продукции у больных с гнойно-септическими осложнениями терминальных состояний.// Анестезиология и реаниматология. - 1993. - N2. - с.38-40.

26. Максимов С.Л., Лебедев В В., Иванушкин Е.Ф., Кокорева Л.Н.. Изменение некоторых показателей клеточного иммунитета у больных ХАГ и ХПГ и возможности выбора иммунокорригирующей терапии.// Материалы IV Всесоюзного съезда гастроэнтерологов. - Москва. - 1990. - т.2. - с. 169-171.

27. Медуницын Н.В., Акользина С.Е., Авдеева Ж.Э., Алпатова H.A., Шмелев В.А., Лебедев В.В., Степанов О.Г. Цитокины как стимуляторы поствакцинального иммунитета.// II Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". - Москва. -1995.- с.39.

28. Покровский В.И., Сулейманов А.К., Лебедев В.В., Желудков М.М., Клизенко O.A., Шмаров Д.А., Москалева Е.Ю., Караулов А. В. Им-мунореабилитирующее действие тимогексина при лечении больных хроническим бруцеллезом.// Тер. архив. - 1992. -N11.- с.22-26.

29. Pokrovski V.l., Suleimanov А.К., Lebedev V.V., Zheludkov M.M., Kizenko O.A., Shmarov D.A., Moskaleva E.Yu., Karaulov A.V. Immunorehabilitative Effect of Thymohexin in Treatment of Chronic Brucellosis Patiens.// Soviet Archives of Internal Medicine. - 1992. - v64. - N6. - pp.647651.

30. Pokrovski V.l., Suleimanov A.K., Lebedev V.V., Kizenko O.A., Moskaleva E.Yu., Shmarov D.A., Zheludkov M.M., Karaulov A.V. Thymohexin in Immunorehabilitation in Patients with Chronic Brucella Infection.// 1st International conference on immunorehabilitation. - Sochi-Dagomys. - 1992. -p.118.

31. Певницкий Л.А., Баймуканова Т.К., Писарев В.М., Лебедев В В., Бакуридзе А.Д., Курцикидзе М.Ш. Экологический иммунодефицит: иммунологические аспекты его развития и коррекция.// Вестник РАМН,- 1994,-N4,- с.20-28.

32. Петрова О.Г., Лебедев В.В., Дерябин A.M. Эффективные противовирусные препараты при инфекционном ринотрахеите - инфекционном пустулезном вульвовагините крупного рогатого скота.// Сб. трудов Свердловской НИВС "Проблемы профилактики и лечения заболеваний сельскохозяйственных животных". - Екатеринбург. - 1995. - N 10. - с.80-84.

33. Писарев В.М., Баймуканова Г.К., Тутельян A.B., Певницкий Л.А., Лебедев В В. Иммунорегулирующее действие нового синтетического гек-

сапептида Имунофана при фармакологически индуцированном и экологическом иммунодефиците.// Вестник РАМН - 1995,- N12,- с.22-27

34. Писарев В.М., Тутельян А.В., Данилина А.В., Кремлев С.Г., Ткачева Т.Д., Лебедев В.В., Певницкий Л.А. Механизмы ингибиции продукции фактора некроза опухоли а синтетическим гексапептидом - Имунофаном.// Вопросы медицинской химии.-1995,- N2,- с. 11 -15.

35. Писарев В.М., Шмарина Г.В., Данилина А.В., Волгина В.В., Лебедев В.В. Лекарственная регуляция коммитирования лимфоцитов человека к апоптотической гибели.// II Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". - Москва. - 1995,- с. 141.

36. Pisarev V.M., Kremlev S.G., Lebedev V.V., Tutelyan A.V., Leskov V.P. Pevnitzky L.A. Isotype-specfic Regulator Cells of Immunoglobulin Production Induced by Thymogexin - Synthetic Modified Analog of the Immune System Hormone Thymopoietin.// Международный симпозиум по аллергологии и клинической иммунологии. - Алма-Ата. - 1992. - с.246.

37. Pisarev V.M., Kremlev S.G., Lebedev V.V., Tutelian A.V., Leskov V.P., Pevnitski L.A. Modulation of immunoglobulin and tumor necrosis factor production by regulator cells induced by synthetic hexapeptid modified analog of thymopoetin.// VIII International congress of immunology. - Budapest. - 1992. -p.271.

38. Pisarev V., Leoshin A., Tutelyan A., Danilina A., Kremlev S., Lebedev V., Semienov V. Septic inflammation and control of TNF sponaneous production.// 12th. Eur. Immunol. Meeting.- Barselona- 1994,- p. 126.

39. Seisenbaev A.Sh., Balabanova R.M., Barishnicov A.Y., Tupicin N.N., Lebedev V.V. Correction of immunoregulation disorders in rheumatoid arthritis model in vitro.// IVth Prague rheumatological symposium.- Prague-Czechoslovakia.--1989,-p. 114.

40. Сулейманов А.К., Желудков M.M„ Чернышева М.И., Лебедев В.В., Магомедова Д А. Динамика уровней специфических иммуноглобулинов классов G, А, М и Е в процессе лечения больных хроническим бруцел-лезом.//Тер. архив,- 1992. - N11,-с.26-28.

41. Сулейманов А.К., Лебедев В.В., Ющук Н.Д., Никулин А.Н.. Динамика показателей метаболической активности нейтрофилов крови больных хроническим бруцеллезом при лечении тимогексином.//1 съезд иммунологов России. - Новосибирск, 1992. - с.463.

42. Suleimanov А.К.., Zhelodkov М.М., Chernysheva M.I., Lebedev V.V., Magomedova D.A. Changes in Levels of Specific IgG, IgA, IgM, and IgE during

Treatment of Patients with Chronic Brucellosis.// Soviet Archives of Internal Medicine. - 1992. - v64. - N 6,- pp.644-646.

43. Титов М.И., Кадагидзе З.Г., Лебедев B.B., Табагари Д.З., Портно-ва А.П., Дейгин В.И., Помогайбо С.В., Хлябич Г.Н. "Гексапегтгид, обладающий иммунорегулирующим и противоопухолевым действием."// Авторское свидетельство СССР N 1482154.

44. Шелепова Т.М., Степанов О.Г., Лебедев В.В. Получение антител к естественным и синтетическим фрагментам пептидных гормонов иммунитета// Междуна-родный симпозиум по аллергологии и клинической иммунологии." Алма-Ата -1992.- с.339.

Считаю своим долгом выразить глубокую признательность академику РАМН, проф. В.И. Покровскому за проведение консультаций и помощь в написании работы, а также Член-корр. В.В Малееву, Н.В. Медуницину, В.Н. Семенову, проф. В.М. Борзунову, В.И. Борисову, A.B. Бойко, Л.И. Винницкому, В.Н. Дроздову, A.B. Змызговой, В.И. Курмашову. Л.А. Ма-

хоновой, д.м.н. И.Е. Гавриловой, А.К. Сулейманову , д.б.н. Р.И. Якубов-

ской, к.б.н. Е.Р. Немцовой, к.м.н. Э.Ф. Зайковой, A.A. Лешину, С.Л. Максимову и В.А. Болибоку за консультативную помощь и создание творческой атмосферы при проведении совместных научных исследований.