Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуноцитотропные эффекты С-реактивного белка

Актуальность проблемы.

Кооперативные взаимоотношения, возникающие между специфическими и неспецифическими защитными реакциями, являются предметами пристального внимания иммунологов в последние годы. Это связано с тесным взаимодействием медиаторных сигналов этих двух звеньев поддержания иммунологического гомеостаза. Имеются указания на важную роль С-реактивного белка (СРВ) в неспецифичее-ких и иммунных реакциях, а также в обеспечении взаимодействия между ними. Показанная ранее иммунорегуляторная роль С-реактив ного белка, указания на возможность его конформационных изменений в ходе воспалительной реакции и взаимодействия с фагоцитами крови служат основанием для углубленного изучения влияний нативного СРВ и его форм на клетки, непосредственно вовлеченные в воспалительный и иммунный процессы: нейтрофилы, моноциты и лимфоциты. Описано поглощение СРВ нейтрофилами и его йротео-лиз в фагосомах нейтрофилов с выделением пептвдных фрагметов, иммуномодулирующие свойства которых обсуждаются в литературе. Наиболее значимыми направлениями могут стать исследования влияния СРВ, его конформационных вариантов и биологически активных пептидов, выщепляемых из молекулы этого белка в ходе протеолиза, на метаболический аппарат фагоцитов, их миграционную и фагоцитарную активность, продукцию цитокинов нейтрофилами и макрофагами и роль в митогенезе лимфоидных клеток, а также изучение кооперативных взаимоотношений, возникающих между клетками под действием СРВ. Всё это определяет актуальность исследования цитотропных эффектов СРВ в ходе воспалительной реакции.

Цель исследования

Целью настоящего исследования явилось выяснение роли нативного сывороточного С-реактивного белка, его конформационных вариантов и пептидных фрагментов в изменении метаболизма и модулировании основных функций нейтрофилов, моноцитов и лимфоцитов периферической крови человека. Задачи исследования

- сравнить воздействие пентамерного и мономерного СРВ, пептвдов из молекулы СРВ на метаболизм нейтрофилов и моноцитов, их миграционную и фагоцитарную активность;

-.определить характер влияния конформационных вариантов СРВ и пептидных фрагментов на лимфоциты, находящиеся в покоящемся или активированном состоянии;

•» оценить зависимость эффекта СРВ на фагоцитирующие клетки крови от исходного уровня их метаболизма; ~ изучить возможность влияния СРВ и его конформационных вариантов и пептвдов на продукцию нейтрофилами и моноцитами ИЛ-1-подобных факторов и продукцию интерферонов лейкоцитами крови;

- исследовать механизмы кооперативных взаимодействий между лимфоцитами и нейтрофилами при действии СРВ.

Научная новизна работы

Основным результатом проведенной работы является экспериментальное доказательство зависимости характера действия СРВ на лейкоциты крови от конформационной структуры СРВ и от наличия в среде тафтсиноподобных пептвдов, которые могут выщеплять-ся из нативной молекулы белка в ходе его протеолиза в организме. Впервые в пределах одного исследования показано нарастание иммуномодулиругацих свойств СРВ по мере перехода от нативной молекулы к мономерам, и от мономеров к пептидам. Эксперимент тально показано начие иммуномодулирукяцих свойств у пептвдных фрагментов из молекулы СРБ, и зависимость характера действия этих пептидов на лимфоциты от стадии клеточного цикла лимфоцитов. Впервые обнаружена зависимость характера действия СРБ на кислородный метаболизм нейтрофияьных гранулоцитов от исходного уровня этого показателя. Показано, что при действии на нестиму лированные покоящиеся нейтрофилы СРБ дозозависимо усиливает кислородный метаболизм этих клеток, но при действии на нейтрофилы с повышенными показателями спонтанного кислородного метаболизма понижает, нормализуя его.

Впервые установлена зависимость митогенного эффекта СРБ на лимфоциты от сохранения пентамерной структуры молекулы и независимость этого действия от присутствия в среде других митоге-нов. Показана роль взаимодействия СРБ с нейтрофилами и лимфоцитами, заключающаяся в снижении собственного митогенного эффекта СРБ и.повышений его комитогенности в сочетании с другим мито-геном.

Впервые оценено действие различных фирм СРБ и пептвдов из молекулы СРБ на продукцию иммунокомпетентными клетками и нейтрофилами интерлойкин-1-подобных факторов и интерферонов.

Теоретическая и практическая значимость работы

Работа носит теоретический характер. Значение полученных данных состоит в установлении ранее неизвестных фактов, расширяющих представление о роли СЦреактивного белка как фактора неспецифической защиты и кооперации иммунных и неиммунных защит ных реакций. Работа теоретически обосновывает новый клинический подход к сопряженной оценке состояния имыунокомпетентных клеток с уровнями СРБ в сыворотке и течением воспалительного процесса.

В ходе работы произведена модификация рзда рутинных методов с их переводом на автоматизированный учет и сравнение модификаций с прототипом. Среди модифицированных методов - определение продукции супероксоданиона в НСТ-тесте, определение адгезии нейтро филов с использованием меченых пероксвдазой лектинов сои и арахиса, определение активности миелопероксидазн с помощью цветной ферментативной реакции.

Положения, выносимые на защиту

1. Характер цитйтропного влияния С-реактивного белка зависит от конформации молекулы; иммуномодулирущая активность нарастает при переходе от пентамерной молекулы к мономерной и далее к тафтсиноподобным пентодам, содержащимся в первичной структуре СРБ.

2. Эффект пентамерного СРБ на нейтрофилы, моноциты и лимфоциты не зависит от наличия в среде второго активирующего сигнала.

3. Действие мономерной формы СРБ и тафтсиноподобных пептидов из его молекулы не зависит от наличия в среде второго сигнала в случае фагоцитов, но требует такого сигнала в случае лимфоцитов.

Апробация работы

Основные результаты были представлены на I Всесоюзном иммунологическом съезде (Сочи, 1969), на конференциях молодых ученых и специалистов БЙЙЭМ АМН СССР (1986 и 1988 гг.), на заседаниях Ленинградского городского общества иммунологов (1988 и 1990 гг.) и секции иммунологии и иммунохимии Ленинградского городского общества микробиологов (1989), на конференциях профессорско-преподавательского составаЛенинградского Ветеринарного института "Актуальные проблемы ветеринарии" (1991 и

1992 гг.). Фрагменты работы были представлены на Х1У Международном конгрессе по аллергологии и клинической иммунологии (Зап.Берлин,1989 г.) и 9-м Международном симпозиуме но атеросклерозу (Иерусалим-Чикаго, 1991 г.).

Диссертационная работа апробирована на научной конференции отдела иммунологии НИИ экспериментальной медицины АМН 10 января 1992 года.

Публикации. По теме диссертации опубликовано и принято к печати 7 работ.

Структура и объём диссертации.

Работа состоит из введения, обзора литературы, главы "Материалы и методы", главы собственных исследований, представленных в 14 параграфах, обсуждения полученных результатов и выводов. Объем работы составляет 143 страниц машинописного текста. Полученные результаты отражены на 22 рисунках и в 27 таблицах. Список литературы включает 138 наименований, из них 23 работы принадлежат отечественным авторам и 115 - зарубежным.

Результаты исследования дозозависимости эффектов обеих форм СРВ приведены на рис.11. Полученные данные свидетельствуют, что мСРБ является более сильным хематтрактантом по сравнению с пСРБ. Наибольшие ПХ отмечены при умеренной концентрации • вносимого СРВ (10 мкг/мл для обеих форм) и снижается как при

8,0 7,0

6,0 -5,0 4,0 3,0

2,0

1,0 0

••a ,

•и Т^

• •

•

• ■ 4Б В д Е

Рис. 10. Влияние пентамерного и мономерного СРБ и тафтсиноподобных пептидов на. миграцию нейтрофилов По оси абсцисс нанесены результаты для: А- пСРБ, Б- мСРБ, В- тафтсина, Г- /Глн4/-тафтсина, Д- /Лей4/ -тафтсина, Е- /Гли*/-тафтсина, по оси ординат: значения показателя хемотаксиса. Концентрация вносимых в объёме 20 мкл реагентов составляла I мг/мл для СРБ и 0,1 мг/мл для пептидов. Точки- результаты отдельных наблюдений, черта - средний показатель и его ошибка.

Рие. II. Влияние концентрации вносимых форм СРБ на величину показателя хемотаксиса нейтрофилов По оси абсцисс нанесены концентрации п- и м- СРБ; по оси ординат: значения ПХ. Реагенты вносили в объёме 20 мкл. ЧИсло наблюдений равно 3. I - пСРБ, II - мСРБ. её повышении, так и при снижении. Шсокййкоэффициент корреляции ( г = 0,697) между кривыми X и II указывает на сходство биологических свойств п- и м-СРБ при различии в активности по отношению к активации направленной миграции при переходе от пСРБ к МСРБ.

§ 3.4. Влияние СРБ на адгезию нейтрофилов Полученные результаты позволяют говорить о положительном влиянии на адгезивность нейтрофилов (рис.12). Нф высокочувствительны к изменению концентрации СРБ и при её повышении всего в 6-8 раз от нормы отвечают достоверным повышением адгезивности. Прирост концентрации СРБ такого порядка характерен для ранних этапов воспалительной реакции. В контроле с ЧСА. адгезивность не изменялась (рис.12). Максимальное усиление адгезивных свойств нейтрофилов отмечается при концентрации пСРБ равной 25-50 мкг/мл при дозозависимом снижении адгезивности по мере уменьшения концентрации пСРБ. Между результатами воздействия пСРБ и ЧСА отсутствует корреляционная зависимость ( г = 0,080, Р>0,05), что указывает на специфический характер воздействия СРБ, эффект которого не основан на повышении концентрации белка в культу-ральной среде.

§ 3.5. Влияние тафтсиноподобных пептидов на фагоцитарную активность нейтрофилов Опсонические свойства, присущие СРБ, подробно описаны в литературе /94/. Поэтому в представленной работе мы ограничились изучением неосвещенного в литературе вопроса о характере воздействия тафтсиноподобных пептвдов из молекулы СРБ на процесс поглощения корпускулярных окрашенных веществ. Метод исследования описан в разделе 2.13, а полученные результаты приведены на рисЛЗ и 14.

0,5 -0,4 ■ '-■-<-:-1---;-I---» ' ---J--.

0 1,5 3,1 6,25 12,5 25 50 100

Рис. 12. Влияние СРБ на адгезивность нейтрофилов

По оси абсцисс: концентрация реагентов в мкг/мл, по оси ординат: разность между опытным и фоновым поглощением при 492 нм, единищ ОП. I - клетки с пСРБ, II - клетки с ЧСА. Кружком на оси ординат указан уровень адгезии контрольных нейтрофилов. Каждая точка представляет среднее по 9 и более наблюдениям ( в контроле 27 наблюдений).

0,06 •

0,05

0,04

0,03 .

0,02 0,01 •

0 К А Б В Г

Рис. 13. Влияние тафтсина и тафтсиноподобных пептвдов из молекулы СРБ на фагоцитарную функцию нестимулированных нейтрофилов

По оси абсцисс: вносимые факторы : А - тафтсин, Б - /Глн4/-тафтсин, В - /Лей4/-тафтсин, Г - /Гли1/-тафтсин в концентрациях 0,1 , 1,0 и 10 мкг/мл. Контролем служило внесение ЗФР. По оси ординат: разность между опытным и фоновым присутствием красителя, единищ ОП. Число наблюдений во всех случаях равно 3, в контроле - 6. Достоверность различий с контролем оценивали в помощью Z -критерия.

В нестимулированных клетках (рис.13) тафтсин вызывает дозо-зависимое усиление фагоцитарной функции, прирост которой при концентрации тафтсина 10 мкг/мл составляет 65,^ Аналогичным действием обладают все тафтсиноподобные пептиды, содержащиеся в молекуле СРВ. /Глн4/-тафтеин обеспечивает пркфост на 124,7%, а /Лей4/ -тафтсин - на 103,7%. /Гли*/-тафтсин обладает самым выраженным стимулирующим влиянием на фагоцитоз нейтрофилов и увеличивает потребление частиц красителя на 127,9 - 172,1%, что хорошо сочетается с литературными данными, полученными в отношении моноцитов, где указанные пептэды аналогично распределялись по активности: /Гли1/ >/Глн4/ >/Лей4/ /83/.

При одновременной стимуляции нейтрофилов субоптимальной концентрацией продигиозвна (6,3 мкг/мл) эффект указанных пептидов выражен слабее (рис.14). Тафтсин и /Глн4/-тафтсин не обеспечивают прироста фагоцитарной активности в .этом случае. Наиболее т четко стимулирующий эффект выражен у /Гли /-тафтсина (+55,4%), однако это повышение интенсивности фагоцитоза статистически недостоверно (Р>0,05).

В целом можно говорить только о тецценции к стимуляции фагоцитоза со стороны указанных пептидов при стимуляции проди-гиозаном. Это подтверждается достоверным коэффициентом корреляции (г «-0,602 + 0,241, Р<0,05) мезвду результатами воздействия тафтсиноподобных пептидов на фагоцитарную активность нейтрофилов в условиях коетимуляции продигиозаном и без неё. Данный результат согласуется с предположением, сделанным в § 3.1. о независимости характера действия пептидов от наличия в среде дополнительных факторов стимуляции (продигиозана).

§3.6. Влияние СРБ на биоцвдность нейтрофилов

Биоэдцность составляет один из важнейших компонентов антимикробной активности нейтрофилов. Существенной составной частью биоцидности является действие сосредоточенной в азурофильных гранулах миелопероксидазы (МП), которая зависит в своей активности от запуска ГМШ1, сопровождающегося выделением перекиси водорода. Механизмом действия'МП и произведенных ею активных форм кислорода является окисление структурных и функциональных белков бактериальной клетки-мишени. В этом состоит сходство между действием супероксщаниона и миелопероксидазы /14/.

Метод оценки активности МП описан в § 2.15, а результаты представлены на рис.15. Под действием пСРБ (100 мкг/мл) активность внутриклеточной МП возрастала на 4С$ и прирост носил статистически достоверный характер (Р <0,01).8 то же время мСРБ в той же концентрации не оказывал достоверного влияния на активность МП в нейтрофилах. ЧСА, взятый в той же концентрации, что и СРВ, также не влиял на активность МП (рис.15).

Для выяснения механизма действия СРБ в отношении Нф' транскрипцию в этих клетках блокировали обработкой 10 мкг/мл Д-акти-номицина (ДА) в течение всей инкубации. Установлено, что блока-тор транскрипции ДА отменял повышение активности МП в ответ на СРБ (табл.8). При этом не происходило снижения уровня уже синтезированной МП. мСРБ и ЧСА не влияли на активность МП вне зависимости от присутствия ДА в культуральной среде. Следовательно, пСРБ индуцирует в Нф синтез новых иРНК, ответственных за кодирование либо новых молекул МП, либо ферментов, участвующих в запуске ГШН, активация которого является необходимым условием эффективного функционирования МП и проявления биоцидности.

Заключение

Углубленное изучение биологии СРВ в последние годы открыло ещё один важный механизм кооперации неспецифических защитных и иммунных реакций. СРВ возник в период становления тканевых систем беспозвоночных и выполнял исходно функции протоантитела с заданной лигандной специфичностью /18/, игравшего также роль опсонина и стимулятора фагоцитов. При этом роль СРВ развивалась и усложнялась по мере становления и совершенствования защитных систем. Параллельная эволюция структуры и аминокислотной последовательности привела к появлению в молекуле иммуноактивных участков, реализующих свой эффекты после протеолиза в нейтрофи-лах в процессе воспаления. СРВ является хорошим примером теории, по которой специфические биологические функции некоторых белков могут быть присущи их уникальным аминокислотным последовательностям, которые открываются после разрушения исходного белка /107/.

Один из возможных путей развития неспецифической защитной реакции приведен на рис.2. В развитии каскада воспалительных реакций можно выделить ряд этапов.

I/ Агрегация пластинок при тканевом повреждении, запуск реакций системы свертывания крови, выделение tgf -д, который изменяет проницаемость эндотелия, усиливает синтез СРВ гепатоцитами, ингибирует размножение лимфоцитов и активирует макрофаги. 2/ Выброс сывороточного СРВ печенью, его накопление в очаге за счет взаимодействия с фибронектином и ламинином соединительной ткани, модификация СРВ под действием кислотных условий очага воспаления и активация комплемента, ведущая к хемотактическому привлечению нейтрофилов и макрофагов в очаг.

3/ Протеолиз СРВ в нейтрофилах, выброс тафтсиноподобных пептидов, I cv CO 1 фибробласты I L-1 TGFo

- ---- -—- л.——~—1---- IS моноциты лимфоциты

Рис.2. Ивдуцированные С~реактивным белком медиаторные взаимодействия в ходе воспалительной реакции

-^ - стартовые влияния

-.- влияние сывороточного пентамерного СРБ

---- влияние мономеров и тафтеиноподобных продуктов протеолиза СРБ х—х—х> - влияние медиаторов, индуцированных СРБ и продуктами его протеолиза модулирующих активность макрофагов, нейтрофилов, пластинок и, возможно, лимфоцитов и фибробластов.

V Привлечение макрофагов в очаг воспаления, синтез ими высокоактивных монокинов. Формирование контура усиления, состоящего из макрофагов, нейтрофилов и гепатоцитов, объединенных сывороточным СРБ и продуктами его протеолиза.

5/ Активация лимфоцитов в результате взаимодействия с активированными макрофагами, интерлейкинами и СРБ.

Таким образом, в настоящее время можно говорить о том, что при сохранении всех развившихся ранее функций СРБ, главной из них стала иммунорегуляторная. Тесные взаимоотношения СРБ,с макрофагами, нейтрофилами, кровяными пластинками, клетками печени, секреция этими клетками под действием СРБ ростовых факторов, хематтрактантов и ищуномодуляторов составляет основу для разс вертывания иммунного ответа на базе неспецифических защитных реакций и тесной кооперации между ними.

Однако предложенная характеристика взаимоотношений мезвду СРБ и лейкоцитами крови является далекой от завершения. Литературные данные часто носят фрагментарный характер, а исследования ограничиваются всего 2-3 характерными показателями. Отсутствуют экспериментальные данные, подтверждающие многие высказан ные в литературном обзоре предположения. Поэтому эксперименталь ная часть предлагаемой работы будет посвящена уточнению биологических эффектов пентамерной и мономерной форм СРВ и тафтси-ноподобных пептвдов из молекулы СРВ на наиболее существенные функции нейтрофилов, моноцитов и лимфоадных клеток.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

§ 2.1. Экспериментальные животные В работе использованы 30 мышей линии СБА, поставленные питомником лабораторных животных "Рапполово" Академии медицинских наук. Исследования проводили на самках массой 16-18 г, кото рые прошли перед исследованием- карантинное обследование в течение I недели.

§ 2.2. Доноры

К исследованиям было привлечено 85 доноров обоего пола. Испытуемыми были доноры 3 станции переливания крови г.Санкт-Петербурга, студенты I и 2 курса Ветеринарного института и лабо раторный персонал. Возраст доноров составлял от 18 до 53 лет при среднем значении 32,6 года. Антикоагулянтом служил гепарин (§-2.9) в финальной концентрации 12-20 Е)ц на 1 мл крови.

§ 2.3. С-реактивный белок СРБ был любезно предоставлен Л.К.Берестовой (Институт вакцин и сывороток, г.С.-Петербург). Белок вьщеляли из асцитной жвдкости больных с опухолями яичников путем ионообменной хроматографии. Концентрация электрофоретически гомогенного СРБ составляла около 1,0 мг/мл в определении по методу Лоури. Отепень' ишунологической чистоты препарата составляла не менее 99,5%. Полученный белок считали пентамерным сывороточным СРБ (пСРБ). пСРБ хранили в цитратном буфере при рН 6,2 при +4°С в стерильных условиях без консерванта. Перед использованием пСРБ диализовали против 1000-кратного объёма 0,15 М раствора NaCl при +4° С в течение ночи.

Для получения мСРБ пентамерный СРБ выдерживали при рН 2,0 в течение I минуты с последующим восстановлением реакции среды до нейтральной. агСРБ получали из пСРБ прогреванием в течение 5 минут в отсутствие ионов Са2+ при +63°С /98/.

§ 2.4. Пептвдные фрагменты молекулы СРВ Тетрапептвды тре- лиз- про- глн(/ГЛн^/-тафтсин), тре- лизл т про- лей (/Лей /-тафтсин), гли- лиз- про- арг (/Гли /-тафтсин) и тафтсин тре- лиз- про- арг были синтезированы путем твердофаз ного синтеза по нашему заказу НПО *Вектор" (г.Новосибирск). Лиофилизированные пептвды хранили при -18°С. Пептвды растворяли в ЗФР, устанавливая концентрацию 100 мкг/мл^ хранили в фасовках по 0,1 мл при -18°С.

§ 2.5. Лектины В работе использовали следующие лектины растений:

- ФГА-П (Difco , США) - для иццукции митогенеза лимфоцитов в РБТЛ и активации Нф к включению меченых предшественников синтеза РНК и белка;

- Кон А ( Pharmacia , Швеция) - для активаций Нф и стш^уляции тимоцитов мышей при определении активности ИЛ-1;

- митоген лаконоса ( МЛ, s@rva , ФРГ) - для иццукции митогене за В-лимфоцитов в РБТЛ;

- лектины сои и арахиса, меченые пероксидазой (КНПО "ДХагности-кум", г.Львев) в финальной концентрации'по 8 мкг/мл - при определении адгезии Нф.

Все лектины использовали в веде растворов на ЗФР. § 2.6. Гистологические красители и субстраты ферментативных реакций Из указанных реактивов применяли:

- 0,1% раствор азура II отечественного производства35 - для докрашивания ядер лейкоцитов в микроскопической модификации ж - если далее не указан производитель реактива, то речь вдет о реактивах отечественного производства.

НСТ-теста;

-0,1% раствор кристалл-виолета - для окрашивания адгезировав-ших нейтрофилов;

0,2$ раствор п-нитросинего тетразолия ( Ch@mapoi , ЧФР) - для выявления продукции супероксид аниона при измерении кислородного метаболизма Щ) и Мф. Для облегчения растворения НСТ к сухому порошку добавляли ДМСО в количестве 1/40 от расчетного объёма, достигали растворения красителя энергичным шшетированием при подогреве и после остывания раствора медленно добавляли ЗФР при тщательном перемешивании. Полученный раствор был устойчивым и не терял своих свойств по меньшей мере в течение 7 суток при хранении в холодильнике при +4°С;

- 0,1 % раствор амцдочерного ЮБ ( R@anai , Венгрия) - для кон трастирования клеток при учете миграции Нф под агарозой;

- 0,2$ суспензия м-НСТ (Е®апа1 , Венгрия) - для изучения фагоцитарной активности Нф и Мф;

- 0,04$ раствор орто-фенилендиамина (Sigma , США) и 0,1% раствор (по объёму) ^Og в фосфат-цитрат ном буфере при рН 5,0 - субстратная смесь для проявления пероксвдаз в оценке адгезии и био-цидности Щ>.

§ 2.7. Культуральные среды и сыворотки йхбор культуральной среды, концентрации в ней белков, антибиотиков и других добавок зависел от целей эксперимента, ь метода и продолжительности опыта.

-Среда, составленная на основе питательной среды epmi -1640 (plow ,Великобритания) с добавлением 1С# ЭТС (Институт вакцин и сывороток, г.С.-Петербург), 0,03% ь -глютамина (Московский институт полиомиелита и вирусных энцефалитов, МИПВЗ) и 80 мкг/мл гентамицина. феду указанного состава иепользовали при изучении продукции Ш1-1 и ИЛ-1-подобных факторов Мф-и Нф, тест1фовании i их активности, культивировании лимфоцитов человека, изучении синтеза РНК в н|йтрофилах.

- феда 199 (МИПВЭ) с добавлением 10$ ЭТС и 0,03% ь -глютамина

- для изчения миграции Нф под агарозой.

- Раствор Хенкса (РХ) е добавлением 10% ЭТС - для изучения кислородного метаболизма Нф и Мф и синтеза белка в Нф. jscPX, дополненный 0,1% желатиной - для изучения адгезии и био-цидности нейтрофилов.

§ 2.8. Радиоактивно меченые предшественники синтеза нуклеиновых кислот и белка Меченые по тритию (3Ю реагенты получены от НПО "Изотоп".

- 5-метил-3Н~тимодин 53Н-тд) с удельной активностью 1,85 ТБк/мМ использовали в финальной концентрации 37 кБк/мл для изучения синтеза ДНК в лимфоцитах в ходе РБТЛ и при тестировании Ш1-1 на мышиных тимоцитах.

- 5-3Н-уридин (3Н-ур) с той же удельной активностью и финальной концентрацией использовали для изучения изменений синтеза РНК в нейтрофилах.

- (2-3Н)-глвдин и Д,Ъ -(2,3«3Н)-лейщн (3Б-АК) с удельной актив ностью 3,8 ТБк/мМ использовали в финальной концентрации 55 кБк/мл для исследования синтеза белка в нейтрофилах.

§ 2.9. Другие реактивы, использованные в работе

- Градиенты Фиколл-Верографина (соответственно Pharmacia,Швеция и СЖЖ, ЧСФР) с плотностью, d =1,077 и 1,110 г/см3 собственного изготовления - для разделения клеток кровй. *

- 2,5% раствор поливиноловоГо спирта с молекулярной массой более 50 000 на ЗФР с добавлением 0,02% KCI и 0,01 % CaCIg -для вьщеления нейтрофилов и получения лейковзвеси.

- 0,832% и 0,084% водный раствор nh^gi и мансо* соответственнодля лизиса эритроцитов.

- 0,005% официальный продигиозан и 0,05% суспензия опсонизи-рованного зимозана - для иццукции респираторного взрыва в нейтрофилах и макрофагах.

-ДМС0 - для растворения НСТ и гранул диформазана в изучении кислородного метаболизма каеток и фагоцитоза. Часто в качестве диметилсульфокевда использовали официальный препарат димексид.

- 2 М КОН - для разрушения клеток и экстракции красителей.

- 1% агароза для электрофореза ( Ch®map6i , ЧСФР) на среде 199 с сывороткой - для изучения миграции Нф под агарозой.

-1% водный раствор додецилсульфата натрия (ДСН) ( Sigma ,США) -для экстракции красителя из адгезировавших лимфоцитов.

- Человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) (Reanai ,Венгрия в качестве контрольногр|белка во многих тестах.

- Д-актйномицин (ДД) в концентрации 10 мкг/мл - для блокирования транскрипции при изучении биооддности нейтрофилов.

5% водный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ) - для преципитаций белков в ходе подготовки проб к учету сцинтилляционном счетчике.

- толуольный сцинтиллятор, в состав которого входили 5 г

2,5-дифенилоксазола 5ППО) и 100 мг 1,4-ди (5-дифенилоксазолил)-бензола (ПОПОП) на I л толуола для спектроскопии - для радиомет рического учета пролиферации и активации клеток.

- абсолютный метанол - для фиксации мазков.

- абсолютный этанол - для промывки.проб при работе с изотопами.

- 96°, 70° и 40° этанол - для проводки гистологических материалов и фиксации клеток.

- 10 мМ ЭДТА ( Serva ,ФРГ) на ЗФР - для удаления с пластика адгезировавших макрофагов.

- свободный от консерванта гепарин СПОФА (ЧСФР) с концентрацией 130 Щ на X мл ЗФР.

- из других реактивов в работе применяли 0,15 М раствор Naci (физиологический раствор, ФР), ФР,забуференный фосфатами, рН7,2 (ЗФР), I М раствор HCI, I М раствор НаОН , 20% растворH2so^ 10% официнальный раствор желатины в ампулах, дистиллированную воду.

В необходимых случаях реактивы перед работой стерилизовали автоклавированием, либо мембранной фильтрацией при отрицательном давлении через фильтры Сынпор (ЧОФР) с диаметром пор 0,23 микрометра.

§ 2Л0. Оценка кислородного метаболизма нейтрофилов и моноцитов 2.10Л. Описание методов

Продукцию супероксццаниона нейтрофилами и моноцитами оцре-деляли двумя модификациями НСТ-теста: мазковым методом (ММ) и методом автоматизированного учета (МАУ), в основу которого были положены разработки /28/ и /104/, Принцип, лежащий в основе МАУ, заключается в высвобождении и растворении гранул диформазана из клеток с последующим количественным учетом результатов на много канальном спектрофотометре.

В ходе МАУ кровь, содержащую 12 гепарина на I мл крови, подвергали фракционированию. С этой целью 6 мл разбавленной 1:1 ЗФР крови наслаивали на 3 мл градиента Фиколл-Верографина с d = 1,077 г/см3 и центрифупфовали 40 минут при 350 g . Мононуклеары снимали с интерфазы и использовали в качестве источника Мц или лимфоцитов. Осадок, содержавший эритроциты и Нф, отмывали и разбавляли 1:1 ЗФР. К полученной суспензии добав ляли равный объём поливинолового спирта и после тщательного перемешивания инкубировали при +37°С в течение 15-20 минут. Обогащенный гранулоцитами надосадок отмывали ЗФР, и примесь эритроцитов лизировали добавлением к ресуспецдйрованным в 2 мл ЗФР клеткам 8 мл раствора хлористого аммония. Инкубацию проводи ли при +4°G в течение 15 минут /50/. Чистота выделения Щ> при этом способе составляла не менее 95%, а главной примесью были лимфоциты. Жизнеспособность ввделенных Нф составляла около 92%, а выход Нф от теотеретического достигал 50%.

Выделенные Щ> и Мц переводили в РХ с сывороткой, устанавли с вая концентрацию клеток равной 2*10 в I мл, которая была определена опытным путем. Повышение концентрации клеток приводило к повышению спонтанных показателей НСТ-теста. Клетки в среде с сывороткой хранили до использования на льду.

В 96-луночный планшет (завод медполимеров, г.С.-Петербург) вносили 50 мкл РХ с сывороткой (определение спонтанного показателя НСТ-теста) или разведений стимуляторов (ивдуцированный НСТ -тест), 100 мкл суспензии клеток и 50 мкл раствора п-НСТ. В качестве стищляторов использовали 0,05% суспензию опеонизиро-ванного зимозана или 0,0025% раствор продигиозана. По каждому разведению стимулятора ставили две параллельные пробы. В лунки в объёме 20 мкл вносили разведения СРБ, его фрагментов или пептццов, либо ЗФР (контроль). Одновременно определяли спонтанное восстановление НСТ в бесклеточной среде. После внесения всех реагентов планшеты центрифугировали при 150 g в течение 5 минут и затем инкубировали в течение 30 минут при +37°С. Продление инкубации сверх указанного срока повышало абсолютные значения, но снижало величину отношения опытных результатов к контрольным.

По завершении инкубации осадок уплотняли в планшете путем центрифугирования при указанных выше условиях* а надосадок резко вытряхивали, останавливая реакцию. Лунки промывали 0,3 мл ЗФР и 2 сменами абсолютного метанола, центрифугируя планшет при 400 g в течение 7 минут при кавдой отмывке. После высушивания планшета клетки разрушали внесением 120 мкл КОН и 140 мкл ДМС0. Клеточный монослой на дне плоскодонного планшета разрушали энергичным пипетированием, а полного растворения гранул диформа зана,достигали инкубацией планшета при +56° С в течение 10-15 минут. При этом из лунок также удалялись пузырьки воздуха. Спектроскопию проводили на цультискане МСС (Flow-fit®rt•cb , Великобритания) при длине волны 620 нм. Результат выражали в единицах оптической плотности (0П) после вычитания из опытных значений показателей епонтанно восстановленного НСТ в бесклеточ ной среде.

При использовании лейковзвеси вместо суспензии Нф или Мц в МАУ, к 3 объёмам цельной крови добавляли I объём раствора поливи-нола и после тщательного перемешивания кровь отстаивали 20-25 минут при +37°С. Примесь эритроцитов из полученной суспензии удаляли указанным выше способом.

Параллельно с описанной методикой проводили учет НСТ-теета в мазковом методе по /3/. Резульват выражали процентом НСТ+- , клеток.

Автор благодарит н.с. отдела иммунологии НИИ экспериментальной медицины канд.мед.наук. Е.П.Киселёву за плодотворное сотрудничество в разработке и практическом освоении метода автоматизированного учета НСТ-теста.

2.10.2. Сравнение результатов автоматизированного учета и мазкового метода

Полученные в параллельном исследовании данные обнаруживают значительное сходство закономерностей, получаемых в МАУ и

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1 0 контроль 12,5 6,3 3,2 50

25

- 100

80 60

40

20

12,5 0 А

Рис. 3. Сравнение результатов НСТ-теста в мазковом методе и методе автоматизированного учета (очищенные нейтрофилы) По оси абсцисс: концентрации стимуляторов, мкг/мл, А - продигиозан, В - опсонизированный зимозан; по левой оси ординат: единищ оптической плотности, полученные в МАУ, по правой оси ординат: процент НСТ+-клеток по результатам ММ. ©—--—о - результаты ММ , • • - результаты МАУ.

Каждая точка является средней по 10 наблюдениям.

-44ММ (рис.3). В обиих случаях продигиозан обеспечивает незначительный прирост продукции Og аниона, а ответ на опсонизирован-ный зимозан, напротив, характеризуется высокой амплитудой, дозо зависимостью и достоверным отличием от контроля (Р< 0,001) (рис.3). Коэффициент корреляции между результатами МАУ и ММ составляет г .= 0,823-0,254 (Р<0,05). Аналогичные результаты получены при использовании в МАУ очищенной от эритроцитов лейковзвеси вместо вьщеленных Нф(таблЛ). Коэффициент корреляции при этом между результатами двух методов составляет г = 0,760+ 0,291 (Р<0,05$, что подтверждает возможность использования лейковзвеси вместо очищенных нейтрофилов и особенно существенно при проведении широкомасштабных клинических исследо ваний.