Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунопрогностические критерии развития цирроза печени как исхода хронического вирусного гепатита С

На правах рукописи

ШМЕЛЁВА Евгения Васильевна

ИММУНОПРОГНОСТИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ РАЗВИТИЯ ЦИРРОЗА ПЕЧЕНИ КАК ИСХОДА ХРОНИЧЕСКОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА С

14.00.36 - Аллергология и иммунология 14.00.10 - Инфекционные болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2009

003488781

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет» Росздрава

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор

БАЛМАСОВА Ирина Петровна

ЮЩУК

Николай Дмитриевич

Официальные оппоненты:

академик РАЕН,

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

БОРИСОВА Алла Михайловна

ЕРОВИЧЕНКОВ Александр Анатольевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет» Росздрава

Защита диссертации состоится « 23 » декабря 2009 г. в « 1700 » часов на заседании диссертационного совета Д 212.203.26 в ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов (117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.Ю, корпус «А»).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов.

Автореферат разослан « 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Т.А.Славянская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вирусный гепатит С одна из наиболее серьезных и актуальных проблем здравоохранения как в России, так и в мире. По данным Всемирной организации здравоохранения более 175 миллионов жителей нашей планеты (3% населения) инфицировано вирусом гепатита С (ВГС), что позволяет отнести этот вирус к разряду глобальных пандемических агентов. Каждый год число страдающих ВГС-инфекцией возрастает на 3-4 миллиона (K.Lang, D.B.Weiner, 2008). В структуре хронических поражений печени доля вирусного гепатита С достигает 40% и более (О.О.Знойко, 2008; L.B.Seef, 1999; T.T.Tran, P.Martin, 2001).

В России только за 2000 г. лечебно-профилактическими учреждениями страны были выявлены и учтены 31 тыс. случаев острого вирусного гепатита С, 156 тыс. случаев носительства возбудителя вирусного гепатита С, 32 тыс. случаев впервые установленного хронического вирусного гепатита С (ХВГС) (И.Л.Шаханина, О.И.Радуто, 2001). По эпидемиологическим характеристикам заболеваемость ВГС-инфекции тесно связана с такими социальными проблемами как наркомания, безопасность медицинских и немедицинских манипуляций, связанных с нарушением кожных покровов, гемотрансфузий, оперативных вмешательств (О.НЕршова, 2006; Р.И.Сепиашвили и др., 2006; K.Lang, D.B.Weiner, 2008).

В 70-90% случаев заболевание принимает хроническое течение с прогрессирующим поражением печени, которое в среднем через 21 год у 20% больных развивается в цирроз печени, а далее у 8% формируется гепатоклеточная карцинома (К.-П.Майер, 2004; N.I.Rallón, V.Soriano, J.M.Benito, 2007; A.Rauch et al., 2007; VJ.Tong, N.S.El-Farra, A.R.Reikes, 1995). Такой высокий процент персистенции ВГС обусловлен тем, что несмотря на распознавание вируса факторами естественного и адаптивного иммунитета, ВГС ускользает от элиминации, при этом ВГС-индуцированное поражение печени в большей степени опосредованно иммунными механизмами, чем прямыми цитопатическими эффектами самого вируса (J.G.Bode, E.D.Brenndorfer, D.Haussinger, 2008).

Существуют определенные трудности в прогнозировании прогрессирования фиброза и развития цирроза печени. В настоящее время золотым стандартом

\

определения степени фиброзных изменений в печени является биопсия с последующим определением стадии фиброза, однако этот метод относится к числу высоко инвазивных, а его использование иногда приводит к серьезным осложнениям, угрожающим жизни пациента, кроме того, этот метод не позволяет осуществлять мониторинг заболевания, что заставляет продолжать поиск менее инвазивных способов определения критериев цирроза (.Ш.Ье&ошйсЬ, 2007; Н-УеБЬиа, Я-Огеп, 2008). Ввиду того, что определяющую роль в развитии и прогрессировании хронического гепатита С играет иммунная система, одним из таких критериев может служить характер иммунного ответа на ВГС с участием естественных киллеров (ЕК) и ЕКТ - клеток иммунной системы, широко представленных в печеночной ткани, за которыми признается ведущая роль в элиминации ВГС (Ь.ОоЫеп-Мазоп, Н.Я.Яо5еп, 2006; Т.Кеппа е1 а1., 2003; А.ЯаисЬ «Я а1., 2007).

Таким образом, проблема хронического вирусного гепатита С является чрезвычайно актуальной и с медицинской, и с социальной точки зрения.

Цель исследования: Определение диагностического и прогностического значения субпопуляционного состава и функционального состояния естественных киллеров и ЕКТ при хроническом вирусном гепатите С и разработка на их основе комплекса диагностически информативных критериев для оценки стадий фиброзных изменений в печени.

Задачи исследования:

1. Изучить характер иммунологических сдвигов со стороны основных субпопуляций лимфоцитов крови, субпопуляций естественных киллеров и ЕКТ, функционального состояния ЕК и ЕКТ при хроническом вирусном гепатите С в зависимости от пола и возраста больных.

2. Определить характер зависимости иммунологических сдвигов при хроническом вирусном гепатите С на разных стадиях фиброзных изменений в печени.

3. Выделить комплекс наиболее информативных показателей субпопуляционного состава ЕК и ЕКТ, уровня экспрессии маркеров функционального состояния этих клеток для оценки особенностей отдельных стадий фиброзных изменений и цирроза печени при хроническом вирусном гепатите С и определить диапазоны их значений.

4. Определить чувствительность и специфичность разработанного комплекса иммунологических критериев при хроническом вирусном гепатите С путем сопоставления с данными у больных хроническим вирусным гепатитом В, этанол-индуцированным циррозом печени и у здоровых людей.

Научная новизна работы. Впервые на достаточном клиническом материале дана детальная фенотипическая характеристика естественных киллеров и ЕКТ крови у больных хроническим вирусным гепатитом С, на основе чего был:

- разработан оптимальный подход для прогноза цирротических изменений в печени при хроническом вирусном гепатите С на основе иммунологических показателей крови, включающих содержание отдельных субпопуляций ЕКТ и уровни экспрессии маркеров функционального состояния естественных киллеров;

- показано особое патогенетическое значение иммунологических сдвигов со стороны показателей функционального состояния ЕК и ЕКТ крови, соответствующих третьей стадии фиброзных изменений в печени, при хроническом вирусном гепатите С;

- создан комплекс критериев оценки предцирротических изменений в печени и перехода их в цирроз печени на базе иммунологической оценки в крови субпопуляций ЕКТ и функционального состояния ЕК;

- разработана технология прогнозирования угрозы развития цирроза печени при ХВГС по комплексу нетрадиционных иммунологических критериев, определение которых не требует высоко инвазивных вмешательств в организм больного, а выполнение диагностических исследований вполне доступно лабораториям иммунологического профиля.

Практическая значимость. Показана целесообразность использования комплекса иммунологических показателей, основанных на оценке субпопуляционного состава ЕКТ и функционального состояния ЕК периферической крови, для прогнозирования угрозы развития цирроза печени при хроническом вирусном гепатите С.

Установлено особое патогенетическое значение некоторых иммуных сдвигов на третьей стадии фиброзных изменений в печени при ХВГС,

позволяющих определять эту стадию у больных на основе иммунологического анализа крови.

Подтверждена специфичность изменения диапазона значений для комплекса из 6 показателей субпопуляционного состава ЕКТ и функционального состояния ЕК крови для перехода со второй стадии фиброзных изменений на третью и с третьей стадии в цирроз печени при хроническом вирусном гепатите С.

Предложен комплекс иммунологических критериев, позволяющий осуществлять прогноз угрозы развития цирроза печени без проведения высокоинвазивных вмешательств в организм больного.

Внедрение результатов работы в клиническую практику и учебный процесс. Новые сведения о роли ЕК и ЕКТ в иммунопатогенезе предцирротических изменений в печени при хроническом вирусном гепатите С используются в учебном процессе на кафедре инфекционных болезней Московского государственного медико-стоматологическош университета (МГМСУ).

Разработанный комплекс иммунологических критериев для прогноза и вспомогательной диагностики цирроза печени при хроническом вирусном гепатите С используется в научно-практической деятельности лаборатории патогенеза и методов лечения инфекционных заболеваний НИМСИ МГМСУ, лаборатории Московского городского центра СПИД.

Апробация результатов исследования и публикации. Основные положения диссертации доложены на II Съезде физиологов СНГ; Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы»; XVI российском национальном конгрессе «Человек и лекарство»; X Международном Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии»; VII Съезде аллергологов и иммунологов СНГ; VIII научно-практической конференции НИМСИ МГМСУ «От науки к практике»; XXVIII Конгрессе европейской академии аллергологии и клинической иммунологии.

По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе: в центральной печати 1 и в иностранной печати 1.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 160 страницах и состоит из введения, обзора литературы, главы по материалам и методам исследования, 3 глав собственных исследований, заключения и обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 25 таблицами и 40 рисунками. Список литературы содержит 254 источников, из которых 43 отечественных и 211 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. Основная группа обследованных включала 41 человека с верифицированным диагнозом хронического вирусного гепатита С. В группы сравнения вошли: 20 пациентов с верифицированным диагнозом хронического вирусного гепатита В (ХВГВ) и 15 пациентов с верифицированным диагнозом алкогольного цирроза печени. Больные находились под наблюдением в стационарах г. Москвы: инфекционной клинической больнице № 2, инфекционной клинической больнице № 1, Клинике пропедевтики внутренних болезней, гастроэнтерологии и гепатологии им.В.Х.Василенко Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова. Контрольная группа состояла из 26 здоровых доноров.

Критериями отбора в основную группу служили: верифицированный диагноз хронического гепатита С в стадии ремиссии; отсутствие этиотропной терапии на момент исследования; наличие полученных в течение последних 3-х месяцев данных биопсии печени и 2-х недель положительных результатов на наличие в крови вируса гепатита С по данным ПЦР и серологических исследований; возраст от 21 до 60 лет; информированное согласие на обследование. Критериями исключения были: наличие тяжелых соматических заболеваний, наличие сопутствующих аутоиммунных заболеваний и заболеваний соединительной ткани, тяжелых заболеваний эндокринной системы, онкологических заболеваний, наличие ВИЧ-инфекции.

Группа больных с ХВГС состояла из 25 мужчин (61%) и 16 женщин (39%). По возрасту, группа была разбита на три категории: от 21 до 30 лет включала 10 человек, от 31 до 45 лет - 18 человек и от 46 до 60 лет - 13 человек (соответственно 27%, 38% и 35%).

Больные ХВГС были разделены на 4 подгруппы в соответствии со стадией фиброзных изменений печени по шкале МЕТА VIR (рисунок 1). Всем

больным подгруппы с циррозом печени диагноз был поставлен на основании анамнеза, результатов биохимических и физикальных исследований, данных УЗИ брюшной полости и эзофогогастродуоденоскопии.

Рис. 1. Распределение больных ХВГС по стадиям фиброза печени

Все пациенты с хроническим вирусным гепатитом В и С, вошедшие в группу обследованных, были подвергнуты в стационарных условиях биопсии печени с последующим гистологическим исследованием биоптатов. Оценка степени (стадии) фиброза печени при хронических гепатитах проводилась в биоптатах по шкале METAVIR (1994) (P.Bedossa, T.Poynard, 1996; T.Poynard et al., 2000): стадия 1 - звёздчатое расширение портальных трактов без образования септ; стадия 2 - расширение портальных трактов с единичными порто-портальными септами; стадия 3 - многочисленные порто-центральные септы без цирроза; стадия 4 - цирроз.

Иммунологические лабораторные исследования венозной крови с использованием проточного цитофлуориметра BD FACSCanto И (Becton Dickinson, США) после автоматизированной пробоподготовки цельной крови с помощью станции BD FACS Sample Prep Assistant II (Becton Dickinson, США) в соответствии с инструкцией по применению приборов и моноклональных антител включали: определение клеточного состава типовой иммунограммы (CD3+, CD3+/CD4+/CD8+, CD3+/CD4+, CD3+/CD8+, CD3+/CD56+, CD19+, CD3-/CD56+ клеток), субпопуляциокного состава ЕКТ и ЕК (CD3+/CD56+/CD4+, CD3+/CD56+/CD8+, CD3+/CD56+/CD4-/CD8- (DN), CD56bright, CD56dim) и функционального состояния CD56+ клеток по экспрессии маркеров CD158a,h, CD94, NKG2D, NKp46, CD 16, CD 107а. Функциональное значение тестированных маркеров продемонстрировано в таблице 1.

2 стадия 15%

Таблица 1. Функциональная роль маркеров CD56+ клеток

Маркеры Функциональное предназначение

CD158a,h Рецептор подавления (а) и активации (Ъ) киллерной функции суперсемейства иммуноглобулинов

CD94 Рецептор подавления киллерной функции семейства лектинов

NKG2D Рецептор активации киллерной функции семейства лектинов

CD 107а Гранул-ассоциированный рецептор

NKp46 Рецептор естественной цитотоксичности

CD16 Рецептор антителозависимой цитотоксичности

Для статистической обработки данных применялись методы непараметрической статистики с использованием критериев Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова для сравнения средних величин в соответствии с распределением данных, а также корреляционный анализ с использованием коэффициента корреляции Спирмена и определением достоверности силы связей (данные не давали нормального распределения). Для подтверждения информативности и диагностической значимости параметров проводился дискриминантный анализ. Математическая обработка данных проводилась при помощи пакета статистических программ SPSS 17.0 (допустимая ошибка Е=5%) и программы Microsoft Excel 2007.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Как показал анализ клеточного состава типовых иммунограмм, у больных хроническим вирусным гепатитом С достоверно повышено относительное число CD3+/CD4+ клеток, что сказалось на росте иммунорегуляторного индекса. В то же время, содержание Т-клеточных предшественников (CD3 +/CD4+/CD8+) было снижено и по относительным и по абсолютным величинам. Реакция иммунной системы на хронический вирусный процесс проявилась также значительным ростом процентного содержания в крови B-лимфоцитов (CD19+), что косвенно подтверждает данные литературы о значении сероконверсии при ХВГС (Ю.ВЛобзин и др., 2003; В.Ф.Учайкин и др., 2003). Для содержания естественных киллеров при ХВГС отмечено статистически значимое снижение.

При анализе результатов было установленно, что существуют определенные половые различия в реакции клеток иммунной системы при

ХВГС. У женщин число СОЗ+/СБ56+ клеток снижалось по сравнению с контролем, а у мужчин повышалось, для СБЗ+/С04+ клеток отмечалась противоположная тенденция. Различия между отдельными возрастными категориями не были достоверными. Результаты сравнения между иммунологическими показателями у больных ХВГС в зависимости от стадии фиброзных изменений в печени представлены в таблице 2.

Таблица 2. Средние значения типовых иммунограмм у больных ХВГС в соответствии с группировкой данных по стадиям фиброза печени и с учетом пола больных в сопоставлении с контролем

Показатели Средние значения и их стандартная Р1 Р2

Больные ХВГС Здоровые лица

1 2 3 4 5

1-ая стадия фиброза (п> = 16, пг = 26)

СШ+ % 74,4 ±5,01 72,3 ± 6,63 0,254

10% 1,31 ±0,36 1,35 ± 0,54 0,854

С03+/СБ4+/С08+ % 0,55 ±0,41 0,87 ±0,58 0,096

107л 0,01 ±0,01 0,02 ± 0,02 0,056

СЮ+/С04+ % 45,7 ± 6,49 41,5 ± 8,57 0,084

107л 0,81 ±0,26 0,75 ± 0,28 0,406

СОЗ+/СБ8+ % 25,6 ± 5,05 27,3 ± 10,7 0,782

10% 0,44 ±0,12 0,54 ±0,44 0,872

Иммуноре1уляторный индекс 1,90 ±0,64 1,79 ±0,95 0,278

СШ+/С056+ % 3,19 ±1,62 4,37 ±0,64 0,457

10% 0,06 ±0,04 0,08 ± 0,05 0,409

СР19+ % 14,1 ±3,75 11,2 ±3,78 0,013 *

107л 0,25 ±0,08 0,20 ±0,09 0,102

СШ-/С056+ % 11,6 ±3,46 15,0 ±4,99 0,042 * -

ю7л 0,20 ±0,05 0,27 ±0,12 0,036 * -

2-ая стадия фиброза (щ= 6, П2 = 26)

СШ+ % 73,5 ±7,98 72,3 ± 6,63 0,823 0,823

107л 1,20 ±0,62 1,35 ±0,54 0,823 0,823

С03+/С04+/С08+ % 0,40 ±0,001 0,87 ± 0,58 0,465 0,683

107л 0,01 ±0,005 0,02 ± 0,02 0,774 0,683

СЮ+/С04+ % 50,7 ±6,15 41,5 ±8,57 0,049 * 0,288

107л 0,83 ± 0,43 0,75 ± 0,28 0,707 0,911

СРЗ+/СБ8+ % 19,6 ± 1,11 27,3 ± 10,7 0,033 * 0,093

ю7л 0,33 ±0,18 0,54 ± 0,44 0,381 0,371

Иммунорегуляторный индекс 2,58 ±0,17 1,79 ±0,95 0,028 * 0,074

СБЗ+/С056+ % 2,43 ± 1,25 4,37 ±0,64 0,364 0,950

ю7л 0,04 ±0,04 0,08 ± 0,05 0,439 0,900

1 2 3 4 5

СБ 19+ % 16,2 ±3,75 11,2 ±3,78 0,039 * 0,263

107л 0,30 ±0,20 0,20 ±0,09 0,381 0,502

СОЗ-/СБ56+ % 8,93 ± 2,55 15,0 ±4,99 0,028 * 0,218

ю7л 0,16±0,11 0,27 ±0,12 0,234 0,737

3-я стадия фиброза (П] = 8, Пг = 26)

СБЗ+ % 69,9 ±2,71 72,3 ±6,63 0,533 0,564

107л 1,18 ±0,14 1,35 ±0,54 0,815 0,564

СБЗ+/С04+/СБ8+ % 0,70 ±0,57 0,87 ±0,58 0,785 0,995

107л 0,01 ±0,01 0,02 ± 0,02 0,927 0,979

СОЗ+/СБ4+ % 43,5 ± 10,5 41,5 ±8,57 0,876 0,564

107л 0,75 ±0,26 0,75 ± 0,28 0,938 0,564

С03+/С08+ % 22,8 ± 6,86 27,3 ± 10,7 0,392 0,999

107л 0,38 ±0,07 0,54 ±0,44 0,640 0,999

Иммунорегуляторный индекс 2,06 ± 1,08 1,79 ±0,95 0,755 0,999

СВЗ+/С056+ % 6,95 ±3,75 4,37 ±0,64 0,505 0,083

107л 0,11 ±0,05 0,08 ±0,05 0,317 0,248

СШ9+ % 14,1 ±4,10 11,2 ±3,78 0,213 0,564

107л 0,24 ±0,10 0,20 ± 0,09 0,533 0,564

СШ-/С056+ % 13,5 ±4,81 15,0 ± 4,99 0,755 0,248

107л 0,22 ±0,06 0,27 ±0,12 0,815 0,564

4-ая стадия фиброза (П| = И, п2 = 26)

СОЗ+ % 74,5 ±11,8 72,3 ± 6,63 0,139 0,395

107л 1.07 ±0,97 1,35 ±0,54 0,081 0,497

СБЗ+/СБ4+/С08+ % 0,70 ±0,60 0,87 ±0,58 0,270 0,722

107л 0,01 ±0,01 0,02 ±0,02 0,088 0,480

С03+/С04+ % 49,1 ±7,70 41,5 ±8,57 0,013 * 0,234

107л 0,70 ±0,26 0,75 ± 0,28 0,146 0,396

СБЗ+/С08+ % 23,4 ±9,34 27,3 ± 10,7 0,290 0,734

107л 0,36 ±0,33 0,54 ±0,44 0,086 0,610

Иммунорегуляторный индекс 2,52 ± 1,22 1,79 ±0,95 0,039 * 0,999

С03+/С056+ % 3,07 ±2,33 4,37 ±0,64 0,546 0,076

107л 0,04 ±0,03 0,08 ± 0,05 0,191 0,076

С019+ % 13,4 ±7,04 11,2 ±3,78 0,492 0,799

107л 0,14 ±0,08 0,20 ±0,09 0,054 0,234

СОЗ-/СБ56+ % 9,29 ± 3,69 15,0 ±4,99 0,002 * 0,269

107л 0,11 ±0,08 0,27 ±0,12 0,001 * 0,062

Примечание: Р1-вероятность различий показателей у больных и здоровых лиц; р2 -вероятность различий показателей у больных одного пола на разных стадиях фиброза; звездочкой (*) отмечена достоверность различий между показателями больных и здоровых людей по критерию Манна-Уитни при р<0,05; щ - число обследованных больных ХВГС в группе, П2 - число обследованных здоровых лиц в группе.

При сопоставлении с данными здоровых людей было установлено, что при ХВГС отклонения иммунологических показателей регистрировались на всех стадиях, кроме третьей. Наиболее постоянными были сдвиги числа ЕК (СОЗ-/СВ56+) клеток. Помимо этого, для первой стадии фиброза печени у больных хроническим вирусным гепатитом С был характерен рост доли В-лимфоцитов (С045+/С019+), для второй стадии - рост числа Т-хелперов (СБЗ+/СВ4+), падение числа цитотоксических Т-клеток (СБЗ+/С08+) в крови и иммунорегуляторного индекса, для третьей стадии отмечалась выраженная тенденция к росту СОЗ+/СБ56+ субпопуляции Т-лимфоцитов (ЕКТ), а для четвертой стадии - снижение в крови общего числа лимфоцитов, увеличение доли Т-хелперов (СОЗ+/СБ4+) и иммунорегуляторного индекса.

Таким образом сдвиги со стороны типовых иммунограмм при хроническом вирусном гепатите С в рамках проведенного исследования зависят от пола больного и стадии фиброзного процесса.

В соответствии с задачами исследования детальный анализ был проведен для двух категорий СБ56+ клеток, подвергавшихся изменениям: ЕК и ЕКТ (рисунок 2).

С056ЬгщМ

СйЗ+/С056+Д)М [ С03+/С056+/С08+ |

С03+/С056+/С04+ :

о

Рис.2. Соотношение субпопуляций ЕК и ЕКТ (€056+ клеток) у больных ХВГС и здоровых людей

Как показано на рисунке 2, соотношение субпопуляций ЕКТ при хроническом вирусном гепатите С изменялось по сравнению с контролем, прежде всего, в пользу нарастания более чем в 3 раза субпопуляции, регулирующей соотношение ТЫ/ТЪ2, - СЮЗ+/СВ56+/СГ)4+ ЕКТ, но различия

были недостоверными из-за разброса данных. Соотношение субпопуляций ЕК также отклонялось от контроля в пользу «печеночной фракции» - СБ56Ьп§Ы. Установлены и возрастные изменения. В возрастных группах 21-30 лет и 46-60 лет достоверные отклонения субпопуляционного состава от контроля не соответствовали таковым для всей категории больных ХВГС и выявляли различия по содержанию СБ4+ и СБ8+ ЕКТ в крови. В то же время в возрастной группе 31-45 лет отмеченные отклонения были такими же, как и для всей основной группы в целом и касались только С056Ьп{>Ы: субпопуляции.

Результаты анализа субпопуляций СБ56+ клеток на разных стадиях фиброза печени у больных ХВГС представлены в таблице 3.

Таблица 3. Средние значения содержания в крови субпопуляций СЮ56+

клеток у больных ХВГС на разных стадиях фиброза печени

Тестируемые клетки Показатели, % Средние значеиия и их стандартная ошибка Р1 Р2

Больные ХВГС(щ) Здоровые люди (пг)

1-ая стадия фиброза (П1 = 16, лг = 26)

ЕКТ С03+/С056+/С04+ 15,9 ±9,62 5,35 ±2,35 0,146 -

СОЗ+/СБ56+/СБ8+ 68,5 ± 17,7 64,9 ±32,4 0,805 -

С03+/С056+ЛЖ 16,3 ±6,71 29,8 ±14,5 0,043 * -

ЕК С056Ьп^ 6,45 ± 5,20 4,28 ± 2,98 0,222 -

2-ая стадия фиброза (П1 = 6, пг = 26)

ЕКТ С03+/С056+/СБ4+ 7,93 ± 13,7 5,35 ±2,35 0,787 -

СШ+/С056+/СВ8+ 57,1 ±9,55 64,9 ±32,4 0,121 -

С03+/С056+ЯЖ 35,0 ±7,40 29,8 ± 34,5 0,121 -

ЕК СБ56Ъ1^Ы 8,60 ±7,27 4,28 ±2,98 0,409 -

3-я стадия фиброза (П1 = 8, г»2 = 26)

ЕКТ СОЗ+/СП5б+/СП4+ 51,0 ±38,2 5,35 ±2,35 0,046 * -

С03+/СБ56+/С08+ 21,6 ±8,56 64,9 ±32,4 0,186 -

СОЗ+/СБ56+ЯЖ 27,3 ± 29,7 29,8 ±34,5 0,818 -

ЕК С056Ьп^ 8,80 ±1,20 4,28 ±2,98 0,017 * -

4-ая стадия фиброза (П1 = 11, П2 = 26)

ЕКТ С03+/С056+/С04+ 14,0 ±12,5 5,35 ± 2,35 0,040 * 0,048 *

СИЗ+/С056+/С08+ 64,4 ±20,0 64,9 ±32,4 0,498 0,050 *

С03+/С056+ЛЖ 21,7 ± 18,0 29,8 ±34,5 0,254 0,050 *

ЕК С05бЬп^ 8,56 ±5,01 4,28 ±2,98 0,199 0,049 *

Примечание: Р1-вероятность различий показателей у больных и здоровых лиц; р2 -вероятность различий показателей на разных стадиях фиброза (по критерию Колмогорова-Смирнова для К-независимых переменных); звездочкой (*) отмечена достоверность различий между показателями; щ - число больных ХВГС в группе, П2 - число здоровых лиц в группе.

Процентное содержание СБЗ+/СВ56+/С04+ ЕКТ в крови было максимальным на третьей стадии заболевания, а при развитии цирроза печени снижалось до уровня первой стадии. Динамические сдвиги со стороны СБЗ+/С056+/С08+ ЕКТ в крови были выражены в наибольшей степени и проявляли совершенно противоположные тенденции. Кардинальные отличия в динамике выявлялись для СВЗ+Л1Ю56+ЛЖ ЕКТ, которые давали максимальный рост на второй стадии фиброза печени. Содержание субпопуляции ЕК СОббЬп^ возрастало, начиная с первой стадии фиброзных изменений, хотя вначале это нарастание не было достоверным и принимало статистически значимый характер на третьей стадии фиброза. Развитие цирроза печени не способствовало кардинальному изменению содержания этих клеток в крови.

Результаты исследования функционального состояния СБ56+ клеток у больных хроническим вирусным гепатитом Сиу лиц контрольной группы показали, что достоверных различий по показателям функциональной активности СБ 56+ клеток у больных ХВГС установлено не было. В то же время группировка данных в соответствии со стадией фиброзных изменений в печени продемонстрировала такие различия (таблица 4, рисунок 3).

На первой стадии фиброзных изменений в печени уровень экспрессии ЫК02В (лектиновый активирующий рецептор) достоверно снижается по сравнению с контролем, что отражает падение способности С056+ лимфоцитов к восприятию активирующих сигналов от клеток, пораженных вирусом гепатита С. Чувствительность к активирующим сигналам еще более снижается при формировании в печени цирротических изменений (стадия 4).

Таблица 4. Средние значения показателей функционального состояния

СБ56+ клеток у больных ХВГС по стадиям фиброза печени

Показатели, % Средние значения и их стандартная ошибка Р1 Р2

Больные ХВГС (п,) | Здоровые липа (п2)

1 стадия фиброза (П1=16. п->=261

С056+/С0158а,Ь+ 20.4 ± 9.94 23.7 ± 12,6 0.563 _

С056+!СтЛ+ 40.2 ±18.0 50,8 ± 17.9 0.097 _

С056+/№С02Б+ 93.8 ±4.89 97.3 ± 2.99 0.001*

СБ56+/СШ07а+ 63.2 ±29,7 76.7 ±30.7 0,248 _

СГ>56+/МКг>46+ 36.8 ±21,4 50,0 ±34,4 0,256 _

СБ56+/С016+ 63.0 ±17,5 61.6 ± 18.3 0.907 -

2 стадия фиброза (п,=6, п?=26)

С056+/С0158а,Ь+ 38,2 ±41,5 23,7 ±12,6 0,876 0,655

С056+/С094+ 57,4 ±9,56 50,8 ± 17,9 0,349 0,110

СВ56+/Ж020+ 97,1 ± 1,25 97,3 ±2,99 0,349 0,155

С05б+/С0Ю7а+ 99,1 ± 1,27 76,7 ±30,7 0,329 0,106

С056+/Жр46+ 34,8 ±5,80 50,0 ±34,4 0,796 0,614

С056+/СШ6+ 64,0 ±31,3 61,6 ±18,3 0,480 0,488

3 стадия фиброза (П|=8, П1=2(Г)

С056+/С0158а,Ь+ 29,6 ±12,4 23,7 ±12,6 0,317 0,999

СТ)56+1СОШ 31,6± 11,0 50,8 ±17,9 0,124 0,043*

С056+/№С02В+ 99,1 ± 1,02 97,3 ± 2,99 0,187 0,180

С05б+/С0107а+ 46,6 ±9,92 76,7 ±30,7 0,464 0,021*

С056+/ЫКр46+ 19,1 ± 9,84 50,0 ±34,4 0,307 0,180

СП56+/С01б+ 54,0 ±13,6 61,6 ±18,3 0,459 0,564

4 стадия фиброза (П1=11.П7=26)

С056+/С0158а,Ь+ 21,0 ±6,51 23,7 ±12,6 0,569 0,275

СБ56+/С094+ 47,2 ±15,8 50,8 ±17,9 0,801 0,361

СВ56+/№С02Б+ 87,7 ±24,0 97,3 ± 2,99 0,044* 0,121

С056+/С0Ю7а+ 80,1 ± 28,9 76,7 ±30,7 0,735 0,040*

С056+/ЫКр46+ 49,5 ±22,2 50,0 ±34,4 0,664 0,430

С056+/СШ6+ 61,8 ±24,0 61,6 ±18,3 0,673 0,465

Примечание: ргвероятность различий показателей у больных и здоровых лиц; рг -

вероятность различий показателей с больными предыдущей стадией фиброза; звездочкой (*) отмечена достоверность различий между показателями больных и здоровых людей по критерию Манна-Уитни при р<0,05; П] - число обследованных больных ХВГС в группе, пг -число обследованных здоровых лиц в группе.

Иную, но схожую между собой динамику, имеют еще два показателя -экспрессия СБ56+ лимфоцитами маркеров С094 и СОЮ7а. СЭ94 - лектиновый рецептор, передающий ингибирующие сигналы от молекул НЬА I класса, на первой стадии фиброзных изменений в печени экспрессируется в несколько меньшей степени на мембране СБ56+ клеток, чем у здоровых людей, но это снижение недостоверно.

I 1™

о

Стадия 1 -Ф-СО5б+/С0158а,Ь+ -Х-С056+/С0107а+

Стадия 2

-Ш-С056+/С094+ -Ж-С056+/1ЧКр4б+

Стадия 3

Стадия 4 (цирроз) -*-С056+/МКб20+ "•"С056+/С016+

Рис. 3. Динамика изменения показателей функциональной активности СБ56+ клеток в соответствии со стадией фиброза печени

На второй стадии экспрессия маркера СБ94 несколько возрастает, что отражает повышение чувствительности клеток к ингибирующим сигналам. На третьей стадии фиброза экспрессия этих киллингингибирующих рецепторов падает и вновь увеличивается при развитии цирроза печени. Такой же волнообразной динамикой характеризуется маркер внутриклеточных цитотоксических гранул СБ 107а. Достоверное снижение экспрессии этого маркера может служить косвенным свидетельством того, что СБ56+ клетки подвергаются дегрануляции и максимально проявляют цитотоксическую активность в отношении пораженных вирусом клеток именно на третьей стадии фиброзных изменений. Возможно, что этот механизм вносит свой вклад в уменьшение числа функционально сохранных гепатоцитов, которым сопровождается развивающийся впоследствии цирроз печени. При этом практически полностью отсутствовали колебания экспрессии маркера антителозависимой цитотоксичности - СБ 16.

Дополнительно была проанализирована зависимость экспрессии тестируемых маркеров функционального состояния С056+ клеток у ЕК (СБЗ-/СБ56+) и ЕКТ (СБЗ+/С056+). Судя по полученным данным, ЕК в ходе фиброзного процесса в печени при хроническом вирусном гепатите С получают регуляторные сигналы преимущественно через рецепторы лектинового типа (СБ94 и МКС2Б), в то время как ЕКТ - через иммуноглобулиновые

регуляторные рецепторы (С0158а,Ь), при этом цитотоксические свойства ЕКТ (способность к дегрануляции) неуклонно падают, о чем свидетельствует рост экспрессии СБ 107а как маркера внутриклеточных цитотоксических гранул.

Выявление наиболее информативных признаков иммунограмм, в наибольшей степени реагирующих на стадию фиброзных изменений в печени, проводилось с помощью дискриминантного анализа. Отобранные таким образом информативные признаки дополнительно анализировались на частоту встречаемости на каждой стадии фиброза печени, при этом к числу критериальных относили тот информативный признак, который регистрировался не менее чем у 70% больных.

В результате из всех тестированных показателей было установлено 6 критериальных признаков, применение которых соответствовало задачам исследования. Интересно, что в состав этих признаков вошли показатели количественного содержания ЕКТ и их субпопуляций в крови (СБЗ+/С056+, СОЗ+/СБ56+/СБ4+, СВЗ+/С056+/СБ8+), а также параметры функционального состояния естественных киллеров (СБ56+/С094+, С056+/МКС2В+, С056+/С0107а+), но не показатели типовой иммунограммы.

Каждый из критериев подвергался сопоставительному анализу по всему диапазону значений (минимум-максимум), зарегистрированных в ходе исследования. Результаты определения диапазонов значений критериальных показателей на каждой стадии фиброзных изменений в печени представлены в таблице 5.

На первой и второй стадиях фиброзных изменений в печени при ХВГС отклонения диапазонов значений информативных показателей от показателей предыдущей стадии или показателей здоровых людей не были уникальными, в то время как переход со второй на третью стадию фиброза печени сопровождался характерным сдвигом диапазонов значений всех 6 информативных показателей у всех без исключения больных ХВГС. Этот факт является прогностически очень важным, так как третья стадия - это этап предцирротических изменений в печени, когда с помощью расширения спектра лечебных мероприятий еще можно повлиять на интенсивность прогрессирования заболевания и отсрочить формирование цирроза печени.

Таблица 5. Диапазоны значений информативных показателей для СР56+ клеток у больных ХВГС на разных стадиях фиброза печени

Информативные показатели Минимум-максимум значений Критериальные значения Частота регистрации

Больные ХВГС, стадия фиброза 1, п = 16

С03+/С056+, % 0.20-14,2 <0,4% или >10,7% 2 чел. -12.5%

СБЗ+/С056+/С04+, % 0-66,7 >13,4% 5 чел.-31,2%

СТО+/С056+/С08+, % 33,3-93,1 >87,5% 1 чел.-6,25%

С056+/СШ4+ клетки, % 22,2-70,6

С056+/№1С20+клетки,% 82,7-99,5 - _

С056+/С0Ю7а+клетки,% 28,7-100 <40,6% 5 чел.-31,2%

Больные ХВГС, стадия фиброза 2, п = 6

С03+/С056+. % 1,20-3,70 - -

СОЗ+/СБ56+/С1>4+, % 0-23,8 -

СБЗ+/СВ56+/С08+, % 47,6-66,7

С056+/СП94+ клетки, % 46.7-65,1 - -

С056+/т02[>клетки,% 95,9-98,4

СП56+/СОЮ7а+ютетки,% 98,2-100 -

Больные ХВГС, стадия фиброза 3, п = 8

СОЗ+/СП5б+, % 4,30-9,60 >3,7% 8 чел. -100%

СБЗ+/С056+/С04+, % 24,0-78,1 >23,8% 8 чел. -100%

С03+/С056+/С08+, % 15,6-27,7 <27,7% 8 чел. -100%

С056+/С094+ клетки, % 31,6-41,6 <46,7% 8 чел. -100%

С056Ш1Ю2В+клетки,% 98,5-99,1 >98,4% 8 чел. -100%

СБ56+/СО107а+клетки,% 46,6-58,9 <98,2% 8 чел.-100%

Больные ХВГС, стадия фиброза 4 (цирроз), п = 11

СБЗ+/С056+,% 0,50-9,10 <4,3% 9 чел.-81,8%

СБЗ +/СБ5 6+/С Р4+, % 0-37,5 <24,0% 9 чел.-81,8%

С03+/С05б+/С08+, % 31,2-90,2 >27,7% 10 чел. -100%

С056+/С094+ клетки, % 27,1-70,7 <31,6% или >41,6% 8 чел.-72,7%

СБ56+/Ш02Г)+клетки,% 89,9-98,9 <98,5% 9 чел.-81,8%

С056+/СБ107а+клетки,% 82,0-99,5 >58,9% 10 чел.-90,9%

Примечание: Рамкой выделены области отклонения критериальных признаков в обозначенном диапазоне от предыдущей стадии фиброза печени больше чем в 70% случаев; на стадии фиброза 1 проведено сопоставление критериальных значений с контролем (стадия фиброза 0).

При переходе с третьей стадии фиброза в цирроз печени у больных ХВГС набор информативных показателей опять меняет диапазон значений в 72,7100% случаев, что позволяет констатировать развитие цирроза печени.

Что касается особенностей изменения каждого критерия и их интепретации, то эти данные анализировались не только путем сопоставления на разных стадиях фиброза печени, но и в сравнении с аналогичными показателями, полученными у больных хроническим вирусным гепатитом В и алкогольным циррозом печени (рисунок 4).

С03+/С056+

ад

100 90

СВЗ+/СБ56+/СВ4+

ХВГС,стздия2 ХВГС, стадия В ХВГС (цирроз) ХВГВ(цирро>) Алкогольный *ВГС,сгадам2 ХВГС, стадия 3 ХВГС(цирроз) ХВГВ|цирроз] Алюпшшй

цирроз цярроз

СВЗ+/СВ56+/СВ8+

СВ56+/СВ94+

■г

А

я ■

Щ як

ш

100 98 96 94 92 90

го ю о

ХВГС.стадияг ХВГС, стадия 3 ХВГС|цирроз| ХВГВ|цирроз| Алкогольный

цирроз

ХВГС, стадия 2 ХВГС, стадия 3 ХБГС (цирроз) ХБГв(цирраэ) Аяюгальный

СВ56+/1ЧКС2В+

ХВГС, стадия 2 ХВГС, стадия 3 ХВГС (цирроз) ХВГЕ(цкрроз) Алкогольный

цирроз

120 100

__________СВ56+/СР107а+___________

ХВГС,стадия2 ХВГС,стадий3 ХВГС(цирроз) ХВГВ(цирроз) Алкогольный

чнрроз

Рис.4. Диапазоны значений (минимум-максимум) критериальных показателей для ХВГС в группах сопоставления

Как показывает графическое изображение, у всех критериев можно отметить некоторые общие черты. В частности, независимо от генеза, цирроз печени сопровождается одними и теми же иммунологическими сдвигами, а

отобранные нами показатели иммунного статуса, характеризующие численный состав и функциональное состояние ЕКТ и ЕК довольно четко позволяют выявлять эти сдвиги. Второе обстоятельство, которое обращает на себя внимание, это тот факт, что в преддверии необратимых изменений со стороны печени при ХВГС первым изменяется численный состав СБ8+ ЕКТ - фракции клеток, супрессирующих через секрецию ИФНу и ИЛ-10 пролиферативный ответ наивных Т-клеток, а также течение фиброзных процессов (Т.БсЬиЬеЛ et а1. 1990).

Параллельно с этими событиями в крови возрастает число СБ4+ ЕКТ настолько, что это сказывается на росте числа ЕКТ в целом. СБ4+ ЕКТ через продукцию ИЛ-4 и ИЛ-13 способны стимулировать при ХВГС Т-хелперы 2-го типа, определяющие преобладание гуморального иммунного ответа, что способствует элиминации вируса гепатита С из кровотока, но не из печени, а также усугубляют явления фиброза. По мере формирования цирроза печени число СБ4+ ЕКТ в крови падает. Таким образом, регуляторные функции ЕКТ, определяемые их субпопуляционным составом, при хроническом вирусном гепатите С в значительной степени меняются, а сам характер наблюдаемых изменений отчетливо совпадает со стадией фиброзного процесса в печени, начиная с периода перехода со второй стадии на третью.

Начиная с третьей стадии фиброза печени у СБ56+ клеток начинается падение экспрессии киллингингибирующих рецепторов лектинового типа (СБ94), более характерное для естественных киллеров. С этим процессом совпадает рост числа клеток, экспрессирующих активирующие киллинг рецепторы лектинового типа - №£020. Параллельно идет снижение внутриклеточной экспрессии у ЕК маркера цитотоксических гранул - СБ 107а, что предполагает активную дегрануляцию этих клеток. Большинство этих проявлений не регистрировалось на второй стадии, и это заставляет полагать, что переход на третью стадию фиброзных изменений в печени совпадает со значительным ростом цитотоксической активности этих клеток и возможным усугублением их повреждающего действия на печень. Эти изменения играют прогностическую роль, их регистрация свидетельствует о прогрессировании патологического процесса и переходе на стадию предцирротических фиброзных изменений.

Развитие цирроза печени относительно мало меняет ситуацию с общим числом ЕКТ и их С08-позитивной фракции - только увеличивается диапазон значений этих показателей, а на смену роста числа С04+ ЕКТ приходит их падение. Наблюдается снижение и ЕК-активности, о чем свидетельствуют расширение диапазона экспрессии этими клетками киллингингибирующих рецепторов (С094), резкое падение экспрессии активирующих киллинг рецепторов (№С02Б), многократный рост внутриклеточной экспрессии маркеров цитолитических гранул (СБ 107а). В целом эти данные позволяют получить новые сведения о патогенезе цирроза печени при ХВГС.

Таким образом, особенности изменения субпопуляционного состава и функционального состояния СБ56+ клеток в крови при ХВГС позволяют сформировать комплекс иммунологических критериев, по диапазону значений которых можно прогнозировать угрозу развития цирроза печени, а также диагностировать наступление цирротических изменений (таблица 6).

Таблица 6. Шкала критериев иммунопрогнозирования цирроза печени и иммунодиагностики предцирротической стадии фиброза печени (стадии 3

по шкале МЕТА VIR) у больных хроническим вирусным гепатитом С

Критериальные параметры Стадия фиброза печени 3 (предцирротическая) Цирроз печени

Критериальное значение Частота регистрации Критериальное значение Частота регистрации

CD3+/CD56+ клетки,% >3,7% 100% <4,3% 81,8%

CD3+/CD56+/CD4+itneTKH,% >23,8% 100% <24% 81,8%

CD3+/CD56+/CD8+mieTKH,% <47,6% 100% >27,7% 100%

CD56+/CD94+ клетки,% <46,7% 100% <31,6% или >41,6% 72,7%

CD56+/NKG2D+ клетки,% >98,4% 100% <98,5% 81,8%

CD56+/CD107a+ клетки,% <98,2% 100% >58,9% 90,9%

По представленным результатам стадия фиброзных изменений 3, предшествующая циррозу печени, сопровождается довольно специфичными изменениями для ХВГС. Указанные диапазоны значений не регистрируются на предыдущей второй стадии, в то время как на третьей стадии у всех больных отмечаются 6 признаков из 6. Попытка определить эти признаки у больных хроническим вирусным гепатитом В показала, что максимальное число регистрируемых признаков в данных диапазонах значений не превышает трех,

аналогичная картина наблюдалась и для здоровых людей (чувствительность и специфичность метода - около 100%).

Что касается развития цирроза печени при хроническом вирусном гепатите С, то наличие 5 из 6 отобранных нами критериальных признаков позволяет поставить диагноз цирроза печени, но, как уже указывалось, этот результат не специфичен для данного заболевания, поскольку может регистрироваться при циррозе печени другой этиологии. Эти критерии приобретают диагностическое значение только при иммунологическом мониторинге больных, когда изменения критериальных признаков, характерных для степени фиброза 3 меняют диапазон значений на таковой, присущий стадии 4. Поскольку в наших исследованиях диапазоны значений показателей, характерные для цирроза, ни разу не были зарегистрированы на стадии фиброза 3, то такое изменение параметров позволяет диагностировать цирроз печени при хроническом вирусном гепатите С.

ВЫВОДЫ

1. Характер иммунологических сдвигов в крови при ХВГС зависит от стадии фиброзных изменений в печени при дополнительном влиянии пола и возраста больных.

2. Анализ субпопуляционного состава и экспрессии маркеров функционального состояния естественных киллеров и ЕКТ крови у больных ХВГС позволяет получить информативные показатели для оценки стадий фиброзных изменений в печени, включая цирроз. Наиболее характерные сдвиги наблюдаются при формировании третьей стадии фиброза печени.

3. Иммунологическими критериями, позволяющими прогнозировать развитие цирроза печени, служат: процентное содержание ЕКТ (С03+/С056+) в крови, доля СБ4+ и Сй8+ клеток среди ЕКТ, процент клеток, несущих ингибирующие (С094) и активирующие (ЖХйБ) МНС-1-специфичные рецепторы лекганового типа, а также маркер цитолитических гранул СО 107а среди С056+ клеток.

4. Критериями третьей стадии фиброзных изменений печени у больных ХВГС являются иммунологические показатели в диапазонах значений: число СБЗ+/С056+ клеток >3,7%; доля СРЗ+/С056+/С04+ клеток среди ЕКТ >23,8%, а С03+/С056+/С08+ <47,6%; число СБ56+/С094+ клеток <46,7%; число С056+/ЩЮ2ЕН- клеток >98,4%; число СБ56+/С0107а+ клеток <98,2%.

5. При циррозе печени комплекс разработанных критериев не специфичен для хронического вирусного гепатита С. О переходе со стадии предцирротических изменений в цирроз можно судить по результатам мониторинга диапазонов значений показателей со сдвигом: числа CD3+/CD56+ клеток <4,3%; доли CD3+/CD56+/CD4+ клеток среди ЕКТ <24%, а CD3+/CD56+/CD8+ >27,7%; числа CD56+/CD94+ клеток <31,6% или >41,6%; числа CD56+/NKG2D+ клеток <98,5%; числа CD56+/CD107a+ клеток >58,9%.

6. При регистрации у больного хроническим вирусным гепатитом С 5-6 критериальных признаков в диапазоне значений, характерных для стадии фиброза 3, больного относят в группу риска по развитию цирроза печени, что служит показанием для проведения профилактических мероприятий с целью предупреждения прогрессирования заболевания.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для оценки стадии предцирротических фиброзных изменений в печени гистологическое исследование биопсионного материала можно дополнять ежегодным неинвазивным иммунологическим исследованием крови при мониторинге больных хроническим вирусным гепатитом С.

2. Прогнозировать развитие цирроза печени у больных ХВГС позволяет разработанная шкала критериев для определения предцирротической стадии фиброза печени (стадии 3 по шкале МЕТА VIR) у больных хроническим вирусным гепатитом С при чувствительности и специфичности способа в случае регистрации 5-6 признаков из 6-около 100%.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Аминергическая регуляция в иммунной системе и естественные киллеры при хроническом гепатите В и С / Юшук Н.Д, Балмасова И.П., Знойко О.О., Максимов СЛ., Ерёмина О.Ф., Шмелёва Е.В. и др. // Сборник тезисов итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития тучно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы». -М, 2008. - С.132-133.

2. Балмасова И.П., Сепиашвили Р.И., Шмелёва ЕВ. Естественные киллеры как регуляторы клеточной пролиферации // Научные труды П съезда физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека». - Москва - Кишинев, 2008. - С. 306-307.

3. Естественные киллеры при хронических гепатитах В и С / Балмасова И.П., Шмелёва Е.В., Ерёмина О.Ф., Дунда Н.И. // Сборник Трудов X Международного

Конгресса «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», посвященого 100-летаю со дня рождения академика АМН А.Д. Адо. - Казань, 2009. - С. 175.

4. Методические возможности определения регуляторно-рецепторного аппарата естественных киллеров у клинически здоровых людей / Балмаеова И.П., Шмелёва ЕВ., Ерёмина О.Ф., Дунда Н.И. // Сборник трудов VI Всероссийской научно-практической конференции «Образование, наука и практика в стоматологии». -М., 2009. - С.186-187.

5. Методическое обеспечение изучения функций естественных киллеров / Балмаеова И.П., Шмелёва ЕВ. Ерёмина О.Ф. и др. // Сборник материалов XVI Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М., 2009. - С.ЗЗ.

6. Соотношение субпопуляций ЕК/ЕКТ как прогностический критерий хронического гепатита С / Балмаеова ИЛ., Ющук Н.Д., Знойко О.О., Дунда Н.И., Ерёмина О.Ф., Максимов С.Л., Шмелёва EJB. и др. // Аллергология и иммунология. -2009. - Т.10. №3. - С. 340-343.

7. Характеристика регуляторно-рецепторного аппарата естественных киллеров у клинически здоровых людей / Балмаеова И.П., Шмелёва Е.В., Ерёмина О.Ф., Дунда НИ. // Аллергология и иммунология. - 2009. - Т. 10. №2. - С. 169.

8. Natural killer cells in patients with chronic В and С hepatitis / Balmasova I., Shmeleva E.V., Dunda N. et al. // European journal of allergy and clinical immunology. Allergy. XXVffl Congress of European Academy of Allergy and Clinical Immunology. Abstract Boot - Warszawa, Poland, 2009. - Vol. 64. Suppl. 90. - P. 498.

9. NK/NKT Ratio as a Prognostic Marker of Chronic Hepatitis С / Balmasova LP., Yushchuk N.D., Znoiko O.O., Shmeleva E.V. et al. // New Horizons in Allergy, Asthma & Immunology. MEDIMOND International Proceedings. -2009. -P. 183-188.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВГС - вирус гепатита С ЕК - естественный киллер ИЛ - интерлейкин ИНФ - интерферон ХВГВ - хронический вирусный гепатит В ХВГС - хронический вирусный гепатит С CD - cluster definition-антигены кластеров дифференцировки DN - double negative - дважды негативные клетки HLA - human leukocyte antigens - антигены лейкоцитов человека МНС - major histocompatibility complex - главный комплекс гистосовместимости

Заказ №318. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз. Отпечатано в ООО «Петроруш». г.Москва, ул.Палиха 2а.тел.250-92-06 www.postator.ru

Актуальность темы. Вирусный гепатит С одна из наиболее серьезных и актуальных проблем здравоохранения как в России, так и в мире. По данным Всемирной организации здравоохранения более 175 миллионов жителей нашей планеты (3% населения) инфицировано вирусом гепатита С (ВГС), что позволяет отнести этот вирус к разряду глобальных пандемических агентов. Каждый год число страдающих ВГС-инфекцией возрастает на 3-4 миллиона [164]. В структуре хронических поражений печени доля вирусного гепатита С достигает 40% и более [9, 220, 244].

В России только за 2000 г. лечебно-профилактическими учреждениями страны были выявлены и учтены 31 тыс. случаев острого вирусного гепатита С, 156 тыс. случаев носительства возбудителя вирусного гепатита С, 32 тыс. случаев впервые установленного хронического вирусного гепатита С [40]. По эпидемиологическим характеристикам заболеваемость ВГС-инфекции тесно связана с такими социальными проблемами как наркомания, безопасность медицинских и немедицинских манипуляций, связанных с нарушением кожных покровов, гемотрансфузий, оперативных вмешательств [8, 5, 164].

В 70-90% случаев заболевание принимает хроническое течение с прогрессирующим поражением печени, которое в среднем через 21 год у 20% больных развивается в цирроз печени, а далее у 8% формируется гепатокле-точная карцинома [11, 164, 211, 140, 243]. Такой высокий процент персистен-ции ВГС обусловлен тем, что несмотря на распознавания вируса факторами естественного и адаптивного иммунитета, ВГС ускользает от элиминации, при этом ВГС-индуцированное поражение печени в большей степени опосредованно иммунными механизмами, чем прямыми цитопатическими эффектами самого вируса [44].

Существуют определенные трудности в прогнозировании прогрессиро-вания фиброза и развития цирроза печени. В настоящее время золотым стандартом определения степени фиброзных изменений в печени является биопсия с последующим определением стадии фиброза, однако этот метод относится к числу высоко инвазивных, а его использование иногда приводит к серьезным осложнениям, угрожающим жизни пациента, кроме того, этот метод не позволяет осуществлять мониторинг заболевания, что заставляет продолжать поиск менее инвазивных способов определения критериев цирроза [166, 252]. Ввиду того, что определяющую роль в развитии и прогрессиро-вании хронического гепатита С играет иммунная система, одним из таких критериев может служить характер иммунного ответа на ВГС с участием естественных киллеров (ЕК) и ЕКТ - клеток иммунной системы, широко представленных в печеночной ткани, за которыми признается ведущая роль в элиминации ВГС [116, 192, 140].

Таким образом, проблема хронического вирусного гепатита С является чрезвычайно актуальной и с медицинской, и с социальной точки зрения.

Цель исследования: : Определение диагностического и прогностического значения субпопуляционного состава и функционального состояния естественных киллеров и ЕКТ при хроническом вирусном гепатите С и разработка на их основе комплекса диагностически информативных критериев для оценки стадий фиброзных изменений в печени.

Задачи исследования:

1. Изучить характер иммунологических сдвигов со стороны основных субпопуляций лимфоцитов крови, субпопуляций естественных киллеров и ЕКТ, функционального состояния ЕК и ЕКТ при хроническом вирусном гепатите С в зависимости от пола и возраста больных.

2. Определить характер зависимости иммунологических сдвигов при хроническом вирусном гепатите С на разных стадиях фиброзных изменений в печени.

3. Выделить комплекс наиболее информативных показателей субпопуляционного состава ЕК и ЕКТ, уровня экспрессии маркеров функционального состояния этих клеток для оценки особенностей отдельных стадий фиброзных изменений и цирроза печени при хроническом вирусном гепатите С и определить диапазоны их значений.

4. Определить чувствительность и специфичность разработанного комплекса иммунологических критериев при хроническом вирусном гепатите С путем сопоставления с данными у больных хроническим вирусным гепатитом В, этанол-индуцированным циррозом печени и у здоровых людей.

Научная новизна:

Впервые на достаточном клиническом материале дана детальная феноти-пическая характеристика естественных киллеров и ЕКТ крови у больных хроническим вирусным гепатитом С, на основе чего был:

- разработан оптимальный подход для прогноза цирротических изменений в печени при хроническом вирусном гепатите С на основе иммунологических показателей крови, включающих содержание отдельных субпопуляций ЕКТ и уровни экспрессии маркеров функционального состояния естественных киллеров;

- показано особое патогенетическое значение иммунологических сдвигов со стороны показателей функционального состояния ЕК и ЕКТ крови, соответствующих третьей стадии фиброзных изменений в печени, при хроническом вирусном гепатите С;

- создан комплекс критериев оценки предцирротических изменений в печени и перехода их в цирроз печени на базе иммунологической оценки в крови субпопуляций ЕКТ и функционального состояния ЕК;

- разработана технология прогнозирования угрозы развития цирроза печени при ХВГС по комплексу нетрадиционных иммунологических критериев, определение которых не требует высоко инвазивных вмешательств в организм больного, а выполнение диагностических исследований вполне доступно лабораториям иммунологического профиля.

Практическая значимость работы:

Показана целесообразность использования комплекса иммунологических показателей, основанных на оценке субпопуляционного состава ЕКТ и функционального состояния ЕК периферической крови, для прогнозирования угрозы развития цирроза печени при хроническом вирусном гепатите С.

Установлено особое патогенетическое значение некоторых иммуных сдвигов на третьей стадии фиброзных изменений в печени при ХВГС, позволяющих определять эту стадию у больных на основе иммунологического анализа крови.

Подтверждена специфичность изменения диапазона значений для комплекса из 6 показателей субпопуляционного состава ЕКТ и функционального состояния ЕК крови для перехода со второй стадии фиброзных изменений на третью и с третьей стадии в цирроз печени при хроническом вирусном гепатите С.

Предложен комплекс иммунологических критериев, позволяющий осуществлять прогноз угрозы развития цирроза печени без проведения высоко-инвазивных вмешательств в организм больного.

Положения, выносимые на защиту:

1. Иммунологические исследования субпопуляционного состава и функционального состояния ЕК и ЕКТ в крови больных хроническим вирусным гепатитом С выявляют сдвиги, характерные для отдельных стадий фиброзных изменений в печени.

2. Существуют особенности изменения субпопуляционного состава и функционального состояния ЕК и ЕКТ в крови, высоко специфичные для третьей стадии фиброзных изменений в печени при ХВГС.

3. Особенности изменения субпопуляционного состава и функционального состояния ЕК и ЕКТ в крови при ХВГС позволяют сформировать комплекс иммунологических критериев, по диапазону значений которых можно прогнозировать угрозу развития цирроза печени, а также диагностировать наступление цирротических изменений.

Внедрение результатов работы в практику:

Новые сведения о роли ЕК и ЕКТ в иммунопатогенезе предцирротиче-ских изменений в печени при хроническом вирусном гепатите С используются в учебном процессе на кафедре инфекционных болезней Московского государственного медико-стоматологического университета (МГМСУ).

Разработанный комплекс иммунологических критериев для прогноза и вспомогательной диагностики цирроза печени при хроническом вирусном гепатите С используется в научно-практической деятельности лаборатории патогенеза и методов лечения инфекционных заболеваний НИМСИ МГМСУ, лаборатории Московского городского центра СПИД.

Апробация работы и публикации:

Основные положения работы доложены на:

- П Съезде физиологов СНГ;

- Итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы»;

- XVI российском национальном конгрессе «Человек и лекарство»;

- X Международном Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии»;

- УП Съезде аллергологов и иммунологов СНГ;

- УШ научно-практической конференции НИМСИ МГМСУ «От науки к практике»;

- XXVIII Конгрессе европейской академии аллергологии и клинической иммунологии.

По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе: в центральной печати 1 и в иностранной печати 1.

Структура и объем диссертации:

Диссертация изложена на 160 страницах и состоит из введения, обзора литературы, главы по материалам и методам исследования, 3 глав собственных исследований, заключения и обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 25 таблицами и 40 рисунками. Список литературы содержит 254 источников, из которых 43 отечественных и 211 зарубежных авторов.

ВЫВОДЫ

1. Характер иммунологических сдвигов в крови при ХВГС зависит от стадии фиброзных изменений в печени при дополнительном влиянии пола и возраста больных.

2. Анализ субпопуляционного состава и экспрессии маркеров функционального состояния естественных киллеров и ЕКТ крови у больных ХВГС позволяет получить информативные показатели для оценки стадий фиброзных изменений в печени, включая цирроз. Наиболее характерные сдвиги наблюдаются при формировании третьей стадии фиброза печени.

3. Иммунологическими критериями, позволяющими прогнозировать развитие цирроза печени, служат: процентное содержание ЕКТ (CD3+/CD56+) в крови, доля CD4+ и CD8+ клеток среди ЕКТ, процент клеток, несущих ингибирующие (CD94) и активирующие (NKG2D) МНС-1-специфичные рецепторы лектинового типа, а также маркер цитолитических гранул CD 107а среди CD56+ клеток.

4. Критериями третьей стадии фиброзных изменений печени у больных ХВГС являются иммунологические показатели в диапазонах значений: число CD3+/CD56+ клеток >3,7%; доля CD3+/CD56+/CD4+ клеток среди ЕКТ >23,8%, a CD3+/CD56+/CD8+ <47,6%; число CD56+/CD94+ клеток <46,7%; число CD56+/NKG2D+- клеток >98,4%; число CD56+/CD107a+ клеток <98,2%.

5. При циррозе печени комплекс разработанных критериев не специфичен для хронического вирусного гепатита С. О переходе со стадии предцирротических изменений в цирроз можно судить по результатам мониторинга диапазонов значений показателей со сдвигом: числа CD3+/CD56+ клеток <4,3%; доли CD3+/CD56+/CD4+ клеток среди ЕКТ <24%, а CD3+/CD56+/CD8+ >27,7%; числа CD56+/CD94+ клеток <31,6% или >41,6%; числа CD56+/NKG2D+ клеток <98,5%; числа CD56+/CD107a+ клеток >58,9%.

6. При регистрации у больного хроническим вирусным гепатитом С 5-6 критериальных признаков в диапазоне значений, характерных для стадии фиброза 3, больного относят в группу риска по развитию цирроза печени, что служит показанием для проведения профилактических мероприятий с целью предупреждения прогрессирования заболевания.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для оценки стадии предциррошческих фиброзных изменений в печени гистологическое исследование биопсионного материала можно дополнять ежегодным неинвазивным иммунологическим исследованием крови при мониторинге больных хроническим вирусным гепатитом С.

2. Прогнозировать развитие цирроза печени у больных ХВГС позволяет разработанная шкала критериев для определения предцирротической стадии фиброза печени (стадии 3 по шкале METAVIR) у больных хроническим вирусным гепатитом С при чувствительности и специфичности способа в случае регистрации 5-6 признаков из 6 - около 100%.