Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Иммунопатогенетические основы хронизации иксодового клещевого боррелиоза

004600995

На правах рукописи

Колчина Анна Сергеевна

ИММУНОПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ХРОНИЗАЦИИ ИКСОДОВОГО КЛЕЩЕВОГО БОРРЕЛИОЗА

14.03.03 - патологическая физиология 14.03.09- клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск-2010

И 5 АПР 2010

004600995

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному

развитию»

Нау чные руководители:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук

Кологривова Елена Николаевна Жукова Оксана Борисовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук

Уразова Ольга Ивановна Вельская Наталия Витальевна

Ведущее учреждение:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кемеровская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

диссертационного совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН (634028, г. Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН

Автореферат разослан: апреля 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Защита диссертации состоится «_»

2010 г. в_часов на заседании

доктор биологических наук

Общая характеристика работы

Актуальность исследования.

Иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ) - природно-очаговое трансмиссивное инфекционное заболевание, вызываемое спирохетами рода Borrelia и передаваемое иксодовыми клещами (Лобзин Ю.В. и соавт., 2000). Впервые ИКБ был диагностирован в США в 1975 г., а в настоящее время заболевание широко распространено и в других странах (Ананьева Л.П. и соавт., 2000; Лобзин Ю.В. и соавт., 2000; Лукашова Л.В. и соавт., 2006). В России эндемичным очагом является Западная Сибирь, где наибольшая заболеваемость отмечена в Томской области (Козлов С.С., 1999; Ананьева Л.П. и соавт., 2000). В 1997 - 2000 г.г. заболеваемость в данном регионе составляла 65 случаев на 100 тысяч человек, что в два и более раз превышало показатели в остальных эндемичных очагах (Ананьева Л.П. и соавт., 2000). По данным пунктов серопрофилактики г. Томска в 2009 г. с присасыванием клеща обратилось на 1000 человек больше, чем в предыдущем году, увеличилось количество больных острым ИКБ с безэритемной (труднодиагностируемой) формой заболевания.

Данное заболевание нередко принимает хроническое течение с поражением различных органов и систем. Риск хронизации при безэритемном течении ИКБ значительно выше, чем при эритемном, т.к. мигрирующая эритема является отражением активации неспецифического иммунитета (Бабкин A.B., 1998; Лобзин Ю.В. и соавт., 2000; Добкина М.Н. и соавт., 2003; Деконенко Е.П., 2004).

Известно, что иммунная система принимает непосредственное участие не только в элиминации патогена, но и в развитии осложнений основного заболевания. Хроническое течение ИКБ сопровождается системными аутоиммунными расстройствами с развитием Лайм-артрита, хронического атрофического акродерматита, менингоэнцефалита (Лобзин Ю.В. и соавт., 2000; Ананьева Л.П. и соавт., 2003). Отмена аутотолерантности так же, как и отсутствие адекватного иммунного ответа на патоген, возможны вследствие нарушения механизмов цитокиновой регуляции (Симакова А.И. и соавт., 2004).

Механизмы, лежащие в основе хронизации ИКБ до конца не ясны. Предполагается, что хронизация может быть вызвана неадекватным иммунным ответом, ведущим к развитию постинфекционного аутоиммунитета (Sigal L.H., 1997).

Несмотря на то, что боррелии являются внеклеточными патогенами, наиболее эффективным механизмом санации организма от них является Thl путь иммунного ответа (Ekerfelt С. et al., 2007). В экспериментах с использованием чувствительных и резистентных к боррелиозу мышей (Kang I. et al., 1997), а также в клинических исследованиях (Widhe М. et al., 2004) показано, что благоприятным прогностическим признаком при ИКБ является развитие Thl иммунного ответа с последующим сдвигом иммунологического баланса в сторону Th2. В этом случае происходит элиминация боррелий без последующего формирования аутоиммунного процесса. Гиперактивация Thl пути иммунного ответа, сохраняющаяся в отсутствии детектабельного количества боррелиозных антигенов, приводит к развитию хронического течения ИКБ.

Боррелии обладают способностью к антигенной мимикрии, в связи с чем у больных ИКБ выявлена сенсибилизация Т-лимфоцитов к антигенам нервных тканей, синовиальной оболочки, кардиолипину, наличие органо- и тканеспецифических аутоантител (Steere A.C. et al., 2001; Guerau-de-Arellano M. et al., 2002; Bolz D.D. et al., 2004; Kamradt T. et al., 2004).

Изменение толерантности к аутоантигенам возможно вследствие нарушения супрессорных механизмов иммунной регуляции, которая осуществляется регуляторными CD4~CD25 'Т-клетками, цитокинами - трансформирующим фактором роста-ßl (TGF-ßl) и IL-10, а также эффекторами иммунных ответов. Отмечено повышение индуцированной боррелиями экспрессии FoxP3 мРНК (специфического маркера регуляторных Т-лимфоцитов) у больных с хроническим ИКБ (Nardelli D.T. et al., 2005). Это может свидетельствовать о повышении количества регуляторных CD4+CD25 ""-лимфоцитов, обладающих иммуносупрессивной активностью, при хроническом течении боррелиоза (Jarefors S. et al., 2007).

В настоящее время в клинической практике отсутствуют доступные для широкого использования клинико-лабораторные критерии прогнозирования неблагоприятного исхода ИКБ. С учетом доказанного участия иммунопатологических механизмов в хронизации инфекционных процессов, в том числе ИКБ, целесообразной представляется разработка диагностического алгоритма, позволяющего на основе анализа иммунологических параметров в остром периоде заболевания прогнозировать риск развития его хронической формы. Методы иммунологического обследования должны быть доступны, экономически выгодны, легко воспроизводимы в условиях обычной клинико-диагностической лаборатории.

Широкое распространение ИКБ, частота развития хронической формы и высокий риск развития осложнений обуславливают необходимость исследования механизмов формирования хронического течения заболевания с целью разработки клинико-иммунологических критериев, позволяющих прогнозировать риск хронизации и осложнений данного инфекционного процесса и планировать их своевременную профилактику.

Цель исследования: выявить иммунопатогенетические факторы хронизации иксодового клещевого боррелиоза.

Задачи исследования:

1. Оценить изменение количественных показателей иммунного статуса, функциональной активности нейтрофилов и лимфоцитов, а также особенности продукции цитокинов у пациентов с острым и хроническим иксодовым клещевым боррелиозом.

2. Исследовать особенности функционирования нейтрофилов и лимфоцитов в условиях in vitro при остром и хроническом течении иксодового клещевого боррелиоза на фоне стимуляции ультразвуковым лизатом Borrelia garinii.

3. Оценить продукцию ключевых иммунорегуляторных цитокинов (интерлейкина-2, интерлейкина-4, интерферона-у, трансформирующего фактора роста-ßl) в культуре клеток цельной крови у пациентов с острым

иксодовым клещевым боррелиозом в зависимости от исхода инфекционного процесса.

4. Разработать иммунологические критерии, позволяющие прогнозировать риск хронизации иксодового клещевого боррелиоза.

Научная новизна.

Впервые показано, что высокий риск хронизации иксодового клещевого боррелиоза у взрослых пациентов сопряжен с нарушением кислородозависимых механизмов микробицидности нейтрофилов, с угнетением пролиферативной активности лимфоцитов в ответ на неспецифический митогенный стимул и с цитокиновым дисбалансом. Установлено, что у пациентов с высоким риском хронизации иксодового клещевого боррелиоза спонтанная активация кислородозависимых систем микробицидности сегментоядерных нейтрофилов ассоциирована с их высоким цитодеструктивным потенциалом. Слабый пролиферативный ответ лимфоцитов in vitro на неспецифический митоген (фитогемагглютинин), сочетающийся с интенсивным пролиферативным ответом на ультразвуковой лизат Borrelia garinii, в остром периоде иксодового клещевого боррелиоза свидетельствует о предрасположенности к хронизации инфекционного процесса. Вовлечение в корреляционные взаимодействия уровней антиген-стимулированной продукции интерлейкина-4 и трансформирующего фактора роста-ßl является фактором риска хронизации иксодового клещевого боррелиоза у взрослых пациентов.

Теоретическая и практическая значимость.

Полученные результаты расширяют современные представления о патогенезе хронического течения ИКБ, повышают возможности клинико-иммунологической диагностики хронизации данного заболевания и могут быть использованы в клинической практике.

Показана диагностическая ценность оценки пролиферативной активности лимфоцитов под влиянием фитогемагглютинина и ультразвукового лизата Borrelia garinii для верификации диагноза иксодового клещевого боррелиоза.

Проведенные исследования позволили предложить в качестве одного из диагностических критериев иксодового клещевого боррелиоза коэффициент антиген-стимулированной пролиферативной активности лимфоцитов (К).

Результаты нагрузочных тестов с ультразвуковым лизатом Borrelia garinii (НСТ-тест, оценка пролиферативной активности лимфоцитов) и оценки продукции интерферона-у и трансформирующего фактора роста-ßl в супернатантах культур клеток цельной крови под влиянием боррелиозного антигена могут быть использованы для прогнозирования хронизации иксодового клещевого боррелиоза.

Предложенные в данном исследовании методы оценки иммунного статуса у пациентов с ИКБ являются экономически выгодными, доступными и легко воспроизводимы в условиях клинико-диагностической лаборатории.

Положения, выносимые на защиту:

1. Изменение функциональной активности кислородозависимых систем биоцидности нейтрофилов является одним из патогенетических факторов хронизации иксодового клещевого боррелиоза.

2. Дисбаланс ключевых иммунорегуляторных цитокинов (интерлейкин-2, интерлейкин-4, интерферон-у, трансформирующий фактор рост-(31) в острый период заболевания способствует формированию хронического иксодового клещевого боррелиоза.

3. Комплексная оценка иммунологических показателей на фоне острого иксодового клещевого боррелиоза позволяет прогнозировать риск развития хронического течения заболевания.

Апробация и реализация работы.

Результаты работы используются в учебном процессе кафедр иммунологии и аллергологии, патологической физиологии, а также инфекционных болезней и эпидемиологии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава. По результатам исследования оформлена заявка на изобретение «Способ диагностики иксодового клещевого боррелиоза», приоритетная справка№2009110809 от 24.03.2009.

Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на 61-ой Научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы современной медицины» (Хабаровск, 2004); 59-ой Научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения» (Екатеринбург, 2004); IX Итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежь и современная наука в XXI веке» (Киров, 2005); Всероссийской научной конференции с международным участием «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение» (Уфа, 2005); Всероссийской научно-практической конференции «Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями» (Томск, 2006); Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология - междисциплинарные проблемы» (Санкт-Петербург",' 2008); Научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири - 2008» (Томск, 2008); VI, VII, VIII и X Конгрессах молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск 2005; 2006; 2007; 2009).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 2 статьи - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 182 источника, в том числе 65 отечественных и 117 зарубежных авторов. Текст иллюстрирован 13 таблицами и 10 рисунками.

Материал и методы исследования

Для выявления клинико-иммунологических особенностей различных клинических форм ИКБ на базе МЛПУ МСЧ «Строитель» было обследовано 100 пациентов (35 мужчин, 65 женщин) в возрасте от 18 до 55 лет (средний возраст 36±3 лет), из них - 50 человек с хроническим и 50 - с острым безэритемным течением инфекционного процесса.

Диагноз устанавливался на основании следующих критериев: положительный эпидемиологический анамнез, наличие клинических проявлений заболевания, результаты серологической диагностики. У всех обследованных исключались аутоиммунные заболевания, онкопатология. Кроме того, на момент обследования были исключены острые воспалительные заболевания другой этиологии, обострение хронических заболеваний, психические расстройства, наркотическая и алкогольная зависимости, другие инфекционные заболевания (клещевой энцефалит, вирусный гепатит В и С), наследственная патология, применение иммунотропной терапии, вакцинация в течение одного месяца, предшествующего обследованию.

Для оценки исхода острого заболевания было проведено динамическое наблюдение за пациентами с острым ИКБ в течение 6 мес после госпитализации. В группу динамического наблюдения вошли 25 пациентов, перенесших острый ИКБ, согласившихся пройти повторное клиническое обследование в указанные сроки. По истечении данного периода по результатам проведенного обследования пациенты были разделены на две подгруппы - с последующим выздоровлением после проведенного курса терапии 13 человек (52%) и с последующей хронизацией острого инфекционного процесса - 12 человек (48%).

Характеристика клинических проявлений и результаты серологического обследования пациентов представлены в таблице 1.

Контрольную группу составили 30 здоровых добровольцев с соответствующими характеристиками по полу и возрасту, отрицавших факт присасывания клеща в течение жизни. Одновременно, в качестве группы сравнения для оценки интенсивности аутоиммунных процессов по содержанию аутоантител в сыворотке крови на базе отделения ревматологии ОГУЗ «Томская областная клиническая больница» было обследовано 36 пациентов с верифицированным диагнозом «ревматоидный артрит».

Материалом исследования являлась периферическая кровь, взятая утром натощак из локтевой вены и стабилизированная раствором гепарина в концентрации 25 ЕД/мл,

Для оценки параметров иммунного статуса проводили исследование лейкоцитарной формулы, субпопуляционного состава лимфоцитов в иммунофлюоресцентном тесте с моноклональными антителами против CD3-, CD4-, CD8-, CD16-, CD22-aimireHOB (Васильева O.A. и соавт., 1996), в сыворотке крови определяли содержание иммуноглобулинов классов G, М, А методом радиальной иммунодиффузии (Караулов A.B., 2002, Романцов М.Г., 1997, Сизякина Л.П., 2005), в реакции преципитации в полиэтиленгликоле (ПЭГ-6000) определяли уровень циркулирующих иммунных комплексов (Стручков П.В., 1985). Функциональную активность нейтрофилов исследовали в спонтанном НСТ-тесте и на фоне стимуляции боррелиозным антигеном с последующим разделением клеток на четыре степени активности по содержанию внутриклеточного диформазана (Нагоев Б.С., 1983).

Таблица 1

Клиническая характеристика и результаты серологического обследования пациентов с различной продолжительностью _течения иксодового клещевого боррелиоза__

Частота выявления клинических и лабораторных признаков ИКБ, % Группы обследованных

Пациенты с острым ИКБ (п=50) Пациенты с последующим выздоровлением (п=13) Пациенты с хронюацией острого ИКБ (п=12) Пациенты с хроническим ИКБ (п=50)

Интоксикационный синдром 100,0 100,0 100,0 79,9

Симптомы поражения ЦНС 91,4 80,0 100,0 79,9

Артралгический синдром 57,1 40,0 65,0 61,5

Артритический синдром 8,6 0,0 12,0 13,0

Кардиальные симптомы 7,0 10,0 12,5 4,4

Выявление специфических 1{>М 77,1 80,0 75,0 36,8 р=0,002

Выявление специфических 11,4 10,0 12,0 42,7 р=0,016

Сомнительный результат серологической диагностики 14,3 20,0 13,0 6,6

Отрицательный результат серологической диагностики 8,6 0,0 12,0 26,7 р=0,005

Примечания: уровень р указан для значений, имеющих достоверные различия; р -уровень статистической значимости различий при сравнении с аналогичным показателем у пациентов с острым ИКБ.

Оценку пролиферативной способности лимфоцитов проводили с помощью реакции бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) (Гольдберг Е.Д., 1992) -спонтанной, стимулированной фитогемагглютинином (ФГА) и ультразвуковым лизатом В. £аппи (предоставлен ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ НПО «Вирион», г. Томск), с последующим расчетом коэффициента антиген-стимулированной пролиферативной активности лимфоцитов (К), как отношения процента бластных клеток в РБТЛ, стимулированной антигеном борреяий, к проценту бластных клеток в РБТЛ с ФГА.

Для оценки влияния различных типов цитокинов на течение инфекционного процесса с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) была исследована цитокинпродуцирующая способность клеток периферической крови - спонтанная и на фоне стимуляции клеток ФГА и ультразвуковым лизатом В. gaгinu (боррелиозным антигеном). Проводили количественное определение ключевых иммунорегуляторных цитокинов 1Ь-2, 1Ь-4,1РЫ-у, ТОБ-р1 (ООО «Протеиновый контур», Санкт-Петербург и «Вюзоиге ТСР-(Н», США). Для выявления роли аутоиммунных процессов в патогенезе ИКБ в сыворотке крови методом ИФА определяли содержание ревматоидного фактора и аутоантител к тиреоглобулину с помощью наборов реагентов «ВектоРевмаггоидный фактор суммарный-стрип» («Вектор-Бест», Новосибирск), «ТироидИФА-атТГ-1» («Вектор-Бест», Новосибирск).

Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью пакета программ «БТа^юа 6.0». Для каждого показателя рассчитывали медиану (Ме), верхний и нижний квартили (СЬ и <3з). Для оценки достоверности различий значений выборок, не подчиняющихся критерию нормального распределения, использовали непараметрические тесты Вилконсона для зависимых показателей и Манна-Уитни - для независимых выборок. Анализ корреляционных связей проводили с использованием непараметрического критерия Спирмана. Для оценки частоты распределения признаков использовали точный критерий Фишера (Боровиков В.П., 1998). Различия считались достоверными при уровне статистической значимости р<0,05.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Особенности клинической картины у пациентов с острым и хроническим течением иксодового клещевого боррелиоза На первом этапе обработки результатов была проведена оценка клинической картины у больных с острым и хроническим течением ИКБ, а также у пациентов с различными исходами инфекционного процесса (выздоровлением и хронизацией). Оценивали частоту выявления следующих клинических проявлений: симптомы общей инфекционной интоксикации, наличие симптомов поражения нервной системы, опорно-двигательного аппарата, сердечнососудистой системы.

Анализ клинических проявлений выявил, что симптомы поражения нервной, сердечно-сосудистой системы, суставов встречались у пациентов с различной продолжительностью течения ИКБ с одинаковой частотой (табл. 1). Следовательно, данные клинического обследования не позволяют прогнозировать развитие хронического течения заболевания в отдаленные сроки после проведения этиопатогенетической терапии.

Анализ особенностей лабораторных диагностических тестов показал, что у пациентов с выздоровлением после перенесенного острого ИКБ титр антигенспецифических иммуноглобулинов в среднем составил 1/400, в то время как у пациентов с хронизацией ИКБ не превышал 1/200. Процент серонегативных форм ИКБ чаще встречался у пациентов с хроническим ИКБ (р=0,005) (табл. 1).

Особенности иммунного статуса у пациентов с острым и хроническим иксодовым клещевым боррелиозом Все значения медиан параметров иммунного статуса у пациентов с различной продолжительностью течения ИКБ укладывались в интервалы допустимых границ нормы, однако в ходе сравнительного анализа были выявлены некоторые особенности (табл. 2, 3).

Так, у пациентов с хроническим течением ИКБ снижено абсолютное количество СЭЗЧ СБ4+-, СЭ16+-, С022+-лимфоцитов (табл. 2) и достоверно повышены уровни ГgM и в сыворотке крови по сравнению со здоровыми донорами (табл. 3).

Таблица 2

Субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови

у пациентов с острым и хроническим течением __иксодового клещевого боррелиоза (Ме[рьС))|)___

Абсолютное и Характеристика обследованных

относительное содержание лимфоцитов Здоровые доноры (п=30) Пациенты с острым ИКБ (п=50) Пациенты с хроническим ИКБ (п=50)

+ т О О % 54,00 [53,00;65,00] 63,00 [56,00;73,00] 54,00 [43,00;63,00] р2=0,013

х 109/л 1,48 [1,25; 1,74] 1,05 [0,90; 1,33] 1,06 [0,74;1,40] р1=0,035

+ О и % 34,00 [30,00;38,00] 28,00 [22,00,32,00] 31,00 [18,00;38,00]

х 109/л 0,78 [0,70; 1,02] 0,50 [0,36;0,56] Р1=0,0041 0,53 [0,3 8 ;0,76] р 1=0,027

+ 00 О о % 15,00 [14,00;24,00] 21,00 [16,00;25,00] 19,00 [12,00;21,00]

х 109/л 0,40 [0,30;0,64] 0,40 [0,23;0,49] 0,33 [0,26;0,46]

+ % 10,00 [6,00; 12,00] 10,00 [6,00; 12,00] 6,00 [4,00;8,00] р1=0,05;р2=0,018

О и х109/л 0,22 [0,18,0,34] 0,16 [0,09;0,22] 0,12 [0,07,0,18] р 1=0,023

+ сч % 11,00 [8,00; 13,00] 8,00 [5,00; 14,00] 6,00 [4,00; 11,00]

о о х 10% 0,26 [0,15;0,35] 0,11 [0,06;0,24] 0,13 [0,07;0,20] р 1=0,048

Примечания: уровень р указан для значений, имеющих достоверные различия; р[ -уровень статистической значимости различий при сравнении с показателями здоровых доноров; рг - уровень статистической значимости различий при сравнении с показателями пациентов с острым течением ИКБ.

Таблица 3

Показатели гуморального иммунитета у пациентов с острым и

хроническим течением иксодового клещевого боррелиоза (Ме[С?];СЬ])

Характеристика обследовагшых

Исследуемый показатель Здоровые доноры (п=30) Пациенты с острым ИКБ (п=50) Пациенты с хроническим ИКБ (н=50)

§ ^ я |§ - Г'; 2 = 23 1§М, г/л 1,53 [0,94 ;2,42] 1,88 [1,30;2,63] 2,03 [1,54;2,66] р=0,036

ЫО, г/л 12,91 [10,33;14,36] 13,30 [ 11,81; 13,83] 14,19 [11,53;17,76] р=0,027

я >■ И В 2 о г я ^А, г/л 2,21 [1,45;2.57] 2,34 [1,64;2„98] 2,21 [1,79;2,90]

Уровень ЦИК, ед. ояг. пл. 63,00 [53,00;77,00] 68,00 [55,00; 105,00] 78,00 [63,00; 108,00]

Примечания: уровень р указан для значений, имеющих достоверные различия; р -уровень статистической значимости различий при сравнении с показателями здоровых доноров.

Отмеченное нами снижение абсолютного количества Т- и В-лимфоцитов у больных с хроническим течением ИКБ указывает на наличие у пациентов данной группы иммунного дисбаланса, который может быть обусловлен нарушением адаптационных возможностей специфического иммунитета на фоне длительной персистенции возбудителя в организме (Федоров Е.С. и соавт., 1999).

Роль изменений функциональной активности нейтрофилов в хронизации острого иксодового клещевого боррелиоза Оценка активности кислородозависимых механизмов биоцидности нейтрофилов выявила достоверное снижение процента активных нейтрофилов в спонтанном НСТ-тесте у пациентов с хроническим ИКБ по сравнению с уровнями этого показателя у здоровых доноров (табл. 4). Кроме того, у пациентов с последующим выздоровлением показатели спонтанного НСТ-теста оказались выше, чем у пациентов с хроническим течением ИКБ.

Таблица 4

Активность нейтрофилов в НСТ-тесте у пациентов с острым и хроническим течением иксодового клещевого боррелиоза (Ме[С?1;(Зз])_

Количесл во активных нейтрофилов в НСТ-тесте, % Характеристика обследованных

Здоровые доноры (п=30) Пациенты с последующим выздоровлением (п=13) Пациенты с последующей хронизацией ИКБ (п=12) Пациенты с хроническим ИКБ (п=23)

НСТ-тест, спонтанный 6,25 [4,00; 10,00] 7,25 [5,00;14,00] 4,00 [2,40:8,00] 3,00 [2,00;6,00] Р1=0,006 р2=0,045

НСТ-тест, стимулированный боррелиозным антигеном 10,25 [7,00; 11,00] 13,25 [5,00; 18,80] 6,00 [3,00;7,00] 7,50 [1,00;8,75]

Примечания: уровень р указа» для значении, имеющих достоверные различия; Р1 -уровень статистической значимости различий при сравнении с аналогичным показателем у здоровых доноров; рг - уровень статистической значимости различий при сравнении с аналогичным показателем у пациентов с последующим выздоровлением.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что у пациентов с благоприятным исходом заболевания нейтрофилы на раннем этапе инфекционного процесса обладают достаточной способностью к активации кислородозависимых механизмов микробицидности, что обеспечивает эффективную элиминацию патогена.

Неэффективность фагоцитарного звена может быть связана с гиперпродукцией активных форм кислорода, которая ведет к массовой гибели нейтрофилов при повышении функциональной нагрузки. В ходе дальнейшего анализа среди НСТ-положительных нейтрофилов рассчитывали доли клеток с 12 и 3-4 степенями активности. Нейтрофильные лейкоциты с 1-2 и 3-4 степенями активности у здоровых доноров выявлялись в равных долях, и их соотношение не

изменялось на фоне стимуляции антигеном боррелий (табл. 5). При оценке результатов спонтанного НСТ-теста у больных с последующим выздоровлением было выявлено преобладание клеток с 1-2 степенями активности по сравнению с аналогичным значением в контроле, а процентное соотношение нейтрофилов с различными степенями активности сохранялось в НСТ-тесте, стимулированном боррелиозным антигеном (табл. 5).

Таблица 5

Распределение нейтрофилов по степеням активности у пациентов с ____иксодовым клещевым боррелиозом_____

Количество активных неюрофилов в НСТ-тесте Характерис тика обследованных

Здоровые доноры (п=30) Пациенты с последующим выздоровлением (п=13) Пациенты с последующей хронизацией ИКБ (п=12) Пациешы с хроническим ИКБ (п=23)

Спонтанный НСТ-тест Нейтрофилы 1-2 степени активности, % 47,0 62,0 Р|=0,02 33,0 р,=0,03 р2<0,01 81,0 Р1<0,01 Р2<0,01 рз<0,01

Нейтрофилы 3-4 степени активности, % 53,0 38,0 р 1=0,02 67,0 р,=0,03 р2<0,01 19,0 р,<0,01 р2<0,01 Рз<0,01

НСТ-тест, стимулированный боррелиозным : антигеном Нейтрофилы 1-2 степени активности, % 44,0 65,0 Р1=0,001 73,0 р,<0,01 Р4<0,001 63,0 р,=0,006 р4<0,001

Нейтрофилы 3-4 степени активности, % 56,0 35,0 Р)=0,001 27,0 р,<0,01 р4<0,001 37,0 р 1=0,006 р4<0,001

Примечания: уровень р указан для значений, имеющих достоверные различия; р\ -достоверность различий при сравнении с показателями у здоровых доноров; рг - достоверность различий при сравнении с показателями у пациентов с последующим выздоровлением; рз -достоверность различий при сравнении с показателями у пациентов с последующей хронизацией; р4 - достоверность различий при сравнении со спонтанным уровнем активации нейтрофилов.

У пациентов с последующей хронизацией заболевания, напротив, соотношение нейтрофилов с различными степенями активности в спонтанном НСТ тесте было сдвинуто в сторону клеток с сильно выраженной активацией (3-4 степени активности) по сравнению с показателями у здоровых доноров и у пациентов с последующим выздоровлением. На фоне стимуляции боррелиозным антигеном отмечено смещение соотношения активных нейтрофилов в сторону преобладания клеток с 1-2 степенями активности оксидазных систем, что достоверно отличалось от показателей спонтанной активации нейтрофилов у данных лиц (табл. 5). У пациентов с хроническим течением ИКБ в спонтанном НСТ-тесте преобладали нейтрофилы с 1-2 степенями активности, что достоверно отличалось от значения аналогичных показателей у здоровых доноров и у

пациентов с различными исходами острого ИКБ. Однако на фоне стимуляции боррелиозным антигеном соотношение клеток изменилось в сторону снижения нейтрофилов с 1-2 степенями активности и повышения высокоактивных нейтрофилов но сравнению с результатами спонтанного НСТ-теста (табл. 5).

Предполагается, что усиление кислородного метаболизма в нейтрофильных лейкоцитах до 1-2 степеней активности является адекватным ответом на антигенный раздражитель и приводит к эффективной элиминации патогена, а гибель активных фагоцитов происходит путем алоптоза (Герасимов И.Г., 2006). Гиперпродукция кислородных радикалов (3-4 степень активности нейтрофилов в НСТ-тесте) способствует некротической гибели фагоцита при его активации (Герасимов И.Г., 2006). Кроме того, не исключено, что кислородные радикалы повреждают рецепторы, органеллы, ослабляя реактивность клеток, что может являться одним из механизмов деактивации нейтрофила (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989). Эти данные позволяют рассматривать преобладание нейтрофилов с высокой степенью активности в спонтанном НСТ-тесте как неблагоприятный признак, так как эффективной элиминации патогена в этом случае не наблюдается, в то время как воспалительный процесс в тканях усиливается.

Изменения со стороны фагоцитарного звена иммунитета, выявленные нами у пациентов с последующей хронизацией ИКБ, указывают на преобладание в острую стадию заболевания среди циркулирующих в крови нейтрофилов клеток, находящихся в состоянии гиперпродукции активных форм кислорода, что было зарегистрировано в спонтанном НСТ-тесте. Полученные нами данные позволяют предположить, что чрезмерно выраженная активация кислородозависимых механизмов биоцидности нейтрофилов обуславливает неэффективность работы фагоцитарного звена неспецифической резистентности и создает условия для длительной персистенции возбудителя в организме.

Характеристика изменения пролиферативной активности лимфоцитов в зависимости от исхода острого иксодового клещевого боррелиоза

Оценивая пролиферативную активность лимфоцитов in vitro, мы выявили у пациентов с ИКБ достоверное повышение уровня спонтанной бластной трансформации лимфоцитов по сравнению с контролем. Значение показателей пролиферативной активности лимфоцитов в ответ на ФГА у всех пациентов с ИКБ оказались достоверно ниже, чем у здоровых доноров. Пролиферативный ответ на антиген боррелий у пациентов с неблагоприятным исходом острого инфекционного процесса ИКБ был приближен к значениям ФГА-стимулированной бласттрансформации и не имел достоверных различий с этим показателем (табл. 6). Представленные данные позволяют заключить, что высокий пролиферативный ответ на боррелиозный антиген у больных с последующей хронизацией ИКБ, сопоставимый с ответом на неспецифический митогенный стимул (ФГА), в острый период заболевания является неблагоприятным прогностическим признаком.

Сочетанное изменение пролиферативного ответа на ФГА и боррелиозный антиген у пациентов с ИКБ отражает предложенный нами в данном исследовании

коэффициент антиген-стимулированной пролиферативной активности лимфоцитов (К). Значение К у всех пациентов с ИКБ достоверно превышало показатель у здоровых доноров (табл. 6). По нашему мнению, выявленная особенность пролиферативной активности лимфоцитов in vitro отражает изменения функционального статуса антигенснецифических Т-клеток на фоне инфекционного процесса и может быть использована в качестве одного из диагностических критериев ИКБ при безэритемном течении заболевании.

Таблица 6

Интенсивность бластной трансформации лимфоцитов периферической

крови у пациентов с острым и хроническим течением _ иксодового клещевого боррелиоза (Ме^ьСЬ]) _

Показатели Характеристика обследованных

Здоровые доноры (п=30) Пациенты с последующим выздоровлением (ч=13) Пациенты с последующей хронизацией ИКБ (п=12) Пациенты с хроническим ИКБ (п=23)

X 3 К хо m о4-S Б 1 a g р з г ° РБ'ГЛ спонтанная, % 6,50 [5,50;7,50] 10,25 [6,00;12,50] р3Ю,016 13,00 [9,00;25,00] рз=0,05 9,00 [6,00; 12,00] р3=0,029

РБТЛ ФГА-стимулиро-ванкая, % 64,00 [43,00;71,00] Pi<0,01 33,75 [25,00;38,00] pi=0,027; Рз<0,01 43,50 [35,75,57,15] pi=0,013; рз= 0,048 37,00 [28,00;49,00] Pi<0,01; Рз<0,01

й g § о и РБТЛ антиген-стимулированная, % 16,40 [12,40,19,25] pi<0,01; р2<0,01 18,50 [12,00,35,00] pi=0,028 рг=0,027 36,50 [24,50;54,25] pi=0,021; рз <0,01 26,00 [18,00;36,00] р,<0,01; р2=0,014 рз <0,01

К (усл. ед.) 26,50 [23,50;30,50] 56,00 [41,00;91,00] рз<0,01 86,50 [56,50,105,00] рз<0,01 67,50 [43,00;88,00] рз<0,01

Примечания: К - коэффициент антиген-стимулированной пролиферативной активности лимфоцитов; уровень р указан для значений, имеющих достоверные различия; р! - уровень статистической значимости различий при сравнении со спонтанной бластной трансформацией лимфоцитов; рг - уровень статистической значимости различий при сравнении с показателем ФГА-стимулировашой бластной трансформации лимфоцитов; рз - уровень статистической значимости различий при сравнении с аналогичным показателем у здоровых доноров.

Роль изменения продукции ключевых шшунорегуляторных щтокинов в хронизации иксодового клещевого боррелиоза У пациентов с острым течением ИКБ медианы показателей спонтанной и антиген-стимулированной продукции 1Ь-2 оказались достоверно выше, чем у здоровых доноров. Одновременно с этим значения спонтанной, ФГА- и антиген-стимулированной продукции данного цитокина были достоверно ниже аналогичных показателей у пациентов с хроническим течением ИКБ (табл. 7).

Более высокие уровни продукции 1Ь-2 у пациентов с различной продолжительностью инфекционного процесса могут быть подтверждением наличия большого количества продуцентов 1Ь-2 среди Т-лимфоцитов в клеточной культуре и косвенно свидетельствовать о повышении функциональной активности ТЫ-пути иммунного ответа у пациентов с ИКБ. Выявленный факт может быть еще одним доказательством наличия в крови больных ИКБ высокоактивных Т-лимфоцитов, способных продуцировать не только 1Ь-2, но и другие провоспалительные цитокины (Федоров Е.С. и соавт., 1999; Лобзин Ю.В. и соавт., 2000).

Уровень спонтанной продукции №N-7 у всех пациентов с ИКБ превышал значения, полученные у здоровых доноров. При этом у пациентов с последующим выздоровлением данный показатель был достоверно ниже, чем у пациентов с последующей хронизацией и хроническим течением ИКБ. Ответ на ФГА у данных пациентов регистрировался на достоверно более низком уровне по сравнению с контролем. При хронизации острого ИКБ отмечено повышение антиген-стимулированной продукции 1РК-у по сравнению с показателем у пациентов с хроническим течением заболевания. Следует отметить, что при остром и хроническом вариантах течения ИКБ мы не зарегистрировали повышения уровней продукции 1Ь-2 и 1Ш-у в ответ на митогенный и антигенный стимулы в сравнении со спонтанной продукцией этих цитокинов (табл. 7). Полученные данные могут свидетельствовать об отсутствии резервных возможностей ТЫ на фоне их функционального напряжения при боррелиозной инфекции.

Результаты исследования показали, что у пациентов с хроническим течением ИКБ отмечалась наиболее высокая спонтанная продукция 1Ь-4 (табл. 7). У пациентов с выздоровлением после перенесенного острого ИКБ показатели спонтанной и ФГА-стимулированной продукции данного цитокина оказались достоверно ниже по сравнению со значениями аналогичных параметров у пациентов с хроническим ИКБ. В то же время у пациентов с последующей хронизацией заболевания не выявлено значимых различий при сравнении спонтанной продукции 1Ь-4 со значениями, полученными у пациентов с хронической формой заболевания, что может указывать на высокий уровень активации ТЬ2-клеток, не имеющих специфических рецепторов к антигенам боррелий. Уровень антиген-стимулированной продукции 1Ь-4 у пациентов обеих подгрупп пациентов с острым ИКБ достоверно превышал показатели контроля (табл. 7), что, вероятно, является отражением активного вовлечения ТЬ2-пути в противоборрелиозный иммунный ответ.

Исследование продукции ТСР-р1, отражающего иммуносупрессорный потенциал Т-лимфоцитов, показало, что максимальная концентрация антиген-стимулировакного ТОР-Р1, достоверно превышающая спонтанный уровень продукции данного цитокина, была выявлена у пациентов с хроническим течением ИКБ.

Таблица 7

Продукция цитокинов у пациентов с различной продолжительностью ____течения иксодового клещевого боррелиоза (Ме[С)1 ;(?3])___

Уровень цитокинов в супернатантах культуры клеток крови (пг/мл) Характеристика обследованных

Здоровые доноры (п=10) Пациенты с острым ИКБ с последующим выздоровлением (п=13) Пациенты с острым ИКБ с последующей хронизацией(п=12) Пациенты с хроническим ИКБ (п=22)

гч ^ спонтанный 5,12 [4,42;5,83] 19,53 [19,53;20,40] р2=0,034 20,00 [7,38;23,42] р2=0,015 26,71 [24,18; 102,50] р2<0,01; р3<0,01; р.,<0,01

ФГА-стимулированный 6,53 [6,53; 12,68] 20,40 [20,00;20,40] Р1=0,025 19,53 [6,53;20,40] 37,74 [20,00; 105,00] р2<0,01; р3=0,04 р<=0,026

антиген-стимулированный 7,25 [5,12;7,98] 24,18 [14,39;26,44] р,=0,022 20,00 [11,04;24,18] рг=0,022 32,09 [20,00; 103,00] р2<0,01;рз=0,04; Р4=0,02

ь спонтанный 0,00 [0,00;0,00] 38,17 [38,17;50,00] р 2=0,040 87,83 [87,83;150,50] р2=0,040;р3=0,035 87,65 [75,37;124,30] р2 <0,01 ;рз <0,01

ФГА-стимулированный 412,40 [265,00;47,92] р ,0,023 50,00 [27,35;75,30] р2=0,048 56,15 [50,00;62,30] р2=0,030 68,99 [50,00;99,84] р2<0,01

антиген-стимулированный 217,10 [100,20;239,90] р,-0,023 100,00 [50,00; И 2,00] Рз=0,04 300,50 [112,00;489,00] 87,65 [50,00;112,00] р2=0,035; р<=0,034

,3 спонтанный 12,96 [10,89,12,96] 9,11 [7,60,10,90] 15,37 [9,11;40,00] 29,42 [28,32;35,00] р2<0,01; р,<0,01

ФГА-стимулированный 21,39 [18,16;21,39] 12,96 [10,89; 18,16] 18,16 [12,96;25,12] 33,89 [15,37;69,28] р,=0,015

антиген-стимулированный 10,46 [7,%;14,18] 15,37 [15,37^1,39] р2<0,01 15,37 [7,60;21,39] Рз-0,017 21,39 [10,89;34,35]

5. о н спонтанный 62,50 [31,23;62,50] 21,78 [21,78;62,50] 86,26 [31,20; 125,00] 62,30 [31,20;62,50]

ФГА-стимулированный 105,60 [62,50;!25,00] 73,39 [21,78;125,00] 31,20 [21,78;62,50] 62,50 [31,20,125,00]

антиген-стимулированный 44,55 [38,02; 125,00] 31,20 [31,00;31,20] 86,26 [15,20;86,26] 125,00 [86,26; 125,00] р,=0,047

Примечания: уровень р ухазан для значений, имеющих достоверные различия; р1 -уровень статистической значимости различий по сравнению со спонтанным уровнем продукции цитокинов; р2 - уровень статистической значимости различий по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров; рз - уровень статистической значимости различий по сравнению со значениями у пациентов с острым ИКБ с последующим выздоровлением; - уровень статистической значимости различий по сравнению со значениями у пациентов с острым ИКБ с последующей хронизацией

Указанные особенности могут косвенно свидетельствовать об активации антигенспецифических клонов Tregy пациентов с хроническим ИКБ. Повышенная продукция TGF-pl клетками крови в ответ на стимуляцию боррелиозным антигеном, зарегистрированная нами in vitro, вероятно, способствует угнетению иммунного ответа на патоген в реальных условиях и создает возможность для длительной персистенции боррелий в организме.

Анализ корреляционных связей между концентрациями различных цитокинов в супернатантах клеточных культур на фоне стимуляции боррелиозным антигеном выявил наличие ряда зависимостей (рис. 1).

а)

б)

в)

Рисунок 1. Характеристика корреляционных связей между уровнями продукции цитокинов у пациентов с различной продолжительностью течения иксодового клещевого боррелиоза (а - пациенты с последующим выздоровлением; б - пациенты с последующей хронизацией острого ИКБ; в -пациенты с хроническим течением ИКБ)

Примечание:-положительная корреляционная связь.

На фоне хронического течения ИКБ была выявлена положительная корреляционная взаимосвязь между уровнями антиген-стимулированной продукции ШЫ-у и 1Ь-2 (г=0,81, р<0,05); уровень спонтанной продукции 1РМ-у

также прямо коррелировал со значением антиген-стимулированной продукции ТСР-Р1 (г=0,70, р<0,05), что может указывать на активацию иммуносупрессрорных механизмов в ответ на антигенный стимул в условиях воспалительного процесса.

У пациентов с последующим выздоровлением (рис. 1) была выявлена положительная связь между антиген-стимулированной продукцией 1Ь-4 и 1РН-у (г=0,78, р<0,05), свидетельствующая об одновременном активном участии ТЫ- и ТЬ2-лимфоцитов в противоборрелиозном иммунном ответе при благоприятном исходе острого ИКБ.

При обработке данных, характеризующих пациентов с последующей хронизацией ИКБ (рис. 1), обнаружены положительные корреляционные зависимости между антиген-стимулированной продукцией 1Ь-4 и 1Ь-2 (г=0,74, р<0,05), 1Ь-4 и ^N-7 (г=0,91, р<0,05), а также 1Ь-4 и TGF.pl (г=0,92, р<0,05). Зависимость между продукцией 1Ь-4 и 1РЫ-у, как и у пациентов с последующим выздоровлением, может указывать на одновременную активацию цитокинового паттерна ТЫ- и ТЬ2-пути иммунного ответа на фоне антигенной стимуляции. С другой стороны, положительная взаимосвязь между 1Ь-4 и ТСР-р1 может свидетельствовать о вовлечении в активное функционирование антигенспецифических клонов Тге„, поддерживающих иммуносупрессорный режим работы иммунной системы и обуславливающих неблагоприятный исход заболевания.

Таким образом, результаты оценки корреляционных взаимосвязей демонстрируют вовлечение в противоборрелиозный ответ цитокина с супрессорной активностью (ТСР-р1) у пациентов с последующей хронизацией заболевания и подтвержденным диагнозом «хронический ИКБ».

Участие аутоантител в формировании хронического течения иксодового клещевого боррелиоза и его осложнений

В настоящее время широко распространены аутоиммунные заболевания с поражением суставов и щитовидной железы. Одним из наиболее распространенных аутоиммунных заболеваний суставов является ревматоидный артрит (РА) (Окороков А.Н., 2003). Субклинический аутоиммунный тиреоидит и циркулирующие аутоантитела обнаруживаются у 10 - 15% практически здоровых граждан, находящихся в эутиреоидном состоянии (Окороков А.Н., 2003; Шарипова З.Ф. и соавт., 2006). Установлено, что РА и другие аутоиммунные заболевания могут сочетаться с поражением щитовидной железы (Гонтарь И.П. и соавт., 2009).

Для установления роли латентных аутоиммунных процессов в формировании хронического течения ИКБ было проведено исследование содержания ревматоидного фактора (РФ) и антител к тиреоглобулину (ТГ) в сыворотке крови пациентов с ИКБ, больных ревматоидным артритом (РА) и здоровых доноров. В сыворотке крови здоровых доноров и пациентов с острым ИКБ РФ не выявлялся, у 33,3% пациентов с хроническим ИКБ присутствовали

аутоантитела вышеуказанных спсцифичностей, но их содержание было достоверно ниже аналогичного показателя у больных РА (табл. 8).

Таблица 8

Концентрация и частота выявления аутоантител в сыворотке крови у

пациентов с иксодовым клещевым боррелиозом, ревматоидным артритом и ____здоровых доноров (Ме[СЬ;С)з])_

Группы обследованных Антитела к тирсоглобулину Ревматоидный фактор

Частота выявления диагностически значимых уровней. % Содержание аутоантител, Ед/мл Частота выявления диагностически значимых уровней, % Содержание аутоантител, Ед/мл

Здоровые доноры (п=10) 0,00 7,16 [6,08;7,57] 0,00 0,00 [0,00;0,00]

Пациенты с хроническим ИКБ (п=10) 5,88 5,29 [0,00;10,40] 33,30 97,10 [70,95; 139,40] р1<0,01;р3<0,01; р4<0,01;р5<0,01

Пациенты с острым ИКБ (п=25) 7,14 6,83 [5,63;8,20] 0,00 0,00 [0,00,0,00]

Пациенты с выздоровлением (п=13) 11,11 7,83 [7,17;9,361 0,00 0,00 [0,00;0,00]

Пациенты с хронизацией острого ИКБ (п=12) 0,00 5,89 [4,63;7,57] 0,00 0,00 [0,00;0,00]

Пашенты с РА (п=36) 5,56 45,26 [28,72;56,23] р!<0,01;р2<0,01; рз<0,01;р4<0,01; р5<0,01 66,70 294,80 [170,05;445,00] р,<0,01;р2<0,01; рз<0,01;р4<0,01; р3<0,01

Примечания: уровень р указан для значений, имеющих достоверные различия; р! -уровень статистической значимости различий при сравнении с показателями у здоровых доноров; рг - уровень статистической значимости различий при сравнении с показателями у пациентов с хроническим ИКБ; рз - уровень статистической значимости различий при сравнении с показателями у пациентов с острым ИКБ; р4 - уровень статистической значимости различий при сравнении с показателями у пациентов с последующим выздоровлением; рз -уровень статистической значимости различий при сравнении с показателями у пациентов с последующей хронизацией ИКБ.

Антитиреоидные антитела определялись у доминирующего большинства пациентов с РА (94,44%) в диагностически незначимых количествах, однако медиана их уровней достоверно превышала значения, полученные у пациентов с ИКБ (табл. 8). У пациентов с различными исходами острого ИКБ РФ не определялся, а уровни аутоантител к ТГ были достоверно снижены по отношению к значению аналогичного показателя у больных РА, не достигая при этом диагностически значимых цифр.

Представленные в настоящем исследовании результаты не выявили значимой роли аутоантител указанных выше специфичностей, определяемых на начальном этапе острого периода заболевания, в последующем формировании хронического ИКБ.

Заключение

Обобщая полученные нами результаты и данные других исследователей, иммунопатогенез хронического течения ИКБ можно представить следующим образом (рис. 2).

При попадании боррелий в кожу человека в момент присасывания клеща реакция защиты организма начинается с активации системы комплемента и фагоцитоза микроорганизмов нейтрофильными гранулоцитами. В процессе поглощения бактерий в нейтрофилах индуцируется «кислородный взрыв», результатом которого является продукция активных форм кислорода (Kondrusik М. et al., 2002). С одной стороны, это ведет к гибели боррелий, а с другой -избыточная наработка активных метаболитов кислорода вызывает развитие воспалительной реакции.

Несостоятельность фагоцитарного звена врожденного иммунитета, обусловленная нарушением функционирования кислородозависимых механизмов биоцидности, способствует быстрой диссеминации возбудителя в органы и ткани и переходу заболевания в следующую стадию. Развитие специфического иммунного ответа происходит после поглощения боррелий антигенпрезентирующими клетками и представления антигенных детерминант Т-клеткам (Макаренко JI.A. и соавт., 2002; Montgomery R.R. et al., 2002).

В нашем исследовании у всех пациентов, как в острый период заболевания, так и при хронизации процесса бьшо выявлено повышение спонтанной активности лимфоцитов в РБТЛ. Повышенная пролиферативная активность лимфоцитов на фоне стимуляции боррелиозным антигеном при одновременном снижении ответа на неспецифический митоген (ФГА) у пациентов с хронизацией ИКБ является отражением высокой степени антигенспецифической сенсибилизации лимфоцитов. В то же время равные по силе пролиферативные ответы на антигенный и митогенный стимул могут быть признаком неблагоприятного течения острого ИКБ.

Сила и выраженность иммунных ответов в острый период заболевания определяется продукцией ключевых иммунорегуляторных цитокинов. В проведенном исследовании получены данные, свидетельствующие в пользу повышенной активации цитокинового паттерна Thl (IFN-y) у всех пациентов с ИКБ.

Повышение относительно контрольных значений антиген-стимулированной продукции 1L-4, одного из ключевых регуляторов гуморальных иммунных ответов, выявленное у пациентов с хронизацией ИКБ, в сочетании с высоким уровнем стимулированной антигеном боррелий продукции IFN-y не приводит к адекватной элиминации патогена, что обусловлено, вероятно, антагонистическим воздействием цитокинов Thl-пути иммунного ответа.

Рисунок 2. Схема иммунопатогенеза хронизации иксодового клещевого боррелиоза (по данным Ю.В. Лобзина и соавт. (2000) и результатам собственных исследований)

Примечание:' » звенья иммунопатогенеза, описанные в данном исследовании.

Недостаточная эффективность противоборрелиозного иммунного ответа может быть обусловлена запуском в острую стадию инфекционного процесса иммуносупрессорных механизмов, что может подтверждаться вовлечением в корреляционные взаимодействия TGF-ß у пациентов с последующей хронизацией ИКБ. Вследствие указанных выше изменений стадия диссеминации возбудителя может переходить в стадию хронических органных поражений.

Таким образом, результаты нашего исследования вносят существенный вклад в понимание патогенеза ИКБ, а также могут быть использованы в клинической практике для диагностики ИКБ с различной продолжительностью течения и для прогнозирования рисков хронизации острого инфекционного процесса.

Выводы

1. Хроническое течение иксодового клещевого боррелиоза сопровождается развитием иммунного дисбаланса, характеризующегося снижением абсолютного количества CD3+-, CD4+-, CD16+-, С022+-лимфоцитов, угнетением спонтанной продукции активных форм кислорода нейтрофильными лейкоцитами, а также повышением концентрации сывороточных иммуноглобулинов классов М и G.

2. У пациентов с иксодовым клещевым боррелиозом слабый уровень пролиферативного ответа лимфоцитов на неспецифический митогенный стимул сочетается с интенсивной пролиферацией на воздействие лизата В. garinii в условиях in vitro и не зависит от типа течения инфекционного процесса.

3. Дисбаланс иммунорегуляторных цитокинов при иксодовом клещевом боррелиозе обусловлен повышением секреции интерлейкина-2 и интерферона-у на фоне снижения функционального резерва ТЫ, о чем свидетельствует отсутствие митоген- и антигенстимулирующего влияния на продукцию данных цитокинов in vitro.

4. Особенностями функциональной активности лимфоцитов у пациентов с хроническим течением иксодового клещевого боррелиоза являются высокие уровни спонтанной продукции интерлейкина-4 и индуцированной лизатом Borrelia garinii продукции трансформирующего фактора роста-ßl, что свидетельствует о вовлечении в иммунную регуляцию механизмов, ограничивающих функциональную активность Thl.

5. Риск хронизации иксодового клещевого боррелиоза ассоциирован с преобладанием нейтрофильных лейкоцитов, характеризующихся высокой степенью активации кислородозависимых механизмов биоцидности, с одинаковыми по силе пролиферативными ответами лимфоцитов in vitro на антигенный и митогенный стимулы, с положительной корреляционной зависимостью между индуцированной лизатом Borrelia garinii продукцией интерлейкина-4 и трансформирующего фактора роста-ßl в культурах клеток цельной крови.

6. Латентные аутоиммунные процессы, связанные с наработкой ревматоидного

фактора и антител против антигенов щитовидной железы, не являются

прогностическими факторами хронизации иксодового клещевого боррелиоза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Интенсивность наработки иммуноглобулинов при Лайм-боррелиозе / A.C. Бараулина, C.B. Нечаева, С.К. Заподовников // Вестник РГМУ. - 2004. -№3(34).-С. 147.

2. Продукция антител к боррелиям при различных формах иксодовых клещевых боррелиозов / A.C. Бараулина, C.B. Нечаева, В.В. Погребенкова, С.К. Заподовников // Материалы 61-й научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы современной медицины». -Хабаровск, 2004. - Часть I. - С.56-58.

3. Показатели иммунного статуса у больных Лайм-боррелиозом с различной степенью сенсибилизации к антигенам боррелий / C.B. Нечаева, A.C. Бараулина, В.В. Погребенкова, С.К. Заподовников // Материалы 61-й научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы современной медицины». - Хабаровск, 2004. - Часть I. - С.75-77.

4. Продукция ревматоидного фактора у пациентов с различной степенью сенсибилизации к антигенам боррелий / C.B. Нечаева, A.C. Бараулина, В.В. Погребенкова // Материалы 59-ой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения». -Екатеринбург, 2004. - С. 165-166.

5. Оценка показателей иммунного статуса у больных Лайм - боррелиозом / C.B. Нечаева, A.C. Бараулина // Вятский медицинский вестник. - 2005. -№1.-С. 65.

6. Интенсивность продукции ревматоидного фактора у пациентов с различной степенью сенсибилизации к антигенам Borrelia garinii / E.H. Кологривова, A.C. Бараулина, C.B. Нечаева, И.И. Шестакова, О.В. Стронин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2005. -№1. - С. 70-72.

7. Изменения клинико-лабораторных показателей при различных вариантах течения Лайм-боррелиоза / E.H. Кологривова, И.И. Шестакова, A.C. Бараулина, C.B. Нечаева, Л.А. Малышева // Материалы всероссийской научной конференции с международным участием «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение». -Уфа, 2005. - С. 183-184.

8. Лайм-боррелиоз и корреляционные связи иммуно- и гемограмм с ревматоидным фактором / Я.В. Кухарев, A.C. Бараулина, C.B. Нечаева // Материалы VI конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». - Томск, 2005. - С. 23.

9. Оценка функциональной активности Т-клеток у больных ревматоидным артритом / A.C. Бараулина, H.A. Пронина, B.C. Свиридова, A.C. Чурсина, Е.В. Шкуратова // Материалы VII Конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». - Томск, 2006. - С. 29-30.

10. Особенности показателей иммунограммы у больных иксодовым клещевым боррелиозом с разными уровнями противоборрелиозных антител / E.H. Кологривова, И.И. Шестакова, A.C. Бараулина, C.B. Нечаева, H.A. Шутова// Материалы всероссийской научно-практической конференции «Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в XXI веке». - Томск, 2006. - С. 73-75.

11. Особенности реакции бластгрансформации лимфоцитов при иксодовом клещевом боррелиозе / A.C. Бараулина, H.A. Пронина, B.C. Свиридова, МЛ. Григорьева, М.А. Ковалева // Материалы VIII Конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». - Томск, 2007. - С. 52-53.

12. Функциональная активность лимфоцитов у пациентов с различной этиологией артритов / A.C. Бараулина, E.H. Кологривова, H.A. Пронина, B.C. Свиридова, И.И. Шестакова, О.В. Стронин, M.JI. Григорьева, М.А. Ковалева // Российский аллергологический журнал. - 2007. - №3, приложение 1. - С. 276-277.

13. Пролиферативная активность лимфоцитов под влиянием a-интерферона in vitro у пациентов с ревматоидным артритом / H.A. Пронина, B.C. Свиридова, E.H. Кологривова, A.C. Бараулина, J1.B. Елисеева // Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2(11), № 2-3. - С. 237.

14. Ревматоидный артрит и персистентная герпесвирусная инфекция / H.A. Пронина, B.C. Свиридова, E.H. Кологривова, A.C. Бараулина, A.C. Чурсина, Е.В. Шкуратова // Российский иммунологический журнал. - 2008. -Т. 2(11),№2-3.-С. 237.

15. Уровни антител различной специфичности у больных ревматоидным артритом / H.A. Пронина, B.C. Свиридова, E.H. Кологривова, A.C. Бараулина, J1.B. Елисеева // Российский иммунологический журнал. - 2008. -Т. 2(11),№2-3.-С. 237.

16. Признаки иммунной недостаточности у больных с иксодовым клещевым боррелиозом / A.C. Бараулина, E.H. Кологривова, H.A. Пронина, B.C. Свиридова, Н.П. Пирогова // Российский аллергологический журнал. -2008.-№1, приложение 1. -С. 30-31.

17. Особенности антиген-стимулированной цитокинопродукции в культуре клеток периферической крови пациентов с иксодовым клещевым боррелиозом / A.C. Бараулина, A.B. Черников, E.H. Кологривова, O.E. Чечина, О.Б. Жукова, H.A. Пронина, B.C. Свиридова // Сибирский медицинский журнал. - 2008. - Т.23, №3, выпуск 1. - С. 83.

18. Оценка продукции TGF-ß у пациентов с различными вариантами течения иксодового клещевого боррелиоза / A.C. Бараулина, Е.С. Никонова // Материалы X Конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». - Томск, 2009. - С. 29-30.

19. Особенности продукции цитокинов при хронизации иксодового клещевого боррелиоза / A.C. Бараулина, E.H. Кологривова, О.Б. Жукова, O.E. Чечина // Бюллетень сибирской медицины. - 2010. -№ 1. - С. 21-25.

Список использованных сокращении

ЛГ - антиген ЛТ - антитело

ГЗТ - гиперчувствителыюсть замедленного типа ИКБ - иксодовый клещевой боррелиоз ИФА - иммуноферментный анализ

К - коэффициент антиген-стимулированной пролиферативной активности лимфоцитов

HCT - нитросиний тетразолий ПЭГ - полиэтиленгликоль РА - ревматоидный артрит

РБТЛ - реакция бластной трансформации лимфоцитов

РФ - ревматоидный фактор

ТГ - тиреоглобулин

ФГА - фитогемагглютинин

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы

ЦНС - центральная нервная система

В. - Borrelia

CD - кластер дифференцировки

Ig - иммуноглобулин

IL - интерлейкин

IFN-y -у-интерферон

NK - натуральный киллер

TGF-ß - трансформирующий фактор роста-ß

Th - Т-хелпер

Trcg - Т-регулятор

Тираж 100 экз. Отпечатано в ООО «Позитив-НБ» 634050 г. Томск, пр. Ленина 34а

Актуальность исследования.

Иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ) - природно-очаговое трансмиссивное инфекционное заболевание, вызываемое спирохетами рода Borrelia и передаваемое иксодовыми клещами (Лобзин Ю.В. и соавт., 2000). Впервые ИКБ был диагностирован в США в 1975 г., а в настоящее время заболевание широко распространено и в других странах (Ананьева Л.П. и соавт., 2000; Лобзин Ю.В. и соавт., 2000; Лукашова Л.В. и соавт., 2006). В России эндемичным очагом является Западная Сибирь, где наибольшая заболеваемость отмечена в Томской области (Козлов С.С., 1999; Ананьева Л.П. и соавт., 2000). В 1997 - 2000 г.г. заболеваемость в данном регионе составляла 65 случаев на 100 тысяч человек, что в два и более раз превышало показатели в остальных эндемичных очагах (Ананьева Л.П. и соавт., 2000). По данным пунктов серопрофилактики г. Томска в 2009 г. с присасыванием клеща обратилось на 1000 человек больше, чем в предыдущем году, увеличилось количество больных острым ИКБ с безэритемной (труднодиагностируемой) формой заболевания.

Данное заболевание нередко принимает хроническое течение с поражением различных органов и систем. Риск хронизации при безэритемном течении ИКБ значительно выше, чем при эритемном, т.к. мигрирующая эритема является отражением активации неспецифического иммунитета (Бабкин А.В., 1998; Лобзин Ю.В. и соавт., 2000; Добкина М.Н. и соавт., 2003; Деконенко Е.П., 2004).

Известно, что иммунная система принимает непосредственное участие не только в элиминации патогена, но и в развитии осложнений основного заболевания. Хроническое течение ИКБ сопровождается системными аутоиммунными расстройствами с развитием Лайм-артрита, хронического атрофического акродерматита, менингоэнцефалита (Лобзин Ю.В. и соавт., 2000; Ананьева Л.П. и соавт., 2003). Отмена аутотолерантности так же, как и отсутствие адекватного иммунного ответа на патоген, возможны вследствие нарушения механизмов цитокиновой регуляции (Симакова А.И. и соавт., 2004).

Механизмы, лежащие в основе хронизации ИКБ до конца не ясны. Предполагается, что хронизация может быть вызвана неадекватным иммунным ответом, ведущим к развитию постинфекционного аутоиммунитета (Sigal L.H., 1997).

Несмотря на то, что боррелии являются внеклеточными патогенами, наиболее эффективным механизмом санации организма от них является Thl путь иммунного ответа (Ekerfelt С. et al., 2007). В экспериментах с использованием чувствительных и резистентных к боррелиозу мышей (Kang I. et al., 1997), а также в клинических исследованиях (Widhe М. et al., 2004) показано, что благоприятным прогностическим признаком при ИКБ является развитие Thl иммунного ответа с последующим сдвигом иммунологического баланса в сторону Th2. В этом случае происходит элиминация боррелий без последующего формирования аутоиммунного процесса. Гиперактивация Thl пути иммунного ответа, сохраняющаяся в отсутствии детектабельного количества боррелиозных антигенов, приводит к развитию хронического течения ИКБ.

Боррелии обладают способностью к антигенной мимикрии, в связи с чем у больных ИКБ выявлена сенсибилизация Т-лимфоцитов к антигенам нервных тканей, синовиальной оболочки, кардиолипину, наличие органо- и тканеспецифических аутоантител (Steere А.С. et al., 2001; Guerau-de-Arellano М. et al., 2002; Bolz D.D. et al., 2004; Kamradt T. et al., 2004).

Изменение толерантности к аутоантигенам возможно вследствие нарушения супрессорных механизмов иммунной регуляции, которая осуществляется регуляторными С04+С025+Т-клетками, цитокинами — трансформирующим фактором Р (TGF-J3) и IL-10, а также эффекторами иммунных ответов. Отмечено повышение индуцированной боррелиями экспрессии FoxP3 мРНК (специфического маркера регуляторных Т-лимфоцитов) у больных с хроническим ИКБ (Nardelli D.T. et al., 2005). Это может свидетельствовать о повышении количества регуляторных СБ4+СВ25+-лимфоцитов, обладающих иммуносупрессивной активностью, при хроническом течении боррелиоза (Jarefors S. et al., 2007).

В настоящее время в клинической практике отсутствуют доступные для широкого использования клинико-лабораторные критерии прогнозирования неблагоприятного исхода ИКБ. С учетом доказанного участия иммунопатологических механизмов в хронизации инфекционных процессов, в том числе ИКБ, целесообразной представляется разработка диагностического алгоритма, позволяющего на основе анализа иммунологических параметров в остром периоде заболевания прогнозировать риск развития его хронической формы. Методы иммунологического обследования должны быть доступны, экономически выгодны, легко воспроизводимы в условиях обычной клинико-диагностической лаборатории.

Широкое распространение ИКБ, частота развития хронической формы и высокий риск развития осложнений обуславливают необходимость исследования механизмов формирования хронического течения заболевания с целью разработки клинико-иммунологических критериев, позволяющих прогнозировать риск хронизации и осложнений данного инфекционного процесса и планировать их своевременную профилактику.

Цель исследования: выявить иммунопатогенетические факторы хронизации иксодового клещевого боррелиоза.

Задачи исследования:

1. Оценить изменение количественных показателей иммунного статуса, функциональной активности нейтрофилов и лимфоцитов, а также особенности продукции цитокинов у пациентов с острым и хроническим иксодовым клещевым боррелиозом.

2. Исследовать особенности функционирования нейтрофилов и лимфоцитов в условиях in vitro при остром и хроническом течении иксодового клещевого боррелиоза на фоне стимуляции ультразвуковым лизатом Borrelia garinii.

3. Оценить продукцию ключевых иммунорегуляторных цитокинов (интерлейкина-2, интерлейкина-4, интерферона-у, трансформирующего фактора роста-(31) в культуре клеток цельной крови у пациентов с острым иксодовым клещевым боррелиозом в зависимости от исхода инфекционного процесса.

4. Разработать иммунологические критерии, позволяющие прогнозировать риск хронизации иксодового клещевого боррелиоза.

Научная новизна.

Впервые показано, что высокий риск хронизации иксодового клещевого боррелиоза у взрослых пациентов сопряжен с нарушением кислородозависимых механизмов микробицидности нейтрофилов, с угнетением пролиферативной активности лимфоцитов в ответ на митогенные стимулы и с цитокиновым дисбалансом. Установлено, что у пациентов с высоким риском хронизации иксодового клещевого боррелиоза спонтанная активация кислородозависимых систем микробицидности сегментоядерных нейтрофилов ассоциирована с их высоким цитодеструктивным потенциалом. Слабый пролиферативный ответ лимфоцитов in vitro на неспецифический митоген (фитогемагглютинин), сочетающийся с интенсивным пролиферативным ответом на ультразвуковой лизат Borrelia garinii, в остром периоде иксодового клещевого боррелиоза свидетельствует о предрасположенности к хронизации инфекционного процесса. Вовлечение в корреляционные взаимодействия уровней антиген-стимулированной продукции интерлейкина-4 и трансформирующего фактора роста-(31 является фактором риска хронизации иксодового клещевого боррелиоза у взрослых пациентов.

Теоретическая и практическая значимость.

Полученные результаты расширяют современные представления о патогенезе хронического течения ИКБ, повышают возможности клинико-иммунологической диагностики хронизации данного заболевания и могут быть использованы в клинической практике.

Показана диагностическая ценность оценки пролиферативной активности лимфоцитов под влиянием фитогемагглютинина и ультразвукового лизата Borrelia garinii для верификации диагноза иксодового клещевого боррелиоза.

Проведенные исследования позволили предложить в качестве одного из диагностических критериев иксодового клещевого боррелиоза коэффициент антиген-стимулированной пролиферативной активности лимфоцитов (К).

Результаты нагрузочных тестов с ультразвуковым лизатом Borrelia garinii (НСТ-тест, оценка пролиферативной активности лимфоцитов) и оценки продукции интерферона-у и трансформирующего фактора роста-pi в супернатантах культур клеток цельной крови под влиянием боррелиозного антигена могут быть использованы для прогнозирования хронизации иксодового клещевого боррелиоза.

Приведенные в данном исследовании методы оценки иммунного статуса у пациентов с ИКБ являются экономически выгодными, доступными и легко воспроизводимы в условиях клинико-диагностической лаборатории.

Положения, выносимые на защиту:

1. Изменение функциональной активности кислородозависимых систем биоцидности нейтрофилов является одним из патогенетических факторов хронизации иксодового клещевого боррелиоза.

2. Дисбаланс ключевых иммунорегуляторных цитокинов (интерлейкин-2, интерлейкин-4, интерферон-у, трансформирующий фактор рост-pi), в острый период заболевания способствует формированию хронического ИКБ.

3. Комплексная оценка иммунологических показателей на фоне острого иксодового клещевого боррелиоза позволяет прогнозировать риск развития хронического течения заболевания.

Апробация и реализация работы.

Результаты работы используются в учебном процессе кафедр иммунологии и аллергологии, патологической физиологии, а также инфекционных болезней и эпидемиологии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава. По результатам исследования оформлена заявка на изобретение «Способ диагностики иксодового клещевого боррелиоза», приоритетная справка №2009110809 от 24.03.2009.

Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на 61-ой Научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы современной медицины» (Хабаровск, 2004); 59-ой Научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения» (Екатеринбург, 2004); IX Итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежь и современная наука в XXI веке» (Киров, 2005); Всероссийской научной конференции с международным участием «Медицинские иммунобиологические препараты в XXI веке: разработка, производство и применение» (Уфа, 2005); Всероссийской научно-практической конференции «Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями» (Томск, 2006); Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология — междисциплинарные проблемы» (Санкт-Петербург, 2008); Научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири - 2008» (Томск, 2008); VI, VII, VIII и X Конгрессах молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск 2005; 2006; 2007; 2009).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 2 статьи - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 182 источника, в том числе 65 отечественных и 117 зарубежных авторов. Текст иллюстрирован 13 таблицами и 10 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. Хроническое течение иксодового клещевого боррелиоза сопровождается развитием иммунного дисбаланса, характеризующегося снижением абсолютного количества CD3 -, CD4 -, CD16 -, CD22-лимфоцитов, угнетением спонтанной продукции активных форм кислорода нейтрофильными лейкоцитами, а также повышением концентрации сывороточных иммуноглобулинов классов М и G.

2. У пациентов с иксодовым клещевым боррелиозом слабый уровень пролиферативного ответа лимфоцитов на неспецифический митогенный стимул сочетается с интенсивной пролиферацией на воздействие лизата В. garinii в условиях in vitro и не зависит от типа течения инфекционного процесса.

3. Дисбаланс иммунорегуляторных цитокинов при иксодовом клещевом боррелиозе обусловлен повышением секреции интерлейкина-2 и интерферона-у на фоне снижения функционального резерва Thl, о чем свидетельствует отсутствие митоген- и антигенстимулирующего влияния на продукцию данных цитокинов in vitro.

4. Особенностями функциональной активности лимфоцитов у пациентов с хроническим течением иксодового клещевого боррелиоза являются высокие уровни спонтанной продукции интерлейкина-4 и индуцированной лизатом Borrelia garinii продукции трансформирующего фактора роста-pi, что свидетельствует о вовлечении в иммунную регуляцию механизмов, ограничивающих функциональную активность Thl.

5. Риск хронизации иксодового клещевого боррелиоза ассоциирован с преобладанием нейтрофильных лейкоцитов, характеризующихся высокой степенью активации кислородозависимых механизмов биоцидности, с одинаковыми по силе пролиферативными ответами лимфоцитов in vitro на антигенный и митогенный стимулы, с положительной корреляционной зависимостью между индуцированной лизатом Borrelia garinii продукцией интерлейкина-4 и трансформирующего фактора роста-(31 в культурах клеток цельной крови. 6. Латентные аутоиммунные процессы, связанные с наработкой ревматоидного фактора и антител против антигенов щитовидной железы, не являются прогностическими факторами хронизации иксодового клещевого боррелиоза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ИКБ, подобно другим спирохетозам, является системным заболеванием, в развитии которого можно выделить определенные этапы, соответствующие поражению различных органов и систем. В настоящее время последовательность развития заболевания (стадия локальной инфекции, стадия диссеминации и острых органных поражений, стадия хронических органных поражений) является скорее исключением, чем правилом, при этом переход в хроническую форму возможен на любой стадии инфекционного процесса (Деконенко Е.П., Кареткина Г.Н., 2009).

Обобщая полученные нами результаты и данные других исследователей, иммунопатогенез развития хронического течения ИКБ можно представить следующим образом (рис. 10).

При попадании боррелий в кожу человека в момент присасывания клеща реакция защиты организма начинается с активации системы комплемента и фагоцитоза микроорганизмов нейтрофильными гранулоцитами. В процессе поглощения бактерий в нейтрофилах индуцируется «кислородный взрыв», результатом которого является продукция активных форм кислорода (Kondrusik М. et al., 2002). С одной стороны, это ведет к гибели боррелий, и фрагменты лизированных микроорганизмов становятся доступными для механизмов специфической иммунной защиты. С другой стороны, активные формы кислорода вносят определенный вклад в развитие воспалительной реакции в месте присасывания клеща с формированием мигрирующей эритемы - характерного клинического признака ИКБ. Однако при ИКБ фагоцитоз может носить незавершенный характер, что обусловлено снижением функциональной активности фагоцитов (Пирогова Н.П., 2003; Лукашова Л.В., 2006; Миноранская Н.С. и соавт., 2007).

В проведенном нами исследовании при отсутствии мигрирующей эритемы в острый период заболевания, у пациентов с последующей хронизацией ИКБ был выявлен количественный дефицит функционально активных нейтрофилов в спонтанном НСТ-тесте с преобладанием среди активированных нейтрофилов клеток с гиперпродукцией кислородных радикалов, потенциально способствующих усилению воспалительных процессов за счет локальной деструкции тканей. Несостоятельность фагоцитарного звена врожденного иммунитета и нарушения барьерной функции тканей способствуют быстрой диссеминации возбудителя в органы и ткани и переходу заболевания в следующую стадию (Деконенко Е.П., Кареткина Г.Н., 2009).

Развитие специфического иммунного ответа происходит после поглощения боррелий антигенпрезентирующими клетками и миграции их к периферическим лимфатическим узлам, где они представляют антигенные детерминанты Т-клеткам (Макаренко J1.A. и соавт., 2002; Montgomery R.R. et al., 2002). Т-клеточный ответ при ИКБ формируется на ранних стадиях заболевания. Сенсибилизированные к антигенам боррелий лимфоциты появляются более, чем у 40% больных на четвертые сутки заболевания (Vaz A. et al., 2001). В нашем исследовании у всех пациентов, как в острый период заболевания, так и при хронизации процесса было выявлено повышение спонтанной активности лимфоцитов в РБТЛ, а также усиление их пролиферации на фоне стимуляции боррелиозным антигеном при одновременном снижении ответа на неспецифический митоген (ФГА).

При попадании возбудителя в организм развитие специфического иммунного ответа может протекать по двум путям — клеточному (Thl) и гуморальному (Th2). Сила и выраженность защитных реакций в острый период заболевания определяются продукцией ключевых иммунорегуляторных факторов - цитокинов. Для эффективного противоборрелиозного ответа необходимо формирование смешанного Thl/Th2-nyra или преобладание Thl-пути иммунного ответа (Симакова А.И., 2004; Лукашова Л.В., 2006). t

Рис. 10. Схема иммунопатогенеза хронизации иксодового клещевого боррелиоза (по данным Ю.В. Лобзина и соавт. (2000) и результатам собственных исследований)

Примечание: i i звенья иммунопатогенеза, описанные в данном исследовании.

В проведенном исследовании получены данные, свидетельствующие в пользу повышенной активации цитокинового паттерна Thl у пациентов с хронизацией острого ИКБ — высокая спонтанная и антиген-стимулированная продукция IL-2, повышение спонтанной продукции IFN-y в сочетании с низким цитокиновым ответом на ФГА. Подобные изменения могут быть обусловлены значительной напряженностью противоборрелиозного Т-клеточного ответа вследствие снижения микробицидной активности нейтрофилов. В свою очередь, полученные данные могут указывать на формирование хронического специфического воспаления по типу гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), характерного для хронического инфекционного процесса с внутриклеточной локализацией.

Повышение по сравнению с контролем антиген-стимулированной продукции IL-4, одного из ключевых регуляторов гуморальных иммунных ответов, выявленное у пациентов с хронизацией ИКБ, не приводит к адекватной элиминации патогена, так как, возможно, сопровождается снижением общей функциональной активности Т112-лимфоцитов, обусловленной, вероятно, антагонистическим воздействием цитокинов Thl-пути иммунного ответа. Высказанное нами предположение подтверждается наличием в сыворотке крови пациентов с последующей хронизацией острого ИКБ низких титров противоборрелиозных антител (1/100 — 1/200), тогда как у пациентов с выздоровлением титр антигенспецифических антител в среднем составил 1/400.

Недостаточная эффективность специфического противоборрелиозного иммунного ответа может быть обусловлена вовлечением в острую стадию инфекционного процесса антигенспецифических клонов Treg, продуцирующих иммуносупрессорные цитокины (Быковская С.Н., Насонов E.JI., 2005; Romagnani S. et al., 2006; Jarefors S. et al., 2007). По данным S.A. Pancewicz и соавт. (2008), содержание TGF-pi в сыворотке крови пациентов с эритемной формой острого ИКБ превышает аналогичный показатель у больных хроническим заболеванием. S. Grygorczuk и соавт. (2007) выявили подобные изменения содержания данного цитокина в супернатантах клеточных культур при остром нейроборрелиозе. Зарегистрированное нами активное вовлечение в корреляционные взаимодействия TGF-pi у пациентов с последующей хронизацией ИКБ, вероятно, отражает иммуносупрессорный режим функционирования иммунной системы, на фоне которого формируются как реакции со стороны факторов врожденного иммунитета, так и специфические иммунные реакции.

Вследствие указанных выше изменений стадия диссеминации возбудителя может переходить в стадию хронических органных поражений (Деконенко Е.П., Кареткина Г.Н., 2009). Для хронического течения ИКБ характерно снижение функциональных возможностей иммунной системы организма на фоне длительного инфекционного процесса. Нами отмечено снижение абсолютного количества CD3+-, CD4+-, CD16+-, С022+-лимфоцитов при хроническом течении заболевания, а также низкий уровень спонтанной активации нейтрофилов в НСТ-тесте. Одновременно отмечается высокая спонтанная пролиферативная активность лимфоцитов, повышение сывороточных иммуноглобулинов IgG и IgM, высокая спонтанная продукция IL-4, ассоциированная со снижением продукции данного цитокина на антиген боррелий. Полученные данные согласуются с результатами других исследователей (Громыко Ю.Н., 1996; Дерюгин М.В., 1996; Козлов С.С., 1999; Усков А.Н, 2003).

Наличие при хроническом течении ИКБ признаков гиперактивации Th2-лимфоцитов, не имеющих специфической сенсибилизации к антигенам боррелий, как показано в нашей работе при исследовании спонтанной продукции IL-4 у данных пациентов (рис. 8), сочетается с высоким уровнем антигенспецифической продукции TGF-P, что может быть отражением активного вовлечения клеток с супрессорной активностью (Treg) в контроль за течением иммунных реакций при хроническом варианте ИКБ. Полученные нами результаты об изменении параметров иммунного статуса как на фоне хронического ИКБ, так и на фоне острого течения заболевания у пациентов с последующей его хронизацией, подчиняются общим закономерностям развития иммунопатологических состояний, сопровождающих хронические заболевания, включая персистирующие инфекции (Клиническая иммунология и аллергология., 2006). Кроме того, иммунологические нарушения, отмеченные нами у пациентов с хроническим течением ИКБ и в острый период у пациентов с последующей хронизацией заболевания, характерны для аутоиммунных процессов, играющих важную роль в развитии осложнений хронического ИКБ. В проведенном нами исследовании не выявлено повышения антитиреоидных антител как при остром, так и при хроническом течение ИКБ. Однако по данным других исследователей, в сыворотке крови пациентов с ИКБ выявляются аутоантитела к кардиолипину, миелину, денатурированной ДНК (Axford J.S. et al., 1999; Ананьева Л.П. и соавт., 2003; Soulas P. et al., 2005), подтверждающие участие аутоиммунного синдрома в патогенезе осложнений ИКБ. Выявленное нами повышение РФ в сыворотке крови у 33,3% пациентов с хроническим течением заболевания также согласуется с существующими данными о наличии РФ у трети пациентов с ИКБ (Ананьева Л.П. и соавт., 2003).

Таким образом, результаты нашего исследования вносят существенный вклад в понимание патогенеза ИКБ, а также могут быть использованы в клинической практике как для диагностики ИКБ с различной продолжительностью течения, так и для прогнозирования развития хронизации острого инфекционного процесса.

125