Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Иммунопатогенетические механизмы эффектов антицитокиновой терапии в лечении ревматоидного артрита

094603295

На правах рукописи

КАЛАШНИКОВА Татьяна Анатольевна

ИММУ НО ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ЭФФЕКТОВ АНТИЦИТОКИНОВОЙ ТЕРАПИИ В ЛЕЧЕНИИ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА

14.03.09- клинический иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 /, ИЮН ?010

Ростов-на-Дону 2010

004608295

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Сизякина Людмила Петровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Симбирцев Андрей Семенович

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Зотова Валентина Владимировна

Ведущая организация: ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России

Защита состоится «ОХ.»иЮЛР 2010 года, в /О часов на заседании диссертационного совета Д 208.082.02 при ГОУ ВПО Ростовском государственном медицинском университете (344022, г. Ростов-па-Дону, пер. Нахичеванский, 29).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Ростовского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан « » ¡^-сх^___2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.м.п.

Н.Ю. Пшеничная

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Продукция цитокинов иммунокомпетентными клетками играет основополагающую роль в характере межклеточных взаимодействий, силе протекающих иммунных реакций и, соответственно, обуславливает клинические проявления, течение и прогноз заболевания. Ключевую роль в патогенезе ревматоидного артрита (РА) играет преобладание цитокинов, способствующих воспалению, к которым относятся ИЛ-1(3, ИЛ-6, ФНО-а и хемо-кины (ИЛ-8), что сочетается со сниженной активностью цитокинов, подавляющих воспаление: ИЛ-10, ТФР-0 (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008). Установлена также группа цитокинов, активирующих Т-лимфоциты: ИЛ-12, ИЛ-27, ИЛ-23 и цитокинов, вызывающих активацию В-лимфоцитов: ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-3, ИЛ-4 при PA (Zinkernagel R.M., 2008). В синовиальной ткани, синовиальной жидкости и в сыворотке крови пациентов с РА наблюдается увеличение концентрации ФНО-а и экспрессии растворимых ФНО-а рецепторов, коррелирующее с клиническими признаками активности воспалительного процесса (Насонов Е.Л., 2005). Основными эффектами ФНО-альфа являются активация острофазного ответа, а также усиление функциональной активности макрофагов, синовиоцитов и эндотелиальных клеток. ФНО-а принимает участие в развитии клинических признаков воспаления (боль, лихорадка, потеря мышечной и костной массы), индуцирует экспрессию молекул адгезии, стимулирует синтез провослалительных медиаторов, провоспалительных цитокинов и хемоки-нов, вызывающих повреждение кости и хряща, стимулирует рост новых сосудов (неоангиогенез) и пролиферацию фибробластов, играющих важную роль в формировании ревматоидного паннуса (Насонов Е.Л., 2006). ФНО-а участвует в процессах высвобождения других провоспалительных цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-6 и ИЛ-8 (Firestein G., 2003). Недавно открытый провоспапительный цитокин ИЛ-17, синтезирующейся ТЫ7-лимфоцитами также повышен в синовиальной жидкости у пациентов с РА, где синергично взаимодействует с ИЛ-ip и ФНО-а, a также повышает активность металлопротеиназ в синовиоцитах и хондроцитах, удлиняя продолжительность заболевания (Lubberts, 2007).

Прогресс, достигнутый в последнее время в понимании патогенеза аутоиммунных заболеваний, в частности, выявление важной роли провоспалительного цитокина ФНО-альфа, инициировал развитие новых подходов к лечению заболеваний. Применение химерных моноклональных антител к ФНО-а (инфликсимаба), которые обладают высокой аффинностью к тримерному ФНО-а и in vitro эффективно подавляют активность секретируемого и мембран- ассоциированного ФНО-а оказалось эффективным в лечении большинства больных, резистентных к традиционным методам лечения. Однако до настоящего времени недостаточно изученными являются вопросы прогнозирования эффективности лечения, длительности курса терапии анти-ФНО-а-перапатами, а также, в связи с появлением новых видов биологической терапии (этанерцепт, тоцшшзумаб, ритуксимаб, адалимумаб) -выбора того или иного препарата, что обуславливает необходимость поиска объективных иммунологических критериев сопровождения, с помощью

которых возможно решить эти проблемы. Все вышеизложенное определяет необходимость дальнейших исследований иммунологических механизмов биологической терапии при ревматоидном артрите, что и определило цель нашего исследования.

Целью исследования является оценка динамики иммунного статуса и цитоки-нового профиля в сыворотке крови и супернатантах мононуклеаров периферической крови на фоне терапии инфликсимабом и разработка критериев прогноза ее эффективности у пациентов с различными вариантами ревматоидного артрита.

Задачи исследования:

1. Выявить особенности процессов созревания, дифференцировки и активации иммунокомпетентных клеток у больных с серопозитивным вариантом суставной формы ревматоидного артрита.

2. Определить особенности продукции про- и противовоспалительных ци-токинов (ФНО-сц ИЛ-6, ИЛ-1Р, РАИЛ-ф, ИФ-у, ИЛ-4) мононуклеарами периферической крови (МПК), а также содержание этих цитокинов в сыворотке крови пациентов с серопозитивным вариантом суставной формы ревматоидного артрита.

3. Изучить способность лимфоцитов к активации и дифференцировке, оценить процессы созревания иммунокомпетентных клеток, функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов, а также оценить параметры цитокино-вого каскада у больных с серонегативным вариантом суставной формы ревматоидного артрита.

4. Оценить динамику показателей иммунного статуса и цитокинового профиля при включении инфликсимаба в базисную терапию пациентов с серопозитивным вариантом суставной формы ревматоидного артрита.

5. Изучить особенности субпопуляционного состава иммунокомпетентных клеток периферической крови и цитокинового профиля пациентов с серонегативным вариантом, суставной формы ревматоидного артрита на фоне терапии инфликсимабом.

6. Обосновать индивидуализированные показания к проведению терапии инфликсимабом и выявить критерии сопровождения у больных с различными вариантами суставной формы ревматоидного артрита.

Научная новизна работы:

• У пациентов с серопозитивным вариантом суставной формы ревматоидного артрита установлено повышение общего содержания СОЗ+, СОЗ+СБ4+ -лимфоцитов, на фоне снижения содержания СВЗ-СО(16+56)+-лимфоцитов, также отмечается усиление процессов поздней активации, повышение содержания иммуноглобулинов класса ^А, 1§М и количества циркулирующих иммун-

ных комплексов, а также повышение синтеза провоспалительных цитокинов: ФНО-а, ИЛ-1 р, ИЛ-6, ИЛ-17.

• Выявлено увеличение содержания СБЗ+С04+-лимфоцитов, СБ20+-лимфоцитов при одновременном снижении содержания СБЗ+С08+-лимфоцитов, интенсификация процессов ранней и поздней активации, увеличение количества лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы к ФНО-а, повышение содержания ФНО-а, РАИЛ-1(3, ИЛ-6 в сыворотке крови и спонтанных су-пернатантах МПК на фоне снижения стимулированной продукции ИФ-у и ИЛ-4 у больных с серонегативным вариантом суставной формы ревматоидного артрита.

• В развитии ревматоидного артрита различных вариантов течения показана патогенетическая роль ФНО-а, ИЛ-1Р, ИЛ-6, ИЛ-17, ИЛ-4, РАИЛ-13 и определен характер их взаимодействия до начала и на фоне терапии инфликсима-бом.

• Выявлены прогностические критерии эффективности включения инфлик-симаба в базисную терапию пациентов с различными вариантами суставной формы РА, включающие определение содержания лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы к ФНО-а и соотношения стимулированной и спонтанной продукции мононуклеарами периферической крови ФНО-а, ИЛ-6.

• Установлены основные параметры иммунного и цитокинового статуса, отражающие эффективность терапии инфликсимабом у пациентов с различными вариантами суставной формы РА.

Практическая значимость работы:

Полученные иммунологические данные позволили:

• создать способ прогнозирования эффективности включения инфликсима-ба в терапию пациентов с серопозитивным и серонегативным вариантами суставной формы РА.

• разработать критерии эффективности терапии инфликсимабом путем использования иммунологического мониторинга пациентов с различными вариантам» суставной формы РА.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В качестве прогностических критериев эффективности терапии инфликсимабом у пациентов с серопозитивным вариантом суставной формы ревматоидного артрита необходимо использование индекса влияния ФГА на продукцию ФНО-а, ИЛ-6 мононуклеарами периферической крови, а также определение количества лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы к ФНО-а.

2. Алгоритм прогнозирования эффективного лечения инфликсимабом пациентов с различными вариантами суставной формы РА включает монито-рирование параметров клеточного, гуморального звеньев иммунной системы, лимфоцитов, маркирующих процессы ранней и поздней активации, а также со-

держание ключевых провоспалительных цитокииов: ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-ip, ИЛ-17 и соотношения содержания ФНО-а/ИЛ-4 и ИЛ-6/ИЛ-4 в сыворотке крови и супернатантах МПК. Положительная динамика данных показателей на фоне терапии свидетельствует о тенденции к восстановлению баланса про- и противовоспалительных цитокинов, а значит эффективной иммунопатогенетической терапии инфликсимабом.

3. У пациентов с серопозитивным вариантом суставной формы РА с выраженным клиническим эффектом инфликсимаба - редукция процессов ранней и поздней активации, выраженное снижение синтеза ИЛ-6, ФНО-а, ИЛ-ip с одновременным увеличением продукции ИЛ-4 после VI инфузии свидетельствуют о тенденции к восстановлению баланса про- и противовоспалительных цитокинов и может служить основанием для перевода пациентов на монотерапию метотрексатом, с последующим иммунологическим мониторингом таких больных для предупреждения активации аутоиммунного воспаления путем своевременного решения вопроса о повторном курсе инфликсимаба.

Внедрение результатов исследования:

Материалы диссертации включены в лекции и семинарские занятия на кафедре клинической иммунологии и аллергологии ФПК и ППС, а также в практическую деятельность НУПК «Клиническая иммунология» ГОУ ВПО Ростовского государственного медицинского университета; используются при проведении антицитокиновой терапии больным с РА в работе «Центра антици-токиновой терапии» на базе Центра терапии РостГМУ г. Ростова-на-Дону.

Апробация работы:

Основные положения работы доложены, обсуждены и получили положительную оценку на:

1. Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология

- междисциплинарные проблемы» (г. Москва, 26 февраля 2008 г.),

2. IV Конференции ревматологов Южного федерального округа «Проблемы современной ревматологии», (г. Волгоград, 15 апреля 2008 г.),

3. 62-я Итоговой научной конференции молодых учёных РостГМУ, (г. Ростов-на-Дону, 23 апреля 2008 г.),

4. IV Научно-практической конференции Южного федерального округа «Актуальные проблемы клинической иммунологии и аллергологии», (г. Пятигорск, 23 октября 2008 г.),

5. «The second TRiPR conference «Innate Immunity and the Pathogenesis of Rheumatic Diseases» (Italy, c. Genoa, 6th of May 2009),

6. «The third TRiPR conference «Adaptive Immunity and the Pathogenesis of Rheumatic Diseases», (Italy, c. Genoa, 25th of May 2009),

7. Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология

— практическому здравоохранению» (г. Москва, 25 февраля 2010),

8. «The 29lh Congress of the European Academy of Allergy and Clinical Immunology», (Great Britain, London 6АоПипе 2010).

Публикации.

Основные положения диссертации изложены в 9 научных работах, из них 5 опубликовано в изданиях, входящих в перечень ВАК РФ: Российский иммунологический журнал, Российский аллергологический журнал, Цитокины и воспаление, Иммунология, а также в материалах российских и международных конференций и форумов. Оформлена заявка на изобретение «Способ прогнозирования эффективности включения инфликсимаба в терапию пациентов с ревматоидным артритом» регистрационный номер ФИПС (Роспатент) 2010103494.

Объем и структура диссертации:

Диссертация изложена на 205 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, двух глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя (18 источников на русском и 37 на иностранных языках) и приложений. Работа содержит 94 таблицы и 44 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

Проводилось обследование 33 больных страдающих суставной формой РА, высокой степени активности, находившихся на стационарном лечении в центре терапии Рост ГМУ, а также в ревматологическом отделении ГУЗ Областной больницы № 2 за период с 2007 по 2010 годы. Всем больным проводилось комбинированное лечение - базисная (метотрексат 12,5-15 мг) и антици-токиновая терапия (6-9 инфузий инфликсимаба 3 мг/кг внутривенно на 0, 2, 6, затем через каждые 8 недель). Контрольную группу составили 20 здоровых доноров. Диагноз устанавливался на основании диагностических критериев Американской ревматологической ассоциации 1987 года и классификации Ассоциации ревматологов России 2007 года. Из обследованных больных было 7 мужчин (21,2 %) и 26 женщин (78,8 %), пациентов моложе 40 лет было 12 чел (36,3 %), а 21 больных (63,7%) были старше 40 лет. У 18 (54,5 %) больных длительность заболевания составила до 5 лет, у 16 (45,5 %) — превысила 5 лет. Пациенты разделены на две группы, первую группу составили 24 серопозитивных по ревматоидному фактору (РФ) пациентов (72,7 %), а вторую группу 9 больных (27,3 %), серонегативных по РФ. Ретроспективно, в зависимости от эффекта терапии внутри каждой группы были выделены 2 подгруппы: I подгруппа — больные с серопозитивным вариантом суставной формы РА и выраженным клиническим эффектом, II подгруппа - больные с серопозитивным вариантом суставной формы РА и умеренным клиническим эффектом, III подгруппа - пациенты с серонегативным вариантом суставной формы РА и выраженным кли-

ническим эффектом, IV подгруппа - пациенты с серонегативным вариантом суставной формы РА и умеренным клиническим эффектом.

Для решения поставленных задач использован комплекс клинических, лабораторных и статистических методов исследования. Применение клинических методов исследования имело важную роль для оценки эффективности проводимой терапии инфликсимабом до начала лечения, а также после каждой инфузии препарата. С этой целью проводился опрос пациентов о локализации и интенсивности болей в суставах болевого синдрома по визуальной аналогог ой шкапе (ВАШ) от 0 до 100 мм. Оценка качества жизни больных была основг.на на результатах вопросов функционального теста Ли. С целью определения активности РА был использован индекс DAS28 (Насонов Е.Л., 2005). Для оценки эффективности антицитокиновой терапии использовались критерии улучшения Европейской Противоревматической Лиги (EULAR), включающие динамическое изменение показателей DAS28.

Лабораторные методы включали общий анализ и биохимическое исследование крови. Инструментальные методы исследования включали ультразвуковое исследование внутренних органов. У пациентов с ревматоидным артритом - рентгенологическое исследование кистей рук и стоп в прямой проекции. Иммунологические методы исследования, проводимые до и после каждой инфузии инфликсимаба, включали определение содержания CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD3-CD(16+56)+, CD20+, CD3+CD25+, CD3+HLA-DR+, CD9.5+, CD120+- лимфоцитов методом проточной цитофлюориметрии на цитофлюори-метре Beckman Coulter FC500 (США) с использованием моноклональных антител (Beckman Coulter, США) в прямом иммунофлюорисцентном тесте. Количественно определяли иммуноглобулины классов А, М, G (Манчини, 1965), количество циркулирующих иммунных комплексов (Гриневич Ю. А., 1981), а также интенсивность кислородзависимого метаболизма в НСТ-тесте (Пинегин Б.В., 1989). Проводили определение содержания цитокинов: ФНО-а, ИЛ-17, ИФН-у, РАИЛ-lß, ИЛ-lß, ИЛ-4, ИЛ-6 в сыворотке крови, а также исследование спонтанной и стимулированной ФГА (фитогемагглютинином) продукции МПК данных цитокинов. Затем определяли индекс влияния (ИВ) ФГА на синтез МПК цитокинов (В.И. Коненков, И.Г. Ракова и соавт, 2005)

Математическую обработку полученных данных проводили на ПК Microsoft Windows ХР professional, используя программу Microsoft Exel, Open Office.

Результаты исследований и их обсуждение.

При исследовании клинических показателей у группы пациентов с серо-позитивным вариантом суставной формы РА до начала терапии инфликсимабом установлено, что они соответствуют высокой степени активности заболевания (DAS28 - 12,5±3,4 баллов, продолжительность утренней скованности 89,7±7,2 мин, ВАШ пациента 44,3±2,1 мм, индекс Ли 9,9±2,1 баллов). При изучении параметров клеточного звена иммунной системы отмечается достоверное повышение относительного содержания СОЗ+-лимфоцитов (73,2±1,3%, контрольная группа 65,4±2,2%), а также С03+С04+-лимфоцитов (45,3±1,1, кон-

трольная группа 41,9±1,9%) в то время как количество СОЗ-СО(16+56)+-лимфоцитов ниже показателей контрольной группы (6,5±1,1% и 12,1 ±1,2% соответственно). Исходное содержание СОЗ+СЕ)25+-лимфоцито8, маркирующих процессы ранней активации, а также отражающих готовность к апоптозу-С095+- лимфоцитов у больных из данной группы значительно не отличается от показателей контрольной группы, в то время как количество СОЗ+НЬА-ОЯ+-лимфоцитов достоверно превышает их (10,3±1,6% и 8±0,06% соответственно). Значения показателей гуморального звена иммунной системы превышает контрольные данные (¡¿А 2,43±0,14 г/л и 1,1 ±0,06 г/л, ígM 1,46±0,12 г/л и 1,07±0,06 г/л, количество циркулирующих иммунных комплексов 138,83±5,94 у.е. и 64,2±7,7 у.е. соответственно). Кроме того, отмечается достоверное повышение спонтанной (119,52±5,1 у.е., контрольная группа 90,1±5,0 у.е.) и снижение стимулированной активности нейтрофилов (176,2±6,8 у.е., контрольная группа 193,6±10,1 у.е.), что отражается в снижении коэффициента стимуляции (1,49±0,04 у.е, контрольная группа 2,1±0,08 у.е.).

При оценке цитокинового статуса выявлено, что содержание ФНО-а в сыворотке крови соответствует показателям контрольной группы (3,2±1,4 пг/мл и 1,2±0,9 пг/мл соответственно). Продукция данного цитокина МПК достоверно превышает контрольные данные (спонт.196,2±12,5 пг/мл, стим. 496,7±32 пг/мл и спонт.19,9±6,6 пг/мл, стим. 242,4±54 пг/мл соотвественно). При исследовании количества лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности рецепторы к ФНО-а (СО 120а), посредством которых происходит передача воспалительного сигнала от ФНО-а в клетку-мишень, у больных, находящихся на базисной терапии установлено повышенная экспрессия рецепторов к ФНО-а по сравнению с контрольной группой (7,5±0,6% и 4,04±0,4 % соответственно). Также у данной группы больных установлены высокие значения ИЛ-6 в сыворотке крови (39±4,3 пг/мл) и супернатантах МПК (спонт. 6549,7±135 пг/мл, стим. 12351±131 пг/мл). Исходное содержание ИЛ-17 в сыворотке крови не отличается от данных контрольной группы (1,3±0,09 пг/мл и 1,2±0,8 пг/мл соответственно), в то время как в спонтанных супернатантах МПК установлены достоверно повышенные значения данного цитокина (26±12,8 пг/мл) на фоне снижения стимулированной активности МПК (39±14,2 пг/мл). При исследовании исходного содержания ИЛ-1Р в сыворотке крови и в культуре МПК пациентов с серопозитивным вариантом суставной формы РА установлено достоверно повышенное содержание ИЛ-в супернатантах МПК (спонт. 348,4±44,5 пг/мл, стим. 1369,2±135,1 пг/мл). Содержание РАИЛ-10 в сыворотке крови (1461±137 пг/мл) и в культуре МПК пациентов получающих базисную терапию достоверно превышает контрольные значения (спонт. 9678,5±2245 пг/мл, стим. 12136,2±3420 пг/мл и спонт. 450±48 пг/мл, стим. 1700±210 пг/мл соответственно). Содержание ИЛ-4 в сыворотке крови у данной группы пациентов соответствует контрольным данным (2,2±0,7 пг/мл и 1,9±0,2 пг/мл соответственно), в то время как в супернатантах МПК значительно ниже таковых (спонт. 4,1±0,8 пг/мл, ст. 6,2±2,1пг/мл) синтеза. Содержание ИФ-у в сыворотке крови пациентов не отличается от показателей контрольной группы (9,3±),2 пг/мл и 6,2±3,3

пг/мл), спонтанный синтез этого цитокина МП К повышен, а его стимулированная продукция снижена по сравнению с контрольными данными (спонт. 167,1±31,2 пг/мл, стим. 238,2±23 пг/мл и спонт. 91,3±3,5 пг/мл, стим. 2093±46,4 пг/мл соответственно).

Ретроспективно, в зависимости от клинического эффекта инфликсимаба больные с серопозитивным вариантом суставной формы РА разделены на две подгруппы. В первую подгруппу входят пациенты, индекс активности заболевания БА828 (до начала лечения 5,4±0,2 баллов) которых статистически достоверно снижается после III инфузии (до 3,5±0,2 баллов), продолжая постепенно уменьшаться до более низких значений (3,1±0,1 баллов), что соответствует выраженному эффекту терапии согласно критериям улучшения Европейской Противоревматической Лиги. Индекс активности заболевания Г)А828 (до начала лечения 5,2±0,4 баллов) у пациентов из II подгруппы практически не изменяется на фоне лечения, его повышенные значения сохраняются спустя 54 недели лечения (4,8±0,2 баллов), что соответствует умеренной эффективности терапии согласно критериям улучшения ЕиЬАЯ.

При сопоставлении показателей клеточного звена иммунной системы, у пациентов из I подгруппы отмечается сниженное количество СОЗ-СО(1 б+5б)+ -лимфоцитов в течение всего периода наблюдения (до I инфузии 4,6±1,3%, после IX инфузии 6,5±2,5%), в то время как у больных из II подгруппы содержание СОЗ-СО(16+5б)+-лимфоцитов соответствует контрольным значениям в течение всего курса антицитокиновой терапии (до 1 инфузии 16,7±6,4%, после IX инфузии 16±7,3%, контр. 12,1±1,2%). Количество СОЗ+СВ8+-лимфоцитов достоверно снижается у больных с выраженной клинической эффективностью терапии инфликсимабом (до I инфузии 25±2%, после IX инфузии 14,5±1,5%), а у пациентов с умеренным клиническим эффектом содержание СОЗ'СЕ)8+-лимфоцитов достоверно увеличивается после IX инфузии (до начала лечения 19,5±3,7%, после IX инфузии 34,5±9,8%). Таким образом, количество лимфоцитов, обладающих цитотоксической активностью у больных с умеренной клинической эффективностью инфликсимаба превышает показатели больных с его выраженным клиническим эффектом в течение всего периода наблюдения, что свидетельствует о сохраняющейся агрессии аутоиммунного процесса.

Установлено повышенное количество С03+С025+-Лимфоцитов у пациен-ов из II йодгруппы в течение всего курса терапии инфЛиксимабоМ; достоверно прейЬМающёе показатели пациентов ИЗ I подгруппы кй б-ой недЬлё (I подгруппа 0)9±0,1%; II Подгруппа 3,2±1,1%) И 54-ой неделе (I подгруйпа 0)9±0,4%, И подгруппа 3;3±1,1%), что Свидетельствует о выраженных процессах ранней активации у пациентов из II подгруппы. У пациентов с выраженным клиническим эффектом исходное количество СОЗ+С025+-лимфоцитов соответствует контрольным значениям с достоверным снижением относительного количества после IX инфузии (2,2±0,3% и 0,9±0,4% соответственно). Относительное содержание СОЗ+НЬА-ВЯ+-лимфоцитов у больных с выраженным и умеренным клиническим эффектом инфликсимаба существенно не различается. Количество С095+ -лимфоцитов у пациентов из I подгруппы до начала лечения соответ-

ствует значениям контрольной группы (2±С.7% и 2,6±1,0% соответственно), а после III и IX инфузии совсем не определяется в крови, в то время как у пациентов из II подгруппы соответствует контрольным данным в течение курса ан-тицитокиновой терапии.

При исследовании гуморального звена иммунной системы у пациентов из I подгруппы содержание В-лимфоцитов не изменяется на фоне лечения, а у больных из II подгруппы - соответствует контрольным данным течение всего периода наблюдения. При изучении изменений в составе иммуноглобулинов выявлена достоверно повышенная концентрация 1дА в течение периода наблюдения по сравнению с контролем у всех пациентов. После IX инфузии у пациентов с выраженным клиническим эффектом инфликсимаба, установлено снижение ^М до значений контрольной группы (1,0±0,02 г/л и 1,07±0,06 г/л соответственно), в то время как у пациентов с умеренной эффективностью препарата отмечается достоверное увеличение ^М выше исходных данных после VI инфузии (1,8б±0,2 г/л). Спонтанная активность нейтрофилов увеличивается к 54-й неделе у всех пациентов на фоне терапии инфликсимабом, но у пациентов из II подгруппы отмечаются более высокие показатели (I подгруппа - 121±7 у.е., II подгруппа - 131±12 у.е.). Стимулированная активность нейтрофилов практически не различается у пациентов обеих групп после курса терапии инфликсимабом.

Исходное содержание ФНО-а в сыворотке крови у пациентов с умеренным эффектом до начала' лечения в 4 раза превышает показатели данного цито-кина у больных с выраженной клинической эффективностью инфликсимаба (табл.1). У всех пациентов отмечается снижение содержания ФНО-а в сыворотке крови вплоть до полного исчезновения на фоне терапии инфликсимабом. У пациентов из I подгруппы установлена исходно повышенная продукция ФНО-а в спонтанных супернатантах, которая достоверно уменьшается к 30-й неделе лечения до контрольных значений. ФГА-стимулированная способность МПК к синтезу данного цитокина статистически достоверно снижается в период с 6-й по 54-ю неделю терапии до низких значений. У пациентов из II подгруппы способность МПК к спонтанному и ФГА-стимулированному синтезу ФНО-а до лечения инфликсимабом существенно выше, чем у пациентов из I подгруппы, а на фоне антицитокиновой терапии имеет нестабильный характер, достигая к 54-й неделе лечения высоких значений.

Таблица 1

Показатели цитокинового профиля пациентов с серопозитивным вариантом, суставной формой РА на фоне

терапии инфликсимабом

Пациенты с выраженной клинической эффективностью терапии инфликсимабом Пациенты с умеренной клинической эффективностью терапии инфликсимабом

Исход 6 нед 30 нед 54 нед Исход 6 нед 30 нед 54 нед

До 1 инфузии После III инфузии После VI инфузии После IX инфузии До I инфузии После III инфузии После VI инфузии После IX инфузии

ОАЭ 25 5,4±0,2 3,5±0,2* 3,3±1,24 3,1±0,1» 5,2±0,4 5,2±0,3 5,И0,5 4,3±0,2

Цитокины пг/мл

ФНО-а сы8 2,5±1,3 0,8±0,4 1,6±1,4 *0±0»» *10,8±6,4 6,3±4,5 1,4±0,7»* 1,1 ±0Д**

ФНО-а сп *80,8±13,7 *102,75±16 19,3±8** 27±13** *439±49 *48,5±2,1»* 29,4±7,8** *445±45

ФНО-а ст 138,84=71,5 *42,25±1б" »22,3±9,1 ** *41,3±11** »856±112,7 •45,б±П,7*» •64,9±2,2»» *71б±58

ИЛ-6 сыв *17±5,6 0,8±0,2»* 4,5±2,3** »0,1±0,02*» *43,8±13,6 *8,9±2,4»* *63,2±34,8 *0,2±0,03**

ИЛ-6 сп *5699,8±157 *7457±497»* *533±21** *2354±218»* *483,б±21,8 »719,4±113** *900±117*» *12510±320*»

ИЛ-бст *9362,3±!92 *4705=Н98»* »738±18** *|245±!65** *31394±367 *1708±121** *2520±224** *23480±796**

ИЛ-17 сыв 0,9±0,07 1,4±0,5 1,2±0,9 1,1 ±0,8 5,9±4,9 2,05±1,4 1,8±0,6 1±0,5

ИЛ-17 сп *23±И,7 *31±12,8 *33±11,3 *26±12,4 *25±13,б *21±15,7 *26±16,2 *29±12,7

ИЛ-17 ст *23±12,8 *35±12,1 *27±13,9 *21±12,3 *21±13,4 *101±58,7** »140±43,3** *110±58,9»*

ИЛ-1 р сыв 1,2±0,5 0,7±0,3 •0,3±0,1»* *0±0** 2,1±1,7 *0,3±0,1** 0,9±0,5 *0,4±0,1*»

ИЛ-фсп »8 66,8±74,б *1590±337" *316±35 ** •1248±133" *5138±266 »79981170*» *257,3±90** *993±110»*

ИЛ-1р ст *1148,7±162,8 3655,5±243** 520±28** 1832±331** *6180±220 *811б±118** *329±33»* *1605±251**

РАИЛ-1Р сыв •2361±124 »823,3±68»* •241±96»» *230±42*» *2771±179 *23И,7±!93,3 ♦3635,5±112»* *225±87*»

РАИЛ-1Р сп *11878,5±4355 *15142±5878 27130±320»» *6196±385»* *16710±443,6 »2528±249,4*» 434±75»» *1892б±133»»

РАИЛ-1 (1 ст «13088,5±3180 •11496*2234 *32090±1189" *5119±475»* »16328*3251 *358,3±87»» 2288±543" »11940*120»*

Примечание.

* - статистически достоверное различие показателей больных и контрольной группы (р<0,05).

**- статистически достоверное различие показателей больных до лечения и после проведения инфузий (р<0,05)

Исходное достоверно повышенное относительное количество CD120a-лимфоцитов (5,6±0,3%) у пациентов с выраженным клиническим эффектом ин-флнксимаба после 111 и IX инфузий не определяется в периферической крови, в то время как у больных из II подгруппы отмечается дальнейшее достоверное повышение содержания CD120a- лимфоцитов к 30-ой неделе (3±0,5%) и к 54-й неделе лечения (3,6±0,7%). Таким образом, показатели профиля ведущего про-зоспалительного цитокина в развитии РА - ФНО-а, на фоне терапии инфлик-симабом у пациентов из первой подгруппы имеют положительную динамику, а у пациентов из II подгруппы нестабильны и не имеют каких-либо выраженных позитивных изменений. При сопоставлении показателей цитокинового профиля ИЛ-6 у пациентов получающих комбинированную терапию, его исходная концентрация в сыворотке крови в I подгруппе повышена в 8 раз, тогда как во II подгруппе она превышает значения контрольной группы (2±1,3 пг/мл) примерно в 20 раз (табл.1). У больных с выраженным клиническим эффектом показатели значительно снижаются после III инфузии, тогда как у пациентов с отсутствием или умеренным клиническим эффектом снижение ИЛ-6 установлено только после IX инфузии инфликсимаба. При исследовании этого цитокина в супернатантах у пациентов из I подгруппы выявлен исходно повышенный спонтанный синтез ИЛ-6 с дальнейшей тенденцией к нормализации на фоне лечения, в то время как у больных из II подгруппы к 54-й неделе отмечается достоверное повышение спонтанного синтеза этого цитокина. Стимулированный синтез ИЛ-6 умеренно повышен до начала терапии у пациентов с выраженной клинической эффективностью препарата, тогда как у больных с умеренным клиническим эффектом он значительно (в 3 раза) превышает контрольные значения. На фоне терапии у пациентов из I подгруппы содержание ИЛ-6 в стимулированных супернатантах достоверно уменьшается к 54-й неделе ниже контрольных значений. У больных из II подгруппы стимулированный синтез данного цитокина, несмотря на достоверное снижение в период с 6-ой по 30-ю недели, значительно увеличивается после IX инфузии, что отражает нестабильную продукцию ИЛ-6 МПК. Таким образом, у пациентов с выраженным клиническим эффектом отмечается положительная динамика показателей профиля ИЛ-6. У пациентов с умеренным клиническим эффектом инфликсимаба высокие значения ИЛ-6 в сыворотке крови и в стимулированных супернатантах до начала лечения, а также его выраженные колебания в ходе терапии свидетельствуют о высокой активности данного провоспалительного цитокина. У пациентов с выраженной клинической эффективностью антицитокиновой терапии до начата лечения установлен индекс влияния ФГА на продукцию МПК ФНО-а < 2,4, индекс влияния ФГА на продукцию МПК ИЛ-6< 1,6 и относительное содержание лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы к ФНО-а - CD 120а > 6%, что может быть использовано в качестве прогностических критериев эффективности лечения инфликсимабом. Исследование содержания ИЛ-17 в сыворотке крови пациентов обеих групп, получающих комбинированное лечение не выявило существенных изменений по отношению к контрольной группе и между собой (табл. 1). Стимулированная продукция ИЛ-17 достоверно ниже кон-

трольных значений у пациентов из I подгруппы, а у пациентов из II группы достоверно превышает показатели больных из I подгруппы в период с 6-ой по 54-ю недели лечения (рис. 1).

Рис. 1. Динамика содержания ИЛ-17 в супернатантах МПК пациентов с серопо-зитивным вариантом, суставной формы РА с выраженной (I подгруппа) и умеренной эффективностью (II подгруппа) на фоне терапии инфликсимабом. Примечание.

*- статистически достоверное различие показателей больных из I и I! до начала лечения и после проведения инфузий (р<0,05)

Такие изменения в профиле ИЛ-17 подтверждают его участие в развитии аутоиммунного воспаления при РА. Содержание ИЛ-1 Р в сыворотке крови до начала лечения у пациентов из I и II подгрупп соответствует контрольным значениям, в то время как уровень РА ИЛ-1 (] значительно превышает таковые (табл. 1). Уровень спонтанной и стимулированной продукции МПК РАИЛ-1Р и ИЛ-1Р у больных с выраженной клинической эффективностью имеег волнообразный характер и повышен в течение всего периода наблюдения. Содержание ИЛ-1р в спонтанных супернатантах у пациентов из II подгруппы повышено до начала и на протяжении лечения по отношению к контрольным значениям на фоне нестабильного спонтанного синтеза МПК его рецепторного антагониста. Стимулированный синтез ИЛ-1р и РАИЛ-ф значительно увеличен до начала лечения и в конце наблюдения. Таким образом, у пациентов с умеренным клиническим эффектом терапии инфликсимабом установлены более высокие показатели ИЛ-1Р в сыворотке крови и супернатантах в течение курса лечения, чем у больных с выраженным клиническим эффектом. Полученные данные свидетельствуют о более высокой активности ИЛ-1 р в сыворотке крови и супернатантах у пациентов с умеренной эффективностью терапии инфликсимабом. Установлены различия в цитокиновом профиле ИЛ-4 у пациентов из I и II подгруппы на фоне терапии инфликсимабом. У пациентов из I подгруппы содержание ИЛ-4 в сыворотке крови исходно умеренно повышено (2,5±0,9 пг/мл), в то время как у

О лед 8 нед 30 нед 54 кед

О нед 6 лед 30 нед -"¡ I нед

I подгруппа

II подгруппа

больных с умеренным клиническим эффектом отмечено его низкое содержание в сыворотке крови (0,7±0,5 пг/мл) до I инфузии. После IX инфузии инфликси-маба ИЛ-4 отсутствует в сыворотке крови у всех пациентов. У пациентов из I подгруппы ФГА-стимулированная способность МПК синтезировать ИЛ-4 в период к 30-ой неделе превышает активность МПК у пациентов из II подгруппы (77,4±32 пг/мл и 3,4±2,1 пг/мл соответственно). Содержание ИФ-у в сыворотке крови до начала лечения инфликсимабом не отличается от контрольных значений у всех больных РА, с дальнейшим постепенным уменьшением его на фоне антицитокиновой терапии, а после IX инфузии полном отсутствием в сыворотке крови. При исследовании у пациентов из I подгруппы спонтанной продукции МПК ИФ-у установлен его исходно повышенный синтез (143,1±21 пг/мл) с достоверным уменьшением с 6-ой по 54-ю недели (после IX инфузии 42,6±12 пг/мл). У больных из II подгруппы исходно сниженное содержание данного ци-токина в спонтанных супернатантах достигает контрольных значений к 54-й неделе (64,1±]2 пг/мл и 93,5±26 пг/мл соответственно). Стимулированная продукция ИФ-у снижена в обеих подгруппах до начала лечения инфликсимабом. У пациентов из I подгруппы отмечается достоверное повышение содержания ИФ-у в стимулированных супернатантах с 6-ой по 54-ю недели лечения (984,5±121 пг/мл и 478,9±139 пг/мл соответственно) по сравнению с исходными данными (118,2±32 пг/мл). У пациентов из II второй подгруппы отмечается достоверное снижение значений данного показателя после VI и IX инфузии ин-фликсимаба (196,7±52 пг/мл и 126±55 пг/мл соответственно). У пациентов с выраженным клиническим эффектом исходное соотношение содержания ФНО-а/ИЛ-4 в сыворотке крови соответствует значениям контрольной группы, в то время как у пациентов с умеренным клиническим эффектом инфликсимаба данное соотношение до начала лечения, а также после III и VI инфузии превышает контрольные показатели. После IX инфузии соотношение содержания ФНО-а/ИЛ-4 достигает нулевых значений у всех исследуемых пациентов (рис. 2). Соотношение про- и противовоспалительных цитокинов (ФНО-а/ИЛ-4) в супернатантах МПК у пациентов из I и II подгруппы выше контрольных значений в течение всего периода наблюдения. При сравнении с исходными данными, соотношение содержания ФНО-а/ИЛ-4 в супернатантах у пациентов с выраженным клиническим эффектом достоверно снижается после VI и IX инфу-зий.

О нед 8 нед 30 нед 54 вед 0 нед 8 нед 30 нед 54 нед

____I подгруппа__II подгруппа

Рис. 2. Динамика соотношения содержания ФНО-а/ИЛ-4 в сыворотке крови и супернатантах МГЖ пациентов с серопозитивным вариантом, суставной формы РА с выраженной (I подгруппа) и умеренной эффективностью (II подгруппа) на фоне терапии инфликсимабом. Примечание.

*- статистически достоверное различие показателей больных до лечения и после проведения инфузий (р<0,05)

**- статистически достоверное различие показателей больных из I и II до начала лечения и после проведения инфузий (р<0,05)

У больных с умеренной эффективностью лечения значение данного индекса снижается уже после III инфузии инфликсимаба, сохраняясь на таком же уровне до окончания наблюдения, однако после IX инфузии значения соотношения ФНО-а/ИЛ-4 в стимулированных супернатантах возвращаются к высоким исходным величинам. У пациентов из I подгруппы значение индекса ИЛ-6/ИЛ-4 в сыворотке крови достоверно превышает контрольные показатели до 30-ой недели лечения, в то время как у пациентов из II подгруппы установлено его повышенное значение до I инфузии инфликсимаба, достоверно снижаясь после III инфузии (рис.3). У всех пациентов, по сравнению с контрольной группой, соотношение ИЛ-6/ИЛ-4 в супернатантах сохраняется на высоком уровне в течение всего курса лечения. У пациентов с выраженным клиническим эффектом уровень ИЛ-6/ИЛ-4 в спонтанных супернатантах достоверно снижается с 30-й по 54-ю недели, а в стимулированных супернатантах - в период с 6-ой по 54-ю недели терапии. У пациентов с умеренным клиническим эффектом соотношение содержания ИЛ-6/ИЛ-4 в спонтанных супернатантах достоверно нарастает

с 6-ой по 54-ю недели, а в стимулированных супернатантах возвращается к повышенным исходньм после IX инфузии инфликсимаба.__

О нед 6 нед 30 нед 54 нед О нед 6 нед 30 нед 54 нед

I подгруппа II подгруппа

Рис. 3. Динамика соотношения содержания ИЛ-6/ИЛ-4 в сыворотке крови и супернатантах МПК пациентов с серопозитивным вариантом, суставной формы РА с выраженной (I подгруппа) и умеренной эффективностью (II подгруппа) на фоне терапии инфликсимабом. Примечание.

*- статистически достоверное различие показателей больных до лечения и после проведения инфузий (р<0,05)

**- статистически достоверное различие показателей больных из I и II подгруппы до начала лечения и после проведения инфузий (р<0,05)

Таким образом, у пациентов из II подгруппы не отмечено положительной динамики индексов ИЛ-6/ИЛ-4 в спонтанных и стимулированных супернатантах по сравнению с таковой у пациентов из I подгруппы. Кроме того, следует отметить, что к 30-й неделе лечения (после VI инфузии) у пациентов с выраженным клиническим эффектом инфликсимаба значительно уменьшается активность аутоиммунного процесса, снижаются значения индекса (БАБ 28), показателей клеточного звена иммунной системы, уменьшается содержание провоспали-тельных цитокинов: ИЛ-6, ФНО-а, ИЛ-1(3 в сыворотке крови и супернатантах. Полученные данные могут служить основанием для перевода пациентов на монотерапию метотрексатом, с последующим иммунологическим мониторингом таких больных для предупреждения активации аутоиммунного воспаления.

Значения клинических показателей больных с серонегативньш вариантом суставной формы РА до начала терапии инфликсимабом соответствуют высокой степени активности заболевания (ОАБ 28 - 12,2±2,1 баллов, продолжительность утренней скованности 115±15 мин, ВАШ пациента 37,8±2,7 мм, индекс

Ли 17,3±3,2 баллов). При исследовании клеточного звена иммунной системы отмечается повышенное содержание С03+С04+-Лимфоцитов (46,5±1,2%), обладающих хелперно-индукторной активностью на фоне снижения количества CD3 CD8 -лимфоцитов (16,2±1,3 %). Кроме того установлено повышение содержания СОЗ+СВ25+-лимфоцитов (5,2±1,3%), а также CD3+HLA-DR4-лимфоцитов (17±2,8%), маркирующих процессы ранней и поздней активации соответственно. Показатели гуморального звена иммунной системы у пациентов из данной группы (CD20+-9,4±1,1%, IgA- 2,3±0,4 г/л, IgM-l,5±0,3 г/л, IgG-12,8±0,6, ЦИК- 126,2±9,1 у.е.) достоверно превышают значения контрольной группы, а также отмечается недостаточность адаптационных резервов нейтро-филов, что отражено в сниженном коэффициенте стимуляции (1,6±0,2 у.е.).

Анализируя исходные параметры цитокинового каскада, а именно профиля ФНО-а в сыворотке крови и супернатантах иммунокомпетентных клеток у больных с серонегативным вариантом суставной формы РА установлено повышение содержания ФНО-а в сыворотке крови (8,2*1,8 пг/мл) и спонтанных супернатантах МПК (98,5±14,2 пг/мл). Экспрессия рецепторов к ФНО-а исходно повышена по сравнению со значениями контрольной группы (9,4±3,4% и 4,04±0,4% соответственно). Содержание ИЛ-б в сыворотке крови соответствует значениям контрольной группы (1,9±0,8 пг/мл и 2±1,3 пг/мл соответственно), а спонтанная (8310±1270 пг/мл) и стимулированная продукция данного цитокина МПК (13700±1840 пг/мл) значительно превышает контрольные данные (спонт. 120±6 пг/мл, стим. 8500±220 пг/мл). Содержание ИЛ-lß в сыворотке крови соответствует контрольным показателям (1,6±0,9 пг/мл и 1,98±0,8 пг/мл соответственно), в то время как содержание его рецепторного антагониста достоверно превышает таковые (520±35 пг/мл и 1520±690 пг/мл соответственно). Содержание ИЛ-lß (спонт. 1570±154 пг/мл, стим. 2300±253 пг/мл) и его рецепторного антагониста (спонт. 8350±1145 пг/мл, стим. 9330±1450 пг/мл) в супернатантах МПК увеличено по сравнению с контрольными данными (ИЛ-lß спонт. 62±31пг/мл и стим. 470±14 пг/мл и РАИЛ-lß спонт. 450±48 пг/мл, стим. 1700±210 пг/мл). Содержание ИФ-у в сыворотке (1,2±0,2 пг/мл и 6,2±3,3 пг/мл соответственно) и стимулированных супернатантах МПК ниже значений контрольной группы (319±81 пг/мл и 2093±4б,4 пг/мл соответственно), в то время как спонтанный синтез ИФ-у выше таковых (210,9±31,3 пг/мл и 91,3±3,5 пг/мл соответственно). Содержание ИЛ-4 в сыворотке крови и спонтанных супернатантах МПК у пациентов с серонегативным вариантом суставной формы РА соответствует контрольным данным, в то время как стимулированная продукция данного цитокина ниже значений контрольных данных (62,2±13,5 пг/мл и 2093±4б,4 пг/мл соответственно).

В дальнейшем, в терапию пациентов с серонегативным вариантом суставной формы РА был включен инфликсимаб (6 инфузий). В зависимости от клинического эффекта инфликсимаба больные также ретроспективно разделены на 2 подгруппы. У больных из III подгруппы отмечается положительная динамика клинических показателей, которая отражается в снижении DAS28 уже к 6-ой недели лечения (до I инфузии- 5,5±0,5 баллов, после III инфузии - 3,8±0,2

баллов), в то время как у пациентов из IV подгруппы установлено лишь умеренное снижение индекса активности заболевания на фоне антицитокиновой терапии (до I инфузии 6,5±0,06 баллов, после VI инфузии 4,8±0,4 баллов). При сопоставлении показателей клеточного звена иммунной системы на фоне терапии инфликсимабом отмечено, что у пациентов из III и IV подгруппы исходное содержание СОЗ+-лимфоцитов по сравнению с контрольными значениями повышено (CD3 - 83±1,5% и CD3 - 77,6±3,4% соответственно), с тенденцией к снижению после III и VI инфузии препарата. Относительное содержание СОЗ+СБ4+-лимфоцитов исходно повышено у всех пациентов (III подгруппа 57±2,2%, IV подгруппа 51±5%), не изменяющееся после VI инфузии у больных с выраженным клиническим эффектом (55,5±7,5%), в то время как у пациентов с умеренной эффективностью препарата достоверно повышается (63±3,8%). При исследовании изменений лимфоцитов, обладающих супрессорно-цитотоксической активностью пациентов из III подгруппы отмечено достоверное повышение абсолютного и относительного содержания CD3+CD8+-лимфонитов после III инфузии по сравнению с исходными показателями (3]±8% и 1б±2,5% соответственно). У больных, составляющих IV подгруппу, напротив, выявлено достоверное снижение цитотоксических лимфоцитов после VI инфузии инфликсимаба по сравнению с исходными значениями (11±2,1% и 27±5,1% соответственно). Относительное содержание CD3-CD(16+56) -лимфоцитов до начала проведения антицитокиновой терапии ниже контрольных показателей у пациентов с выраженным клиническим эффектом (8±2% и 12,1±1,2% соответственно), в то время как у больных с умеренной клинической эффективностью терапии соответствует контрольным значениям в течение всего периода наблюдения (12,1±1,2% и 12±2,9% соответственно). Экспрессия маркеров ранней активации у пациентов из III подгруппы исходно повышена (4,!±1,1%), а на фоне лечения снижается (2,3±0,2%). У больных из IV подгруппы количество С03+С025+-лимфоцитов ниже значений контрольной группы до начала терапии (1,1±0,5%) с дальнейшим уменьшением до более низких значений (0,6±0,1%). Кроме того, у пациентов с умеренной эффективностью препарата количество С03+НЬА-011+-Лимфоцитов, маркирующих процессы поздней активации (до I инфузии 10±2,9 %) после IV инфузии значительно увеличивается (24±4,9%) по сравнению со значениями больных из III подгруппы (11,5±3,5%). У всех больных с серонёгативным вариантом суставной формы РА наблюдается исходно повышенное содержание B-лимфоцитов по сравнению с кбмтрольными значениями (III подгруппа 104:1,1%, IV ПоДгруйпа 14,3±6,4%, контрольная группа 6,2±1,1%): Fi дальнейшем, к 30-й неделе лечения у пациентов из III подгруппы отмечается снижение относительного содержания CD2G-лимфоцитов (8±1,2%). У больных из IV подгруппы установлено увеличение содержания B-лимфоцитов (23±4,2%), достоверно превышающее показатели пациентов из III подгруппы. Соответственно, у пациентов с выраженным клиническим эффектом после VI инфузии препарата отмечается тенденция к нормализации синтеза IgA, IgM. В то время как у пациентов с умеренным клиническим эффектом установлены повышенные концентрации данных иммуноглобу-

лииов (IgA-2,3±0,3r/n, IgM-l,9±0,lr/n). Отчетливой динамики изменения синтеза IgG у пациентов обеих групп не выявлено. В обеих группах больных отмечается тенденция к снижению количества циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК). У пациентов из III подгруппы на фоне терапии инфликсимабом установлено повышение спонтанной (147±18 у.е.) и стимулированной активности нейтрофилов (212±16 у.е.) к 30-й неделе лечения, в то время как у больных из IV подгруппы отмечается тенденция к нормализации спонтанного восстановления нитросинего тетразолия (90±13 у.е.) и достоверное снижение стимулированной активности нейтрофилов (115±30 у.е.) после VI инфузии. Коэффициент стимуляции нейтрофилов снижен у всех пациентов в течение всего периода наблюдения.

Исходное содержание ФНО-а (2,4±1,7 пг/мл) и ИЛ-6 (3,8±1,1 пг/мл) в сыворотке крови соответствует значениям контрольной группы у пациентов с выраженным клиническим эффектом инфликсимаба, в то время как у больных с умеренной эффективностью антицитокиновой терапии значения данных цито-кинов достоверно превышают таковые (ФНО-а 17,6±4,9 и ИЛ-6 22,5±15,1 пг/мл). На фоне лечения у всех пациентов отмечается постепенное снижение содержания цитокинов сыворотке крови. Продукция МПК ФНО-а и ИЛ-6 у пациентов с серонегативным вариантом суставной формы РА имеет волнообразный и нестабильный характер. У всех пациентов уровень экспрессии рецепторов к ФНО-а исходно снижен по сравнению со значениями контрольной группы (III подгруппа- 0,6±0,1%, IV подгруппа- 2±0,3%) и к 30-й неделн CD120a+-лимфоциты не определяются в крови. При изучении изменений в содержании ИЛ-lß в сыворотке крови на фоне анти-ФНО-а терапии, его значения соответствуют контрольным в течение всего периода наблюдения (1,98±0,8 пг/мл и 1,6±0,9 пг/мл соответственно). Содержание рецепторного антагониста ИЛ-lß в сыворотке крови у всех обследованных пациентов достоверно превышает показатели контрольной группы, но у больных из III подгруппы достоверно выше (4270±467 пг/мл), чем у обследуемых из IV подгруппы (756,5±35 пг/мл). Содержание ИЛ-lß и его рецепторного антагониста в супернатантах МПК у всех пациентов на фоне терапии инфликсимабом увеличено по сравнению с контрольными данными.

Содержание ИФ-у в сыворотке крови у больных на фоне терапии инфликсимабом ниже контрольных значений или соответствует им. Исходная спонтанная продукция МПК данного цитокина достоверно выше контрольных значений у всех пациентов (III подгруппа-179,4±22,9 пг/мл, IV подгруппа 149,9±47 пг/мл), к 30-й неделе у пациентов из III подгруппы отмечается тенденция к его нормализации (149,3±58 пг/мл), а у больных из IV подгруппы существенно не изменяется (196±61 пг/мл). Исходный стимулированный ФГА синтез исследуемого цитокина у пациентов из IV подгруппы (4513±132 пг/мл) повышен по сравнению со значениями III подгруппы (139±30 пг/мл), а после VI инфузии установлено его статистически достоверное снижение (IV подгруппа-до 161±44 пг/мл) по отношению контрольным и исходным данным. Содержание ИЛ-4 у пациентов с выраженным клиническим эффектом инфликсимаба не определя-

ется в сыворотке крови до начала лечения, а к 6-ой неделе лечения нарастает (до 9,1±1,2 пг/мл), достоверно превышая показатели больных из IV подгруппы (1,3± 1,0 пг/мл). После VI инфузии данный цитокин не определяется в сыворотке у всех пациентов. Спонтанная и стимулированная продукция ИЛ-4 МПК преобладает у больных с выраженным клиническим эффектом инфликсимаба (рис. 4).

пг/мл

25

О вед 6 нед 30 Нед

IV подгруппа

О кед в вед 30 иед

III подгруппа

Рис. 4. Динамика содержания ИЛ-4 в супернатантах пациентов с серонегатив-ным вариантом, суставной формы РА с выраженной (III подгруппа) и умеренной эффективностью (IV подгруппа) на фоне терапии инфликсимабом Примечание.

*- статистически достоверное различие показателей больных до лечения и после проведения инфузий (р<0,05)

**- статистически достоверное различие показателей больных из I и II до начала лечения и после проведения инфузий (р<0,05)

ВЫВОДЫ

1. У пациентов с серопозитивным вариантом суставной формы ревматоидного артрита выявлено повышение содержания СОЗ+, СОЗ+СВ4+-лимфоцитов при одновременном снижении содержания СОЗ-СО(16+56)+-лимфоцитов, усиление процессов поздней активации, повышение содержания иммуноглобулинов класса ^М и количества циркулирующих иммунных комплексов.

2. У больных с серопозитивным вариантом суставной формы ревматоидного артрита отмечается повышенное содержание ИЛ-6, РАИЛ-1р, ФНО-а в сыворотке крови и супернатантах иммуиокомпетентных клеток, увеличение спонтанной продукции ИЛ-17, ИФ-у на фоне снижения спонтанного и стимулированного синтеза ИЛ-4.

3. При серонегативном варианте суставной формы РА у пациентов выявлено увеличение содержания СМ+СВ4+-лимфоцитов и €020'- лимфоцитов, сни-

жение количества цитотоксических СОЗ+С08+-лимфоцитов, усиление процессов ранней и поздней активации, гипергаммаглобулинемия классов А, М, С и увеличение количества циркулирующих иммунных комплексов.

4. У больных с серонегативным вариантом суставной формы РА установлено увеличение количества лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы к ФНО-а наряду с повышением содержания ФНО-а, РАИЛ-1Р,

ИЛ-6 в сыворотке крови и спонтанных супернатантах МПК на фоне снижения содержания ИФ-у в сыворотке крови и уменьшение синтеза ИФ-у и ИЛ-4 в стимулированных супернатантах МПК.

5. Критериями прогноза умеренной эффективности терапии инфликсимабом пациентов с серопозитивным вариантом суставной формы РА являются: исходно повышенное содержание СБЗ СБ25 -лимфоцитов, высокое содержание ФНО-а и ИЛ-6 в сыворотке крови до начала лечения, нарастание количества С03+С08+, СПЗ+С025-лимфоцитов, повышение содержания ^М, активация стимулированного синтеза ИЛ-17, высокая спонтанная и стимулированная продукция ФНО-а, ИЛ-6 на протяжении лечения (после VI и IX инфузии инфлик-симаба).

6. У пациентов с серопозитивным вариантом суставной формы РА иммунологическими критериями прогноза выраженной эффективности терапии инфликсимабом являются: снижение количества СПЗ+С08+, СОЗ-СО(16+56)+-лимфоцитов, уменьшение содержания 1§М, супрессия процессов ранней и поздней активации иммунокомпетентных клеток, высокая спонтанная и стимулированная продукция РАИЛ-1Р МПК, снижение содержания ФНО-а, ИЛ-6 в спонтанных и стимулированных супернатантах, уменьшение количества лимфоцитов, экспрессирующих рецепторы к ФНО-а и соотношения ФНО-а/ИЛ-4 и ИЛ-6/ИЛ4 в сыворотке и супернатантах иммунокомпетентных клеток на протяжении лечения (после VI и IX инфузии инфликсимаба).

7. У больных с серонегативным вариантом суставной формы РА и выраженной клинической эффективностью терапии инфлисимабом усиливаются процессы дифференцировки Т-лимфоцитов с преобладанием СБЗ+С08+-лимфоцитов, сохраняется повышенное содержание иммуноглобулинов класса А, М, увеличена спонтанная и стимулированная продукция РАИЛ-1Р и ИЛ-4 в супернатантах иммунокомпетентных клеток на фоне проводимого лечения (после VI инфузии инфликсимаба).

8. Критериями прогноза умеренной эффективности терапии инфликсимабом пациентов с серонегативным вариантом суставной формы РА являются: Исходно повышенное содержания ФНО-а и ИЛ-6 в сыворотке крови, а также повышение содержания СЕ)3+С04+-лимфоцитов, снижение содержания СОЗ+СВ8+-лимфоцитов, увеличение количества В-лимфоцитов и иммуноглобулинов класса А, М на фоне лечения.

9. Алгоритм прогнозирования эффективности лечения инфликсимабом пациентов с различными вариантами суставной формы РА включает мони-торирование параметров клеточного, гуморального звеньев иммунной системы, лимфоцитов, маркирующих процессы ранней и поздней активации, а также

содержание ключевых провоспалительных цитокинов: ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-1Р, ИЛ-17 в сыворотке крови и супериатантах МПК. Положительная динамика перечисленных показателей на фоне терапии свидетельствует об эффективной терапии инфликсимабом.

Практические рекомендации:

1. Перед включением инфликсимаба в базисную терапию пациентов с серо-позитивным вариантом суставной формой ревматоидного артрита рекомендуется проводить исследование ИЛ-6 и ФНО-а не только в сыворотке, но и в супериатантах МПК, а также определять количество лимфоцитов, экспрессирую-щих рецепторы к ФНО-а. При одновременном выполнении условий, когда индекс влияния ФГА на продукцию МПК ФНО-а i < 2,4, индекс влияния ФГА на продукцию МПК ИЛ-6 <1,6 и относительном содержании лимфоцитов, экс-прессирующнх рецепторы к ФНО-а - CD120a > 6% возможно прогнозирование хорошего эффекта при включении инфликсимаба в стандартную терапию.

2. У пациентов с серопозитивным вариантом суставной формы РА с выраженным клиническим эффектом инфликсимаба редукция процессов ранней и поздней активации, выраженное снижение синтеза ИЛ-6, ФНО-а, ИЛ-ip с одновременным увеличением продукции ИЛ-4 после VI инфузии свидетельствуют о тенденции к восстановлению баланса про- и противовоспалительных цитокинов и может служить основанием для перевода пациентов на монотерапию метотрексатом, с последующим иммунологическим мониторингом таких больных для предупреждении активации аутоиммунного воспаления путем своевременного решения вопроса о повторном курсе инфликсимаба.

Работы, опубликованные по теме диссертации.

1. Зудбинова В.Ю., Калашникова Т.А. Иммунопатогенетические эффекты антицитокиновой терапии у пациентов с ревматоидным артритом // Российский иммунологический журнал. СПб., 2008.- Том 2 (11). - № 2-3.-С. 233.

2. Калашникова Т.А. Влияние инфликсимаба на иммунный статус пациентов с ревматоидным артритом // 62-я итоговая научная конференция молодых ученых. - Ростов-на-Дону, 2008. - С. 29.

3. Зудбинова В.Ю., Калашникова Т.А., Зудбинов Ю.И. Значимость провоспалительных цитокинов в иммунопатогенезе ревматоидного артрита И Актуальные проблемы современной ревматологии. Сборник научных работ. Волгоград, 20GS.-С. 50-51.

4. Зудбинова В.Ю., Калашникова Т.А., Зудбинов Ю.И. Особенности имму-нопатогенеза различных вариантов ревматоидного артрита // Российский аплер-гологический журим. М., 2008. №1. - С. 110-111.

5. Калашникова Т.А. Иммунопатогенетические эффекты инфликсимаба у пациентов с ревматоидным артритом и болезнью Крона // Цитокины и воспаление. СПб., 2008. Том 7, №3. С.49.

6. Т. Kalashnikova, U. Hasanov, M. Gashkova, Y. Sokolova, L. Siziakina. The dynamics of immune status and cytokine profile in patients with rheumatoid arthritis as influenced by infliximab administration // Submitted Abstracts. The 2nd TRiPR conference Innate Immunity and the Pathogenesis of Rheumatic Diseases. Italy, Genoa, 2009. P. 29.

7. T. Kalashnikova, U. Hasanov, M. Gashkova, L. Siziakina. Correlation between status of immune system and efficacy of infliximab in patients with rheumatoid arthritis // Submitted Abstracts. The 3rd TRiPR conference Adaptive Immunity and the Pathogenesis of Rheumatic Diseases. Italy, Genoa, 2009. P.32.

8. Калашникова T.A., Сизякина Л.П., Чумакова E.A. Оценка иммунного статуса пациентов с серонегативным вариантом ревматоидного артрита на фоне терапии инфликсимабом // Российский аллергологический журнал. - М., 2010. - №1, вып.1. С.79.

9. Калашникова Т.А., Хасанов У.В., Сизякина Л.П. Показатели активацион-ных маркеров и цитокинового профиля у пациентов с ревматоидным артритом на фоне терапии инфликсимабом // Иммунология. — М., 2010, №4.

Список сокращений.

CD - антигены кластеров дифференцировки клеток

DAS - Disease Activity Score - индекс активности болезни

Ig - immunoglobulinum - иммуноглобулин

Боль/ВАШ - оценка боли по визуально-аналоговой шкале

ИВ - индекс влияния

ИЛ - interleukin - интерлейкин

ИФН-у - intererferon - интерферон гамма

МПК - мононуклары периферической крови

HCT спонт. — спонтанное восстановление нитросинего тетразолия

HCT стим. — стимулированное восстановление нитросинего тетразолия

HCT- тест - тест восстановления нитросинего тетразолия

РА - ревматоидный артрит

РАИЛ-lß - растворимый антангонист интерлейкина-1-бета РФ - ревматоидный фактор Спонт. - спонтанная продукция МПК цитокинов Стим. - стимулированная продукция МПК цитокинов ФГА - фитогемагглютинин

ФНО-а - tumor necrosis factor- фахтор некроза опухоли-альфа

Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Формат 60*84/16. Объем 1,0 уч.-изд.-л. Заказ № 137. Тираж 100 экз. Отпечатано в КМЦ «НЕО-ПРИНТ» 344002, г. Ростов-на-Дону, пер., Соборный 24, тел. 247-35-43