Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунопатогенетическая характеристика экспериментальной инфекции эндотелия сосудов человека вирусом простого герпеса I типа

На правах рукописи

МИРОНЧЕНКОВА (МАКСЯНИНА) Екатерина Владимировна

ИММУНОПАТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ ЭНДОТЕЛИЯ СОСУДОВ ЧЕЛОВЕКА ВИРУСОМ ПРОСТОГО ГЕРПЕСА I ТИПА

14.00.36. - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2004

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук Щегловитова О.Н.

кандидат медицинских наук Романов Ю.А.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Кондратьева Т.К.

доктор медицинских наук, профессор Баринский И.Ф.

Ведущая организация:

Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича МЗ РФ.

Защита диссертации состоится февраля 2004 года в 11 часов

на заседании Диссертационного совета Д 001.007.01 ГУ НИИЭМ

им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, по адресу: 123098 г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН

Автореферат разослан

января 2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Лу

Русакова Е.В.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Заболевания, вызываемые вирусами группы герпеса, широко распространены в человеческой популяции. По данным ВОЗ, герпесвирусная инфекция занимает 2-ое место (15,8%) после гриппа и ОРВИ (35,8%) как причина смерти от вирусных инфекций. Антитела к вирусу простого герпеса обнаруживаются у 80-90% взрослых людей и у 50% детей, достигших десятилетнего возраста [Шувалова Е.П., 2001; Покровский В.И. и др., 2000; Львов Н.Д. и др., 1999; Баринский И.Ф. и др., 1986; Johnson R.E. et al., 1986]. Наибольшую опасность герпетическая инфекция представляет для беременных в связи с возможностью проникновения вируса через плацентарный барьер, последующим внутриутробным инфицированием плода и возможной его пре- или постнатальной гибелью [Исаков В.А. и др., 1999; Сухих Г.Т. и др., 1997; Цинзерлинг А.В. и др., 1988;, Баринский И.Ф. и др., 1986]. У пациентов, находящихся на иммуносупрессивной терапии после трансплантации органов, реактивация герпесвирусной инфекции может приводить к развитию симптомокомплекса хронического отторжения трансплантата вследствие поражения его сосудов. Распространенный характер герпес приобретает у субъектов с онкологическими, гепатологическими заболеваниями [Кологривова Е.Н. и др., 2000]. Кроме этого, в настоящее время рецидивирующий герпес рассматривается как СПИД-индикаторное состояние, поскольку рецидивы заболевания чаще возникают на фоне иммунодефицита [Покровский В.И. и др., 2000]. Также, имеются данные об участии вирусов группы герпеса в патогенезе атеросклероза кровеносных сосудов человека [Vercellotti G.M., 2001,1998; Herzum M. et al., 1998; Hajjar D.P., 1991].

Вирус простого герпеса 1 типа (ВПГ-1) является одним из наиболее известных вирусов группы герпеса. Обычно, после инфицирования контактным, воздушно-капельным или вертикальным путем, развивается острая стадия инфекции, которая затем переходит в хроническую или латентную форму. Различные провоцирующие факторы (переохлаждение, стресс, травма, иммуносупрессивные состояния) способствуют манифестации инфекции из латентного состояния. Вирус герпеса сохраняется в организме пожизненно, как правило, в клетках паравертебральных сенсорных ганглиев, используя латенцию как механизм для поддержания своей жизнеспособности в организме хозяина и для уклонения от воздействия его иммунной системы [Mossman K.L, 2002; Rajcani J. et al., 2000; Everett R.D., 2000;

MillhouseS. et al., 2000; Roizman В., 1999; Miller C.S., 199 91;

Fraser N.W. et al., 1991]. К настоящему времени известно, что ВПГ-1 может инфицировать не только эпителиальную и нервную ткани; вирус обнаруживается также в эндотелиальных клетках (ЭК) сосудов роговицы [Klein R. J., 1982], плаценты [Сухих Г.Т. и др., 1997; Цинзерлинг А.В. и др., 1988;], мозга [Stumpf Т.Н. et al., 2002; Holbach LM. et al., 1998].

Эндотелий, выстилающий внутреннюю поверхность кровеносных сосудов, является естественным барьером между кровью и тканями организма и играет важную роль в регуляции проникновения циркулирующих клеток и молекул в ткани, то есть является одной из основных клеточных систем, участвующих в поддержании гомеостаза организма [Фрейдлин И.С. и др., 2001; Biedermann B.C., 2001; Cines D.B. et al., 1998; Beilke M.A., 1990; Pober J. et al., 1990; Springer ТА, 1994]. Функционирование эндотелия регулируется гладкомышечными клетками (ГМК) стенки кровеносных сосудов и лейкоцитами крови путем продукции цитокинов, хемокинов и факторов роста. Эти же факторы участвуют в развитии большинства известных физиологических и патологических процессов, таких как рост, дифференцировка и миграция клеток, воспаление, репаративные процессы, реакция на инфекционные агенты [Pozo M.A. et al., 1996; Springer ТА, 1994; Mantovani A. et al., 1992; Shimizu Y. et al., 1992]. В отдельных случаях цитокины способны активировать распространение инфекционных агентов по организму [Campbell I.L., 1991]. С другой стороны, и резидентные (ГМК и ЭК), и циркулирующие в крови типы клеток способны воздействовать на клеточные и гуморальные типы эффекторных механизмов иммунитета благодаря активации продукции цитокинов [Mossman T.R. et al., 1996; Farby Z. et al., 1993]. Таким образом, эндотелиальные, гладкомышечные клетки интимы кровеносного сосуда и лейкоциты крови являются основными типами клеток, постоянно взаимодействующих на уровне кровотока и сосудистой стенки, как в норме, так и при развитии патологического процесса. Однако, влияние гладкомышечных клеток интимы сосуда и лейкоцитов периферической крови на инфекцию эндотелиальных клеток ВПГ-1 до настоящего времени не было изучено.

В этой связи исследование особенностей межклеточных взаимодействий при инфекции ВПГ-1 в многоклеточной модельной системе может дополнить представления о патогенетических механизмах вирусных заболеваний человека.

Цель исследования - изучение роли межклеточных взаимодействий с участием гладкомышечных клеток интимы сосуда и лейкоцитов периферической

крови человека в иммунопатогенезе инфекции эндотелиальных клеток, вызванной ВПГ-1.

Задачи исследования:

1. Разработать экспериментальную модель инфекции ВПГ-1 с использованием культивируемых эндотелиальных клеток человека и охарактеризовать ее по основным морфологическим и функциональным параметрам

2. Охарактеризовать особенности развития герпетической инфекции и продукции цитокинов в культивируемых эндотелиальных клетках, полученных от разных доноров, а также в клональных популяциях культуры эндотелия.

3. Исследовать экспрессию молекул клеточной адгезии эндотелиальными клетками, инфицированными ВПГ-1, и ее взаимосвязь с процессом адгезии лейкоцитов на инфицированный эндотелий.

4. Изучить продукцию цитокинов лейкоцитами крови при взаимодействии с эндотелиальными клетками, инфицированными ВПГ-1. Выявить влияние цитокинов и интерферонов, продуцируемых при этом взаимодействии, на инфекционный процесс и экспрессию молекул клеточной адгезии в культурах эндотелиальных клеток.

5. Исследовать влияние гладкомышечных клеток интимы сосуда и отдельных цитокинов на репродукцию ВПГ-1 в культуре эндотелиальных клеток человека.

6. Сравнить продукцию цитокинов лейкоцитами крови при инфекции вирусом и при трех вариантах индукции: вирусом и вирусинфицированными эндотелиальными клетками и вирусинфицированными лейкоцитами.

Научная новизна. Впервые разработана культуральная модель, позволяющая оценивать влияние гладкомышечных клеток интимы сосуда и лейкоцитов периферической крови на развитие герпесвирусной и других инфекций в культивируемых эндотелиальных клетках человека.

Впервые установлено, что клеточные популяции, полученные из отдельных родоначальных колониеобразующих эндотелиальных клеток, а также культуры эндотелия от разных доноров, различаются по способности поддерживать репродукцию ВПГ-1 и продуцировать цитокины.

Показано, что с развитием вирусной инфекции фенотип эндотелиальных клеток меняется на провоспалительный, который характеризуется экспрессией на клеточной поверхности Р- и Е-селектинов и усилением адгезивных свойств эндотелиальных клеток для лейкоцитов периферической крови, что отражает начальные стадии патогенеза герпетической инфекции.

Впервые выявлено, что при контакте с эндотелиальными клетками, инфицированными ВПГ-1, лейкоциты периферической крови активируются и продуцируют интерфероны (ИФНа, ИФНу) и цитокины (ИЛ-1р, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНОа), которые тормозят репродукцию ВПГ-1 в культурах эндотелия и меняют фенотип клеток на провоспалительный. Эти процессы могут приводить к формированию латенции вируса в эндотелии и развитию порочного круга воспаления в сосудистой стенке.

Впервые показано, что гладкомышечные клетки интимы кровеносного сосуда в условиях со-культивирования тормозят, а в отдельных случаях полностью ингибируют репродукцию ВПГ-1 в эндотелиальных клетках.

Сравнительный анализ цитокинов, продуцируемых лейкоцитами крови при различных типах взаимодействия с вирусом показал, что индукция лейкоцитов ВПГ-1, а так же эндотелиальными клетками или лейкоцитами, инфицированными ВПГ-1, приводит к секреции схожего спектра интерферонов и цитокинов, обладающих провоспалительный и противовирусной активностью. В тоже время, инфекция лейкоцитов ВПГ-1 сопровождается снижением продукции цитокинов, обладающих противовирусной активностью.

Научно-практическая значимость работы. Разработанная модель со-культивирования эндотелиальных клеток, инфицированных ВПГ-1, с гладкомышечными клетками интимы сосуда и лейкоцитами крови может быть использована для изучения механизмов патогенеза вирусных инфекций, тестирования противовирусных препаратов и разработки новых способов лечения вирусных заболеваний человека.

Способность цитокинов, продуцируемых активированными лейкоцитами, подавлять репродукцию ВПГ-1 в эндотелиальных клетках может быть учтена при разработке подходов к терапии герпесвирусных заболеваний.

Полученные данные позволяют расширить современные представления о клеточной биологии сосудистой стенки человека и механизмах развития сосудистой патологии, связанной с инфекцией ВПГ-1.

Апробация работы. Апробация диссертационной работы состоялась 6 ноября 2003 года на конференции Отдела интерферонов ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН. Основные результаты исследований представлены на симпозиумах Международного общества исследований интерферона и цитокинов (Амстердам, Нидерланды, 2000 г., Турин, Италия, 2002 г.); на международной научно-практической школе-конференции "Цитокины.

Воспаление. Иммунитет." (Санкт-Петербург, Россия, 2002. г.); на конференции молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины" (Москва, Россия, январь, 2004 г.)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 142 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и указателя литературы. Список литературы содержит 20 отечественных 243 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 25 рисунками и 4 таблицами.

Список использованных сокращений

ВПГ-1 - вирус простого герпеса 1 типа; ГМК - гладкомышечные клетки; ДФЧ -диплоидные фибробласты человека; ИФН - интерферон; КС-Л - среда, кондиционированная лейкоцитами; КС-ГМК - среда, кондиционированная ГМК; МКА

- молекулы клеточной адгезии; МПКЧ -мононуклеары периферической крови человека; ТЦД/50 - тканевая цитопатическая доза вируса, вызывающая гибель 50% клеточного монослоя; ЦПД - цитопатической действие; ЭК - эндотелиальные клетки.

Материалы и методы. Культуральные среды, реактивы и пластик. Среда 199 с солями Эрла, среда RPMI-1640, эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС), сбалансированные солевые растворы Эрла и Хенкса, фосфатный буфер Дульбекко (ФБД), L-глутамин, пируват натрия, пенициллин-стрептомицин, гентамицин, бикарбонат натрия, 0.05% трипсин -0.02% ЭДТА, HEPES были получены от фирм GIBCO или ICN (США). Диспаза (нейтральная протеаза из B.Polymyxa), коллагеназа (тип IV), желатин (культуральной степени чистоты), гепарин (натриевая соль), диметилсульфоксид (DMSO), глутаровый альдегид (гистологической чистоты, 2.5 % водный раствор), конканавалин А, ингибитор трипсина, бычий сывороточный альбумин - Sigma (США); соляная кислота, натрия гидроокись, одно- и двузамещенный фосфат натрия

- Merck (Германия). Фактор роста ЭК, ECGS (endothelial cells growth supplement), выделяли из ткани мозга человека по методу Maciag et al. [1979].

Чашки Петри (35, 60, 100 мм), 6, 12, 24, 48 и 96-камерные культуральные планшеты, проницаемые культуральные системы TransWell™, центрифужные пробирки, пипетки и другие расходные материалы для культивирования клеток -

Corning и Costar (США). Цитокины ФНОа, ИЛ-Iß и Г-КСФ, а так же рекомбинантные антитела к ИФНа, ИФНу и ФНОа предоставлены фирмой ПанЭко (г. Москва). Культуры клеток человека. Материалом для выделения эндотелиальных клеток (ЭК) служили пупочные канатики, полученные во время нормальных родов. Клетки выделяли по методу Gimbrone M.A. et al. [1974] в модификации Антонова А.С. и соавт. [1986]. Пупочную вену отмывали от крови раствором Эрла и заполняли 0.15% раствором диспазы на среде 199. После инкубации при 37°С в течение 30 минут раствор фермента сливали в пробирку, вену промывали раствором Эрла, полученные клеточные суспензии объединяли и центрифугировали 10 минут при 600д. Осадок ресуспендировали в среде культивирования, которая состояла из среды 199 с солями Эрла с добавлением 20 мМ HEPES, 2 мМ L-глютамина, 1 мМ пирувата натрия, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 10% ЭТС, 5 ЕД/мл гепарина, 50 мкг/мл ECGS. Клетки культивировали в СОг-инкубаторе (при 37°С, 5% СО2) на чашках Петри, предварительно покрытых желатиной; среду меняли каждые 48-72 часа. Рост и морфологию контролировали с помощью фазово-контрастной микроскопии (Diaphot-TMD, Nikon). В работе использовали монослойные культуры 1-2-го пассажей на 4-6 сутки культивирования.

ЭК аорты человека выделяли из визуально неизмененных грудных отделов аорт, полученных при аутопсии [Antonov A.S. et al., 1986, Романов Ю.А. и др., 1992], условия и среда культивирования ЭК аорты не отличались от описанных выше для ЭК пупочной вены. Клональные популяции ЭК получали путем засевания клеток на чашки Петри с разведением 1:200 от исходной плотности монослойной культуры. Полученные колонии ЭК изолировали с помощью цилиндров для клонирования и последовательно субкультивировали для получения необходимого количества клеток. В работе использовали культуры, сохранившие морфологическую гомогенность клеточного состава.

Культуры ГМК получали из фрагментов аорты, оставшихся при выделении ЭК, которые после дополнительной промывки раствором Эрла инкубировали 2-3-часа при 37°С в 0.2% растворе коллагеназы на среде 199. Состав среды (без гепарина) и условия культивирования не отличались от описанных выше для ЭК. Кондиционированные среды ГМК (КС-ГМК) получали при культивировании ГМК в течение 24 часов.

Совместное культивирование (со-культивирование) ЭК и ГМК осуществляли в культуральной системе TransWell™ (Corning-Costar, США). Для этого ГМК засевали в

ячейки вкладышей (размер пор 0.45 мкм), а ЭК на дно 24-луночных планшет, контакт клеток осуществлялся только через культуральную среду.

Культуры диплоидных фибробластов человека (ДФЧ, линия М-19, 10-25 пассаж) и клетки линии Vero были получены из НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН. Клетки культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 2мМ L-глютамина, 100 мкг/мл гентамицина, 5% ЭТС, высевали в 96-луночные культуральные планшеты в объёме 0.1 мл с конечной концентрацией 2x105 клеток/мл, по достижении конфлуентности использовали для титрования ИФН (ДФЧ) и титрования инфекционного вируса (VERO).

Мононуклеары периферической крови человека (МПКЧ) выделяли из гепаринизированной крови здоровых доноров по стандартной методике [Byoum A., 1968], на градиенте фиколла (плотность 1.077 г/смз). Клетки ресуспендировали в среде RPMI-1640 с добавлением 2мМ L-глютамина, 50 мкг/мл гентамицина, 10% ЭТС и культивировали в течение 24-72 часов при 37°С и 5% СОг. Концентрация клеток в экспериментах составляла 1 -2x106 клеток/мл.

Вирусы. Вирус простого герпеса 1 типа (штамм R39) был получен из банка ВОЗ; инфекционный титр составлял 1x106 ТЦД/0.1 мл. Вирус энцефаломиокардита мышей (ВЭММ) и вирус болезни Ньюкасла (ВБН) были получены из Лаборатории препаратов интерферона ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, инфекционные титры вирусов составляли 1х105 ТЦД/ 0.1 мл и 1х109 ТЦД/ 0.1 мл, соответственно. Инфицирование культивируемых клеток и оценка репродукции ВПГ-1. Для характеристики репродукции ВПГ-1 конфлуентные культуры ЭК инфицировали последовательными десятикратными разведениями ВПГ-1. Подготовленные разведения вируса в свежей среде культивирования наносили на ЭК в объеме 0.2 мл для адсорбции вируса в течение 1 часа, (37°С / 5% СО2); после 3-х кратной отмывки теплым раствором Эрла, отбирали "нулевые" пробы и культивировали ЭК в среде роста в стандартных условиях с последующим отбором проб в динамике культивирования. Развитие ЦПД оценивали с помощью световой микроскопии. Культуры ГМК инфицировали аналогичным образом.

МПКЧ активировали конканавалином А (10 мкг/мл) в течение 3 суток, отмывали раствором Эрла и инфицировали ВПГ-1 с МИ 0.1 в течение 1 часа при 37°С при периодическом перемешивании. По окончании адсорбции клетки трижды отмывали от неадсорбированного вируса раствором Версена, ресуспендировали в среде RPMI-1640, содержащей 2мМ L-глютамина, 50 мкг/мл гентамицина, 10% ЭТС, и культивировали при 37°С / 5% СО2 в течение 6 суток. Для определения

внутриклеточного содержания инфекционного вируса лейкоциты разрушали 3-х кратным замораживанием и оттаиванием, с последующим центрифугированием проб для освобождения от клеточного детрита.

Инфекционный титр ВПГ-1 определяли по развитию ЦПД в клеточной культуре линии VERO. Для этого, в ячейки 96-луночных культуральных планшет с монослоем клеток вносили по 0,1 мл последовательных десятикратных разведений вируссодержащего материала в трех повторах. На 4-6 сутки инкубации (при 37°С / 5% СОг) учитывали степень дегенерации клеток. За титр вируса принимали наибольшее его разведение, оказывающее цитопатическое действие на 50% площади монослоя (ТЦД/50).

Адгезия лейкоцитов на культивируемые ЭК. Для оценки адгезивных свойств клеток к контрольным и инфицированным (МИ 0.1 - 0.001) культурам ЭК добавляли суспензию лейкоцитов (1 -2x106 клеток/мл) в среде культивирования ЭК. Через 30 минут культуры отмывали от неприкрепившихся лейкоцитов раствором Эрла, фиксировали в течение 30 минут 2.5% раствором глютарового альдегида на ФБД и окрашивали по Гимза. Просмотр препаратов и подсчет адгезировавших лейкоцитов проводили с помощью микроскопии в проходящем свете.

Фиксаций культивируемых ЭК и МПКЧ глутаровым альдегидом. Контрольные и инфицированные ВПГ-1 (МИ 0.1 - 0.0001) культуры ЭК через 24 часа в культивирования дважды промывали холодным раствором ФБД, фиксировали 0,25% раствором глутарового альдегида на ФБД в течение 10 минут при 4°С, после чего дважды промывали холодным ФБД и один раз ФБД, содержащим 0,2% ЭТС и 0,025% азида натрия (ФБД-ЭТС). Фиксированные культуры хранили в ФБД-ЭТС при 4°С.

Мононуклеары периферической крови человека, инфицированные ВПГ-1 и контрольные клетки, фиксированные глутаровым альдегидом, как описано выше, отмывали от фиксатора холодным ФБД и 3-х кратным центрифугированием. Индукция лейкоцитов. Для индукции • лейкоцитов ВПГ-1, во взвесь свежевыделенных мононуклеаров (1 -2x106 клеток в 0.9 мл среды RPMI-1640 с 10% ЭТС) вносили по 0.1 мл заранее приготовленных последовательных разведений ВПГ-1 и культивировали до 72 часов.

Для индукции лейкоцитов ЭК, инфицированными ВПГ-1, ЭК, выращенные в 24-луночных культуральных планшетах, инфицировали ВПГ-1 (при МИ 0.1-0.001) и фиксировали глютаровым альдегидом, как описано выше. Перед использованием, фиксированные клетки дважды промывали раствором Эрла, после чего в каждую

лунку вносили 1 мл суспензии мононуклеаров (1-2x106 клеток) и культивировали до 72 часов.

При использовании в качестве индуктора лейкоцитов, инфицированных ВПГ-1, последние активировали конканавалином А, инфицировали ВПГ-1 (МИ 0.1) и на 2 день культивирования фиксировали глутаровым альдегидом, как описано выше. Фиксированные и нефиксированные инфицированные лейкоциты использовали для индукции свежевыделенных аутологичных лейкоцитов в соотношении индуктор/продуцент, равном 1:10. Пробы для тестирования цитокинов. и интерферонов при всех методах индукции отбирали через 6, 24, 48 и 72 часа культивирования клеток в стандартных условиях, осветляли центрифугированием и хранили при -20°С.

Определение уровней интерферонов и цитокинов. Для определения активности ИФН методом биотестирования образцы культуральных сред обрабатывали -1N соляной кислотой до рН=2.0 в течение 72 часов для инактивации ВПГ-1, затем нейтрализовали 1N гидроокисью натрия. Пробы тестировали на культуре ДФЧ. Для этого в 96-луночные культуральные планшеты с монослоем ДФЧ вносили по 0.1 мл двукратных разведений титруемого образца в трех повторах. По окончании 24-часовой инкубации в лунки вносили 100 доз индикаторного вируса (ВЭММ) по 0.1 мл в лунку. Результаты титрования учитывали на следующий день по задержке развития цитопатического действия при условии 50% гибели клеток в контрольных лунках с 1/100 дозы индикаторного вируса.

Для количественного определения интерферонов и цитокинов применяли метод иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием коммерческих наборов ПроКон (Санкт-Петербург) и CYTELISA (США) в соответствии с прилагаемыми инструкциями изготовителя.

Оценка содержания вирусной ДНК в инфицированных ЭК методом ПЦР.

Выявление вирусной ДНК в инфицированных клетках проводилось методом ПЦР с праймерами, специфичными для фрагментов гена тимидинкиназы ВПГ-1. В работе был использован набор «Герпес ампли-тест» производства ЗАО «Ниармедик Плюс» (Москва); анализ производился согласно инструкции, прилагающейся к набору. Выявление вирусныхантигенов и молекул клеточной адгезии. Л окал изацию и степень экспрессии позднего вирусного антигена дВ и эндотелиальных МКА оценивали с помощью непрямого сэндвич-метода с использованием мышиных моноклональных антител и авидин-биотин-пероксидазной техники. Количественную оценку изменения экспрессии клетками различных МКА осуществляли с помощью

проточной цитофлуориметрии Анализ окрашенных клеточных суспензий проводили на проточном цитофлуориметре FACS-Cahbur (Becton Dickinson) Для построения гистограмм анализировали 10000 клеток в каждом образце

Результаты собственных исследований и их обсуждение

1. Особенностирепродукции ВПГ-1 вкультурахэндотелиальных клеток.

Для оценки способности ЭК поддерживать репродукцию ВПГ-1, клетки инфицировали вирусом с множественностью инфицирования (МИ) от 1 0 до 0 0001. В результате культивирования инфицированных ЭК в течение 24-72 часов наблюдалось развитие цитопатического действия (ЦПД), которое характеризовалось появлением единичных очагов округлившихся клеток на фоне интактного монослоя (Рис 1А), число очагов и их площадь увеличивались в динамике культивирования и

Рисунок 1. Стадии развития ЦПД (А,В,Г) и экспрессия дВ-антигена (Б) в культуре ЭК человека, инфицированных ВПГ-1. А, В, Г - фазовый контраст, X 200; Б - иммунопероксидазная техника, Х400

Специфичность ЦПД была подтверждена положительным окрашиванием инфицированных ЭК антителами к позднему вирусному антигену gВ (Рис 1Б) Динамика накопления инфекционного вируса в культуральной среде в зависимости от МИ представлена на (Рис 2)

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о способности культивируемых ЭК поддерживать репродукцию ВПГ-1

Культивируемые ЭК, полученные от разных доноров, отличались по способности поддерживать репродукцию ВПГ-1 Исследование культуральной среды ЭК, инфицированных ВПГ-1, в динамике культивирования показало присутствие

цитокинов ИЛ-1Р, ИЛ-6 в количествах больших, чем в неинфицированных культурах ЭК. Уровни цитокинов зависели от донора ЭК. Инфицированные ЭК не продуцировали ИФНа, который, как известно, ограничивает репродукцию ВПГ-1.

Рисунок 2.

Содержание инфекционного вируса в культуральной среде ЭК, инфицированных ВПГ-1 с разной МИ (0.1-0.0001).

"0.1 2 3 ВРЕМЯ, сутки

Имеются убедительные данные, свидетельствующие о том, что эндотелиальный слой сосудов человека гетерогенен [Ribatti et а1., 2002]. Одним из проявлений такой морфологической гетерогенности эндотелия является способность клеток формировать т.н. кластеры - фрагменты монослоя, состоящие из ЭК близкого размера и формы. С существованием подобных кластеров связывают, в частности, возможность локального развития воспалительного процесса и топографию атеросклеротических поражений в сосудах человека [Романов Ю.А. и др., 2000]. Для выяснения возможной взаимосвязи между гетерогенностью эндотелия и особенностями развития вирусной инфекции на уровне сосудистой стенки было проведено следующее исследование. С помощью техники клонирования из первичной культуры ЭК аорты человека были получены культуры, состоящие из отдельно расположенных колоний. Часть колоний была изолирована с помощью цилиндров для клонирования и последовательно субкультивирована с целью получения достаточного количества клеток для проведения экспериментов. Таким образом, было получено 10 клонов, сохранивших морфологическую однородность

клеточного состава. Для определения способности поддерживать репродукцию ВПГ-1, клоны были инфицированы вирусом с разной МИ.

КЛОН 1 Р / клон 2 тон 3 & тон 4 № тон 5 £

тон 6 клон 7 ^^ и тон 8 -л С тон 10____-« 0

" 12 3 12 3 12 3

ВРЕМЯ ПОСЛЕ ИНФИЦИРОВАНИЯ (СУТ.) ПРИ МИ. -

1 2 3 1 2 3 •— 0.001;— 0.0001;—»— 0.00001

Рисунок 3. Репродукция ВПГ-1 в клональных культурах ЭК аорты человека, инфицированных с разной МИ (0.001-0.00001).

На рисунке 3 видно, что все клеточные популяции обладали способностью поддерживать репродукцию ВПГ-1, однако, некоторые: из них; поддерживали репродукцию вируса при всех использованных МИ (клоны №3, №4, №10), другие -только при высоких МИ (клоны №2, №6, №7, №9). Клоны отличались и по динамике накопления инфекционного вируса в культуральной среде.

В следующей серии экспериментов плотность посадки клеток была увеличена до 1:25-1:50 от исходной, плотности монослоя, что в процессе культивирования привело к слиянию отдельных клеточных колоний и получению мозаичного

монослоя, состоящего из морфологически различимых кластеров. Инфицирование такого монослоя ВПГ-1 при МИ 0.001 и последующее культивирование ЭК выявило разновременное развитие ЦПД в отдельных клеточных кластерах (Рис. 4).

Эти данные демонстрируют функциональную гетерогенность ЭК. Полученные результаты позволяют предполагать, что гетерогенность популяций ЭК, выделенных от одного донора, и связанная с ней избирательная способность ЭК быть инфицированными и поддерживать репродукцию ВПГ-1, могут определять в дальнейшем топографию и локальность патологического процесса в эндотелиапьном слое сосудов человека, в том числе, локализацию атеросклеротических поражений.

2. Взаимодействиелейкоцитов с ЭК, инфицированными ВПГ-1.

Эндотелиальные клетки принимают участие в функционировании иммунной системы. Известно, что ЭК экспрессируют молекулы HLA I и II класса в ответ на действие что приводит как к презентации антигена, так и лизису

вирусинфицированных клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами [Waldman W.J. et al., 1996; Hirschberg H. et al., 1991]. Однако, взаимодействие между ЭК и лимфоцитами, в том числе, в ходе презентации антигена возможно, если запускается каскад реакций, конечным итогом которого является адгезия лейкоцитов на ЭК. Начальная фаза этого взаимодействия опосредуется МКА семейства селектинов; последующая плотная адгезия происходит через взаимодействие лейкоцитарных интегринов с МКА иммуноглобулинового семейства [Bevilacqua M.P., 1993; Zimmerman G.A. et al., 1992]. Кроме этого, взаимодействию ЭК и лейкоцитов способствуют различные активирующие и хемоаттрактантные молекулы, такие как фактор активации тромбоцитов и ИЛ-8 [Фрейдлин И.С. и др., 2001; Ковальчук Л.В. и др., 2000]. В этой связи была предпринята попытка определить уровень экспрессии некоторых классов эндотелиальных МКА на разных стадиях развития инфекции ВПГ-1. С помощью иммуногистохимического метода и метода проточной цитофлуориметрии (Таб. 1) было установлено, что уже на самых ранних стадиях развития инфекции (до появления признаков ЦПД) ЭК начинают экспрессировать Р-и Е-селектины.

Результаты, приведенные в Таблице 1, свидетельствуют, что количество инфицированных клеток, экспрессирующих эти МКА, в 4-6 раз выше, чем в контрольных культурах. Вместе с молекулой ICAM-1, экспрессированой на клеточной

мембране постоянно, селектины способствуют адгезии большего числа лейкоцитов на эндотелии [ВеуНаедиа М Р., 1993].

МКА Образец % позитивных клеток

Р- Контроль 38

СЕЛЕКТИН инфекция 12.7

Е- Контроль 4.0

СЕЛЕКТИН инфекция 23.2

УСАМ-1 контроль инфекция 6.4 62

1САМ-1 контроль инфекция 30.9 32.9

Таблица 1.

Экспрессия молекул клеточной адгезии ЭК, инфицированными ВПГ-1, через 24 часа от начала инфицирования культуры (МИ 0.01; данные проточной цитофпуориметрии).

В экспериментах по изучению адгезивных свойств культура ЭК была инфицирована ВПГ-1 с разной МИ. Через 24 часа культивирования к монослою ЭК была добавлена взвесь мононуклеаров, выделенных из крови доноров. Как представлено на рисунке 5, лейкоциты практически не адгезировали на интактные ЭК (Рис. 5А), тогда как ЭК, инфицированные ВПГ-1, обладали способностью адгезировать на своей поверхности лейкоциты, количество которых зависело от МИ ЭК.

При этом, основная масса клеток крови адгезировала на внешне неизмененные ЭК, как единичные, так и формирующие кластеры (т.е. на клетки, экспрессирующие Р- и Е-селектины), но не на клетки, проявляющие первые признаки ЦПД (Рис.5Б,В). На более поздних стадиях инфекционного процесса основная масса лейкоцитов также адгезировала на визуально неизмененные ЭК, расположенные по периферии очагов ЦПД (Рис 5Г)

При контакте инфицированных ЭК и лейкоцитов крови возможна активация последних. Для исследования такой возможности ЭК были инфицированы ВПГ-1 с разной МИ, а затем, через 24 часа фиксированы глутаровым альдегидом. Фиксация глютаровым альдегидом останавливает инфекционный процесс, но сохраняет все, в том числе и вирусспецифические антигены на поверхности инфицированных клеток.

Инфицирование ЭК с разной МИ давало возможность проследить результаты взаимодействия ЭК с лейкоцитами при экспрессии увеличивающихся по мере развития инфекционного процесса количеств вирусспецифических антигенов. Образцы культуральной среды отбирали после совместного культивирования лейкоцитов и фиксированных ЭК через 6, 24, 48 часов, затем тестировали на присутствие ИФН и цитокинов (Рис. 6).

Рисунок 6.

Продукция интерферонов и цитокинов лейкоцитами, активированными ЭК, инфицированными ВПГ-1 и фиксированными глутаровым альдегидом.

ВРЕМЯ ПОСЛЕ АКГИЕ!/>ЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ |ЧАСЫ)

ми во 1 що 01 ЕЗ<ко1

В результате контакта с ЭК, инфицированными ВПГ-1, лейкоциты крови продуцировали ИФНа и цитокины: ИФНу, ИЛ-1р, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНОа, но не ИЛ-4. Динамика секреции медиаторов была индивидуальной: к 6 часам от начала активации лейкоцитов ЭК, инфицированными ВПГ-1, максимальная продукция была характерна для ФНОа; к 24 часам - для ИФНа, ИЛ-ip, и ИЛ-6 и к 48 часам - для ИФНу.

Уровни продукции цитокинов лейкоцитами крови коррелировали с МИ ЭК, используемых для активации лейкоцитов.

При биотестировании ИФН часть проб культуральной среды обрабатывали HCI при рН 2.0 в течение 24 часов для определения его кислотолабильности. Оказалось, что после обработки кислотой титр ИФН уменьшался, причем более значительно в образцах, полученных через 48 часов от начала активации лейкоцитов, т.е. во время большей продукции Кислотолабильность ИФН

обусловливается присутствием в культуральной среде ИФНу, а активность ИФН в пробах, не обработанных кислотой, - аддитивным действием с

[Щегловитова О.Н., 1999].

Из результатов экспериментов можно заключить, что для индукции синтеза интерферонов и цитокинов достаточно только мембранного контакта лейкоцитов и инфицированных ЭК, экспрессирующих антиген ВПГ-1, что ранее было показано только для индукции ИФНа при контакте лейкоцитов и ДФЧ, инфицированных ВПГ-1 [Capobianchi M.R. et al., 1985]. Межклеточный контакт, очевидно, активировал весь лейкоцитарный пул, так как, согласно данным литературы, продуцируют

преимущественно моноциты/макрофаги и В-лимфоциты, ИФНу - естественные киллеры и Т-хелперы I типа, ИЛ-1р - моноциты/макрофаги, ФНОа - Т-хелперы I типа и ИЛ-6 Т-хелперы II типа [Paul W.E. et al., 1994; Dianzani F., 1993; Balkwill F.R. et al., 1989;Capobianchi M.R. etal., 1985].

Интерфероны и цитокины, продуцируемые лейкоцитами крови при контакте с ЭК, инфицированными ВПГ-1, обладают широким спектром активностей как in vitro, так и в организме человека: оказывают противовирусное действие, могут быть вовлечены в презентацию антигена, принимать участие в активации соседних клеток, в развитии иммунных и/или воспалительных реакций внутри сосудистой стенки, апоптозе клеток и др. [Waldman W.J. et al., 1996]. В связи с этим было исследовано влияние кондиционированной среды (КС-Л), полученной при активации

лейкоцитов ЭК, инфицированными ВПГ-1, на репродукцию вируса герпеса в культуре ЭК.

Рисунок 7.

Влияние кондиционированной среды (КС-Л), полученной после 6 (А), 24 (Б) и 48 (В) часов от начала активации лейкоцитов ЭК, инфицированными ВЛГ-1 с разной МИ, на репродукцию ВПГ-1 в интактной культуре ЭК.

В данном разделе работы использовали КС-Л, полученную через 6, 24, 48 часов от начала активации лейкоцитов ЭК, инфицированными ВПГ-1 с разной МИ и фиксированными глутаровым альдегидом через 24 часа после инфицирования. Интактные культуры ЭК обрабатывали КС-Л в течение 24 часов, затем инфицировали ВПГ-1 с МИ 0.001 и продолжали культивировать в свежей среде роста. Динамику репродукции вируса оценивали в течение 6 дней от начала инфицирования по накоплению инфекционного вируса в культуральной среде (Рис. 7).

Видно, что КС-Л, полученная через 6 часов от начала активации лейкоцитов, содержащая низкие уровни ИФН и цитокинов, практически не влияла на репродукцию ВПГ-1 в ЭК и была близкой к репродукции вируса в контрольных необработанных КС-Л культурах. Напротив, КС-Л, полученная через 24 и 48 часов тормозила репродукцию вируса в ЭК. Ингибирующее действие было связано с КС-Л, полученной через 24 и 48 часов от начала активации лейкоцитов ЭК, инфицированными при наиболее высоких МИ (0.1-0.01)

Для ответа на вопрос, какой из факторов, продуцируемых активированными лейкоцитами, обладает ингибирующим действием на репродукцию вируса, в

1 2 3 4 5 6 ВРЕМЯ ПОСЛЕ ИНФИЦИРОВАНИЯ, СУТКИ

МИ —»—10. —»—01 —«—001, —«—0 001 —о— о 0001, —•— control

следующих экспериментах нами были использованы нейтрализующие антитела к ИФНа, ИФНу, ФНОа, которыми вместе с КС-Л обрабатывали ЭК в течение 24 часов, затем ЭК инфицировали ВПГ-1. Образцы культуральной среды отбирали в динамике культивирования для определения титра инфекционного вируса.

Рисунок 8.

Влияние антител к ИФНа, ИФНу и ФНОа на антивирусный эффект среды, полученной через 24 часа от начала активации лейкоцитов ЭК, инфицированными ВПГ-1 при МИ 0.1.

Как представлено на рисунке 8, КС-Л, полученная через 24 часа от начала активации лейкоцитов ЭК, инфицированными ВПГ-1 с МИ 0.1, ингибировала репродукцию вируса. Использование КС-Л вместе с антителами к указанным цитокинам приводило к восстановлению репродукции ВПГ-1 в разной степени: более выраженное при использовании антител к ИФНа и смеси антител к ИФНа, ИФНу, ФНОа; менее выраженное при использовании антител к ИФНу. При исследовании влияния антител на ингибирующее действие КС-Л в динамике культивирования ЭК, инфицированных ВПГ-1, оказалось, что антитела к и оказывали

больший нейтрализующий эффект на КС-Л, полученную через 24 часа от начала активации лейкоцитов, где активность этих медиаторов была выше. Напротив, антитела к нейтрализовали в большей степени эффект КС-Л, полученной

через 48 часов от начала активации лейкоцитов, где активность была выше.

Тот факт, что эффект КС-Л в присутствии нейтрализующих антител не блокировался полностью, скорее всего, объясняется тем, что помимо вышеуказанных цитокинов эффект КС-Л на репродукцию ВПГ-1 в ЭК определяется присутствием в ней и других факторов, которые продуцируются лейкоцитами в результате их активации.

При использовании в экспериментах лейкоцитов доноров было выявлено, что в некоторых случаях они спонтанно продуцировали высокие уровни цитокинов. В

следующем разделе работы мы исследовали влияние КС-Л, полученной от доноров с высокой спонтанной секрецией цитокинов, на репродукцию ВПГ-1 в ЭК. В экспериментах был использован один из таких образцов КС-Л, содержащий ИЛ-6 (600 пкг/мл), ФНОа (200 пкг/мл), ИФНу (16 ЕД/мл) и небольшое количество ИЛ-1р (30 пкг/мл).

Рисунок 9.

Влияние КС-Л с высоким содержанием спонтанно продуцируемых цитокинов на репродукцию ВПГ■1 в ЭК. А - репродукция ВПГ-1 в ЭК при МИ 0.001 в присутствии КС-Л; Б - определение ДНК методом ПЦР в ЭК без признаков репродукции ВПГ■1. 1 - контроль (+); 2,3 - исследуемые образцы ЭК, без признаков репродукции вируса;

4 - контроль (-)

Как видно на рисунке 9А, 24-часовое культивирование ЭК с КС-Л, содержащей высокие концентрации спонтанно продуцируемых цитокинов, до или до и после инфицирования ВПГ-1 при МИ 0.001 приводило к ингибированию репродукции вируса, характеризующейся отсутствием признаков ЦПД и накопления инфекционного вируса в культуральной среде. При пассировании ЭК без признаков репродукции вируса и последующем культивировании их в КС-Л, помимо отсутствия репродукции вируса не была обнаружена и ДНК ВПГ-1 методом ПЦР (Рис. 9Б, образцы 1 и 2). Возможно, именно способностью лейкоцитов крови спонтанно продуцировать высокие уровни цитокинов можно объяснить невосприимчивость небольшой части человеческой популяции к ВПГ-1, а у части людей - редкие случаи реактивации вируса.

Как уже отмечалось, КС-Л, полученная при активации лейкоцитов ЭК, инфицированными ВПГ-1, содержит значительное количество ИФН и цитокинов. Для изучения возможной активации интактных ЭК под влиянием факторов, продуцируемых активированными лейкоцитами, была проведена следующая серия экспериментов. С помощью проточной цитофлуориметрии была исследована экспрессия МКА VCAM-1 и ICAM-1 в культурах ЭК, инкубированных в присутствии КС-Л, полученной от контрольных и активированных лейкоцитов (Рис. 11).

Влияние КС-Л, активированных ЭК, инфицированными ВПГ-1, на экспрессию 1САМ-1 в культуре ЭК.

1 - отрицательный контроль;

2 - контрольные ЭК;

3 и 4-ЭК, инкубированные с КС-Л лейкоцитов, активированных ЭК. контрольными и инфицированными ВПГ-1, соответственно.

Рисунок 10.

Контрольные культуры ЭК экспрессировали незначительный базальный уровень ICAM-1 (кривая 2). Обработка ЭК в течение 24 часов КС-Л, полученной при активации лейкоцитов неинфицированными ЭК, приводила к увеличению экспрессии ICAM (кривая 3); однако, максимальная интенсивность флуоресценции клеток была после контакта с КС-Л, полученной после активации лейкоцитов ЭК, инфицированными ВПГ-1 (кривая 4). Следовательно, в результате такой обработки неинфицированные ЭК приобретали провоспалительный фенотип и способность адгезировать лейкоциты крови, тем самым, поддерживать воспаление.

Таким образом, инфицирование ЭК ВПГ-1 приводит к каскаду следующих событий: происходит усиление экспрессии Р- и Е-селектинов на ЭК, что приводит к увеличению на них адгезии лейкоцитов. В свою очередь, адгезия лейкоцитов сопровождается их активацией и продукцией ИФН и цитокинов, благодаря совместному действию которых происходит замедление или ингибиция репродукции ВПГ-1 в ЭК. С другой стороны, эти же цитокины воздействуют на инфицированные и/или окружающие ЭК, способствуя повышенной экспрессии МКА и запуская, тем самым, воспалительную реакцию в сосудистой стенке. Баланс между действием продуцируемых лейкоцитами цитокинов и репродукцией вируса определяет возможность становления вирусной латенции, реактивации вируса и развития хронического воспаления, формируя, таким образом, развитие порочного круга воспалительной реакции сосудистой стенки, который, в итоге, ведет к необратимым изменениям сосудов, определяющим морфологическую и клиническую манифестацию заболевания.

3. Влияние гладкомышечныхклетокинтимыкровеносного сосудана репродукцию ВПГ-1 в культуреэндотелиальных клеток человека.

ЭК, выстилающие внутреннюю поверхность кровеносных сосудов, являются полупроницаемым барьером между кровью и тканями организма (Ribatti О. Et al., 2002). Функционирование эндотелия тесно связано с функционированием лейкоцитов крови и гладкомышечных клеток (ГМК) интимы кровеносного сосуда. Именно ЭК, ГМК и лейкоциты являются тремя основными клеточными типами, постоянно взаимодействующими между собой на уровне кровотока и сосудистой стенки. С одной стороны, функции ЭК (рост, дифференцировка, репарация, развитие воспаления и т. д.) контролируются гуморальными факторами (цитокинами, хемокинами, ростовыми факторами), продуцируемыми ГМК и лейкоцитами [Pozo М.А et al., 1996; Springer T.A., 1994]. С другой стороны, ГМК и ЭК активируют дифференцировку CD4+ лимфоциты в Тп1 и Th2, что определяет, в конечном счете, преобладание либо клеточно-опосредованного, либо гуморального типа иммунного ответа [Фрейдлин И.С. и др., 2001; Mossman T.R., 1996; Farby Z. et al., 1993]. В этой связи, было высказано предположение, что не только лейкоциты, но и ГМК, благодаря высокой секреторной активности, могут влиять на репродукцию ВПГ-1 в ЭК.

Для моделирования процесса взаимодействия ЭК и ГМК в работе использовали систему TransWell™, в которой ГМК интимы аорты человека культивировали на полупроницаемых вкладышах, а ЭК - на дне 24-луночных культуральных планшет. Клетки взаимодействовали только через культуральную среду. Клеточные культуры со-культивировали за 24 часа до, в течение 24 часов после или до и после инфицирования ЭК ВПГ-1. Пробы культуральной среды отбирали в динамике культивирования и тестировали на содержание инфекционного вируса. В качестве контроля использовали показатели репродукции ВПГ-1 в ЭК без совместного культивирования.

Результаты, полученные в ходе работы, показали, что совместное культивирование ЭК и ГМК во всех случаях приводило к снижению темпов репродукции вируса, что проявлялось в более позднем развитии ЦПД вируса и снижении титров инфекционного вируса в культуральной среде (Рис. 11В).

В отдельных экспериментах было показано, что ГМК способны поддерживать репродукцию ВПГ-1, которая характеризовалась развитием ЦПД в виде очагов округлившихся клеток и накоплением инфекционного вируса в культуральной среде.

Развитие ЦПД и динамика накопления инфекционного вируса находились в прямой зависимости от МИ ГМК. В связи с этим при со-культивировании ГМК и ЭК после инфицирования нельзя было исключить получения артефактных результатов, связанных с возможностью инфицирования и ГМК. Вследствие этого в последующих экспериментах вместо ГМК была использована среда, кондиционированная неинфицированными ГМК (КС-ГМК).

Рисунок 11. Влияние

гладкомышечных клеток и

среды, кондиционированной

ГМК, на репродукцию ВПГ•1 в

эндотелиальных клетках.

А и Б — при использовании КС-ГМК, добавленной до или после инфицирования ЭК; В-в условиях со-культивирования до или до и после инфицирования ЭК МИ: А-0.1;Б, В-0.1

В результате проведенных экспериментов, в которых КС-ГМК добавляли за 24 часа до, или в течение 24 часов после инфицирования ЭК при МИ 0.1-0.001, были получены два типа эффектов, которые зависели от МИ: замедление репродукции вируса (при МИ 0.1-0.01, рис.11А. Б) и полное отсутствие признаков репродукции вируса при низкой МИ (0.001) (Рис. 12А).

Рисунок 12.

Влияние КС-ГМК на репродукцию

ВПГ-1 в ЭК при множественности

инфицирования 0,001.

А - первичное инфицирование культуры

Б - первый пассаж культуры без признаков ЦПД в соотношении 1:2 и продолжение культивирования в ростовой среде и КС-ГМК.

При последующем пассировании инфицированных культур ЭК без признаков репродукции вируса в соотношении 1:2 от исходной плотности и продолжении

культивирования клеток в контрольной среде роста репродукция ВПГ-1 возобновлялась: отмечалось появление ЦПД и накопление инфекционного вируса в культуральной среде. Напротив, при продолжении культивирования инфицированных ЭК с КС-ГМК признаков репродукции вируса не было (Рис.12Б).

По литературным данным ГМК обладают способностью продуцировать цитокины, обладающие потенциальной антивирусной направленностью с разными механизмами действия [Warner S.J. etal., 1989].

В следующих экспериментах нами было исследовано влияние ИЛ-1р, ФНОа и Г-КСФ на репродукцию ВПГ-1 в ЭК. Клетки культивировали в течение 24 часов с рекомбинантными цитокинами до или после инфицирования вирусом (МИ 0.001) и оценивали накопление инфекционного вируса в культуральной среде. Обработка ЭК ИЛ-Iß, ФНОа и Г-КСФ в отличие от КС-ГМК, приводила в наших экспериментах только к торможению вирусной репродукции. Вероятно, антивирусная активность КС- ГМК определяется не только перечисленными, но и некоторыми дополнительными растворимыми факторами. Таким образом, ГМК продуцируют факторы, способные тормозить или ингибировать репродукцию ВПГ-1 в ЭК, что может являться одним из механизмов становления латенции ВПГ-1 в сосудистом эндотелии.

В настоящее время имеется недостаточная информация, касающаяся механизмов формирования и поддержания вирусной латенции. Именно способность использовать латенцию как механизм, посредством которого вирус персистирует в организме хозяина, является типичным свойством всех герпесвирусов, включая и ВПГ-1 [Сухих Г.Т. и др., 1997; Баринский И.Ф. и др., 1886, 1980; Stumpf Т.Н. et al., 2002; Larcher С. et al., 2001; Halford W.P. et al., 1996; Rinaldo C.R. et al., 1978]. В то же время, результаты работы говорят в пользу того, что ГМК способны продуцировать факторы, под влиянием которых в ЭК возможно формирование латентной инфекции ВПГ-1. Длительность латенции, по-видимому, может зависеть от длительности воздействия факторов, продуцируемых ГМК.

4. Сравнительный анализ цитокинов, продуцируемых лейкоцитами крови при разных типах взаимодействия с ВПГ-1.

Попадая в кровеносный сосуд, инфекционный агент взаимодействует не только с клетками, выстилающими внутреннюю поверхность кровеносного сосуда, но и с клетками крови. В этой связи представляло интерес охарактеризовать продукцию цитокинов лейкоцитами при различных взаимодействиях с ВПГ-1: при инфекции вирусом и при индукции, как вирусом, так и вирусинфицированными лейкоцитами, а

также сравнить с цитокинами, продуцируемыми лейкоцитами при индукции вирусинфицированными ЭК. Результаты этой части работы представлены в сводной таблице 2.

Таблица 2. Продукция интерферонов и цитокинов лейкоцитами крови при различных типах их взаимодействия с ВПГ-1.

Тип взаимодействия лейкоцитов с ВПГ-1 Интерфероны Цитокины

ИФНа ИФНу ИЛ-Iß ИЛ-4 ИЛ-6 ИЛ-8 ФНОа

Инфекция ВПГ-1 1 1 i t

Индукция ВПГ-1 Т t т т t

Индукция лейкоцитами, инфицированными ВПГ-1 т ? т т t

Индукция ЭК, инфицированными ВПГ-1 т t т т н.о. Т

Обозначения: Т- увеличение продукции; снижение продукции; <->-без изменений; — отсутствие продукции; и.о. - не определялся

Как было показано ранее и подтверждено в данном исследовании, при первичном инфицировании человека ВПГ-1 или же при реактивации этого вируса из латентного состояния, возможно попадание его в кровоток и инфицирование лейкоцитоз крови [Баринский И.Ф., Шубладзе А.К., 1986,1980; Larcher С. et al., 2001; Mendez-Samperio P. et al., 2000; Rinaldo C.R. et al., 1978]. Инфицирование лейкоцитов ВПГ-1 возможно только при предварительной активации их митогенами. В экспериментах in vitro лейкоциты крови были инфицированы ВПГ-1 при МИ 1.0 и 0.1. При этом вирус репродуцировался в лейкоцитах, выделялся в культуральную среду и накапливался в ней до максимальных показателей ко 2-3 дню культивирования. Инфекция лейкоцитов сопровождалась ингибицией спонтанно вырабатываемых ИФНу, ИЛ-6 и ИЛ-8. ИЛ-6 так же, как и ИФНу являются факторами резистентности при инфекции ВПГ-1 [Minami M. et al., 2002; Sainz B.Jr. et al., 2002;

Paludan S.R., 2001], ИЛ-8 - хемотаксическим цитокином [Фрейдлин И.С., 2001; Ковальчук Л.В., 2000]. В связи с этим, подавление продукции ИФНу, ИЛ-6 и ИЛ-8 лейкоцитами, инфицированными ВПГ-1, а так же отсутствие продукции клетками крови ИФНа и других цитокинов, обеспечивающих реализацию клеточного и гуморального звеньев иммунитета, можно рассматривать как результат действия ВПГ-1, направленного на подавление антивирусных клеточных механизмов с целью избежать давления иммунитета хозяина и сохранить свой репродуктивный потенциал.

Лейкоциты крови, индуцированные ВПГ-1, секретировали медиаторы с антивирусной, иммуномодулирующей и провоспалительной направленностью: ИФНа, ИФНу, ИЛ-Iß, ИЛ-6, ФНОа, но не и ИЛ-4, что отражает, по-видимому, первичную защитную реакцию на попадание инфекционного агента [Сухих Г.Т. и др., 1997; Minami M. et al., 2002; Sainz B.Jr. et al., 2002; Larcher С. et al., 2001; Keadle T.L. et al., 2000r Beifke V.A., 1989; Linnavuori K. et al., 1983;]. Отсутствие выработки ИЛ-4 указывает, что на первых этапах инфекционного процесса организм продуцирует фактор, связанный с развитием гуморального иммунитета.

В настоящее время нет однозначной информации, касающейся инфицированности популяций лейкоцитов крови ВПГ-1 в организме человека. Так, по одним данным при инфекции ВПГ-1 in vitro на долю инфицированных клеток крови приходится 80% моноцитов, 20% Т-клеток и 30% В-клеток [Larcher С, 2001], хотя по другой информации только 5% лейкоцитов крови человека могут быть инфицированы ВПГ-1 [Capobianchi M.R. et al., 1985]. Следовательно, в крови сохраняется значительная неинфицированная популяция лейкоцитов, способная реагировать на соседние инфицированные вирусом клетки. В данной работе была показана способность лейкоцитов, инфицированных ВПГ-1, индуцировать в аутологичных лейкоцитах продукцию ИФНа, ИФНу, ИЛ-Iß, ИЛ-6 и ФНОа, но не ИЛ-4. При использовании для индукции лейкоцитов, инфицированных и затем фиксированных глутаровым альдегидом, были получены аналогичные результаты. Отличие заключалось в отсутствии продукции Возможно, количества

антигена, экспрессируемого инфицированными и фиксированными лейкоцитами, недостаточно для индукции ИФНа в интактных лейкоцитах. По-видимому, продуцируемый инфицированными, но не фиксированными лейкоцитами вирус накапливается в культуральной среде и при совместном культивировании с интактными лейкоцитами индуцирует в них продукцию ИФНа.

Полученные результаты также дают основание предположить достаточность мембранного взаимодействия лейкоцитов с вирусспецифическими антигенами на поверхности инфицированных лейкоцитов для запуска процесса выработки цитокинов.

Таким образом, индукция интактных лейкоцитов как В П М , так и лейкоцитами и ЭК, инфицированными ВПГ-1, приводит к продукции схожего спектра интерферонов и цитокинов, тогда как инфекция лейкоцитов ВПГ-1 приводит к снижению продукции цитокинов, обладающих антивирусной активностью.

Из представленных данных можно заключить, что ВПГ-1 проявляет разные эффекты в лейкоцитах крови. Это - индукция интерферонов и цитокинов вирусом -первая защитная реакция хозяина, далее - подавление антивирусных механизмов хозяина при инфекции лейкоцитов для ускользания от давления иммунитета хозяина и затем, при контакте с инфицированными лейкоцитами, повторная продукция интерферонов и цитокинов, как более поздняя защитная реакция организма на инфицированные вирусом клетки. Результат этих взаимодействий зависит, по-видимому, от соотношения всех составляющих описанных процессов и может отражать этапы патогенеза герпетической инфекции.

ВЫВОДЫ

1. Впервые разработана экспериментальная модель со-культивирования эндотелиальных клеток с гладкомышечными клетками интимы кровеносного сосуда и лейкоцитами периферической крови человека, позволяющая исследовать механизмы патогенеза герпетической и других вирусных инфекций.

2. Выявлено, что культуры ЭК, полученные от разных доноров, а также клеточные популяции, полученные методом клонирования из отдельных родоначальных колониеобразующих эндотелиальных клеток, характеризуются функциональной гетерогенностью, связанной с избирательной способностью поддерживать репродукцию ВПГ-1, что в дальнейшем может определять топографию и локальность патологического процесса.

3. Показано, что развитие инфекции эндотелиальных клеток ВПГ-1 сопровождается умеренной продукцией провоспалительных цитокинов и увеличением поверхностной экспрессии Р- и Е-селектинов, что приводит к усиленной адгезии лейкоцитов периферической крови на инфицированные ЭК.

4. Установлено, что лейкоциты периферической крови доноров в результате контакта с эндотелиальными клетками, инфицированными ВПГ-1, активируются и продуцируют интерфероны и цитокины

которые тормозят репродукцию ВПГ-1 и увеличивают экспрессию молекул клеточной адгезии на эндотелиальных клетках. Полученные результаты отражают этапы, формирования порочного круга воспаления в сосудистой стенке.

5. Впервые в экспериментах in vitro доказано, что гладкомышечные клетки интимы сосуда обладают способностью тормозить, а в отдельных случаях ингибировать репродукцию ВПГ-1 в эндотелиальных клетках в условиях со-культивирования.

6. Сравнительный анализ цитокинов, продуцируемых лейкоцитами крови при различных типах взаимодействия с ВПГ-1 показал, что индукция лейкоцитов как ВПГ-1, так и лейкоцитами или эндотелиальными клетками, инфицированными ВПГ-1, приводит к секреции схожего спектра интерферонов и цитокинов, обладающих провоспалительной и противовирусной активностью. Напротив, инфекция лейкоцитов .вирусом сопровождается угнетением продукции противовирусных цитокинов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Scheglovitova O.N., Samojlenko O.V., Maksianina E.V., Romanov Yu.A. Smooth muscle cells of human vessels set up latent HSV-1 infection in human endothelial cells. Role of soluble factors. J. Interferon & Cytokine Res., 1999, v.1, p.59.

2. Scheglovitova O.N., Samojlenko O.V., Maksianina E.V., Romanov Yu.A., Kabaeva N.V. The effect of smooth muscle cells and leukocytes on HSV-1 reproduction in cultured human endothelial cells. Russian J. Immunol., 2000, v.2, p.134-139.

3. Щегловитова О.Н., Максянина Е.В., Романов Ю.А., Растегаева И.Н., Ковальчук Л.В., Гонковская Л.В. Регуляция цитокинами репродукции ВПГ-1 в эндотелии сосудов in vitro и в организме больных. Аллергол. и Иммунол., 2000, том 1, №2, стр.131 (№335).

4. Scheglovitova O.N., Maksianina E.V., Samojlenko O.V., Romanov Yu.A., Kabaeva N.V. HSV-1 reproduction in cultured human endothelial cells. The effect of environment cell produced factors. Eur. Cytokine Network, 2000, v.5, № 11 (special issue), p.183.

5. Щегловитова О.Н., Максянина Е.В., Паршина О.В., Гусева Т.С., Ершов Ф.И. Продукция цитокинов лейкоцитами крови доноров. Вопросы вирусологии, 2001, №6, стр. 36-38.

6. Scheglovitova O.N., Maksianina E.V., Romanov YuA, Kabaeva N.V., Pronin A.G. Herpes simplex type 1 virus infection of cultured human vascular endothelial cells: expression of cell adhesion molecules and induction of interferon and cytokine production by mononuclear cells. Russian J. Immunol., 2001, v.4, p.367-376.

7. Scheglovitova O.N., Maksianina E.V., Romanov Yu.A., Svintsitskaya V.A., Pronin A.G. Herpes simplex type 1 virus infected human vascular endothelial cells induce the production of anti-viral and proinflammatory factors by peripheral blood leukocytes in vitro. Russian J. Immunol., 2002, v.7 (2), p.115-122.

Типография ООО «Телер» 127299 Москва, ул. Космонавта Волкова, 12 Лицензия на полиграфическую деятельность ПД № 00595

Подписано в печать 08.01.2004 г. Формат 60x90 1/16. Тираж 70 экз. Бумага «Снегурочка» 1,0 л. Заказ № 8