Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуномодулирующее и противовоспалительное действие аутологичных, лекарственно индуцированных клеток-регуляторов и оценка клинической эффективности экстракорпоральной иммунофармакотерапии у больных бронхиальной астмой

Г

и

Но права;-" рук.

СНИМЩИКОВА Ирина Анатольевна

ИМЫ.У НОМ ОДУ ЛИР У ЮЩЕЕ И ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ АУТОЛОГЙЧНЫХ, ЛЕКАРСТВЕННО ИНДУЦИРОВАННЫХ КЛЕТОК-РЕГУЛЯТОРОВ И ОЦЕНКА КЛИНИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОЙ ИММУ-Н О Ф А Р М А К' С ТЕРАПИИ У БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ.

] 4. 00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицински/, кяук

КУРСК - 1996

Работа выполнена в Курском государственном медицинском университете

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор С. М. Юдина

Официальные опоненты: доктор медицинских наук, профессор Ю.А. Блинков кандидат медицинских наук а.н. Манжосов

Ведущее учреждение: Российский государственный медицинский университет

Защита состоится ""¿V "рг^ф&и^ 199&Т. в

часов на заседании диссертационного Совета К 084.57.01 при Курском государственном медицинском университете (305033, г. Курск, ул. К. Маркса, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КГМУ. Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат медицинских наук, доцент IШлГ В. В. Новиков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Новый подход к иммунокорригирую-щей терапии,основанный на введении в организм аутологичных клеток, активированных in vitro лекарственными препаратами -йммуномодуляторами, названный экстракорпоральной иммунофар-макотерапией (ЭИФТ), занял важное место в комплексном лечении различных иммунопатологических состояний (Лесков В.П. и др., 1994; Писарев В. М., 1995; Юдина С. М., 1995).

Показана высокая клиническая эффективность ЭИФТ при тяжелом атопическом синдроме, бронхиальной астме, гнойно-септических процессах, обширной термической травме, осложненной ожоговой болезнью (Прозоровский Н. С. и др., 1991; Латышева Т. В., 1991; Курбачева О.М. и др., 1992; Юдина С. М. , 1995).

В связи с этим, очевидна необходимость дальнейшего поиска новых препаратов для индукции клеток-регуляторов иммунных реакций, изучения их иммунокорригирующего и противовоспалительного действия при заболеваниях, в патогенезе которых иммунопатологические механизмы имеют решающее значение.

Известно, что целый ряд заболеваний характеризуется исходно низким уровнем циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), а эффекты многих лекарственных препаратов связаны с их действием на обмен в клетках циклических нуклеотидов, опосредующих активацию, пролиферацию клеток, регуляторное влияние гормонов и медиаторов иммунного ответа (Жихарев С.С., 1932; Ляшенко В.Я. и др.. 1988; Пальцев И.А. и др., 1995).

Это обосновывает актуальность дальнейшего изучения механизмов ЭИФТ и, в частности, свойств клеток-регуляторов, индуцированных препаратами, влияющими на обмен циклических нуклеотидов в клетке .

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью работы явилось изучение иммуномодулирующей и противовоспалительной активности аутологичных клеток-регуляторов, индуцированных in vitro лекарственными препаратами, влияющими на соотношение цикличес-

ких нуклеотидов в клетке, а также оценка клинической эффективности ЭИФТ с простеноном и эуфиллином у больных бронхиальной астмой.

В соответствии с целью работы решались следующие задачи.

1. Изучить влияние аутологичных клеток-регуляторов,индуцированных простеноном, адреналином, эуфиллином, тренталом, на продукцию фактора некроза опухоли (ФНО) и функциональную активность нейтрофилов (продукцию лизосомальных ферментов, цитотоксичность).

2. Изучить влияние клеток-регуляторов, обработанных указанными препаратами, на экспрессию мембраноассоциированных иммунорегуляторных структур CD4, CD8, CD25, CDllb, HLA-DR.

3. Оценить клиническую эффективность ЭИФТ с простеноном и эуфиллином у больных инфекционно-зависимой и атопической формой бронхиальной астмы.

4. Изучить значение иммунологических показателей в оценке эффективности ЭИФТ с простеноном и эуфиллином у больных бронхиальной астмой.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые изучено влияние клеток-регуляторов, индуцированных препаратами, влияющими на соотношение циклических нуклеотидов в клетке (простенон, адреналин, эу-филлин, трентал) на продукцию ФНО мононуклеарами периферической крови доноров.

Впервые установлено,что клетки-регуляторы, обработанные указанными препаратами, в ранние сроки после активации продуцируют растворимые факторы, оказывающие дозозависимый эффект на ингибицию продукции ФНО МНК и нейтрофилами.

Впервые показано влияние клеток-регуляторов, активированных вышеперечисленными препаратами, на изменение фенотипа клеточной поверхности, выражающееся в снижении CD4 и HLA-DR+ клеток, ингибиции экспрессии рецептора Ил-2 (CD25), повышении CD8 положительных лимфоцитов.

Впервые установлено влияние клеток-регуляторов, индуцированных указанными препаратами на функциональную активность нейтрофилов - продукцию лизосомальных ферментов (миелоперок-сидазы, b-глюкуронидазы) , цитотоксичность и экспрессию молекул адгезии.

Впервые показана клиническая эффективность ЭИФТ с прос-

теноном и эуфиллином при инфекционно-зависимой и атопическоГ: Форме бронхиальной астмы.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

1. Экспериментально обоснована возмимюсть использование клеток-регуляторов, индуцированных препаратами, влияющими на соотношение циклических нуклеотидов в клетке (простенон, адреналин, эуфиллин, трентал) при аллергических и аутоиммунных заболеваниях, в патогенезе которых дисбалланс цАМФ/цГМФ имеет важное значение.

2. При неэффективности традиционной терапии инфекционно-зависимой и атопической формы бронхиальной астмы, прогрессирующего течения, стероидозависимости, рекомендуется применение в комплексном лечении ЭИФТ с простеноном.

3. В случаях снижения чувствительности к эуфиллину и непереносимости препарата у больных бронхиальной астмой, рекомендуется метод ЭИФТ с обработкой аутологичных клеток эуфиллином.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Клетки-регуляторы, индуцированные лекарственными препаратами, влияющими на соотношение циклических нуклеотидов б клетке (простенон, адреналин, эуфиллин, трентал), ингибируют продукцию ФНО мононуклеарами периферической крови доноров (ИНК), опосредуемую растворимыми факторами, высвобождаемыми в ранние сроки после активации препаратами и оказывающими дозозависимый эффект на продукцию ФНО МНК.

2. Обработка клеток-регуляторов in vitro указанными препаратам!! приводит к изменению фенотипа клеточной поверхности аутологичнкх лимфоцитов, а именно, снижении CD1 п HLA-PR-клеток. повышению CD8-» лимфоцитов. ингибивдш экспрессии ре цепторов Ил-2 (CD25).

3. Клетки-регуляторы, индуцированные данными препаратами, подавляют провоспалительный потенциал нейтрофилов: уменьшают продукцию лизосомальных ферментов, цитотоксическук активность по отношению к эмбриональным фибробластам человека и экспрессию адгезивных молекул.

4. Введение клеток-регуляторов, обработанных in vitre простеноном и эуфиллином, больным бронхиальной астмой, рефрактерным к базисной терапии, сопровождается быстрым и стой-

ким купированием бронхообструктивного синдрома, коррелирующим с патогенетически значимым снижением эозинофилов в пери-феричской крови, СБ4 и НЬЛ-БИ-»- клеток, увеличением С08+ лимфоцитов, восстановлением иммунорегуляторного индекса.

ВНЕДРЕНИЕ. Метод ЭИФТ с простеноном и эуфиллином у больных бронхиальной астмой внедрен в практику лечебной работы пульмонологического и аллергологического отделений областной клинической больницы г. Курска.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения работы доложены на II. III Российских Национальных конгрессах "Человек и лекарство" (г. Москва, 1995, 1996), ii Международном конгрессе по иммунореабилитации (Анталия, 1996), У1 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Новосибирск, 1996), совместной научной конференции кафедр клинической иммунологии и аллергологии и внутренних болезней ФПО (Курск, 1996).

ПУБЛИКАЦИЙ. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 рисунками и 8 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных данных (4 главы), заключения, выводов, практических рекомендаций, а также библиографического указателя, включающего 103 отечественных и 114 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Метод ЭИФТ с простеноном и эуфиллином применен нами в комплексном лечении 22 больных бронхиальной астмой.

Процедуру выделения и обработки клеток препаратом, в отличие от оригинальной методики (Гущин И.С.. Лесков В.П. п соавт., 1986), осуществляли в модификации, описанной Юдиной С. II с соавт., 1995, обработку клеток-регуляторов простеноном (1000 нг/мл) и эуфиллином (100 мкг/мл) проводили в течении одного часа с последующей реинфузией больному.

Всем пациентам проводили 2-4 сеанса ЭИФТ с интервалом в 2-4 дня. Всего проведено 68 процедур ЭИФТ.

Контрольную группу составили 20 больных инфекционно-за-висимой и атонической формой бронхиальной астмы, сопоставимых по полу, возрасту и тяжести течения заболевания.

В экспериментальной части работы использовали мононукле-арные клетки периферической крови, полученной из локтевой вены здоровых доноров и выделенные с помощью одноступенчатого градиента плотности фиколл-верографина (Дж. Клаус, 1990).

Нейтрофильные гранулоциты (НФ) выделяли, используя двойной градиент плотности фиколл-верографина (Фримель Г., 1987).

Исследования выполнены на материале, полученном от 65 здоровых доноров.

Продукцию ФНО в надосадочной жидкости (HI) МНК периферической крови доноров оценивали по методу (Лешин А.А., 1994) с использованием чувствительной к ФНО линии фибробластов L-929. В качестве индуктора продукции ФНО использовали липо-полисахарид (ЛПС) Е. coli ("Calbiochem", США ) в концентрации 5 мкг/мл.

Для определения продукции лизосомальных ферментов (b-глюкуронкдазы и миелопероксидазы) нейтрофилами, выделенные и ресуспендированные в полной питательной среде RPMI-1640 в концентрации 2 млн/мл НФ помещали в лунки 96-лу-ночных планшетов ("Linbro", Flow). В качестве стимуляторов нейтрофилов использовали BaS04 (3 мг/мл) (Россия) и рФНО (1000 пг/мл) (Респ. Беларусь). После проведения манипуляций, предусмотренных экспериментом, в НЖ нейтрофилов определяли активность миелопероксидазы, b-глюкуронидазы (Фримель Г., 1987; Федосеева В.Н. и др., 1993). Реакцию оценивали по интенсивности окрашивания содержимого лунок путем измерения оптической плотности при длине волны 410 нм, используя аппарат "АИФ-С".

Для определения цитотоксической активности нейтрофилов, выделенные НФ в концентрации 2'млн/мл вносили в лунки 96-лу-ночных планшетов. По окончании'манипуляций, предусмотренных экспериментом, НФ добавляли в культуру эмбриональных фибробластов человека, помещенную в лунки 24-луночных планшетов. Инкубацию осуществляли при 37°С в атмосфере 5л С02 в течение 24 часов. После окончания инкубации планшеты центрифугировали в течение 10 мин. при 2000 об./мин., отбирали Нй,

глотки трижды отмьшапи средой, удаляя погибшие клетки. В лунки к отмытым клеткам добавляли 0,01 % кристаллического Фиолетового в этаноле и окрашивали в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего измеряли количество связавшегося с клетками красителя спектрофотометрически на приборе "АИФ-С" при длине волны 620 нм.

Экспрессию мембранассоциированных иммунорегуляторных структур ЛФ и НФ, а также изменение субпопуляционного состава мнк и НФ в эксперименте определяли непрямым иммуноперок-сидазным методом с использованием моноклональных антител серии ИКО ("Диагнотех", Москва) против антигенов CD4. CD8, CDllb, CD25, HLA-DR (Барышников А. Ю. ,1990).

С целью индукции клеток-регуляторов (KP), МНК здоровых доноров обрабатывали препаратами: простенон (Эстония), адреналин, эуфиллин (Россия), трентал (Hoechst, Германия) в бессывороточной среде RPMI-1640 в течение 1 часа при 3?С в атмосфере 5% С02. По окончании инкубации клетки трижды отмывали от препарата и вносили в конечной концентрации 10% в культуру аутологичных МНК или НФ, ресуспендированных в полной питательной среде RPMI-1640.

Инкубацию клеток-регуляторов с НФ осуществляли'в течение 1,5 часов, после чего определяли функциональную активность НФ. В качестве контроля использовали МНК или НФ с добавлением клеток, необработанных препаратами.

Все общеклинические методы выполняли на базе клинической лаборатории областной клинической больницы г. Курска с использованием биохимического анализатора "Impact-ЗОО" и реактивов фирмы "Orion" (Финляндия).

Оценку иммунного статуса больных проводили в иммунологической лаборатории областной клинической больницы г. Курска с использованием реактивов фирмы "Реакомплекс" (г. Чита).

Субпопуляционный состав МНК исследовали с помощью моноклональных антител "серии ИКО ("Диагнотех", г. Москва) против антигенов CD4, CD8, CDllb, CD25, HLA-DR иммунопероксидазным методом (Барышников А.Ю., 1990).

Исследование функции внешнего дыхания выполнялось на аппарате " Путест-2" (Венгрия) ассистентом кафедры внутренних болезней <Ш0 КГМУ Барбашиной Т. А. и на базе отделения функ-

циональной диагностики ОКБ.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с учетом формы распределения изучаемого показателя, используя параметрический критерий Ь Стьюдента, и методы независимые от распределения (Гублер Е.В., 1978) с помощью прикладных программ на компьютере 1ВМ РС АТ.

Выраженность клинических симптомов бронхиальной астмы шкалировали в соответствии с известными критериями. Степень тяжести заболевания определяли по сумме шести симптомов (приступы удушья, одышка, кашель, хрипы в легких, число дыханий , пульса в минуту), оценивая каждый симптом в 4-х балльной системе (Гублер Е. В. и др., 1978; МарчукГ.И., 1989). Данный прием применяли до процедуры ЭИФТ, после 1, 2, 3 сеансов , что позволило не только разделить больных на группы по степени выраженности клинических симптомов, но и оценить эффективность ЭИФТ в динамике, в зависимости от конкретной клинической ситуации.

Математическая и статистическая обработка экспериментального и клинического материала была проведена при консультации акад. МАНЭБ, д. м. н. Ахмедзянова Л.М. (КГМУ, г. Курск).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Для решения задач данного исследования проведены эксперименты по изучению влияния клеток-регуляторов, индуцированных простеноном, адреналином, эуфиллином. тренталом на некоторые механизмы воспалительных реакций, а именно, продукт:.-: ФНО, функциональную активност£\НФ (продукцию лизосомальных Ферментов, цитотоксическую активность по отношению к эмбриональным фибробластам человека), экспрессию мембранассоцииро-ванных иммунорег'уляторных структур.

Продукцию ФНО МНК определяли,- используя ФНО-чувствитель- . ную линию клеток Ь-929. С целью индукции клеток-регуляторов, МНК здоровых доноров обрабатывали одним из изучаемых препаратов в бессывороточной среде НРМ1-1640 в течение I часа при ЗТ С в атмосфере 5% С02 . Инкубацию клеток-регуляторов с МНК проводили в течение 2 часов . после чего в культуры вносили

ЛИС и через 12 часов оценивали содержание ФИО в надосадочной жидкости МНК в биологическом тесте.

что

300 200

100 О

Контроль 10 100 1000 ... ...

Рис. 1. Влияние клеток-регуляторов, индуцированных адреналином (1) и простеноном (2) (нг/мл), эуфиллином (3) и тренталом (4) (мкг/мл) на продукцию ФНО МНК.

Примечание: по оси абсцисс - концентрация препаратов, использованная для индукции клеток-регуляторов; контроль -внесены клетки, необработанные препаратом; по оси ординат -оптическая плотность при 620 нм. Минимальным значениям оптической плотности соответствуют максимальные уровни цитокина в образце.

тайных простеноном (в дозах 10, 100, 1000 нг/мл), адреналином (10,100 нг/мл), эуфиллином и тренталом (10,100,1000 мкг/ мл) приводит к дозозависимой ингибиции продукции ФНО МНК.

Полагая, что действие клеток-регуляторов, индуцированных изучаемыми препаратами, на продукцию ФНО МНК опосредуется растворимыми факторами, НЖ аутологичных клеток, активированных in vitro простеноном. адреналином, эуфиллином, тренталом в установленных концентрациях, вносили в культуры МНК и через 12 часов оценивали содержание ФНО в супернатантах в биологическом тесте.

Эксперименты показали, что в ранние сроки после дозозависимой активации препаратами, в НЖ жидкости клеток-регуля-

Результаты проведенных экспериментов (рис.1) показали, внесение в культуры МНК 10% аутологичных клеток, обрабо-

торов появляются растворимые факторы, ингибирующие ии-душт ФИО mi IK.

Таким образом, результатами исследований установлена способность препаратов,влияющих на соотношение циклических нуклеотидов в клетках, индуцировать при экстракорпоральной обработке МНК доноров, клетки-регуляторы, ингибирующие продукцию одного из основных медиаторов воспаления - ФНО.

Как известно, в опосредовании эффектов клеток-регуляторов, индуцированных препаратами, важное значение имеют межклеточные взаимодействия, с участием вспомогательных молекул (CD2, CD4, CD8, HLA-DR и др.), тесная ассоциация которых на клеточной мембране с отдельными цепями рецептора интерлейки-на-2 обосновывает реальную возможность модуляции функциональной активности цитокинов и их последующей продукции (Юдина С. М., 1995; Писарев В. М., 1995).

В связи с этим изучалось влияние клеток-регуляторов, индуцированных вышеперечисленными препаратами на экспрессию CD4, CD8, CD25 и HLA-DR рецепторов ЛФ,показавшее выраженное снижение экспрессии CD4 и HLA-DR. Причем, снижение экспрессии CD4 и HLA-DR на ЛФ зависело от дозы препарата и наиболее было выражено при концентрации нростенона 1000. 10 ООО нг/мл; адреналина - 1000 нг/мл; эуфиллина и трентала - 100, 1000 мкг/мл.

Такой же дозозависимый эффект при обработке аутологичных лимфоцитов наблюдался и в отношении CD8+ клеток, а именно, простенон и адреналин во всех вышеуказанных дозах, эуфиллин, трентал в дозах 10, 50, 100 мкг/мл приводили к индукции клеток-регуляторов, повышающих количество CD8' ЛФ; »спол-.-;ос.а-ние эуфиллина, трентала в концентрации 1000 мкг/мл приводило к обратному эффекту.

Обработка мононуклеаров простеноном, эуфиллином и адреналином сопровождалась ингибицией экспрессии рецептора к ИЛ-2 (CD25) во всех используемых концентрациях, за исключением трентала, который достоверный эффект оказывал только в дозе 1000 мкг/мл.

Таким образом, индукция клеток-регуляторов вышеуказанными препаратами с последующим внесением их в количестве 10/ в культуру аутологичных МНК модулирует экспрессию лимфоцитами

CD4, CD8, CD25, HLA-DR, имеющих важное значение во взаимодействии иммунокомпетентных клеток.

В настоящее время установлено, что в развитии воспаления значительная роль принадлежит НФ, обладающим большим деструктивным потенциалом, обусловленным гиперпродукцией лизосо-мальных ферментов, биооксидантов, цитокинов (ФНО, ИЛ-1, ИЛ-6 и др.), приводящих к повреждению эндотелия сосудов, расстройствам микроциркуляции, деструкции матрикса соединительной ткани, потенцирующих эффекторные свойства МНК (Маянский А. Н., Пику за 0. И., 1993; G. Games Е., 1992; HaczKu A. et al., 1994).

Учитывая это, а также влияние на активность НФ препаратов, повышающих уровень циклического аденозинмонофосфата в клетках (Ялкут С.И. и др., 1989; Базилевич Н.В. и др., 1992), представляло интерес выяснить влияние клеток-регуляторов, индуцированных простеноном, адреналином в дозах 10, 100, 1000 нг/мл; эуфиллином и тренталом - 10, 100, 1000 мкг/мл на функциональную активность нейтрофилов.

Установили.что обработка МНК указанными препаратами в изучаемых концентрациях, приводила к появлению у них способности ингибировать спонтанную и стимулированную продукцию миелопероксидазы и b-глюкуронидазы НФ. как это представлено в отношении препарата "простенон"(рис. 2,3).

Аналогичная зависимость наблюдается и при использовании адреналина.эуфиллина, трентала. Максимальный эффект был отмечен для простенона и адреналина в дозе 1000 нг/мл, эуфиллина и трентала - 1000 мкг/мл. Выявленные свойства клеток-регуляторов, обработанных вышеперечисленными препаратами, вероятно обусловлены ингибицией продукции ФНО, индуцирующего дегрануляцию НФ и высвобождение лизосомальных ферментов (Потапнев М.П., Печковский , 1994).

Установлена также способность клеток-регуляторов, индуцированных простеноном, ингибировать экспрессию НФ рецепторов к СЗЬ фрагменту комплемента (CDUb), которая согласно данным литературы (Маянский А.Н. и др., 1993; Ogle Games D. et al., 1992), коррелирует с их адгезивной способностью.

Учитывая данные литературы о способности препаратов, повышающих уровень цАМФ в клетках, уменьшать цитотоксический

—I-1----—

Контроль 10 100 1000

Рис. 2. Изучение спонтанной (1) и стимулированной BaS04

(2) и рФНО (3) продукции b-глюкуронидазы НФ в присутствии клеток-регуляторов, индуцированных простеноном.

Примечание: здесь и на рис. 3, по оси абсцисс - концентрация простенона, использованная для индукции клеток-регуляторов (нг/мл), контроль - внесены клетки, необработанные препаратом; по оси ординат - оптическая плотность при 410 нм.

250 200 150 100

50 О

Рис. 3. Изучение спонтанной (1) и стимулированной ВаБ04 (2) и рФНО (3) продукции миелопероксидазы НФ в присутствии клеток-регуляторов, индуцированных простеноном.

-г——'-1-1-'-1-1—1—г

Контроль 10 100 Ю00

потенциал НФ (У. Пол,' 1989) представляло интерес изучить г.-лиянип клеток-регуляторов, индуцированных изучаемыми препаратами, на цитотоксичность НФ . Для решения данного вопроса цитотоксическую активность НФ в присутствии клеток-регуляторов, индуцированных указанными препаратами, исследовали по отношению к эмбриональным фибробластам человека и оценивали через 24 часа инкубации с ними. 500

400

300

200

100

О

Контроль-1 10 ' 100 1000 Контроль-2

Рис. 4. Изучение цитотоксичности нейтрофилов периферической крови в присутствии клеток-регуляторов, индуцированных адреналином (1) и простеноном (2) (нг/мл), эуфиллином (3) и тренталом (4) (мкг/мл).

Примечание: по оси абсцисс - концентрация препарата, использованная для индукции клеток-регуляторов; контроль 1 -внесены клетки, необработанные препаратом, контроль 2 - внесены только нейтрофилы; по осп ординат - оптическая плотность при 620 нм.

Как видно из представленных результатов (рис. 4), внесение клеток-регуляторов, обработанных изучаемыми препаратами, в культуру аутологичных НФ приводит к дозозависимой ингиби-ции их цитотоксичности, что свидетельствует о возможном снижении их деструктивного потенциала.

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что клетки-регуляторы, индуцированные препаратами, повышающими уровень цАМФ (простеноном,адреналином, эуфиллином, трента-

2

4

лом), оказывают выраженное влияние на ключевые механизмы воспалительных реакций (продукцию ФНО, экспрессию мембрано-ассоциированных иммунорегуляторных структур, функциональную активность НФ), выступая в роли клеток-ингибиторов иммунных реакций и продукции медиаторов воспаления.

Эти данные позволили предположить, что соотношение циклических нуклеотидов в клетках, нарушенное при ряде воспалительных заболеваний, можно корригировать экстракорпоральной иммунофармакотерапией.

РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИЧЕСКИХ НАБЛЮДЕНИЙ.

Клиническая эффективность ЭИФТ с простеноном и эуфиллином у больных бронхиальной астмой.

Как известно, в патогенезе бронхиальной астмы важную роль имеют механизмы неспецифического воспаления слизистой бронхов (Beasley R. etal., 1989; Kay А. В., 1991; Gauldie G. et al., 1993). В поддержании воспалительного процесса в слизистой бронхов принимают участие активированные Т - лимфоциты и эозинофилы (Кау А.В., 1991; Del.prete G., 1992; Romag-nanl S., 1993;),повышенная адгезия и миграция гранулоцитов в слизистую (Coldits G. et al., 1984; Montefort S. et al., 1993; Broide D.A., 1994), а также гиперпродукция фактора некроза опухоли, способствующего экспрессии молекул адгезии на эндотелиальных клетках (Gamble G.R. et- al., 1985; Cavan-der D. etal., 1987; Broide D.A., 1994).

Учитывая данные литературы о том,что при ряде иммунопатологических состояний (бронхиальная астма, атонический дерматит и др.) отмечается низкий уровень цАО, а регуляторное влияние гормонов и медиаторов в иммунном ответе опосредуется циклическими нуклеотидами (Жихарев ,1982; Ляшенко В. А. , 1988; Федоров Н.А. с соавт., 1990; Prigent А., 1990), мы использовали для обработки клеток-регуляторов препараты, влияющие на соотношение цАМФ/цГМФ в клетках, - простенон (Эстония) и эуфиллин (Россия).

Вышеприведенными экспериментами было показано, что обработка МНК простеноном и эуфиллином приводила к дозозависимой активации клеток, подавляющих продукцию ФНО МНК, лизосомаль-

ных ферментов НФ, уменьшающих цитотоксическую активность последних. Установлено также, что внесение клеток-регуляторов, индуцированных простеноном и эуфиллином, в культуру ау-тологичных. Кон А стимулированных МНК, сопровождается изменением фенотипа клеточной поверхности ЛФ, выражающемся в снижении СБ4 и НЬА-БК+ клеток, повышении СБ8+ ЛФ, ингибиции экспрессии С025.

Учитывая это, мы применили ЭИФТ с обработкой клеток простеноном и эуфиллином у 22 больных инфекционно-зависимой и атопической формой бронхиальной астмы, средний возраст которых составил 36, 3+3,32 года (17 женщин и 5 мужчин).

Контрольную группу составили 20 больных инфекционно-зависимой и атопической формой бронхиальной астмы, средний возраст которых был 37,2±4,5 (женщин - 14, мужчин - 6), которым проводилась базисная терапия, включавшая ГКС системного и местного действия, препараты кромолинового ряда, ксан-тиновые производные, симпатомиметики.

Оценка клинической эффективности базисной терапии у больных контрольной группы, а также динамика иммунологических показателей приведена в табл.1.

ЭИФТ с обработкой аутологичных клеток простеноном применена в комплексном лечении 15 больных бронхиальной астмой (средний возраст - 34,б±2,6; 12 женщин и 3 мужчин). У всех больных в анамнезе отмечался хронический бронхит, у 12 - эмфизема легких и диффузный пневмосклероз. Все больные ранее лечились ГКС системного и местного действия. Показаниями к назначению ЭИФТ с простеноном являлись: прогрессирующее течение заболевания, отсутствие стойкой ремиссии, неэффективность предшествующей базисной терапии, в ряде случаев - стё-роидозависимость. Курс ЭИФТ состоял из 2-4 процедур с интервалом в 2-4 дня и проводился на фоне базисной терапии.

Оценку клинической эффективности ЭИФТ проводили по сумме баллов (см. Материалы и методы). Эффект"ШФТ'свдтали отличным при полном купировании приступов удушья, исчезновении одышки, кашля, хрипов в легких, нормализации частоты дыхания и пульса; хорошим - при прекращении приступов удушья, одышки только при ходьбе, редкого кашля, единичных хрипов в легких, нормализации числа дыханий и пульса; удовлетворительным -

Таблица 1. Оценка эффективности ЭИФТ у больных бронхиальной астмой.

Проводимая терапия

Контрольная группа больных

п=20

Больные с применением I Больные с применением ЭИФТ с простеноном IЭИФТ с зуфиллином n=15 I п=7

I Показатели

До лечения

После лечения

До лечения

После ЭИФТ

До лечения

После ЭИФТ

II. Клиническая эф-I фективность по

! сумме баллов

III. Показатели i ФВД

I VC

I FVC

I FEV1

I Индекс Тиффно

i fmf

i III.Иммунологичес-

! кие показатели I

I CD4 I

I CD8

; CD25

1 HLA-DR

I ИРИ

13,96*0,58

2, 56*0, 26 2, 46 '-О, 29 1, 44±0, 17 54,99*2,70

1,33*0,17

41,00=1,56 7, 90 ь-0, 82

41, 20-1, 32 5, 19-0,15

4,39-0,38*

2,58-0,19 2,33-0, 17 1,55-0, 18

64,81-4,26 * *

1,55-0,19

39,50-2,45 8,20±0,49

37,80=0,53 4,90=0,29

14,17±0,65

2,56*0,30 2, 47*0, 29 1, 60±0, 20 62,30*3,61

1, 39*0, 28

45,00*2,20 7.33*0,87

42,00±1,47 6,12±0, 83

0,8*0,18** Il4, 5*1, 23

3,00±2, 251 2, 20±0, 21 2, 90ч-0. 271 2,04*0, 29 2,07*0,23*! 1,11*0,21

71,59*3,12450,08*5,64 * * |

1,85*0,261 1,01*0,19

-t* ^ |

36,33*0,70145,00*6,14 *** ]

15,40*0,901 5,33*1,73

I

* * * J * * *

38,27*1, 16146,00*2,63

* * * j * * *

2,29*0.211 8,50*0,84

1, 5*0,31**

2,50*0,24 2, 32±0, 30 1,54*0,24* 62,88*5,72

с *

1,27*0,21

35,17*3, 52 * * *

16,00*1,21

* * *

37, 83-0, 87 ! * Т * I 2,20*0, 20i

Примечания. * - р<0.05; ** - р<0.01; *** - р<0.001.

при единичных приступах удушья, одышки при физической нагрузке, частого продуктивного кашля, рассеянных сухих хрипах в легких, ЧД до 22 в минуту и пульса до 70-80 в минуту.

По сумме баллов состояние больных до применения ЭИФТ соответствовало тяжелому и характеризовалось прогрессирующими приступами удушья, одышкой в покое и при незначительной физической нагрузке, частым малопродуктивным кашлем, рассеянными сухими свистящими и жужжащими хрипами в легких, тахикардией, рефрактерностью к проводимой терапии, что требовало применения четвертой ступени базисной терапии.

После первого сеанса ЭИФТ хороший эффект отмечался у 5 больных, у 10- удовлетворительный. После второй процедуры у большинства больных отмечался отличный (5) и хороший эффект (4), а после третьего - у 12 и 3 пациентов соответственно.

Оценка эффективности ЭИФТ с простеноном в баллах выявила статистически значимое снижение выраженности симптомов бронхиальной астмы (до ЭИФТ - 14,2*0,7; после ЭИФТ 0,8±0,2 ; р < 0,01), сочетавшееся со значительным улучшением показателей функции внешнего дыхания.

Как известно, эуфиллин является одним из наиболее доступных и эффективных средств купирования обструктивного синдрома (Замотаев И.П., 1993), однако процент больных с побочными эффектами препарата, эуфиллинорезистентностью составляет около 40% (Гармаш В.Я. и др., 1981; Чучалин А.Г., 1989; Белоусов Ю.Б., Омельяновский В.В., 1996).

В связи с этим, представлялось актуальным_оценить клиническую эффективность ЭИФТ с эуфиллином у больных бронхиальной астмой. Показаниями к назначению ЭИФТ с эуфиллином являлись : привыкание к препарату и необходимость применения гипертерапевтических доз, неизбежно приводящих к побочному действию, а также непереносимость эуфиллина. Эффективность ЭИФТ с эуфиллином у больных бронхиальной астмой, оценивалась также, как и с препаратом простенон.' Тяжесть состояния'"больных по сумме баллов на традиционной терапии до ЭИФТ составляла 14,5+1,2, после ЭИФТ - 1,5+0,3 балла, р < 0, 01.. Применение ЭИФТ позволило добиться полного, прекращения приступов удушья и одышки, купирования кашля, исчезновения хрипов в легких, нормализации показателей функции внешнего дыхания.

Необходимо отметить, что ЭИФТ с эуфиллином не сопровождалась характерными для данного препарата побочными эффектами.

Динамика иммунологических показателей на фоне ЭИФТ у больных бронхиальной астмой.

Результаты экспериментальных исследований показали, что клетки-регуляторы, обработанные In vitro простеноном и эуфиллином, обладают выраженным иммуномодулирующим и противовоспалительным действием.

Учитывая это, нами исследовано влияние ЭИФТ на показатели иммунного статуса больных бронхиальной астмой. Как следует из таблицы 1, определение фенотипа клеточной поверхности ЛФ на фоне ЭИФТ позволило уже после первого сеанса выявить патогенетически значимое для бронхиальной астмы снижение CD4 и HLA-DR+ клеток, повышение CD8+ ЛФ и восстановление иммуно-регуляторного индекса (CD4/CD8), что сочеталось с положительной динамикой клинической картины заболевания. В процессе ЭИФТ не наблюдалось появления клеток, экспрессирующих рецепторы к ИЛ-2 (CD25), что имеет важное значение, так как повышенная продукция медиаторов воспаления и, в частности ИЛ-2, играет значительную роль в развитии воспаления в слизистой бронхов (Kay А. В.,1991; Hamid Q., 1992; Holgate S., 1993).

Подтверждением противовоспалительной активности клеток -регуляторов, индуцированных простеноном и эуфиллином, является нормализация в периферической крови на фоне ЭИФТ количества лейкоцитов и эозинофилов - основных эффекторных клеток воспаления, а также усиление фагоцитарной активности НФ, способствующей ускоренной элиминации бактериальных аллергенов из бронхиального дерева.

ВЫВОДЫ.

1. Обработка МНК периферической крови доноров препаратами. влияющими на соотношение циклических нуклеотидов в клетке (простенон, адреналин, эуфиллин, • трентал), приводит к индукции клеток-регуляторов, ингибирующих продукцию ФНО ауто-логичными МНК, опосредуемую растворимыми факторами, высвобождаемыми в ранние сроки поело :ити«иши препаратами.

2. Индукция клеток-регуляторов указанными препаратами способствует уменьшению провоспалптельного потенциала нейт-

рофилов (снижает продукцию лизосомальных ферментов, цитоток-спческую активность, экспрессию молекул адгезии).

3. Обработка МНК периферической крови данными препаратами приводит к индукции клеток-регуляторов, способствующих снижению CD4 и HLA-DR+ клеток, повышению CD8+ лимфоцитов, ингибиции экспрессии рецептора к ИЛ-2 (CD25).

4. Введение больным бронхиальной астмой аутологичных лимфоцитов, обработанных in vitro простеноном, приводит к быстрому и стойкому купированию бронхообструктивного синдрома, повышает чувствительность к глюкокортикоидам.

5. Применение ЭИФТ с эуфиллином у больных бронхиальной астмой в случаях эуфиллинорезистентности и непереносимости препарата приводит к. быстрому купированию бронхообструкции и не сопровождается побочными эффектами эуфиллина.

6. Введение больным бронхиальной астмой аутологичных МНК. обработанных in vitro простеноном или эуфиллином, сопровождается патогенетически значимым снижением эозинофилов в периферической крови, CD4 и HLA-DR+ клеток, увеличением CD8+ лимфоцитов, восстановлением иммунорегуляторного индекса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Новые варианты метода экстракорпоральной иммунофарма-котерапии в лечении ожоговой болезни, гнойной инфекции, ато-пического дерматита и бронхиальной астмы // 2 Российский национальный конгресс "Человек и лекарство.- Москва.- 1995.-с. 14?. (соавт. Юдина С.М.. Писарев В.М.).

2. Клинико-икмунологические аспекты экстракорпоральной '.¡ммунофармаг.отералии (ЭИФТ) с простагландином Е2 при бронхиальной астие // Мат. юбилейной конф., посвященной 100- летаю Курской биофабрики.- 1996.- с. 300-302.

3. Экстракорпоральная иммунокоррекция в клинике внутренних болезней // III Российский национальный конгресс "Человек и лекарство"". - Москва. - 1996.- с. 245 (соавт. Юдина С.М.).

4. Экспериментальное обоснование применения аутологичных клеток-регулятороз, обработанных простагландином Е2 , для лечения атопического дерматита и бронхиальной астмы // II Международный конгресс "Иммунореабилитация и реабилитация в медицине".- Анталия, Турция.- 1996,- с. 81.(соавт. Юдина С.М.,

Шуклина Г. В. ).

5. Экспериментальное обоснование применения аутологичных клеток-регуляторов, экстракорпорально индуцированных прос-тагландином Е2, адреналином, тренталом и эуфиллином // УТ Национальный конгресс по болезням органов дыхания,- Новосибирск,- 1996,- с. 179 (соавт. Юдина С. М. . Шуклина Г. В.).

6, Бронхоальвеолярный лаваж в оценке эффективности экстракорпоральной иммунофармакотерапии // У1 Национальный конгресс по болезням органов дыхания,- Новосибирск.- 1996.-и. 183 (соавт. Юдина С. М., Неро ног. Л.Ф. ).

Подписано в л-чать 5.0-?. 1.99У?. Заказ Н ??

Тир. 100 экз., усл.-печ. л. 1.0 ТГ "КАСКАД"