Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуномодулирующее действие препаратов витаминов А и Е при общем и локальном охлаждении

На правах рукописи

?ГБ ОД L „ ОлТ ЬЗЗ

АВАКЯН АРМЕН РОЛАНДОВИЧ

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ПРЕПАРАТОВ ВИТАМИНОВ А И Е ПРИ ОБЩЕМ И ЛОКАЛЬНОМ ОХЛАЖДЕНИИ

14.00.36 — аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена в Курском государственном медицинском университете.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, академик РАЕН и МАИ, заслуженный деятель науки РФ, профессор Л. Г. Прокопенко.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Ф. Я. Байбурин

доктор биологических наук, член-корр. РАЕН Г. А. Чалый

Ведущее учреждение: Российский государственный медицинский университет.

Защита состоится « $> ¿¿^0^^1999 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета К 084.57.01. при Курском государственном медицинском университете по адресу: 305033, Курск, ул. К. Маркса, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КГ МУ (Курск, ул. К. Маркса, 3).

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук доцент В. В. Новиков.

б г г. о

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Общее охлаждение организма достаточно часто встречается на производстве и в быту, особенно при различных чрезвычайных ситуациях. Локальное охлаждение нередко имеет место в естественно возникающих ситуациях, а также применяется как средство лечения различных заболеваний.

Охлаждение индуцирует усиление секреции катехоламинов, следствием которой является активизация липолиза, разобщение окислительного фосфорилирования, усиление генерации активных метаболитов кислорода и процессов перекисного окисления липи-дов. Это приводит к нарушению структуры клеточных мембран, снижению функциональной активности клеток и их табели (П. Хочач-ка, Дж. Сомеро, 1988; К. П. Иванов, 1996; JI. Г. Прокопенко и др., 1998).

Общее и локальное охлаждение является частой причиной возникновения тяжелых инфекционных заболеваний, в основе развития которых лежит нарушение функциональной активности иммунной системы организма (JI. Е. Панин, 1978, 1983; Г. М. Яковлев и др., 1990).

Иммуносупрессия, возникающая при остром холодовом стрессе, характеризуется значительным угнетением фагоцитарной активности клеток периферической крови, макрофагов селезенки и печени, снижением количества Т-лимфоцитов в периферической крови, угнетением их реакции на митогенные стимулы, увеличением количества и активности Т-супрессоров, снижением соотношения Т-хелперы/Т-супрессоры, нарушением экспрессии рецепторов для интерлейкина-2, нерезко выраженным уменьшением количества и пролиферативной активности В-лимфоцитов, неоднонаправленным изменением концентрации и синтеза иммуноглобулинов различных классов, нарушением синтеза и выделения иммуноцитами интер-феронов и интерлейкинов (Shu Е. А., 1993; Kizaki Е. А., 1995, 1996; Bhatnagar Е. А., 1996).

Наиболее резкое угнетение иммунологических функций наблюдается при иммерсионном охлаждении. Иммуносупрессия, индуцированная таким охлаждением, недостаточно эффективно корригируется препаратами, которые нормализуют иммунологическую реактивность, сниженную воздушным охлаждением (JI. Г. Прокопенко и др., 1995, 1999).

Выраженность иммуносупрессии, развивающейся после охлаждения, а также частота связанных с этим патологических процессов обусловливают актуальность поиска средств эффективной

коррекции нарушений иммунологических функций у лиц, подвергающихся действию низкой температуры окружающей среды. Учитывая важную роль усиления свободнорадикальных реакций и перекисного окисления липидов (ПОЛ) при остром холодовом стрессе, можно ожидать, что эффективными иммуномодулято-рами в этих условиях окажутся антиоксид анты. Проведенные ранее исследования показали, что р-каротин и эссенциале корригируют антиоксидангный статус и иммунологическую реактивность при воздушном охлаждении, но недостаточно эффективны при иммерсионном холодовом стрессе (А. М. Лосенок, 1995; Л. Г. Прокопенко и др., 1995; Н. Н. Бондарева, 1999). Выраженным ан-тиоксидантным и иммуномодулирующим действием при физических нагрузках, вибрационном поражении, голодании, поступлении в организм избыточного количества липидов и токсикантов обладают препараты витаминов А и Е (И. Л. Ласкова, 1990; Е. А. Яковлева, 1990; И. А. Николаева, 1995; Е. В. Барт, 1995; Е. Н. Конопля, 1997).

Целью работы было экспериментальное обоснование целесообразности использования витаминов А и Е в качестве иммуномодуля-торов при остром холодовом стрессе.

Задачи работы

1. Изучение иммуномодулирующего действия препаратов витаминов А и Е при общем воздушном и иммерсионном охлаждении.

2. Изучение иммуномодулирующего действия препаратов витаминов А и Е при локальном охлаждении.

3. Выяснение роли цитокинов, выделяемых клетками селезенки и лимфатических узлов, в развитии иммуносупрессии при общем и локальном охлаждении.

4. Выяснение роли цитокинов, выделяемых клетками селезенки и лимфатических узлов, в реализации иммуномодулирующего действия препаратов витаминов А и Е.

Научная новизна

Установлено, что иммуносупрессирующее действие общего воздушного охлаждения опосредуется цитокинами спленоцитов, иммерсионного — цитокинами спленоцитов и клеток лимфатических узлов, локального — цитокинами регионарных лимфатических узлов. Витамины А и Е, применяемые по отдельности, корригируют развитие гуморального иммунного ответа (ГИО) и гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) при воздушном охлаждении, но малоэффективны при иммерсионном охлаждении.

Сочетанное применение препаратов витаминов А и Е является эффективным средством иммунокоррекции при иммерсионном охлаждении. Ретинола ацетат индуцирует выделение хелперных ци-токинов неприлипающими к стеклу спленоцитами охлажденных крыс, а токоферола ацетат предотвращает выделение супрессиру-ющих цитокинов прилипающими клетками селезенки. Витамины А и Е являются эффективными средствами иммунокоррекции при локальном охлаждении. Действие витаминов при локальном охлаждении опосредуется цитокинами регионарных лимфатических узлов.

Практическая значимость

Экспериментально обоснована целесообразность клинического изучения использования препаратов витаминов А и Е при общем и локальном охлаждении.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Иммуносупрессирующее действие общего и локального охлаждения опосредуется цигокинами спленоцитов и клетками лимфатических узлов.

2. Препараты витаминов А и Е являются эффективными имму-номодуляторами при общем и локальном охлаждении.

3. Препараты витаминов А и Е оказывают влияние на выделение цитокинов клетками селезенки и лимфатических узлов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), описания методов исследования (1 глава), изложения результатов исследования (2 главы), заключения, выводов и списка литературы, включающего /¡^источников на русском и Ж на иностранных языках. Работа изложена на ^^страницах машинописи, содержит с^Утаблиц.

Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждены на научных конференциях Курских центров РАМН, РАЕН и МАИ (1997, 1998) и V Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1998).

Публикации. Основные положения диссертации изложены в 4 научных статьях и монографии «Иммунометаболические аспекты хо-лодового стресса» (Курск, 1999).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Эксперименты выполнены на крысах Вистар массой 180—200 г. Объектом исследования являлись сыворотки крови, клетки селезен-

ки и лимфатических утоп, сулернатанты спленодшов и клеток лимфатических узлов, их хроматографические фракции.

Модель охлаждения

Общее охлаждение вызывали путем содержания крыс в индивидуальных плексиглассовых камерах на воздухе при температуре —2—0° С в течение 2 часов или в воде при температуре 10— 12° С в течение 30 минут. Режимы охлаждения выбирали с таким расчетом, чтобы после охлаждения ректальная температура снижалась на 1—1,5°С. Локальное охлаждение с помощью аппарата «Иней — 3», работающего на жидком азоте. Диаметр контакта с поверхностью кожи — 0,5 см, температура в зоне контакта — минус 120"С.

Индукция и оценка выраженности ГИО и ГЗТ

Животных иммунизировали эритроцитами барана (ЭБ), хранившимися в растворе Ольсвера при 4°С. Перед употреблением эритроциты трехкратно отмывали изотоническим раствором натрия хлорида и центрифугировали при 400 б (Е. Кэбот, М. Мей-ер, 1968). Антиген вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 108 клеток/кг.

О выраженности ГИО судили по количеству АОК и РОК в селезенке. Число АОК устанавливали методом прямого локального гемолиза по К. Мальбер и Э. Зигль (1987). Количество иммунных РОК определяли по X. Зауэр (1987). При оценке развития ГЗТ сенсибилизирующую дозу ЭБ (10® клеток) вводили внутрибрюшинно, спустя 4 суток в подушечку правой лапки вводили 106 ЭБ, а в подушечку левой лапки — 0,15 М натрия хлорида. О выраженности ГЗТ судили по величине разницы массы (РМ) и количества кариоцитов (РК) в регионарных и контрлатеральных лимфатических узлах спустя 24 часа после введения разрешающей дозы ЭБ.

Выделение, фракционирование и культивирование клеток селезенки и лимфатических узлов.

Клетки выделяли путем вьщавливания в стеклянном гомогенизаторе в среде 199. Эритроциты удаляли гемолитическим шоком (Ю. Бурмей-стер, 1979). Клетки фракционировали по способности прилипать к пластику или стеклу (Э. Ф. Полушкина и др., 1983). Прилипающие и непри-липающие клетки инкубировали в среде 199, содержащей 5% эмбриональную сыворотку, в течение 3—6 часов в ламинарном боксе при периодическом обновлении газовой среды (95% 02 и 5% С02) (А. И. Конопля и др., 1989). По истечении срока инкубации клетки осаждали и готовили пул надосадочной жидкости.

Фракционирование и определение иммуномодулирующей активности надосадочной жидкости

Пул жидкости диализировали в течение 12—15 часов против 50-кратного объема 0,05 M трис-НС1-буфера (рН 8,0), приготовленного на 0,15 натрия хлорида. После диализа его концентрировали полиэтиленгликолем (40 кД) и повторно диализировали против трис-НС1-буфера. Очищенную от низкомолекулярных веществ жидкость освобождали от образовавшегося при концентрировании осадка центрифугированием при 800 g в течение 15 мин.

Надосадочные жидкости фракционировали с помощью се-фадекса G-150 на хроматографической колонке. В качестве элю-ента использовали 0,05 M трис-НС1-буфер (рН 8,0), приготовленный на 0,15 M натрия хлорида. Надосадочную жидкость концентрировали и фракционировали на колонке, заполненной се-фадексом G-50. Концентрацию белка в надосадочных жидкостях и их фракциях определяли по Бредфорду, используя краситель Ку-маси G 250 (С. С. Шишкин, 1982). Молекулярную массу белков хроматограф пч ее ких фракций рассчитывали по объему выхода из колонки белков с известной молекулярной массой (Г. Детерман, 1970).

Иммуномодулирующую активность надосадочных жидкостей супернатантов селезенки и лимфатических узлов и их хромато-графических фракций определяли путем однократного и двукратного внутрибрюшного введения их интактным животным в объеме, содержащем 500 мкг белка, и одновременной инъекцией антигенов.

Определение биохимических показателей

В эритроцитах определяли активность супероксиддисмутазы (СОД) (Е. В. Макаренко, 1988) и каталазы (М. А. Подильчак, 1967), в сыворотке крови —содержание витаминов А и Е (Biem, Privai, 1995), диеновых конъюгатов жирных кислот (ЦК) (И. Д. Стальная, Т. Г. Га-ришвили, 1977) и малонового диальдегида (МДА) (И. Д. Стальная, 1977).

Статистическая обработка материалов

Материалы подвергали статистической обработке. Вычисляли средние арифметические и их стандартные ошибки. Существенность различий средних величин оценивали по критериям Стьюдента и Вилкоксона — Манна — Уитни (Е. В. Гублер, 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Иммуномодулируннцее действие препаратов витаминов А и Е при ; общем воздушном и иммерсионном охлаждении

Жирорастворимые витамины и возникающие под их влиянием метаболиты существенно модифицируют структуру и функции мембран различных клеток, играющих важную роль в регуляции иммунного ответа при состояниях напряжения и в условиях патологии (Л. Г. Прокопенко и др., 1995).

Изучено влияние ретинола ацетата и токоферола ацетата на развитие ГИО и ГЗТ при воздушном охлаждении. Препараты вводили пятикратно, с интервалом 12 ч, в дозах 15 мг/кг ретинола ацетата и 25 мг/кг токоферола ацетата, внутрижелудочно или внутримышечно.

Внутрижелудочное введение ретинола ацетата крысам, подвергнутым воздушному охлаждению (КПВО), усиливало, но не нормализовало развитие ГИО и вместе с тем не оказало влияния на развитие ГЗТ. Внутрижелудочное введение токоферола ацетата не влияло на интенсивность ГИО и ГЗТ. Внутримышечные инъекции КПВО ретинола ацетата нормализовали развитие ГИО и усиливали, но не нормализовали, развитие ГЗТ. Инъекции токоферола ацетата усиливали развитие ГИО и не влияли на интенсивность ГЗТ.

Для решения вопроса о механизме действия препаратов витаминов А и Е проведено три серии экспериментов. В первой серии исследована иммуномодулирующая активность сыворотки крови и инкубатов клеток селезенки (ИКС) КПВО, получавших инъекции ретинола ацетата и токоферола ацетата. Установлено, что введение интактным крысам сыворотки крови КПВО, не получавших препараты витаминов, и КПВО, которым вводили ретинола ацетат, оказывали одинаково выраженное иммуносупрессорное действие. Введение же интактным животным сыворотки КПВО, получавших токоферола ацетат, не влияло на развитие у них иммунного ответа, индуцированного ЭБ. Таким образом, ретинола ацетат не влиял на накопление иммуномодулирующих субстанций в крови охлажденных крыс, в то время как токоферола ацетат блокировал этот процесс или нейтрализовал иммуномодулирующие субстанции крови.

ИКС охлажденных крыс, не получавших препараты витаминов, супрессируют развитие ГИО на ЭБ у аллогенных охлажденных реципиентов. ИКС охлажденных крыс, получавших инъекции

ретинола ацетата, не обладали иммуномодулирующей активностью, а ИКС животных, которым вводили токоферола ацетат, суп-рессировали развитие ГИО у охлажденных реципиентов, хотя и не столь сильно как ИКС КПВО, не получавших препараты витаминов. Это может свидетельствовать о блокировании ретинола ацетатом и ослаблении токоферола ацетатом индуцирующего влияния субстанций сыворотки крови на клетки-супрессоры селезенки.

Во второй серии экспериментов спленоциты неохлажденных крыс, получавших препараты витаминов А и Е, обрабатывали сывороткой КПВО. Инкубаты этих спленоцитов вводили аллогенным охлажденным реципиентам и определяли у последних интенсивность ГИО на ЭБ. Оказалось, что ИКС крыс, которым не вводили препараты витаминов, супрессировали развитие ГИО. ИКС животных, получавших ретинола ацетат, не обладали иммуносупрессирующей активностью, а иммуносупрессируюшая активность ИКС животных, которым вводили токоферола ацетат, была выражена слабее, чем ИКС крыс, не получавших витамин Е.

Полученные данные показывают, что ретинола ацетат блокирует индуцируемое сывороточными субстанциями выделение иммуно-супрессирующего фактора спленоцитами или индуцирует выделение спленоцитами фактора, являющегося ингибитором или функциональным антагонистом супрессирующего фактора клеток селезенки. Токоферола ацетат слабее, чем ретинола ацетат, подавляет реакцию клеток селезенки на действие сывороточного иммуномодулирующего фактора.

В третьей серии экспериментов исследовано влияние ИКС охлажденных крыс на развитие иммунного ответа у животных, получавших инъекции ретинола ацетата и токоферола ацетата. Введение ИКС крысам, получавшим ретинола ацетат, не влияло на развитие иммунного ответа, индуцированного ЭБ. У крыс, которым вводили токоферола ацетат, ИКС тормозил развитие иммунного ответа, однако это торможение было выражено слабее, чем при введение ИКС крысам, которым препараты витаминов не вводили.

Результаты этих исследований свидетельствуют о снижении чувствительности иммуноцитов крыс, получавших препараты витаминов А и Е, к действию фактора ИКС охлажденных крыс. Вместе с тем не исключено, что под влиянием витаминов вырабатываются ингибиторы или функциональные антагонисты иммуносупрессирующего фактора, выделяемого спленоцитами после охлаждения.

Изучено также влияние ретинола ацетата и токоферола ацетата на развитие ГИО и ГЗТ, индуцируемых ЭБ, при иммерсионном охлаждении. Препараты вводили внутрибрюшинно пятикратно с интервалом 12 часов. Установлено, что иммерсионное охлаждение вызывало у животных резкое угнетение развития ГИО и ГЗТ на ЭБ. Введение препаратов витаминов А и Е дозозависимо усиливало развитие ГИО. При введении 30 мг/кг ретинола ацетата и 50 мг/кг токоферола ацетата наблюдалась полная нормализация ГИО. Значительно слабее влияли препараты на супрессированное охлаждением развитие ГЗТ. Ретинола ацетат и токоферола ацетат в дозах соответственно 15 мг/кг и 25 мг/кг не влияли на развитие ГЗТ, а в дозах 30 мг/кг и 50 мг/кг усиливали, но не нормализовали этот процесс у крыс, подвергнутых иммерсионному охлаждению (КПИО).

Изучение влияния иммуномодулирующих факторов сплено-цитов КПИО, получавших препараты витаминов крыс, показало, что инкубат прилипающих к пластику клеток селезенки (ИПКС) КПИО угнетает развитие ГИО и ГЗТ у аллогенных реципиентов, а инкубат неприлипающих к пластику клеток селезенки (ИНКС) не влияет на эти формы иммунного реагирования. ИПКС КПИО, получавших инъекции ретинола ацетата, супрессирует развитие ГИО и ГЗТ, а ИНКС значительно стимулирует ГИО и слабо (но статистически существенно) усиливает развитие ГЗТ у аллогенных реципиентов. ИПКС и ИНКС КПИО, получавших токоферола ацетат, не влияют на развитие ГИО, вместе с тем ИПКС вызывает слабовыраженное угнетение развития ГЗТ у аллогенных реципиентов.

На основании этих данных можно заключить, что ретинола ацетат не блокирует выделение иммуносупрессирующего фактора прилипающими к пластику клетками селезенки КПИО, но индуцирует выделение неприлипающими клетками субстанций, обладающих сильно выраженной иммуностимулирующей активностью в отношении ГИО и слабовыраженной усиливающейся активностью в отношении ГЗТ. В отличие от ретинола ацетата, токоферола ацетат не индуцирует выделения прилипающими клетками селезенки охлажденных крыс иммуностимулирующих субстанций, но блокирует или резко ослабляет выделение иммуно-супрессирующих факторов прилипающими к пластику сплено-цитами.

Важную роль в развитии иммуносупрессии при охлаждении играет усиление свободнорадикальных реакций и процессов ПОЛ клеточных мембран (Вига<1г1е. а., 1992, 1997). Активация ПОЛ приводит к изменению структуры их двойного фосфолипидного слоя, кон-формации и взаимного расположения мембранных рецепторов, нарушения функции транспортных и канальных белков, инактивации мембраносвязанных ферментов.

В крови КПВО и КПИО определяли активность СОД и катала-зы, содержание витаминов А и Е, ДК и МДА. Установлено, что воздушное и иммерсионное охлаждение снижало активность СОД и ка-талазы, при иммерсионном охлаждении снижение было более выраженным, чем при воздушном. Аналогичное влияние оказывало воздушное и иммерсионное охлаждение на концентрацию в крови витаминов А и Е. Воздушное охлаждение повышало концентрацию первичного продукта ПОЛ-ДК, но не влияло на содержание одного из конечных продуктов — МДА. Иммерсионное охлаждение повышало содержание ДК и МДА. На основании изложенного можно предположить, что снижение иммунологической реактивности, наблюдающейся при воздушном и иммерсионном охлаждении связано с усилением свободнорадикальных процессов и повышением в крови содержания продуктов ПОЛ.

Изучено влияние витаминов А и Е на активность ферментов ан-тиоксидантной системы, содержание антиоксидантов липидной природы и концентрации продуктов ПОЛ в крови КПВО и КПИО. Препараты вводили внутримышечно 5-кратно с интервалом 24 часа. Разовые дозы витамина А равнялись 7,5 мг/кг, витамина Е — 12,5 мг/кг (то есть половине тех, которые использовались при раздельном введении препаратов).

Установлено, что витамины А и Е, введенные по отдельности, нормализовали антиоксидантный статус и иммунологическую реактивность у КПВО, но не влияли на эти функции у КПИО. Введенные совместно витамины А и Е уменьшали выраженность сдвигов этих показателей (таблица 1). Результаты этих наблюдений позволяют считать, что нарушение антиоксидантной защиты и увеличение выраженности процессов ПОЛ играют важную роль в развитии холодо-вой иммуносупрессии, а нормализация их параметров является существенным компонентом иммуномодулирующего действия препаратов витаминов А и Е.

Таблица 1. Влияние ретинола ацетата (РА) и токоферола ацетата (ТА) на антиоксидантный статус н иммунологическую реактивность организма при иммерсионном охлаждении.

Показатели Контроль Охлаждение Охлаждение + РА Охлаждение + ТА Охлаждение РАиТА

СОД, ед 0,62±С,05 0,29±0,05'1 0,28±0,05*' 0,26±0,06-1 0,50Ю,071-4

Каталаза, ед 13,2+0,2 5,910,5*' 5,6Ю,61 6,210,4*' Э,7±0,5'ы

Витамин А, мкмоль/ед 0,363±0,034 О^вЗЮДО'1 0,17840,025'' 0,186±0,03'' 0,251±0,03Г1'

Витамин Е, мкмоль/ед 0,41610,06 0,29010,03м 0,286Ю,04"1 0,28810,05м 0,364Ю,06'М

ДК, мкмоль/ед 33,8±0,8 [49,311,2'' 46,710,9"' 48,911,1*' 38,410, в'1-4

ЦЦА, мкмоль/ед 12,3±0,8 31,912,4'' 29,312,2м 30,612,5*1 19,811 Ж'"4

АОК, тыс/орган 23,7+2,8 6,6±0,9'1 7,210,9*' 7,611,0'1 15,411,7м

РОК, тыс/орган 51,415,6 17,4±2,3' 18,1 ±2,3 м 17,812,2*' 43,214,7*'4

Одной из причин более выраженного иммуносупрессирующег действия иммерсионного охлаждения, по сравнению с воздушных вероятно, является непосредственный контакт охлаждающего агент (воды) с кожными покровами. Не исключено, что охлаждение кож ных покровов индуцирует поступление в регионарные лимфатичес кие узлы клеток химических соединений кожи, активирующих выде ление супрессирующих цитокинов макрофагальными и лимфоидны ми клетками лимфатических узлов.

Для проверки высказанных предложений проведено три вари анта экспериментов. В первом варианте супернатанты прилипающи и неприлипающих к стеклу клеток подколенных лимфатических уз лов (КПЛУ) КПВО и КПИО вводили ингактным крысам и КПВС Одновременно с первой инъекцией супернатантов крыс однократ но внутрибрюшинно иммунизировали ЭБ (108 клеток/кг). Установ лено, что супернатант прилипающих клеток селезенки и суперна тант неприлипающих клеток селезенки охлажденных на воздухе кры не оказывает влияние на развитие ГИО и ГЗТ у интактных крыс : крыс, подвергнутых воздушному охлаждению. Инъекции суперна танта прилипающих клеток иммерсионно охлажденных крыс н влияли на выраженность ГИО и ГЗТ у интактных животных, н существенно супрессировали эти процессы у КПВО. Введение су пернатанта неприлипающих клеток иммерсионно охлажденных кры интактным животным и КПВО не вызывало иммуномодулирующег эффекта (таблица 2).

Во втором варианте КПВО вводили ретинола ацетат, токоферола ацетат или оба препарата. Исследовали влияние супернатантов клеток подколенных лимфатических узлов на развитие ГИО и ГЗТ у КПВО. При такой постановке эксперимента инъекции препаратов (по отдельности или совместно) не влияли на иммуномодулирую-щую активность супернатантов прилипающих и неприлипающих клеток селезенки (таблица 3).

В третьем варианте эксперимента препараты витаминов вводили вместе с супернатантом прилипающих клеток селезенки иммерсионно охлажденных крыс интактным животным. Оказалось, что витамины, введенные по отдельности, не влияли на имму-носупрессирующий эффект супернатанта прилипающих клеток селезенки иммерсионно охлажденных крыс, а совместное введение препаратов значительно ослабляло его (таблица 4). Таким образом, иммерсионное охлаждение, в отличие от воздушного, индуцирует выделение прилипающими к стеклу клетками лимфатических узлов супрессирующих цитокинов, действие которых отменяется совместным введением ретинола ацетата и токоферола ацетата.

Таблица 2. Иммуносупрессирующая активность супернатантов КПЛУ охлажденных животных.

№№ Реципиенты Доноры Супер-натанты АОК РОК РМ РК

1. Интакгные крысы КПВО СПК 2б,3±2,9 51,4±5,5 6,8±0,7 7,6±0,8

2. -II- -II- СНК 24,9+12,7 48,7±53 6,4+0,7 7,4±0,7

3. -II- кпво СПК 27,0±3,1 53,2±5,8 6,7±0,6 7,8±0,8

4. -II- -II- СНК 25,0±2,8 49,4+5,2 6,3±0,7 7,7+0,8

5. КПВО кпво СПК 4,8±0,6* 15,7+1,9* 1,8±0,2* 2,0±0,3*

6. -II- -II- СНК 28,5±3,2 52,0±5,8 6,5+0,6 7,5+0,7

Примечания:

1) величины АОК, РОК, РМ и РК соответственно:

у интактных крыс — 26,2+2,7; 52,3+5,6; 6,6±0,7 и 7,5±0,8; у КПВО - 8,3+0,9; 25,1+3,0; 3,4±0,5 и 4,2±0,7;

2) СПК и СНК — супернатанты прилипающих и неприлипающих клеток.

Таблица 3. Влияние супернатантов КПЛУ иммерсионно охлажденных крыс, получавших РА и ТА, на развитие иммунного ответа у КПВО.

№ № Условия опыта АО К РОК РМ РК

1. Контроль (без введения супернатантов) 7,4±0,9 26,3±3,1 3,3±0,5 4,0±0,6

2. Введение СПК крыс, не получавших витамины 4,2±0,5*1 14,0±1,9'1 1,7±0,21 2,2±0,31

3. Введение СПК крыс, получавших РА 4,0+0,5*1 14,7±1,8*1 1,9+0,2"1 2,3±0,3 1

4. Введение СПК крыс, получавших ТА 3,9+0, б'1 13,7+1,б'1 1,7+0,3'1 2,1±0,3"1

5. Введение СПК крыс, получавших ТА и РА 4,4±0,6*1 14,9±2,0*1 1,8+0,3"1 г^+о.з'1

6. Введение СНКС крыс, не получивших витамины 7,6±0,8'2'5 23,8+3,2*^ 3,0+0,5'2"5 4,3±0,б'г"5

7. Введение СНК крыс, получавших РА 7,2±0,8*2"5 25,1+3,О**5 3,5+0,б*2"5 4,0+0,5'2"5

8. Введение СНК крыс, получавших ТА 7,1+0,8'2"5 27,8±3,3*2"5 3,2±0,52'5 4,0+0,5*2"5

9. Введение СНК крыс, получавших ТА и РА 7,5±0,7'2"5 24,4+2,8^ 3,5±0,6*2"5 3,8±0,4'2"5

Таблица 4. Влияние СПК лимфоузлов иммерсионно охлажденных крыс на развитие ГИО и ГЗТ у неохлажденных животных, получивших инъекции РА и ТА.

N£N9 Условия опыта АО К РОК РМ РК

1. Контроль (без введения препарата и СПК) 23,7±2,8 48,6±5,0 6,4±0,8 7,5+0,8

2. Введение РА 22,4±2,6 49,0±5,3 6,5±0,7 7,7±0,9

3. Введение ТА . 24,8±2,9 50,6±5,7 6,3±0,7 73±0,7

4. Введение РА и ТА 25,1 ±3,0 51,7+5,6 6,6+0,8 7,8+0,9

5. Введение СПК 12,6+1,7 м 31,5+3,7*М 4,2±0,5*1"4 5,3+0,б*1"4

6. Введение РА и СПК 1131,6™ 29,4±3,5'м 4,0±0,6*1"4 бДЮ.б*1"4

7. Введение ТА и СПК 12,0+1,5™ 33,6±3,8'14 4,1±0,5'1-4 б.ЗгЮ.б"1"4

9. Введение РА, ТА и СНК 17,2+1,91-7 40,7+4,8*1'7 5,3±0,6*1'7 6,3+0,б*1"7

Иммуномодулирующее действие витаминов А и Е при локальном

охлаждении

Локальное криогенное воздействие применяют для лечения различных заболеваний, в патогенезе которых существенную роль гграет нарушение иммунологических функций (Б. С. Турсунов, [996; М. Е. Мызенская и др., 1996, 1997). Учитывая это, изучение вменений иммунологической реактивности и поиск эффектив-1ых средств ее коррекции при локальном охлаждении является «обходимым условием повышенной эффективности и предот-¡ращения или ослабления негативных последствий этого метода ючения.

Изучено влияние глубокого локального охлаждения (ГЛО) кож-шх покровов передней поверхности брюшной стенки и подушечки ¡топы задней лапки на развитие ГИО и ГЗГу крыс, а также возмож-юсть коррекции этих форм иммунного ответа с помощью ретинола щетата и токоферола ацетата. Препараты вводили внутрикожно трехкратно с интервалом 6 ч в разовых дозах 5 мг/кг витамина А и 8 мг/кг щтамина Е.

Установлено, что ГЛО (температура в месте контакта — 120°С) адней конечности и передней брюшной стенки в течение 10 или Ю сек. стимулирует развитие иммунного ответа, а охлаждение в ечение 1 или 2 мин. супрессирует этот процесс. Выраженность тимулирующего и супрессирующего эффектов возрастает с уве-[ичением времени экспозиции. Иммуностимулирующее действие юкального охлаждения в зоне задней конечности и передней ¡рюшной стенки выражено одинаково, супрессия иммунного от-¡ета в большей степени проявляется при локальном охлаждении адней конечности. Введение ретинола ацетата в зону локального 0- и 20-секундного охлаждения усиливает вызванную последним тимуляцию иммунного ответа. Введение препарата в зону, отда-;енную от участка локального 10- и 20-секундного охлаждения, ютенцирует иммунностимулирующее действие последнего вмень-ией степени, чем при введении витамина в участок охлаждения. 5ведение витамина А в зону локального 1- и 2-минутного охлаж-ения уменьшает выраженность вызываемой им супрессии именного ответа. Инъекции витамина А в участок, отдаленный от оны локального 1-й 2-минутного охлаждения, не оказывают лияния на развитие гуморальной и клеточной иммунологичес-:их реакций.

Введение токоферола ацетата в зону локального 1- и 2-минутного охлаждения уменьшает выраженность холодовой иммуносуп-рессии. Введение препарата в участок, отдаленный от зоны 1- и 2-минутного охлаждения, не оказывает существенного влияния на развитие иммунного ответа. Сочетанное введение витаминов А и Е в зону охлаждения нормализует развитие ГИО и ГЗТ, а в участок, отдаленный от зоны охлаждения, уменьшает выраженность супрессии ГИО и не влияет на развитие ГЗТ.

Глубокое локальное охлаждение в течение 10 или 20 секунд не индуцирует выделения иммунномодулирующих цитокинов клетками лимфатических узлов, регионарных к месту охлаждения. Иммунно-супрессирующее действие 1- и 2-минутного локального охлаждения опосредуется цитокинами прилипающих к стеклу клеток регионарных лимфатических узлов. Супрессирующие цитокины обнаруживаются в составе фракции, содержащей белки с молекулярной массой 20-30 кД.

Введение ретинола ацетата в зону 10- или 20-секундного, а также 1- или 2-минутного охлаждения индуцирует выделение иммуностимулирующих цитокинов неприлипающими клетками регионарных лимфатических узлов. Хедперные цитокины обнаруживаются в составе фракции, содержащей белки с молекулярной массой 10—15 кД. Введение токоферола ацетата в зону 1- или 2-минутного ГЛО предотвращает выделение супрессирующих цитокинов клетками регионарных лимфатических узлов. Таким образом, иммуномодулирующее действие препаратов витаминов А и Е при локальном охлаждении в значительной степени опосредуется клетками регионарных лимфатических узлов и выделяющимися ими цитокинами.

Проведенные нами эксперименты показали, что СПК лимфатических узлов, регионарных к месту ГЛО, при аллогенном перекосе снижают активность СОД и каталазы в эритроцитах и повышают содержание ДК и МДАв плазме интактных крыс. Супер-натанты прилипающих клеток лимфатических узлов локально охлажденных крыс, получавших ретинола ацетат и токоферола ацетат, в условиях наших экспериментов таких эффектов не вызывали (таблица 5).

Таблица 5. Влияние ретинола ацетата (РА) и токоферола ацетата (ТА) на прооксидантное действие СПК регионарных лимфатических узлов после 2-минутного локального охлаждения.

Показатели Контроль без введения СПК Введение СПК крыс, не получавших РАиТА Введение СПК крыс, получавших РА Введение СПК крыс, получавших ТА

;од 0,62±0,05 0,49+0,04^ 0,59+0,Об"2 0,64+0,Об"2

Саталаза 13,2±0,6 9.3Ю.5*1 13,1±0,5'2 12,710,7*

Зитамин А 0,363±0,03 0,358+0,05 0,368+0,04 0,360±0,05

Зитамин Е 0,416±0,06 0,407+0,05 0,410+0,05 0,418±0,08

1К 33,8±0,8 39,7±0,9*1 32,1 ±0,7* 30,2±0,9'2

У1ДА 12,3±0,9 8,2±0,9*1 ^^гШ.б"2 11,8*0,7*

Результаты проведенных экспериментов позволяют предположить, го периферические лимфатические узлы и вьвделяемые ими цитокины грают важную роль в регуляции выраженности реакций различных ункциональных систем на действие внешних раздражителей. Они обо-ювывают перспективность углубленного изучения влияния цитоки-зв клеток периферических лимфатических узлов на интенсивность раз-1чных биохимических процессов и физиологических функций.

ВЫВОДЫ

Внутрижелудочное введение ретинола ацетата КПВО усиливает, но не нормализует развитие ГИО и не влияет на интенсивность ГЗТ. Внутрижелудочное введение токоферола ацетата не влияет на выраженность ГИО и ГЗТ. Внутримышечные инъекции КПВО ретинола ацетата нормализуют развитие ГИО и повышают выраженность ГЗТ. Инъекции токоферола ацетата усиливают развитие ГИО и не влияют на интенсивность ГЗТ.

Внутримышечные инъекции ретинола ацетата и токоферола ацетата усиливают развитие ГИО и не влияют на выраженность ГЗТ у иммерсионно охлажденных крыс. Сочетднное введение препаратов витаминов А и Е нормализует ГИО и усиливает интенсивность ГЗТ при иммерсионном охлаждении.

Ретинола ацетат индуцирует введение неприлипающими к стеклу клетками селезенки хелперных цитокинов, токоферола ацетат бло-

кирует выделение иммуносупрессирующих цитокинов прилипаю щими клетками селезенки КПИО.

4. Иммерсионное охлаждение, в отличие от воздушного, индуцирует выделение прилипающими к стеклу клетками лимфатически) узлов цитокинов, обладающих иммуносупрессирующими свойствами. Ретинола ацетат и токоферола ацетат при совместном введении не оказывают влияния на выделение клетками лимфатических узлов КПИО, но предотвращают реализацию иммуносупрес-сирующего действия этих цитокинов.

5. Глубокое локальное охлаждение в течение 1—2 мин. супрессирует развитие ГИО и ГЗТ. Ретинола ацетат и токоферола ацетат прг раздельном введении ослабляют, а при совместном нормализуют развитие иммунного ответа после 1—2 минутного ГЛО. Действие витаминов при введении в зону охлаждения выражено сильнее, чем при инъекции в отдаленный участок. Локальное охлаждение i течение 10—20 сек. стимулирует ГИО и ГЗТ, введение ретинола ацетата в зону охлаждения усиливает этот эффект.

6. Инъекции ретинола ацетата в зону ГЛО индуцируют выделение хел-перных цитокинов неприлипающими клетками регионарных лимфатических узлов, а введение токоферола ацетата предотвращает выделение супрессирующих цитокинов прилипающими клетками регионарных лимфатических узлов иммерсионно охлажденных крыс.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ, ОТРАЖАЮЩИХ ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иммуномодулирующее действие локального охлаждения. //Актуальные вопросы дерматовенерологии — Курск, 1997. — С. 69—71 (соавт. Н. Н. Бондарева, Л. Г. Прокопенко).

2. Иммуномодулирующее действие ферментов при локальном охлаж-дении.//Пятый российский национальный конгресс «Человек и лекарство». — Москва, 1998, — С. 429.

3. Иммуномодулирующее действие витаминов А и Е при локальном охлаждении.//Человек и его здоровье (сборник научных работ). — Курск, 1999. — Выпуск 2. — С. 90-92 (соавтор И. Л. Бровкина).

4. Иммуномодулирующее действие препаратов витаминов А и Е при повторяющейся холодовой нагрузке.//Человек и его здоровье (сборник научных работ), 1999. — Вып. 2. — С. 95—97 (соавт. М. И. Лукашев, И. Л. Бровкина).

5. Иммунометаболические аспекты холодового стресса. — Курск, 1999. — С. 118 (соавт. Л. Г. Прокопенко, В. А. Афанасьев, И. Л. Бровкина, Е. Н. Конопля.)