Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Иммунометаболическое и гепатопротекторное действие гликозаминогликанов, гликозидаз и витаминов при кровопотере

у

На правах рукописи

Рыбников Владимир Николаевич

О 3 СЕН 2009

ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКОЕ И ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ, ГЛИКОЗИДАЗ И ВИТАМИНОВ ПРИ КРОВОПОТЕРЕ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

□□34 и

Курск - 2009

003476013

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор Лазарев Алексей Иванович доктор медицинских наук, профессор Бровкина Инна Леонидовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Муляр Александр Георгиевич доктор медицинских наук, профессор Утешев Даниил Борисович доктор медицинских наук, профессор Кинзирский Александр Сергеевич

Ведущая организация: ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ».

Защита состоится «

¿1

2009 г.

. в / V <

аьо

часов на заседании

диссертационного совета Д 208.039.04 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Росздрава.

Автореферат разослан ^2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Пашин £Л1.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Различные формы нарушения гомеостаза характеризуются иммуносупрессией, основными причинами развития которой является усиление генерации активных метаболитов кислорода, снижение антиокислительного потенциала тканей, повышение интенсивности процессов перекисного окисления липидов мембран, снижение энергообеспечения клеток, нарушение структуры и функции иммуноцитов (Прокопенко Л.Г. и др., 1999; Новицкий В.В. и др., 2003).

Наряду с принципиально общими механизмами развития метаболической иммуносупрессии при состояниях, характеризующихся выраженным стрессор-ным компонентом (алиментарные нагрузки, голодание, охлаждение, физические нагрузки), имеют место характерные для них особенности, обусловленные природой индуцирующего агента и первичным звеном его воздействия на клетки и организм в целом (Прокопенко Л.Г., Бровкина И.Л., 2003). Общность направленности и в значительной степени выраженность иммунометаболических сдвигов, наблюдающиеся при различных формах стресса и патологии, сочетаются с неодинаковой эффективностью корригирующего действия различных фармакологических средств.

Потеря значительного количества крови, как правило, сочетается с трав-матизацией тканей, а иногда с действием наркотизирующих веществ. Такая форма стресса является одной из наиболее частых в условиях чрезвычайных ситуаций, а также хирургической и акушерско-гинекологической практики. Иммунометаболические сдвиги, возникающие после острых кровопотерь, изучены недостаточно.

Известно, что умеренная острая кровопотеря приводит к снижению анти-оксидантного потенциала гепатоцитов, усилению перекисного окисления и нарушению энергетического обмена в клетках, повышению проницаемости клеточных мембран гепатоцитов (Матвеев С.Б. и др., 1991, 1999). Кровопотеря сопровождается увеличением числа ретикулоцитов и снижением количества зрелых эритроцитов в периферической крови, изменением деформируемости этих

клеток, снижением числа тромбоцитов, повышением их адгезивных и агрега-тивных свойств (Соловьев C.B.,, 1989). Эритроциты и тромбоциты оказывают существенное влияние на функциональную активность иммуноцитов (Прокопенко Л.Г., Сигшивая Л.Е., 1992), Значительные кровопотери, имеющие место при травмах и хирургических вмешательствах, сопровождаются нарушением иммунологических функций (Прокопенко Л.Г. и др., 1993), механизм которого изучен недостаточно, а следовательно, мало разработаны способы иммунореа-билитации после острых кровопотерь.

Многие фитопрепараты обладают иммуномодулирующими свойствами, обусловленными наличием в них каротиноидов, сапонинов, флавоноидов и, особенно, полисахаридных комплексов (Хаитов P.M. и др., 1995; Du J.-Y. et al., 1996), Гликозаминогликаны различного видового происхождения корригируют развитие различных форм иммунного ответа при токсических поражениях печени, интенсивных физических нагрузках, алиментарных нарушениях гомео-стаза, остром тепловом и холодовом стрессах (Конопля E.H., 1997; Ермакова А.Е., 1995; Прокопенко Л.Г. и др., 1999; Байбурин Ф.Я. и др., 2000).

В составе природных фитопрепаратов содержатся ГАГ, которые могут взаимодействовать с другими соединениями, обладающими иммуномодулирующими свойствами. В то же время мало изучены механизмы взаимодействия ГАГ с жиро- и водорастворимыми витаминами, что представляет большой научный и практический интерес.

Цель - выявление иммунометаболических и гепатопротекторных эритро-цитзависимых эффектов взаимодействия гликозаминогликанов, гликозидаз, протеаз и витаминов при острой кровопотере.

Задачи.

1, Изучение иммунометаболических эффектов взаимодействия гликозаминогликанов растительного происхождения и жирорастворимых витаминов при кровопотере.

2. Выявление иммунометаболических эффектов взаимодействия гликозаминогликанов растительного происхождения и водорастворимых витаминов после кровопотери.

3. Установление иммунометаболических эффектов взаимодействия гли-козаминогликанов животного происхождения и витаминов при кровопотере.

4. Изучение иммунометаболических эффектов взаимодействия гликози-даз и витаминов после кровопотери.

5. Изучение иммунометаболических эффектов взаимодействия витаминов и продуктов фрагментации гликозаминогликанов при кровопотере.

6. Выяснение роли эритроцитов в реализации иммунометаболических эффектов взаимодействия гликозаминогликанов, гликозидаз и витаминов после кровопотери.

7. Выявление гепатопротекторных эффектов взаимодействия гликозаминогликанов, гликозидаз и витаминов после кровопотери.

8. Изучение иммунометаболических эффектов совместного введения про-теолитических ферментов и витаминов после кровопотери.

Научная новизна. Острая кровопотеря вызывает развитие иммуносу-прессии, в реализации которой принимают участие эритроциты. Гликозамино-гликаны растительного происхождения (ГАГ-Р, ГАГ-Т, ГАГ-А) как иммуно-корректоры при кровопотере более эффективны, чем гликозаминогликаны животного происхождения («Остенил», «Дона», АНК). Иммунометаболические эффекты гликозаминогликанов различного видового происхождения и гликозидаз («Лидазы» и «Лизоцима») при кровопотере усиливаются жиро- («Ретинола ацетат», «Токоферола ацетат», «Викасол», «Менадион») и водорастворимыми витаминами («Пиридоксина гидрохлорид», «Фолиевая кислота», «Цианкобала-мин»). Наиболее эффективно при этом совместное применение гликозаминогликанов и гликозидаз с витаминами А, К, В6, и В12. В реализации иммунотроп-ного действия совместного применения гликозидаз с витаминами А и К важную роль играют тяжелые эритроциты. Высокой иммунометаболической активностью обладает строма эритроцитов, включающая менадион и обработанная ли-зоцимом. Гликозаминогликаны или лизоцим, введенные с витаминами А или К, вызывают выраженный гепатопротекторный эффект. Иммунометаболические эффекты гликовитаминных взаимодействий опосредуются соединениями, вы-

деляющимися различными популяциями спленоцитов. Протеазы по отдельности и в сочетании с жиро- или водорастворимыми витаминами в норме или после кровопотери оказывают разнонаправленные иммунометаболические эффекты. Папаин не влияет, а лизоцим или террилитин по отдельности, в большей степени в сочетании с витаминами, повышают ФМА нейтрофилов и иммунную реактивность крыс после кровопотери. Строма эритроцитов крыс, полученная после кровопотери, реагирует на кобаламин повышением иммуномодулирую-щей активности, индуцируемой лизоцимом и террилитином

Практическая значимость. Экспериментально обоснована перспектива изучения иммуномодулирующего, гепатопротекторного действия лизоцима в сочетании с витаминами А, К, В6 или В12 при острых кровопотерях в хирургической, травматологической и акушерско-гинекологической практике. Показана возможность получения высокоэффективных иммунокорректоров, гепатопро-текторов на основе стромы эритроцитов, экстракорпорально взаимодействующих с менадионом и лизоцимом. Показана взаимосвязь фармакологических эффектов действия витаминов и гликолитических ферментов при кровопотере. Установлены стимулирующие эффекты террилитина и лизоцима, как по отдельности, так и в сочетании с витаминами, на функциональную активность нейтрофилов и иммунологическую реактивность крыс после кровопотери. Обнаружены иммуномодулирующие свойства стромы эритроцитов, индуцированной лизоцимом или террилитином, полученной после кровопотери и обработанной кобаламином.

Материалы диссертации включены в рабочие программы ряда кафедр Курского, Саратовского, Самарского и Российского государственных медицинских университетов, Нижегородской государственной медицинской академии, медицинских факультетов Белгородского и Орловского государственных университетов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Различие иммунометаболической активности гликозаминогликанов растительного и животного происхождения.

2. Эффективность иммунометаболического взаимодействия гликозами-ногликанов и витаминов.

3. Особенности иммунометаболических эффектов взаимодействия глико-зидаз и витаминов.

4. Интегрирующая роль эритроцитов в реализации иммунометаболических эффектов взаимодействия гликозидаз и витаминов.

5. Гепатопротекторные эффекты взаимодействия гликозаминогликанов, гликозидаз и витаминов.

6. Сочетанное применение террилитина или лизоцима с ретинола ацетатом или менадионом вызывает более выраженный иммуномодулирующий эффект, чем раздельное введение препаратов.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на конференциях Курского государственного медицинского университета: конференциях, посвященных 65- и 66-летию КГМУ «Актуальные проблемы медицинской науки и фармации» (Курск, 2000, 2001), IV съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Москва, 2000), VII и X Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2000, 2003), Международной научно-практической конференции «Современные технологии фитонутрициологии в акушерстве, гинекологии и педиатрии» (Москва, 2003), V Всемирном конгрессе rio иммунопатологии и аллергии (Москва, 2007), на совместном заседании кафедр фармакологии, фармацевтической и токсикологической химии с курсом аналитической химии, биохимии, спортивной медицины и медицинской реабилитации, акушерства и гинекологии, акушерства и гинекологии ФПО, микробиологии и патофизиологии Курского государственного медицинского университета (2008).

Публикации. По материалам диссертации в центральной и местной печати опубликовано 32 работы, в том числе 10 в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, и 3 монографиях. В работах содержится весь объем информации, касающейся темы диссертации.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 211 страницах машинописного текста, иллюстрирована 64 таблицами и 16 рисунками, со-

стоит из введения, обзора литературы (4 главы), описания методов исследования, изложения собственных результатов (11 глав), заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 280 отечественных и 111 иностранных источников.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследования. Исследования проведены на крысах Вистар массой 200-220 г. В опытах использовали животных, прошедших карантинный режим вивария Курского государственного медицинского университета и не имевших внешних признаков каких-либо заболеваний. Все животные содержались в одинаковых условиях, на обычном пищевом режиме. Для получения статистически достоверных результатов группы формировали из 8-10 животных. В контрольные и опытные группы входили животные одного возраста, полученные из питомника одновременно. Разброс в группах по исходной массе не превышал ± 10%. Все исследования проводили в одно и то же время суток с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (г. Страсбург, Франция, 1986). Животных выводили из опыта декапитацией под эфирным наркозом. Для исследования от опытных животных получали сыворотку крови, эритроциты и нейтрофилы периферической крови, ткань селезенки, подколенные лимфатические узлы.

Кровопотерю моделировали следующим образом: после предварительного обильного питья под общим обезболиванием выполняли венесекцию участка бедренной вены одной из задних лапок крысы, затем кашолировали мобилизованную вену и вводили 1000 МЕ гепарина, после чего из кровотока удаляли 21 мл/кг крови, что приблизительно соответствует 3,5-4 мл или кровопотере. Объем циркулирующей жидкости восполняли аналогичным кровопотере объемом 0,15 М раствора хлорида натрия (Барбет Ь.А., 1960).

Использованные фармакологические препараты и активные субстанции, производитель, способы, дозировки и кратность их введения представлены в табл.1.

Таблица 1

Изученные препараты и фармакологически активные субстанции

Фармакологически активная субстанция Препарат Фирма-производитель Способ введения Разовая доза, мг/кг Схема введения

Количество инъекций (введений) Интервал меяоду инъекциями (введениями), ч

ГАГ растительного происхождения

Polygonaceae (ГАГ-Р) — По способу И.Л, Ласковой и др. (а, с. № 1603714) в/жел в/м 10 2 5 12

Tiliaceae (ГАГ-Т) — в/жел в/м 10 2 5 12

Asteraceae (ГАГ-А) — в/жел в/м 10 2 5 12

ГАГ животного происхождения

Гиалуронат натрия Остенил Chemedica ag, Германия в/жел в/м 10 5 5 12

Глюкозамин Дона Rottaphaim, Италия в/жел в/м 10 5 5 12

АНК — Acros Organics Бельгия в/м 5 10 24

Гидролазы

Папайи млечный сок Папаин Медфлорина, Россия в/м 1 5 12

Террилитин Террилитин СПб НИИ вакцин и сывороток, Россия в/м 5 ME 5 12

Гликозидазы

Гиалуронидаза Лидаза ГУГ1 Иммунопрепа-рат, Россия в/м 1 ед./кг 5 - 12

Лизодим Лизоцим Брынцалов-А, Россия в/м 1 или 5 мг/кг 5 12

Жирорастворимые витамины

Ретинол Ретинола ацетат Фармацевтическая фабрика, СПб, Россия в/жел в/м 15 0,5 5 12

Токоферол Токоферола ацетат Верофарм, Белгородский ф-л, Россия в/жел в/м 30 1,0 5 12

Менадиона натрия бисульфит Викасол Дарница, Украина в/жел в/м 10 0,2 5 12

Менадиона натрия бисульфит Менадион Seth Pharmaceuticals PVT. LTD, Индия в/жел в/м 1,0 0,2 10 24

Водорастворимые витамины

Пиридоксин Пиридок-сина гидрохлорид АО «Ай-Си-Эн Октябрь», Россия в/м 2,5 5 12

Фолиевая кислота Фолиевая кислота АО «Ай-Си-Эн Октябрь», Россия в/м 1 5 12

Цианкобала-мин Цианкоба-ламин АО «Ай-Си-Эн Октябрь», Россия в/м 1,5 5 12

Способ введения препаратов соответствовал рекомендациям, приведенным в пособии по фармакотерапии М.Д. Машковского «Лекарственные средст-

ва» и аннотациях по использованию препаратов.

Таблица 2

Методы исследований

Объект Крысы Вистар

Модель Кровопотеря 2% от массы тела

Показатели

Иммунная реактив-постъ ГИО (гуморальный иммунный ответ) АОК (антителообразующие клетки)

ГЗТ (гиперчувствительносгъ замедленного типа) РМЛ (раз1шца массы лимфоузлов)

Функциональио-мстаболичсская акгив-носгь нейтрофилов Фагоцитарная активность ФИ (фагоцитарный индекс) ФЧ (фагоцитарное число)

Кислородзависимая активность НСТ-сп. (тест восстановления нитросинего тетразолия спонтанный)

НСТ-шш. (тест восстановления нитросинего тетразолия индуцированный)

Энергетический, анти-оксидангный статус и ПОЛ эритроцитов Энергетичский статус БФГ (бифосфоглицерат) АТФ (аденозшггрифосфат)

Антиоксидангаый статус СОД (супсроксиддисмутаза) ГП (глутатионпероксидаза)

Каггалаза ГР (глутагионредуктаза)

ПОЛ МДА (малоновый диальдегид) ДК (диеновые коньюгаты)

Метаболические маркеры клеток крови Полиморфноядерные лейкоциты Активность НАДФН-оксидазы

Лимфоциты Содержание фруктозо-2,6-дифосфатазы

Эритроциты + Активность Mg2 -АТФ-азы

Тромбоциты Содержание МДА

Метаболическое состояние гепатоцитов AJ1T (аланинами- ACT (аспартатами- ЩФ (щелоч- ОБ (общий би- Скорость биотрансформации нотрансфераза) нотрапсфераза) ная фосфата- лирубин) тиопентала натрия за)

Иммуномодулирующие соединения крови ГАГ (гликозаминоглика- ЛНП (липопротеиды шя- ААП (а(- АМГ (а2-макроглобулины) ны) кой плотности) антипротсазы)

О выраженности ГИО судили по количеству АОК и РОК в селезенке. Индукцию иммунного ответа проводили эритроцитами барана (Кэбот Е., Мей-ер М., 1968). Антиген вводили внутрибрюшшшо в дозе 108 клеток на 1 кг массы тела. Число АОК к ЭБ устанавливали методом прямого локального гемолиза в агаре (Мальберг К., Зигль Э., 1987). Количество иммунных РОК определяли по X. Зауэр (1987). Для определения выраженности ГЗТ сенсибилизирующую дозу ЭБ (106) вводили внутрибрюшинно, спустя 4 суток в подушечку правой лапки вводили разрешающую дозу ЭБ (108), а в подушечку левой лапки вводили 0,15 M хлорид натрия. О выраженности ГЗТ судили по величинам разницы массы регионарных и контрапатеральных лимфатических узлов спустя 24 ч после введения разрешающей дозы (Федосеева В.Н. и др., 1993) (табл. 2).

Функционально-метаболическую активность нейтрофилов оценивали по их способности поглощать инертные частицы латекса размером 1,5-2 мкм. Рассчитывали: фагоцитарный показатель, фагоцитарное число, индекс активности фагоцитоза (Медведев А.Н., Чаленко В.В., 1991). Кислородзависимую активность полиморфноядерных лейкоцитов оценивали по показателям НСТ-тестов спонтанного и стимулированного зимозаном и по общему резерву нейтрофилов - разнице между спонтанным и стимулированным тестами (Щербаков В.И., 1989) (табл. 2).

Спленоциты получали из ткани селезенки, которую извлекали в асептических условиях и измельчали ножницами в чашках Петри. Полученную тканевую массу разбавляли средой 199, гомогенизировали в гомогенизаторе Потте-ра-Уэлса и центрифугировали 10-15 минут при 200 g. Суспензию фильтровали через капроновые сетки и дважды отмывали средой 199 в течение 10 минут при 200 g. Эритроциты удаляли гемолитическим шоком (Бурмейстер Ю., 1979). Клетки селезенки фракционировали по способности прилипать к стеклу при различной температуре (Родионов C.B. и др., 1985). Прилипающие и неприли-пающие клетки инкубировали в среде 199 (107 клеток на 1 мл среды), содержащей 5% телячьей эмбриональной сыворотки и антибиотики (пенициллин и

стрептомицин), в течение 4-6 часов в ламинарном боксе при периодическом обновлении газовой среды (95% кислорода и 5% двуокиси углерода) и готовили пул супернатантов прилипающих и не прилипающих к стеклу клеток селезенки, содержащих равные объемы супернатантов 5-6 животных. Белки супернатантов прилипающих и неприлипающих клеток селезенки после диализа и концентрирования фракционировали на сефадексе G-150. Получали три фракции белков: фракция 1 содержала белки с молекулярной массой более 150 кД, фракция II -белки с молекулярной массой 50-60 кД и фракция III - белки с молекулярной массой менее 15 кД. Концентрацию белков во фракциях устанавливали по Бредфорд. Активность фракций оценивали путем внесения их в среду инкубации ПЯЛ.

Выделение эритроцитов проводили следующим образом. Кровь отстаивали дважды в 10 мМ Na-фосфатном буфере (рН = 7,4), содержащем 0,9% хлорида натрия и 2% декстрана Т-500, в течение 30 мин при 37°С. Затем кровь центрифугировали (3000 об/мин, в течение 10 мин при 4°С). Слой эритроцитов удаляли аспирацией. Эритроцитарную массу подвергали дополнительной очистке на хроматографической колонке, содержащей HBS-целлюлозу в 10 мМ Na-фосфатном буфере, содержащем 0,9% хлорида натрия. После очистки эритроциты осаждали центрифугированием (3000 об/мин в течение 10 мин при 4°С) (Beutler, 1985). Эритроциты фракционировали в градиенте плотности яичного альбумина (Кобзев Т.В. и др., 1978). Для приготовления градиента носителя навеску сухого яичного альбумина растворяли в буферном растворе (рН = 7,8). Готовили ряд пробирок, содержащих 1 мл раствора яичного альбумина: 1 пробирка - конц. 28% (d = 1,079 г/см3), 2 пробирка - конц. 30% (d = 1,091 г/см3), 3 пробирка - конц. 40% (d = 1,105 г/см3), 4 пробирка - 43% (d = 1,117 г/см3). Взвесь эритроцитов (5 х 109 клеток в 0,5 мл среды 199) наносили на раствор альбумина в первую пробирку и центрифугировали при 1400 g в течение 10 мин. Верхняя зона представляла собой легкие эритроциты (плотность ниже 1,079 г/см3). Нижнюю зону переносили во вторую пробирку и центрифугировали, верхнюю зону клеток отбрасывали, а нижнюю переносили в третью про-

бирку. После центрифугирования отделяли эритроциты верхней зоны, имеющие плотность 1,091-1,105 г/см3 (промежуточная по плотности фракция), а клетки нижней зоны вносили в четвертую пробирку. После центрифугирования отделяли нижнюю зону клеток. Это фракция тяжелых эритроцитов с плотностью, превышающей 1,117 г/см3.

Полученные фракции эритроцитов тщательно отмывали от альбумина 0,15 М хлоридом натрия и использовали для введения аллогенным животным.

Спленоциты культивировали с аллогенными эритроцитами или их фракциями в соотношении клеток 1:2 (5 х 107 лимфоцитов и 108 эритроцитов на 3 мл среды) в среде 199 (5 х 107 клеток на 3 мл среды), содержащей 5% телячьей эмбриональной сыворотки и антибиотики (пенициллин, стрептомицин), в течение 4 часов в ламинарном боксе при периодическом обновлении газовой среды (95% кислорода и 5% углекислого газа). По истечении срока инкубации клетки осаждали центрифугированием при 400 g в течение 15 минут и готовили пул надосадочных жидкостей, содержащих равные объемы жидкостей 5-6 животных.

Пул жидкости диализовали в течение 12-15 часов против 50-кратного объема 0,05 М трис-буфера (рН=8,0), приготовленного на 0,15 М хлориде натрия. После диализа его концентрировали полиэтиленгликолем (ММ 40 кД) и повторно диализовали против трис-НС1 -буфера). Очищенную от низкомолекулярных веществ и сконцентрированную надосадочную жидкость осаждали от образовавшегося при концентрировании осадка центрифугированием при 800 g в течение 20 минут. Концентрацию белка в надосадочных жидкостях и их фракциях определяли по Бредфорду, используя краситель Кумаси 0-250 (Шишкин С.С., 1982).

Активность надосадочных жидкостей и их фракций определяли путем добавления их к взвеси мононуклеаров в объеме, содержавшем 100 мкг белка, и последующего определения показателей ФМА мононуклеаров.

Выделение стабильного метаболита оксида натрия лейкоцитами определяли спектрофотометрически с использованием реактива Грисса (Голиков П.П.

и др., 2003). Активность НАДФН-оксидазы нейтрофилов определяли по J1.B. Никитиной и др. (2001), содержание фруктозо-2,6-дифосфата (ФДФ) в лимфоцитах - по Б.Ф. Коровкину и др. (1999). В строме эритроцитов определяли суммарную активность Na+, К+-АТФазы и Mg^-АТФазы (Рыжикова Г,Ф., Виишяков С.И., 2005). Активность последней устанавливали в присутствии да-балсна, ингибирующего Na+, К+-АТФазу. В тромбоцитах определяли содержание МДА (Негреску Е.В., 1992) (табл. 2).

Иммуносупрессорный потенциал крови оценивали по концентрации в сыворотке ЛНП (Кобл В.Г., Камышников B.C., 1976), ДК и МДА (Стальная И.Д., 1977; Стальная И.Д. и Гаришвили Т.Г., 1977), ГАГ (Мудрашов Б.Ф. и др., 1986), активности антипротеолитических белков - АЛЛ и АМГ (Нартикова В.Ф., Пас-хина Г.С., 1979). Иммуностимулирующую активность сыворотки оценивали по концентрации АНК (Колб В.Г. и Камышников B.C., 1976), активности протео-литических ферментов (Покровский A.A., 1969) и лизоцима (Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1974) (табл. 2).

В эритроцитах определяли содержание макроэргических соединений (БФГ и АТФ) (Виноградова И.Л. и др., 1980) и активность антиоксидантных ферментов (СОД и ГР) (Макаренко Е.В., 1988) (табл. 2).

ГАГ выделяли из соцветий лекарственных растений Polygonaceae (ГАГ-Р), Tiliaceae (ГАГ-Т) и Astraceae (ГАГ-А) по способу Ласковой И.Л. и др. (а.с. № 1603714). Способ включает экстракцию 5% раствором серного эфира в этаноле и очищение горячей (95°С) водой, деминерализацию путем переосаждения этанолом и диализом, дополнительную деминерализацию ионитами, очистку от белковых примесей, обработкой смесью хлороформа и этилового спирта и щелочного омыления гетерополисахаридного комплекса. Количественный и качественный состав выделенных полисахаридов изучен и описан ранее. Полученные соединения являются глнжуроногликанами, в состав которых входят D-галактуроновая кислота (60-80%), галактоза (15-19%), глюкоза (6-12%), ара-биноза (4-8%) и рамноза (5-10%) (Яковлев А.И. и др., 1985,1988).

Получение эритроцитов, обработанных ГАГ-Р и менадионом. Эритроциты здоровых крыс и животных, потерявших 2% крови, инкубировали в растворах, 1 мл которых содержал 1, 2 или 3 мг ГАГ-Р или 1, 2 или 3 мг менадиона. К 1 мл раствора добавляли 107 эритроцитов и инкубировали 30 минут при 37°С.

Для включения менадиона в строму эритроцитов использовали метод ги-поосмотического гемолиза (Генинг Т.П. и др., 1988; Жумадилов Ж.Ш., Мака-ренкова Р.В., 1990) Эритроциты крыс, выделенные из 3 мл крови, дважды отмывали изотоническим раствором натрия хлорида путем центрифугирования при 500 g в течение 5 мин при 4°С. К осадку эритроцитов добавляли семикратный объем охлажденной до 0°С дистиллированной воды и центрифугировали при 1500 g в течение 25 мин. К полученной строме приливали пятикратный объем менадиона, растворенного в охлажденной до 5°С дистиллированной воде. Концентрация препарата в инкубационной среде составляла 1, 2 или 3 мг/мл. Взвесь инкубировали в течение 20 мин при 4°С, затем добавляли 1/10 объема 10% хлорида натрия для восстановления целостности стромы и инкубировали в течение 30 мин при 37°С. После включения менадиона в стро-мальные сферы, последние дважды отмывали изотоничеким раствором натрия хлорида, затем осаждали при 1500 g в течение 10 мин.

Включение ГАГ в строму эритроцитов осуществляли методом гипоосмо-тического гемолиза (см. выше). О включении ГАГ в строму судили по увеличению в среде гексуроновых кислот после полного гемолиза стромальных сфер (Прохорова М.И., 1982).

СЭОГ и СЭОМ вводили внутрибрюшинно 5-кратно с 12-часовым интервалом по 108 частиц на 1 кг массы тела. Одновременно с первой инъекцией СЭОГ или СЭОМ животных иммунизировали ЭБ. Контролем служили крысы, которым вводили строму эритроцитов, не обработанную препаратами.

Статистическая обработка материала. Вычисляли средние арифметические величины определявшихся показателей и их стандартные ошибки. Существенность различий средних величин оценивали по критериям Стьюдента (Ла-кин Т.Ф., 1980), Вилкоксона, Манна-Уитни (Гублер Е.В., Генкин A.A., 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Иммуномодулнрующес действие жирорастворимых витаминов н гликозаминоглнкапов при кровопотерс. Внутрижелудочное введение ГАГ, выделенных из растений семейства Teliaceae, Asteraceae и Polygonaceae (ГАГ-Т, ГЛГ-А и ГАГ-Р), интактным крысам не влияло на развитие у них ГИО и ГЗТ, индуцированных ЭБ. Внутримышечное введение ГАГ интактным животным стимулировало развитие ГИО, но не влияло на ГЗТ. Наиболее выраженный стимулирующий эффект вызвало введение ГАГ-Р.

Потеря 2% крови угнетала развитие ГИО и ГЗТ, подавляла функционально-метаболическую активность лейкоцитов периферической крови, снижала содержание БФГ, АТФ, активность СОД и ГР в эритроцитах, повышала концентрацию АГП и МДА, активность АЛТ, ACT, ААП, АМГ, ЩФ и содержание ОБ в плазме крови. По-видимому, после потери 2% крови иммуносупресси-рующий эффект, вызываемый повышением интенсивности ПОЛ, усиливается нарушением функций гепатоцитов и накоплением в крови ААП и АМГ, обладающих выраженными иммуносупрессорными свойствами (Прокопенко Л.Г. и Др., 1998).

Установлено, что внутримышечное и внутрижелудочное введение ГАГ-Р в сочетании с РА или ТА корригирует ГИО и ФМА нейтрофилов и не влияет на развитие ГЗТ. Комбинированное применен не ГАГ-Р и филлохинона или мена-диона частично или полностью корригирует клеточный и гуморальный иммунный ответ и ФМА полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови КПК (табл. 3).

После кровопотери легкие эритроциты приобретали иммуносупресси-рующие свойства. Введение ГАГ-Р и менадиона ослабляло иммуносупресси-рующие свойства легких эритроцитов и индуцировало появление иммуностимулирующих свойств у тяжелых клеток. Полученные данные свидетельствуют о существенной роли эритроцитов в реализации иммуномодулирующего действия совместного применения ГАГ и менадиона при кровопотере.

Таблица 3

Влияние сочетанного применения гликозаминогликанов растительного происхождения с жирорастворимыми витаминами на иммунитет крыс

после кровопотери

№ п/п Условия опыта гио гзт Функциональная ативность нейтрофнлов

1. Кровопотеря Угнетение Угнетение Угнетение

2. Кровопотеря и введение гликозаминогликанов семейства Ро1у-gonaceae и ретинола ацетата Коррекция Нет эффекта Коррекция

3. Кровопотеря и введение гликозаминогликанов семейства Ро1у-йопасеае и токоферола ацетата Коррекция Нет эффекта Коррекция

4. Кровопотеря и введение гликозаминогликанов семейства Ро1у-йопасеае и филлохинона Нормализация Нормализации Нормализация

5. Кровопотеря и введение гликозаминогликанов семейства Ро1у-^опасеае и менадиона Нормализация Коррекция Нормализация

Иммуномодулирующее действие гликозаминогликанов Ро^опасеае

и менадиона, иммобилизованных стромой эритроцитов после кровопотери.

Наиболее простым способом фиксации лекарственных препаратов на нерастворимом в водной фазе носителе является адсорбция их на цитоплазматической мембране эритроцитов. Известно, что инкубация эритроцитов в растворах, содержащих ферменты и фосфолипиды, приводила к появлению у этих клеток иммуномодулирующих свойств (Прокопенко Л.Г. и др., 1998). Выраженное влияние на иммуномодулирующие свойства эритроцитов оказывает менадион. Принимая во внимания изложенное, были изучены иммуномодулирующие свойства ГАГ-Р и менадиона, соиммобилизованных на эритроцитах и их стро-ме.

При инкубации с ГАГ-Р эритроциты интактных крыс приобретали свойство стимулировать развитие иммунного ответа у здоровых животных и крыс после кровопотери, причем наиболее выраженными иммуномодулирующими свойствами обладали эритроциты, инкубированные в среде, содержащей 3 мг/мл ГАГ-Р.

Инкубация с ГАГ-Р не индуцировала у эритроцитов, полученных у крыс после кровопотери, свойства модулировать развитие гуморального иммунного

ответа у здоровых животных и крыс, потерявших 2% крови. Полностью неактивными были также эритроциты, инкубированные с менадионом. Эти наблюдения показывают, что после кровопотери мембрана эритроцитов становится рефрактерной к раздельному действию ГАГ-Р и менадиона.

Принимая во внимание изложенное, было изучено иммуномодулирующее действие стромы эритроцитов интактных крыс, экстракорпорально обработанной ГАГ-Р или менадионом.

СЭОГ и СЭОМ стимулировали развитие иммунного ответа на ЭБ у здоровых животных. Наиболее выраженная стимуляция имела место при введении частиц, полученных при содержании в инкубационной среде 2 и 3 мг/мл ГАГ-Р. После кровопотери СЭОГ повышала, но не до уровня контрольной группы, а СЭОМ - не влияла на развитие различных форм иммунного ответа на ЭБ. Изучена также иммуномодулирующая активность стромы эритроцитов, полученных после кровопотери и инкубированной с ГАГ-Р или менадионом. Оказалось, что введение стромы, обработанной ГАГ-Р в дозе 2 мг/мл до или после кровопотери, вызывало слабо выраженный иммуномодулирующий эффект, а инъекции стромы, инкубированной с менадионом или с ГАГ-Р в дозе 1 и 3 мг/мл, не влияли на выраженность иммунной реакции, индуцированной ЭБ. На основании этих экспериментов можно прийти к заключению, что компоненты структуры стромы эритроцитов крыс, потерявших 2% крови, в процессе гемолиза претерпевают изменения, ослабляющие или предотвращающие взаимодействия с ними изученных соединений.

Принимая во внимание то обстоятельство, что цельные тяжелые эритроциты, инкубированные с ГАГ-Р, приобретают иммуностимулирующие свойства, а клетки, обработанные аналогичным образом менадионом, остаются имму-нологически неактивными, возникло предположение, что инкубация СЭОМ с ГАГ-Р повысит стабильность и увеличит иммуномодулирующую активность стромальных частиц. Для проверки этого предположения СЭОМ, полученные на основе клеток интактных животных и крыс, подвергнутых кровопусканию, обрабатывали in vitro ГАГ-Р 2 мг/мл и полученные частицы (СЭОМГ) вводили животным до или после кровопотери.

Оказалось, что СЭОМГ интактных крыс стимулировала развитие иммунного ответа у здоровых животных в значительно большей степени, чем СЭОГ. Об этом свидетельствовал тот факт, что у животных, получавших инъекции СЭОГ, количество АОК в селезенке было в 3,2 раза выше, чем в контроле, а у крыс, которым вводили СЭОМГ, эти параметры превышали контрольный уровень соответственно в 4,9 и 3,5 раза (табл. 4). В отличие от СЭОГ, СЭОМГ нормализовал развитие иммунного ответа после кровопотери. Принципиально важным является тот факт, что СЭОМГ, полученная на основе клеток, выделенных после кровопотери, в отличие от СЭОГ стимулирует развитие гуморальной иммунной реакции на ЭБ у здоровых животных и КПК (табл. 4).

Таблица 4

Влияние стромы эритроцитов интактных животных и КПК, последовательно обработанной менадионом и ГАГ-Р, на развитие иммунного ответа у здоровых животных и КПК

№ п/п Условия опыта Здоровые животные КПК

АОК РМЛ АОК РМЛ

1. Контроль (без введения стромы) 25,4±2,7 5,7±0,5 7,1±0,9 2,3±0,2

2. Введение СЭОГ интактных животных 8 ¡¿±8,4"' 9,1±1,0"' 16,4±1,8*' 3,9±0,3''

3. Введение СЭОМГ интактных животных 124,5±14,3"'"' 8,8±0,9"''^ 27,0±2,9'и 5,2±0,5'1"'

4. Введение СЭОГ КПК 24,8±2,6 5,0±0,5 7,2±0,8 2,5±0,3

5. Введение СЭОМГ КПК 83,5±8,8",/! 4,8±0,4'и 22,9±2,8'и 5,7±0,5"'"г

Примечание. Здесь и на последующих таблицах: 1. * - р<0,05; 2. - цифра рядом со звездочкой указывает на группу, по отношению к которой различия достоверны.

Таким образом, обработка стромы эритроцитов менадионом повышает чувствительность ее структур к модифицирующему действию ГАГ-Р. Механизм этого эффекта остается неясным. Можно лишь предположить, что при взаимодействии менадиона с соединениями стромы эритроцитов образуются структуры, модифицирующие состояние фосфолипидного каркаса мембраны эритроцитов и повышающие эффективность связывания с ними ГАГ-Р.

Иммупомодулирующее действие модифицированных лекарственными соединениями эритроцитов обусловлено цитокинами, выделяемыми моиоци-тарно-макрофагальными и лимфоидными клетками селезенки (Конопля H.A., 2001). Не исключено, что аналогичный механизм реализуется при введении в организм модифицированной стромы эритроцитов. Для проверки этого предположения клетки селезенки крыс, подвергнутых кровопусканию и получавших инъекции СЭОМГ, фракционировали по способности прилипать к стеклу при различной температуре среды, культивировали в течение 6 ч, получали супернатант и тестировали его на наличие иммуномодулирующей активности. Установлено, что супернатант клеток, прилипающих к стеклу при 4-10°С, супресси-рует у аллогенных животных развитие иммунного ответа на ЭБ. Супернатант неприлипающих клеток увеличивает выраженность иммунной реакции, но в меньшей степени, чем супернатант прилипающих при 32-37°С клеток (табл. 5).

Фракция III супернатанта неприлипающих клеток при аллогенном переносе стимулировала развитие иммунного ответа на ЭБ в такой же степени, как и содержащий ее объем нефракционированного супернатанта. Остальные фракции супернатанта неприлипающих клеток не влияли на выраженность реакции, индуцированной ЭБ. Фракция II клеток, прилипающих при 4-10°С, обладала иммуносупрессирующей активностью, а фракция III клеток, прилипающих при 32-37°С, - иммуностимулирующими свойствами.

Клетки моноцитарно-макрофагального ряда выделяют пептиды, оказывающие влияние не только на функциональную активность иммуноцитов, но обладающие также антиоксидантными и гепатопротекторными свойствами (Кетлинский С.А. и др., 1992). Определение антиоксидантной и гепатопротек-торной активности прилипающих и неприлипающих клеток селезенки крыс, потерявших 2% крови, получавших инъекции СЭОМГ, показало, что только фракция I супернатанта спленоцитов, прилипающих к стеклу при 32-37°С, снижает содержание ДК, МДА, активность AJIT, ACT и ЩФ, но не влияет на концентрацию общего билирубина в сыворотке крыс, подвергнутых кровопусканию и не получавших инъекции СЭОМГ. Остальные фракции супернатантов

прилипающих и нсприлипающих клеток не влияли на величину показателей, характеризующих выраженность процессов ПОЛ и состояние гепатоцитов после кровопотсри. На основании проведенных экспериментов можно сделать вывод, что иммуномодулирующее действие и метаболические эффекты ГАГ-Р и менадиона опосредуются цитокинами, выделяемыми различными популяциями снленоцитов.

Таблица 5

Влияние фракций клеток селезенки КПК, получавших инъекции СЭОМГ, на развитие ГИО у интактных крыс

Фракции АОК

Клетки селезенки, не прилипающие к стеклу

Супернатант 50,6±5,2*

Фракция I 23,7±2,8

Фракция 11 25,0±3,1

Фракция III 56,3±6,1*

Клетки селезенки, прилипающие к стеклу при 4-10"С

Супернатант 8,б±0,9*

Фракция I 25,6±2,6

Фракция II 8,8±1Д*

Фракция III 24,2±2,8

Клетки селезенки, прилипающие к стеклу при 32-3 7°С

Супернатант 64,6±7,2*

Фракция I 23,8±2,9

Фракция II 25,5±2,9

Фракция III 48,5±5,1»*

Фракция I + III 47,8±5,2**

Фракция II + III 68,3±7,4+**

Примечание:

1. Каждая средняя величина получена в опытах на 8-10 крысах.

2. В контроле количество АОК 24,7±3,1 тыс./орган, количество РОК 52,6±5,8 тыс./орган.

3. * - существенность различий относительно контроля.

4. ** - существенность различий относительно нефракционированного супернатанта.

5. *** - существенность различий относительно группы «Фракция 1+Ш».

В качестве препарата сравнения использовали гетерополисахарид животного происхождения - гиалуронат калия. Оказалось, что внутрижелудочное и внутримышечное введение ГК в дозах, соответственно равных 10 мг/кг и 5 мг/кг, не оказывало влияния на ФМА лейкоцитов, развитие ГИО и ГЗТ у здоровых крыс.

Отдельное использование ГК и менадиона не оказывает влияния на ФМА ПЯЛ, показатели ГИО и ГЗТ животных после кровопотери. Совместное внутримышечное применение ГК с менадионом не влияет на ФЧ, но повышает ФИ, НСТ-сп. и НСТ-ст, тесты, развитие ГИО и ГЗТ у животных после кровопотери.

Иммунометаболические эффекты, вызываемые Г^-ацетилнейра-миповой кислотой, глюкозамином, водо- и жирорастворимыми витаминами после кровопотери. Введение после кровопотери АНК в дозе 1 мг/кг увеличивало показатели ГИО, но не влияло на выраженность ГЗТ. В дозе 2 мг/кг АНК нормализовала развитие ГИО и усиливала, но не нормализовала развитие ГЗТ. ГА в дозе 1 мг/кг не влиял на иммунную реактивность, а в дозе 2 мг/кг -угнетал показатели ГИО и ГЗТ. Ы-ацетилнейраминовая кислота уменьшала выраженность вызываемого кровопотерей снижения величины метаболических маркеров активности полиморфноядерных лейкоцитов и лимфоцитов (активности НАДФН-оксидазы и содержания ФДФ) и не влияла на величины маркеров эритроцитов и тромбоцитов (активности М§2+-АТФазы и содержания МДА). Установлено, что тромбоциты, полученные после кровопотери, существенно угнетают активность \^2+-АТФазы в стромальных частицах эритроцитов ин-тактных животных (активность 1^2+-АТФазы стромы эритроцитов интактных крыс равнялась 0,63±0,08%, активность фермента после инкубации стромы с тромбоцитами - 0,40±0,05 мкмоль фосфата на 1 г белка в час, р < 0,05), снижают выраженность феномена АЗКЦ (до инкубации 11,6±1,3%, после инкубации- 7,2±0,8%), не влияя на активность НАДФН-оксидазы ПЯЛ (до инкубации - 1,31 ± 0,19, после инкубации 13,8 ± 0,17 г • моль/мин на 103 клеток) и содержание ФДФ в лимфоцитах (до инкубации - 0,92±0,18, после инкубации 0,78±0,15 пкмоль/106 клеток). Введение АНК после кровопотери не влияло на вызываемое тромбоцитами снижение активности М£2+-АТФазы стромы эритроцитов интактных животных и ослабляло тромбоцитзависимое снижение индекса АЗКЦ.

Введение АНК, пиридоксина, фолата или кобаламина здоровым или КПК не оказывало влияния на ФМА ПЯЛ, развитие ГИО и ГЗТ, индуцированных ЭБ.

Сочетанное применение АНК с пиридоксином, фолатом вызывало существенное повышение всех показателей, характеризующих ФМА ПЯЛ, выраженность развития ГИО (но не ГЗТ) на ЭБ. При сочетании АНК с кобаламином величины ФМА ПЯЛ, ГИО и ГЗТ достигали уровня контроля. Введение после кровопоте-ри ретинола ацетата, токоферола ацетата повышало (но не нормализовало) ФМА ПЯЛ и иммунологическую реактивность организма в отношении ЭБ. Инъекции АНК не влияли на эффекты, вызываемые токоферола ацетатом, но усиливали иммуномодулирующее действие ретинола ацетата и менадиона (табл. 6).

Таблица 6

Влияние сочетаниого применения >'-ацетилнейраминовой кислоты, водо- и жирорастворимых витаминов на иммунную реактивность и ФМА

нейтрофилов КПК

№ пУп Условия опыта ФАН ОРН АОК РМЛ

1. Контроль 54,0±5,1 26,4±2,8 27,5±3,0 5,8±0,6

2. Кровопотеря 14,0*2,1'' 11,2±],4"' 9,2±1,Г' 2,4±0,2''

3. Кровопотеря, введение АНК 13,3±1,5"' 11,7±1,3"' 10,3±1,4"' 2,7±0,3М

4. Кровопотеря, введение пири-доксина и АНК 19,4±2,3''"3 З^О^'1"'

5. Кровопотеря, введение фолата и АНК 34,±4,1"'-' 20,1±2,3'1"' 4,3±0,4"м

6. Кровопотеря, введение кобала-мина и АНК 55,7±5,4'" 28,2±3,1'" 29,3±3,2'" 6,Ш,6Ч-Ь

7. Кровопотеря, введение ретинола ацетата и АНК 50,2*5,0'" 27,3*2,5"" 26,8±2,7'" 5,4*0,5'"

8. Кровопотеря, введение токоферола ацетата и АНК 35,6±3,4'1-ЗА' 19,Ш:2)2"'"''А' 19,4±2,3"'"'(,ь'' 3,7±0,4'|"'',>''

9. Кровопотеря, введение менадиона и АНК 55,87±5,б'"'8 28,3±3,2'"'8 5,9±0,б"''"5'8

Введение АНК и препаратов витаминов В6 В9 и В12 по отдельности не влияло на показатели окислительно-энергетического статуса и иммунологические свойства легких и тяжелых эритроцитов КПК. Введение АНК в сочетании с пиридоксином, фолатом или кобаламином уменьшало выраженность метаболических изменений эритроцитов и их иммуносупрессирующих свойств, а инъекции АНК с кобаламином, кроме указанного выше, индуцировали появление иммуностимулирующих свойств у тяжелых эритроцитов.

Экстракорпоральное воздействие АНК и кобаламина или АНК и мена-диопа па эритроциты не индуцировало появление у них иммуномодулирующих свойств. Это дает основание считать, что необходимой предпосылкой появления у тяжелых эритроцитов иммуностимулирующей активности служит изменение в организме метаболического состояния эритроцитов, возможно, их энергетического и антиоксидантного потенциала, сопровождающегося возникновением мембранных структур, распознаваемых иммунокомпетентными клетками крови и лимфоидных органов.

Для проверки обоснованности этого представления проведены два варианта эксперимента. В первом КПК, получавшим инъекции кобаламина или ме-надиона вводили экстракорпорально обработанные АНК тяжелые эритроциты интактных крыс, во втором - КПК, получавшим инъекции АНК, вводили экстракорпорально обработанные кобаламином или менадионом эритроциты здоровых крыс. В первом случае имел место иммуномодулирующий эффект, во втором такой эффект не выявлен. На основании полученных данных можно считать, что кобаламин и менадион в организме КПК сенсибилизируют эритроциты к последующему экстракорпоральному взаимодействию с АНК, приводящему к появлению у эритроцитов иммуностимулирующей активности. В отличие от этого, АНК в организме не повышает чувствительности эритроцитов к экстракорпоральному взаимодействию с витаминами.

Можно предположить, что N-ацетилнейраминовая кислота взаимодействует с гликопептидными эпитопами наружной поверхности цитоплазматиче-ской мембраны эритроцита. Кобаламин внедряется в фосфолипидную структуру мембраны, а менадион проникает в цитоплазму клетки и активирует белки, регулирующие активность мембранных белков (Лазарев А.И., Конопля H.A., 2003). Вероятно, вызываемые кобаламином и менадионом метаболические эффекты трансформируются в конформационные изменения эпитопов, облегчающие связывание с ними N-ацетилнейраминовой кислоты. Результатом этого, по-видимому, является повышение эффективности взаимодействия эритро-

цитов с мембранными структурами макрофагов, приводящее к активации их защитных функций.

В качестве препарата сравнения выбран глюкозамин. Введение глюкоза-мина здоровым или подвергнутым кровопусканию крысам не оказывало влияния на ФМА ПЯЛ и развитие ГИО, индуцированного ЭБ. Инъекции глюкоза-мина с витаминами усиливали иммунологические функции после острой кро-вопотери. Наиболее выраженным было иммуномодулирующее действие глюко-замина с кобаламином, однако, даже в случае введения этих препаратов, параметры иммунологических функций не нормализовались полностью.

Иммуномодулирующее действие гиалуронидазы и жирорастворимых витаминов в норме и после кровопотери. Введение здоровым животным препарата гиалуроновой кислоты вызывает слабо выраженный иммуносупресси-рующий эффект. В отличие от этого, продукты частичного гидролиза гликоза-миногликанов стимулируют индуцированную фитогемагглютинином бласт-трансформацию лимфоцитов и выделение ими хелперных цитокинов, усиливают развитие гуморальной и клеточной форм иммунного ответа (Лазарев А.И., Прокопенко Л.Г., 1995), Фрагментация гликозаминогликанов осуществляется набором ферментов, важнейшим из которых является гиалуронидаза. Установлено, что введение гиалуронидазы повышало ФМА полинуклеаров, стимулировало развитие ГИО и ГЗТ в норме и не влияло на указанные параметры после кровопотери. Изучение влияния гиалуронидазы на иммуномодулирующее действие жирорастворимых витаминов показало, что введение гиалуронидазы с РА, ТА или менадионом приводило к выраженному повышению фагоцитарной и метаболической активности нейтрофилов и иммунологической реактивности у здоровых крыс. Инъекции гиалуронидазы или жирорастворимых витаминов по отдельности не приводили к появлению в крови животных эритроцитов, обладающих иммуномодулирующими свойствами. Введение гиалуронидазы с РА или менадионом индуцировало появление у тяжелых эритроцитов иммуностимулирующих свойств. Инъекции гиалуронидазы с ТА такого эффекта не вызывали (табл. 7).

Таблица 7

Влияние гналуронидазы и жирорастворимых витаминов на ФМА лейкоцитов, развитие ГИО и ГЗТ у здоровых крыс

Показатели 1 2 3 4 5

Контроль Кровопотеря Введение Г и РА Введение ГиТА Введение Г и менадиона

АОК 26,4±2,8 9,6+1,3"' 67,2±7,Ги 59,3±6,4'1"' 63,7±6,8*l,i

РМЛ 4,5±0,5 2,3±0,2'' 7,4±0,8'u б,9±0 ,Ти 7,2±0,7'u

ФЧ 47,U3,8 25,4±2,3Л 85,0±7,6"u 79,4±7,6"1'i 83,5±7,9"^

ФИ 1,5±0,1 0,6±0,Г' 4,0±0,4''"! 3,6±0,4'w 3,9±0,4"u

НСТ-сп. 13,2±0,9 6,8±0,6"' 14,3±1,f'! 27,5±2,9*'"J 28,4±6,0"'"J

НСТ-ст. 35,3±1,9 21,3±1,8"' 52,4±3,7"'-i 56,0±2,7''"i 58,4±3,Г1'1

Установлено, что введение интактным крысам ЭКПГ не влияло на активность полинуклеаров и выраженность иммунного ответа, индуцированного ЭБ. Инъекции ЭКПГ животным, получавшим РА, ТА или мснадион, повышали активность полинуклеаров и стимулировали развитие иммунного ответа в значительно большей степени, чем введение этих препаратов без ЭКПГ. Наиболее выраженное усиление ГИО и ГЗТ имело место при введении ЭКПГ крысам, которым вводили менадион.

Иммунометаболическис эффекты, вызываемые лизоцимом при кро-волотере. Введение после кровопотери лизоцима дозозависимо снижало содержание ДК и МДА, активность АЛТ и ACT, нормализовало содержание лизоцима сыворотки крови при введении лизоцима в дозе 5 мг/кг. Введение лизоцима в дозе 1 мг/кг усиливало, а в дозе 5 мг/кг нормализовало развитие иммунного ответа на ЭБ. Обе дозы препарата индуцировали появление иммуностимулирующих свойств у тяжелых эритроцитов КПК. Введение интактным крысам супернатанта спленоцитов, содержащего иммуносупрессирующий фактор, не оказывало влияния на содержание продуктов ПОЛ и активность ферментов в сыворотке крови. В отличие от этого, введение после кровопотери супернатанта спленоцитов, содержащего хелперный фактор, снижало величины показателей, характеризующих выраженность ПОЛ и проницаемость мембран гепатоцитов. Таким образом, антиоксидантное действие лизоцима после кровопотери опосредуется факторами, выделяющимися клетками селезенки. Вероятно, эти фак-

торы являются элементами механизма, обеспечивающего сохранение структурного гомеостаза при острой потере значительного количества крови.

В связи с изложенным интересно было выяснить, иммуностимулирующий и мембранопротекторный эффекты вызывает один и гот же фактор или их возникновение обусловлено разными соединениями. Установлено, что фракция I супернатантов прилипающих при температуре 32-37°С спленоцитов, выделенных после кровопотери, при введении КПК крысам, не получавшим лизо-цим, вызывала снижение содержания ДК и МДА, активность AJ1T и ACT, а также усиливала иммунный ответ на ЭБ, фракция II была неактивной, а фракция III стимулировала иммунную реакцию на ЭБ, но не влияла на содержание продуктов ПОЛ и активность ферментов в крови реципиента (рис. 1).

^кровопотеря

ЛИЗОЦИМ

сгшеноциты

неприлипающие

При 4-10°С

супернатант

G-100

Ш !Н>! ППШПШШШ

cynef натант

• « * •

G-100

супернатант.

G-100

>100 кД 50-60 кД лз-Ш

муляция иммуностимуяйция

Рис. I. Активность супернатантов клеток селезенки крыс после кровопотери и введения лизоцима.

Введение ВФСС существенно повышало активность СОД и ГР, а инъекции НФСС не влияли на биохимические показатели эритроцитов. Таким образом, в составе ВФСС, полученных после кровопотери и введения лизоцима, со-

держится фактор, активирующий синтез антиоксидантных ферментов и ограничивающий выраженность ПОЛ клеточных мембран. Эритроциты, полученные после кровопотери и инъекций высокомолекулярной фракции, не обладали иммуносупрессирующими свойствами, а эритроциты животных, которым вводили низкомолекулярную фракцию, при аллогенном переносе супрессировапи развитие иммунного ответа на ЭБ.

Отсутствие иммуносупрессирующих свойств у эритроцитов, полученных у крыс после кровопотери с введением лизоцима, может быть объяснено блокирующим влиянием ВФСС на выделение в сосудистое русло или образованием в нем соединений, индуцирующих появление иммуносупрессирующих свойств у эритроцитов, или индуцирующим влиянием ВФСС на выход в сосудистое русло эритроцитов, резистентных к действию сывороточных субстанций, накапливающихся после кровопотери.

Результаты проведенных экспериментов позволяют считать, что иммуно-модулирующее действие лизоцима при кровопотере обусловлено модификацией эритроцитов и выделением под влиянием модифицированных эритроцитов хелперных цитокинов прилипающими к стеклу клетками селезенки. Наряду с этим, лизоцим опосредованно, через цитокины спленоцитов, вызывает изменение антиоксидантного статуса эритроцитов.

Кровопотеря снижала скорость реакции окисления НАДФН в ПЯЛ крови. Введение после кровопотери увеличивало скорость и НАДФН-оксидазной реакции в ПЯЛ.

Принимая во внимание данные об участии цитокинов прилипающих к стеклу клеток селезенки в реализации модулирующего влияния лизоцима на ФМА лейкоцитов, большой интерес представлял вопрос: обусловлено ли повышение скорости реакции, катализируемой НАДФН-оксидазой при введении лизоцима, влиянием на фермент лизоцима или этот эффект вызывают выделяющиеся под влиянием лизоцима прилипающие к стеклу клетки? Для решения этого вопроса ПЯЛ, полученные после кровопотери, экстракорпорально прими-

ровали лизоцимом или фракциями супернататов прилипающих и неприли-пающих клеток селезенки.

Установлено, что примирование лизоцимом не влияло на скорость реакции, катализируемой НАДФН-оксидазы. В отличие от этого, низкомолекулярная фракция супернатантов прилипающих к стеклу при 32-37°С спленоци-тов, полученных у КПК, получавших инъекции лизоцима, или тяжелых эритроцитов крыс, которым вводили лизоцим, увеличивала скорость НАДФН-оксидазной реакции ПЯЛ КПК. На основании полученных данных можно прийти к заключению о том, что активатором НАДФН-оксидазы ПЯЛ КПК является не лизоцим, а выделяющиеся под его влиянием цитокины клеток, прилипающих к стеклу при 32-37°С.

Взаимосвязь иммуномодулирующих эффектов, вызываемых лизоцимом и жирорастворимыми витаминами после кровопотери. Лизоцим, фил-лохинон и менадион, введенные по отдельности, не влияли на показатели ФМА ПЯЛ и иммунологической реактивности. Лизоцим, введенный с филлохиноном или менадионом, повышал, но не нормализовал ФМА нейтрофилов и иммунологическую реактивность КПК. Кровопотеря приводила к появлению в крови легких эритроцитов, обладающих иммуносупрессорной активностью. Инъекции лизоцима, филлохшюна или менадиона по отдельности не влияли на свойства эритроцитов крыс, подвергнутых кровопусканию. Введение КПК лизоцима с филлохиноном или менадионом не отменяло иммуносупрессирующих свойств легких эритроцитов, но индуцировало появление иммуностимулирующей активности у тяжелых клеток.

При изучении концентрации ACT, АЛТ, ЩФ и ОБ после кровопотери выявлено повышение исследованных показателей. Введение КПК лизоцима и лизоцима в сочетании с токоферола ацетатом не влияло, а в сочетании с ретинола ацетатом или менадионом нормализовало уровень ACT, АЛТ, ЩФ и ОБ (табл. 8).

Таблица 8

Метаболические эффекты лизоцима и жирорастворимых витаминов

у КПК

Услопня 1 2 3 4 5 6

опыта Контроль КПК КПК, вве- КПК, вве- КПК, вве- КПК, введе-

дение ли- дение ли- дение ли- ние лизоцима

зоцима зоцима и РА зоцима и ТА и менадиона

ТАГ 3,2±0,4 6,8±1,0 1 6,4±1,Г' 6,6*1,1"' 6,4±1,0"' 6,9±1,2"'

ХОЛ 5,8±0,3 11,5±1,2"1 12,8±1,3"' 12,3±1,4"' п,б±1,Г1 12,7±1,2"'

ДК 3,6±0,3 6,б±0,5"' 7,1±0,7"' 4,6±0,4"'"1 4,4±0,3"ы 6,9±0,6"'Л5

МДА 2,4±0,1 4,3±0,3"' 4,7±0,4"' 3,5±0,2"'"1 3,3±0,2"1:> 4,6±0,4"1,4,3

АЛТ 0,8±0,1 9,0±2,3"' 8,8±2,2"' 0,9±0,2'" 5,4±1,3"1"4 1,2±0,2"'го

ACT 0,4±0,1 5,5±0,9"' 5,1±0,8'1 0,5±0,Г" 3,9±0,6"'^ 3,2±0,7''г-л

ЩФ 9,8±1,4 21,3±2,4'' 23,4±2,5"' 10,3±1,5 ^ 15,2±2,1''-" 17,Ш,

ОБ 8,3±0,9 12,3±1,3"' 11,5±1,0"' 8,6±0,8'" 9,0±1,0™ 8,7±0,9""

ЛНП 23,5±2,4 54,1 ±4,9"' 56,3±4,2"' 46,5±4,2"'"> 40,7±3,8"'"1 33,1±2,8"'*5

ГАГ 0,23±0,02 0,54±0,06"' 0,57±0,08"' 0,49±0,09"' 0,51 ±0,09'' 0,34±0,05''10

ААП 24,7±3,3 38,8±3,Г' 35,0±4,0"' 32,8±3,5"' 34,1±3,7"''4 22,5±2,7'"

АМГ 1,7±0,3 3,4±0,6"' 3,1±0,6"' 3,0±0,5"' 2,5±0,41''

Исследована иммуномодулирующая активность стромы эритроцитов ин-тактных крыс, включавших менадион и обработанных лизоцимом. Оказалось, что введение СВМОЛ животным, иммунизированным ЭБ, повышало ФМА мо-нонуклеаров, стимулировало развитие ГИО и ГЗТ в большей степени, чем строма, включившая менадион, но не обработанная ферментом.

Результаты этих экспериментов дают основание считать, что менадион вызывает иммуностимулирующий эффект, проникая внутрь фагоцитировавшей стромальную частицу клетки, в то время как действие лизоцима реализуется на уровне мембраны эритроцита, в которой эти соединения модифицируют структуру фосфолипидной матрицы и интегрированных в нее гликопротеидных молекул.

Принципиально важно было выяснить иммуномодулирующую эффективность сочетанного применения лизоцима и нафтохинонов, а также СВМОЛ в условиях вторичного иммунодефицитного состояния, вызванного кровопотерей 2% от массы тела. Оказалось, что введение лизоцима и менадиона повышало, но не нормализовало ФМА нейтрофилов и иммунологическую реактивность

КПК. В отличие от этого, инъекции КПК СВМОЛ нормализовали ФМА ПЯЛ периферической крови, а также развитие ГИО и ГЗТ на ЭБ (табл. 9).

Таблица 9

Влияние СВМОЛ на ФМА ПЯЛ, развитие ГИО и ГЗТ у КПК

Показатели Контроль КПК КПК, введение лизоцима и менядиона КПК, инъекции СВМОЛ

1 2 3 4

ФЧ 40,6 ±4,1 20,3 ±2,4'' 32,0 ± 3,5м-2 38,7 ±3,б'2-'

ФИ 1,7 ±0,2 0,7 ±0,1'' 1,2 ± 0,1"'"' 1,4 ± 0,2'*'3

НСТ-сп. 11,2 ±0,9 7,3 ±0,5*' 9,7 ± 0,б'и 10,7 ± ОД'2

НСТ-ст. 26,5 ± 1,9 14,5 ±0,9'' 19,2 ± 28,1 ± 1,7"2'3

АОК 21,6 ±2,5 10,7 ± 1,2"' 15,4 ± 1,8"1,2 19,8 ± 2,2"2">

РМЛ 4,6 ± 0,4 2,7 ±0,3'' 3,5 ± 0,4"'"! 4,3 ± 0,4'^

Полученные данные дают основание считать, что иммуномодулируюгцая активность СВМОЛ при кровопотере опосредуется цитокинами, выделяющимися макрофагальными клетками селезенки.

Иммуномодулнрующее действие лизоцима и водорастворимых витаминов при кровопотере. Крысам после кровопотери по указанной выше схеме вводили лизоцим и препараты витаминов по отдельности или в парных сочетаниях. В день последнего поступления препаратов животных иммунизировали ЭБ. Установлено, что введение лизоцима с пиридоксином или фолатом не влияло на величины показателей, характеризующих ФМА ПЯЛ и иммунологическую реактивность. Выраженный иммуномодулирующий эффект наблюдался при введении лизоцима с кобаламином (табл. 10).

При введении КПК, получавшим инъекции лизоцима супернатантов спле-ноцитов, прилипающих при температуре 4-10°С, установлено иммуносупресси-рующее влияние на развитие ГИО, индуцированного ЭБ. Фракционирование супернатантов показало, что иммуносупрессирующей активностью обладала фракция с молекулярной массой 50-60 кД.

Введение супернатантов, прилипающих при температуре 32-37°С, вызывало иммуностимулирующие эффекты на ГИО КПК после введения лизоцима. Фракционирование показало, что иммуностимулирующие эффекты присущи фракции с молекулярной массой 10-15 кД, а гепатопротекторные - фракции с

массой >100 кД. Также иммуностимулирующие эффекты установлены у фракции непршшпающих клеток с молекулярной массой 10-15 кД.

Таблица 10

Метаболические эффекты лизоцима и водорастворимых витаминов у КПК

Условия опыта 1 2 3 4 5 б

Контроль КПК КПК, введение лшоцимя КПК, введение лизоцима и пнридокси-на КПК, введение лизоцима и фолата КПК, введение лизоцима и ко-баламииа

ТАГ 3,2*0,4 6,8±1,0*' 6,6*1,1'1 6,5*0,8"' 6,7*0,8"' 6,3*1,0"'

ХОЛ 5,8*0,3 11,4*1,2"' 12,3*1,1'' 12,4*1,2"' 10,8*1,3"' 11,8*1,2"'

дк 3,6*0,3 6,7*0,5"' 6,4*0,6"' 4,840,6"' 6,6*0,4"' 4,2±0,4"'"5

МДА 2,4±0,1 4,3±0,3"' 4,4±0,3'' 4,1±0,3*' 4,0±0,3"' 3,6*0,г"'"5

АЛТ 0,8±0,1 6,1*2,6"' 6,7*2,4"1 4,7*2, Г1-'5 5,4*2,3'' 2,3*1,6'^

ACT 0,4±0,1 4,4*0,9"' 4,1*0,8м 3,2*0,б"'-1 3,8*0,7"' 1,6*0,5 м

ЩФ 9,8±1,4 25,4*2,7"' 24,б±2,2"' 17,3 ±2, Г1-" 18,4±2,2'м 11,3±1,7*,~*

ОБ 8,3*0,9 11,9*1,3"' 12,6*1,3"' 10,8*1,2"' 11,2*1,2*' 9,1*0,9"^

лнп 25,8±2,7 57,1*4,8"' 54,9*5,0"' 52,4*5, Г' 56,0*5,3"' 37,7*3,2''~5

ГАГ 0,25±0,03 0,5 6*0,07'1 0,55*0,08"' 0,54*0,08"' 0,59*0,09'' 0,39*0>07"'1"5

ААП 23,4*3,2 38,7±3,3'' 36,8*4,1"' 35,7*3,4"' 37,2*3,7"' 31,7*3,4''

АМГ 1,7±0,3 3,8*0,8"' 3,6*0,9'' 3,2±0,7"' 3,4±0,9*' 2,5*0,6"'-'

Введение лизоцима с пиридоксином или фолатом не приводило к появлению в крови здоровых животных эритроцитов, обладающих иммуномодули-рующими свойствами. В отличие от этого, лизоцим в сочетании с кобаламином обусловливали возникновение у тяжелых эритроцитов хелперной активности. Установлено, что введение ЭКПЛ животным, получавшим пиридоксин или ко-баламин, повышало ФМА нейтрофилов, стимулировало развитие ГИО и ГЗТ в значительно большей степени, чем введение этих препаратов без ЭКПЛ. Введение ЭКПЛ крысам, получавшим фолат, не оказывало влияния на активность полинуклеаров и развитие иммунного ответа. Таким образом, лизоцим индуцировал появление хелперных свойств у эритроцитов только при введении с кобаламином (но не с пиридоксином или фолатом). Вместе с тем ЭКПЛ повышали ФМА ПЯЛ и стимулировали развитие различных форм иммунного ответа при введении животным, получавшим пиридоксин или кобаламин (но не фолат).

Принципиально важно было выяснить, обладают ли иммуномодули-рующими свойствами эритроциты крыс, получавших лизоцим и препараты ви-

таминов при кровопотере. Проведенные для решения этого вопроса эксперименты показали, что тяжелые эритроциты, полученные после кровопотери и введения лизоцима, приобретают выраженные иммуностимулирующие свойства. Инъекции таких эритроцитов КПК повышали функционально-метаболическую активность полинуклеаров периферической крови и усиливали или нормализовали развитие ГИО и ГЗТ на ЭБ.

Результаты проведенных исследований позволяют прийти к выводу о существенной роли тяжелых эритроцитов в реализации взаимосвязанного имму-номодулирующего действия лизоцима, пиридоксина и кобаламина. Они показывают, что введение лизоцима с кобаламином является эффективным средством иммуномодуляции при кровопотере в эксперименте и обусловливает целесообразность клинической апробации эффективности такого сочетания.

Иммунометаболические эффекты протеолитических ферментов и жирорастворимых витаминов при острой кровопотере. Протеолитические ферменты оказывают выраженное влияние на процессы фагоцитоза, являющиеся у высших организмов основной формой защиты от патогенных микробов и составной частью многих физиологических и патологических реакций, Они изменяют структуру рецепторного аппарата лимфоцитов периферической крови и лимфоидных органов и вызывают глубокие изменения клеточного метаболизма (Прокопенко Л.Г. и др., 1994). Острая кровопотеря приводит к нарушению баланса протеолитического и антипротеолитического потенциала крови. Равновесие между этими параметрами сдвигается в сторону преобладания активности антипротеолитических белков, что может стать причиной ослабления регулирующего влияния протеаз на гомеостаз и угнетения функциональной активности клеток крови, участвующих в развитии иммунологических процессов, -нейтрофилов, лимфоцитов, эритроцитов и тромбоцитов (Прокопенко Л.Г. и Др., 2003).

Изучение иммунометаболических эффектов, вызываемых протеолитиче-скими ферментами и их сочетанием с жирорастворимыми витаминами при острой кровопотере показало, что введение папаина здоровым животным снижает

ФМА нейтрофилов, угнетает развитие различных форм иммунного ответа, тогда как террилитин вызывает противоположные эффекты. Инъекции папаина после кровопотери не влияют на показатели иммунологических функций, а террилитин уменьшает выраженность их супрессии. Совместное введение тер-рилитина и ретинола ацетата эффективно корригирует иммунологические функции у здоровых животных, инъекции террилитина с менадионом - у животных, подвергнутых кровопусканию. Иммуномодулирующие эффекты совместного применения террилитина и жирорастворимых витаминов в норме и при кровопотере опосредуются эритроцитами.

Эритроциты интактных крыс, экстракорпорально обработанные лизоцимом или террилитином, при аллогенном переносе повышали ФМА нейтрофилов и стимулировали развитие различных форм иммунного ответа в норме и при острой кровопотере. Лейкоциты интактных крыс, обработанные террилитином, приобретали иммуностимулирующие свойства, а инкубированные с ли-зоцимом были лишены иммунологической активности. Наиболее выраженный иммуностимулирующий эффект после острой кровопотери вызывают лейкоциты, обработанные террилитином, наименее выраженный - эритроциты, обработанные этим ферментом. Инкубация с лизоцимом или террилитином эритроцитов, полученных после кровопотери, индуцировала появление у них иммуностимулирующих свойств, лейкоциты, обработанные террилитином или лизоцимом, были лишены иммуномодулирующей активности.

Эритроциты, экстракорпорально обработанные лизоцимом, и лейкоциты, инкубированные с террилитином, приобретали свойство индуцировать выделение прилипающими к стеклу клетками селезенки факторов, стимулирующих развитие иммунного ответа, повышающих активность антиоксидантных ферментов и снижающих содержание продуктов перекисного окисления липидов в печени после кровопотери.

Экстракорпоральное воздействие менадиона повышало выраженность иммуномодулирующих свойств после инкубации эритроцитов крыс, подвергнутых кровопусканию, с лизоцимом, но не индуцировало иммуномодулирую-

щей активности после инкубации с террилитином. Кобаламин после кровопо-тери не влиял на свойства эритроцитов, обработанных лизоцимом или террилитином (рис. 2).

1

Рис. 2. Влияние менадиона и кобаламина на эффект появления иммуно-модулирующих свойств, вызываемых лизоцимом и террилитином, у эритроцитов и лейкоцитов, полученных после кровопотери.

Примечание. Непрерывная линия - эритроциты, прерывистая - лейкоциты. Радиус окружности - введение интактных клеток;

1 - введение клеток, обработанных лизоцимом;

2 - введение клеток, обработанных террилитином;

3 - введение клеток, обработанных менадионом;

4 - введение клеток, обработанных лизоцимом и менадионом;

5 - введение клеток, обработанных лизоцимом и менадионом;

6 - введение клеток, обработанных террилитином или менадионом;

7 - введение клеток, обработанных лизоцимом и кобаламином;

8 - введение клеток, обработанных террилитином и кобаламицом;

9.9 - существенность различий относительно

кровопотери с вероятностью 95%,

Инкубация лейкоцитов, полученных до и после кровопотери, с менадио-ном или кобаламином усиливала выраженность действия террилитина и не вызывала эффекта усиления в сочетании с лизоцимом.

Кобаламин повышал чувствительность эритроцитов к действию протеаз и гликозидаз, но не влиял на эффект, вызываемый ферментами после обработки ими стромы клеток. Менадион повышал чувствительность эритроцитов и их стромы к действию протеаз и гликозидаз (табл. 11).

Таблица 11

Иммуномодулнрующие свойства у эритроцитов и их стромы после экстракорпоральной обработки лизоцимом, менадионом и кобаламином

№ п/п Объект воздействия Действующие агенты Эффект

ФАН ОРИ АО К РМЛ

1. Эритроцит - 42,5*4,6 22,7*2,1 23,4*2,6 4,4*0,4

2. Строма - 40,3±4,8 20,5*2,2 21,3*2,5 4,0*0,4

3. Эритроцит Лизоцим 69,4*5,7"'-2 43,5*3,3"'"1 67,2*6,8''"' б.блОЖ1"1

4. Строма Лизоцим 60,5*5, 34,3*2,8'1''1 59,4*5,7' 6,2*0,6"'"1

5. Эритроцит Лизоцим, менадион 56,2*5,6"'"' 32,4*2,8"'"' 55,6*5,7"'"-' 5,6*0,5"'"'

6. Строма Лизоцим, менадион 55,7*5,4"'"' 34,9*3,0"'"' 52,8*5,Г'"3

7. Эритроцит Лизоцим, кобаламин 58,0*6,1"'"' 31,5*2,4"'° 54,0*5,2''"' 5,7*0,6"'^

8. Строма Лизоцим, кобаламин 43,7*4,5'-'-' 20,9*2,7''"' 25,8*2,9''"' 4,6*0,4"'"'

Заключение. Результаты проведенных экспериментов позволяют предположить, что действие кобаламина опосредуется реакциями, катализируемыми ферментами цитоплазмы эритроцитов, контролирующими экспрессию белковых и углеводных структур на поверхности мембраны эритроцитов. Эффект менадиона, по-видимому, реализуется через молекулы двойного фосфолипид-ного слоя, состояние которого осуществляет архитектонику белковых и углеводных компонентов на мембране клеток.

Полученные результаты позволяют считать, что введение в организм про-теолитических ферментов приводит к развитию сложной цепи взаимосвязанных реакций, оказывающих выраженное влияние на развитие различных форм иммунного ответа. Вероятнее всего, происходит активация системы: «протеазы —►

модифицированные эритроциты —» хелперные медиаторы макрофагов —» анти-протеолитические эффекты».

Результаты проведенных нами исследований выявили иммунометаболиче-ские эффекты взаимодействия гликозидаз, протеаз, жиро- и водорастворимых витаминов, реализующиеся при острой кровопотере на уровне эритроцитов (рис. 3), Следствием такого взаимодействия является потеря легкими эритроцитами иммуносупрессирующих свойств и приобретение тяжелыми клетками иммуностимулирующей активности.

Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют о том, что жирорастворимые витамины вызывают свои эффекты, действуя на структуры двойного фосфолипидного слоя мембраны и интегрированных в него белков, а водорастворимые витамины оказывают влияние на активность ферментов, ассоциированных с внутренней поверхностью мембраны и растворенных в цитолизе эритроцитов (Прокопенко Л.Г. и др., 2000; Прокопенко Л.Г., Бровкина И.Л., 2003).

Учитывая это, есть основания ожидать, что гликолитические ферменты, связывая и модифицируя интегрированные в фосфолипидную матрицу глико-пептидные эпитопы, оказывают преимущественное влияние на эффекты, вызываемые жирорастворимыми витаминами, а внедряясь и модифицируя липидную основу мембраны, изменяют скорость процессов, зависимых как от жиро-, так и от водорастворимых витаминов. Подтверждения этого предположения получены при изучении витамино-ферментных взаимодействий после интенсивной физической нагрузки, введения гемотропных ядов, действия на организм высокой или низкой внешней температуры (Ласкова И.Л., 1995; Шишкова И.В., 2001; Лазарева Г.А., 2006).

Гепатоциты (снижение антиок-сидантного потенциала)

т

А

Гипоксия

антиоксидактная

Плазма (омЛНП, омГАГ)

т

Гликозаминогликаны, гли-коэидаэыи витамины

Тяжелые эритроциты

Легкие эритроциты

I

Спленоциты, прилипающие к стеклу при 4-10°С

Спленоциты, прилипающие к стеклу при 32-37-С

Метаболические корректоры (>150цД) Н—'

Рис. 3. Схема влияния кровопотери на состояние иммунитета.

Ключевыми вопросами проблемы сочетанной ферментно- и витаминотерапии является взаимодействие ферментов и витаминов между собой и с другими соединениями при различных дозах вводимых препаратов на уровне мембран клеток, в том числе эритроцитов, чем и обосновано представление о возможной конкуренции соединений различной химической природы. Можно предположить, что на мембране эритроцитов возникает специфическое или неспецифическое взаимодействие между разными ферментами, витаминами и соединениями, накапливающимися в повышенных концентрациях в крови, а также другими применяемыми для лечения заболеваний лекарственными веществами. Решение этого принципиально важного для развития эффективной фер-менто- и витаминотерапии вопроса требует всестороннего экспериментального и клинического изучения иммунометаболических эффектов взаимодействия ферментов и витаминов в сопоставлении с химическими изменениями крови здорового и больного человека.

Выводы

1. Острая 2% кровопотеря повышает показатели, характеризующие пере-кисное окисление липидов, снижает в эритроцитах содержание макроэргиче-ских соединений и активность антиоксидантных ферментов, фагоцитарно-метаболическую активность полиморфноядерных лейкоцитов, угнетает развитие гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа, индуцирует появление у легких эритроцитов иммуносупрессирующих свойств.

2. Гликозаминогликаны, выделенные из растений семейств Аэиасеае, ТШасеае и Ро%опасеае, при внутрижелудочном и внутримышечном введении без и после острой кровопотери стимулируют фагоцитарно-метаболическую активность нейтрофилов, развитие гуморального и клеточного иммунного ответа. Иммуномодулирующее действие при совместном применении гликозаминогликанов и препаратов жирорастворимых витаминов выражено сильнее, чем при их раздельном введении.

3. Выраженный иммуномодулирующий эффект после острой кровопотери вызывает совместное применение гликозаминогликанов животного происхождения (препарат «Дона») и водорастворимых витаминов - пиридоксина и коба-ламина. В реализации иммуномодулирующего действия гликозаминогликанов, пиридоксина и кобаламина существенную роль играют эритроциты. Гликозаминогликаны сенсибилизируют эритроциты к взаимодействию с кобаламином, а пиридоксин повышает чувствительность иммуноцитов к взаимодействию с модифицированными гликозаминогликанами и кобаламином.

4. Препарат гликозаминогликана животного происхождения «Остенил» не влияет на функционально-метаболическую активность нейтрофилов и иммунологическую реактивность в норме и после кровопотери. В сочетании с ме-надионом остенил оказывает иммуномодулирующий эффект, выраженность которого ниже, чем при введении гликозаминогликана Ро^опасеае с менадио-

ном. При совместном введении после кровопотери остенила и менадиона легкие эритроциты теряют иммуносупрессирующие свойства, а тяжелые - приобретают иммуностимулирующую активность.

5. Введение после острой кровопотери М-ацетилнейраминовой кислоты уменьшает выраженность угнетения гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа. Ы-ацетилнейраминовая кислота повышает величины метаболических маркеров иммунологической активности поли-морфноядерных лейкоцитов и лимфоцитов, но не влияет на маркеры активности эритроцитов.

6. Совместное введение М-ацетилнейраминовой кислоты и препаратов жиро- или водорастворимых витаминов уменьшает выраженность иммуномета-болических сдвигов, вызываемых кровопотерей, Наиболее эффективными были сочетания Ы-ацетилнейраминовой кислоты с ретинола ацетатом, менадионом и кобаламином. Действие Ы-ацетилнейраминовой кислоты и менадиона опосредовано тяжелыми эритроцитами.

7. Введение препаратов гликозидаз (лидазы или лизоцима) в норме и после острой кровопотери повышает функционально-метаболическую активность иейтрофилов, усиливает формирование гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа. Иммуномодулирующий эффект лизоцима выражен сильнее, чем лидазы. Лизоцим повышает активность НАДФН-оксидазы. Эффект лизоцима опосредуется соединениями, выделяющимися прилипающими к стеклу клетками селезенки, активированными модифицированными лизоцимом тяжелыми эритроцитами.

8. Введение лизоцима после кровопотери дозозависимо оказывает анти-оксидантный и гепатопротекторный эффекты. Введение лизоцима с ретинола ацетатом или токоферола ацетатом снижает содержание в крови продуктов пе-рекисного окисления липидов. Совместное применение лизоцима с ретинола ацетатом нормализует, а с токоферола ацетатом или менадионом - снижает ме-

таболические показатели состояния гепатоцитов. Эффект, вызываемый совместным применением лизоцима с мснадионом или кобаламином, реализуется при участии тяжелых эритроцитов.

9. После кровопотери применение лизоцима в сочетании с пиридоксином и фолатом не оказывает существенного влияния на содержание в крови липи-дов, продуктов перекисного окисления липидов и соединений, обладающих иммунорегулирующей активностью. Лизоцим с кобаламином снижает содержание в крови продуктов перекисного окисления липидов и соединений, характеризующих состояние гепатоцитов и иммуносупрессорный потенциал крови.

10. Строма эритроцитов, с включением менадиона и обработанная глико-замином Ро^опасеае или лизоцимом, в норме и после массивной кровопотери вызывает иммуномодулирующий эффект, выраженность которого выше введения свободных препаратов или стромы, взаимодействовавшей с одним из них. Влияние стромы эритроцитов, взаимодействовавшей с менадионом и гликоза-миногликаном РоНцопасеае или лизоцимом, опосредуется соединениями, выделяющимися прилипающими к стеклу клетками селезенки. Низкомолекулярные (10-15 кД) соединения обладают иммуномодулирующей активностью, высокомолекулярные (> 100 кД) — проявляют антиоксидантные и гепатопротекторные свойства.

11. Протеолитические ферменты (папаин и террилитин) в норме и после кровопотери неодинаково влияют на иммунологические функции животных. Папаин не вызывает иммуномодулирующего эффекта, террилитин повышает фагоцитарно-метаболическую активность нейтрофилов и иммунологическую реактивность. Сочетанное применение террилитина и ретинола ацетата или менадиона вызывает более выраженный иммуномодулирующий эффект, чем раздельное введение препаратов.

12. Экстракорпоральное воздействие менадиона повышает выраженность иммуномодулирующих свойств эритроцитов крыс, подвергнутых кровопуска-

нию, после инкубации их лизоцимом, но не влияет на иммуномодулирующую активность эритроцитов после инкубации их с террилитином. Кобаламин не влияет на свойства эритроцитов крыс с кровопотерей после обработки их лизоцимом или террилитином. Строма эритроцитов крыс, полученная после острой кровопотери реагирует на кобаламин повышением иммуномодулирующей активности, индуцируемой лизоцимом и террилитином.

Практические рекомендации

1. Результаты исследований, основные положения которых включены в монографии: «Метаболическая иммуномодуляция» (Курск, 2000); «Иммуноме-таболические эффекты регуляторов энергетического обмена при нарушении гомеостаза» (Курск, 2006); «Эритроцитзависимые эффекты лекарственных и физиотерапевтических средств» (Курск, 2008), могут использоваться в учебном процессе медицинских вузов с целью углубления и расширения знаний о роли эритроцитов в реализации иммунометаболического и гепатопротекторного действия препаратов гликозашшогликанов, гликозидаз и витаминов при кровопо-тере.

2. Материалы диссертации включены в рабочие программы кафедр фармакологии, биохимии, патофизиологии, спортивной медицины, хирургии, акушерства и гинекологии Курского, Саратовского, Самарского и Российского государственных медицинских университетов, Нижегородской государственной медицинской академии, медицинских факультетов Белгородского и Орловского государственных университетов.

3. Материалы по использованию композиций препаратов гликозаминогликанов, гликозидаз различного видового происхождения в сочетании с витаминами могут быть использованы в клинической практике после клинической апробации для коррекции иммунометаболического статуса после кровопотери.

4. Результаты работы, выразившиеся в создании глико-витаминных препаратов, могут- быть использованы в производственных условиях для получения фармакологических средств, обладающих иммунометаболическими и гепа-топротекторными эффектами при острой кровопотере.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Лазарева, Г.А. Иммуномодулирующее действие фитопрепаратов при острых кровопо-терях / Г.А. Лазарева, В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина / Метаболическая иммуномодуля-ция / под ред. Л.Г. Прокопенко, А,И. Конопли. - Курск, 2000. - С. 199-209.

2. Прокопенко, Л.Г. Иммунометаболические эффекты, вызываемые дозозависимым кровопусканием и их коррекция стабилизаторами клеточных мембран / Л.Г. Прокопенко, Г.А. Лазарева, В.Н. Рыбников / Метаболическая иммуномодуляция / под ред. Л.Г. Прокопенко, А.И. Конопли. - Курск, 2000. - С. 180-187.

3. Рыбников, В.Н. N-ацетилнейраминовая кислота как иммуномодулятор при кровопотерях / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина // Человек и его здоровье. - Курск, 2000. - Вып. 3. -С. 198-200.

4. Рыбников, В.Н. Влияние жирорастворимых витаминов на антиоксидантный и энергетический статус эритроцитов при острой кровопотере / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина // Материалы IV съезда иммунологов и аллергологов СНГ «Аллергология и иммунология». - М., 2000. - Т. 2, № 2. - С. 137.

5. Рыбников, В.Н. Иммуномодулирующее действие витамина К при острых кровопоте-рях / В.Н. Рыбников, A.A. Конопля // Тез докл. VII Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». - М„ 2000. - С. 541.

6. Рыбников, В.Н. Иммуномодулирующее действие нафтохинонов при острых кровопотерях / В.Н. Рыбников, A.A. Конопля, И.Л. Бровкина / Метаболическая иммуномодуля-ция/подред. Л.Г. Прокопенко, А.И. Коноши. - Курск, 2000. -С. 194-199.

7. Рыбников, В.Н. Иммуномодулирующее действие полисахаридов и N-ацетилней-раминовой кислоты при острых кровопотерях / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина // Материалы IV съезда иммунологов и аллергологов СНГ «Аллергология и иммунология». -М„ 2000.-Т. 2, №2.-С. 136.

8. Рыбников, В.Н. Нафтохиноны как иммуномодуляторы при острых кровопотерях /

B.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина П Сб. науч. тр., посвящ, 65-летию КГМУ, «Актуальные проблемы медицинской науки и фармации». - Курск, 2000. - С. 72-73.

9. Бровкина, И.Л. Иммуномодулирующее действие гетерополисахаридов и N-ацетил-нейраминовой кислоты при острых кровопотерях / И.Л. Бровкина, В.Н. Рыбников // Сб. науч. тр. «Актуальные проблемы медицины и фармации». - Курск, 2001. - С. 42.

10. Рыбников, В.Н. Влияние жирорастворимых витаминов на антиоксидантный и энергетический статус эритроцитов при острой кровопотере I В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина // Сб. науч. тр. «Актуальные проблемы медицины и фармации». - Курск, 2001. -

C. 290-291.

11. Бровкина, И.Л. Иммуномодулирующее действие гиалуронидазы и жирорастворимых витаминов в норме и при острой кровопотере / И.Л. Бровкина, В.Н. Рыбников // Курский науч.-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2002. - Вып. 4. - С. 8-11.

12. Бровкина, И.Л. Иммуномодулирующее действие гликолигаческих ферментов при токсических формах анемии и кровопотере / И.Л. Бровкина, В.Н. Рыбников // Курский на-уч-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2002. - Вып. 4. - С. 3-7.

13. Бровкина, И.Л. Иммуномодулирующее действие пиридоксина, фолата, кобаламина и гликозаминогликанов при кровопотере / И.Л. Бровкина, В.Н. Рыбников // Курский на-уч-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2002. - Вып. 4. - С. 12-19.

14. Рыбников, В.Н. Иммуномодулирующее действие гликозаминогликанов и жирорастворимых витаминов при острых кровопотерях / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина // Курский науч-практ. веста. «Человек и его здоровье». - 2002. - Вып. 4. - С. 81-86.

15. Рыбников, В.Н. Иммуномодулирующее действие эритроцитов и их стромы, инкубированных с гликозаминогликанами Polygonaceae и менадионом, при острой кровопотере / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина // Курский науч-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2002. - Вып. 4. - С. 87-92.

16. Рыбников, В.Н. Функционально-метаболическая активность лейкоцитов и ее коррекция лизоцимом при острой кровопотере / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина // Курский науч-практ. вести. «Человек и его здоровье». - 2002. - Вып. 4. - С. 93-97.

17. Бровкина, И.Л. Пиридоксин, фолат и кобаламин как иммуномодуляторы при различных формах анемии / И.Л. Бровкина, В.Н. Рыбников // Тез. докл. X Рос. нац. контр. «Человек и лекарство». -(7-11 апреля 2003 г., г. Москва). - М., 2003. - С. 69S.

18. Рыбников, В.Н. Взаимосвязь иммуномодулируюших эффектов, вызываемых лизоцимом и нафтохинонами, при острой кровопотере / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина // Антибиотики и химиотерапия. - 2003. - Т. 48, № 5. - С. 7-10.

19. Рыбников, В.Н. Иммуномодулирующее действие растительных гетерополисахаридов и жирорастворимых витаминов при острых кровопотерях / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина // Материалы междунар. науч.-практ. конф. «Современные технологии фитонутри-циологии в акушерстве, гинекологии и педиатрии». - (29-30 мая 2003 г., г. Москва). -М.: Изд-воРУДП, 2003. -С. 330-337.

20. Рыбников, В.Н. Иммуномодулирующее действие эритроцитов и их стромы, инкубированных с менадионом и гетерополисахаридами Polygonaceae, при острой кровопотере /

B.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина, М.Г. Газазян // Антибиотики и химиотерапия. -2003. -Т.48,№4.-С. 14-18.

21. Рыбников, В.Н. Иммуномодулирующие эффекты, вызываемые лизоцимом при острых кровопотерях / B.1I. Рыбников, И.Л. Бровкина // Тез. докл. X Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». - (7-11 апреля 2003 г., г. Москва). - М., 2003. - С. 654.

22. Бровкина, И.Л. Иммунометаболические эффекты, вызываемые лизоцимом при острой кровопотере / И.Л. Бровкина, В.Н. Рыбников // Пат. физиология и эксперимент, терапия. - 2004.-№ 2. - С. 14-16.

23. Иммуномодулирующее действие пиридоксина, фолата и кобаламина при различных формах анемии / И.Л. Бровкина, A.A. Конопля, Б.С. Утешев, В.Н. Рыбников Н Экспе-римет. и клиннч. фармакология. - 2004. - Т. 67, № 1. - С. 32-36.

24. Рыбников, В.Н. Влияние лизоцима на функционально-метаболическую активность по-лиморфяоядерных лейкоцитов в условиях острой кровопотери / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина, Б.С. Утешев // Эксперимент, и клинич. фармакология. - 2004. - Т. 67, №2.-С. 45-48.

25. Рыбников, В.Н. Иммунометаболические эффекты, вызываемые N-ацетилнейраминовой кислотой при острой кровопотере / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина // Антибиотики и химиотерапия. -2005.- Т. 50, № 10-11.-С. 24-28.

26. Лазарева, Г.А. Иммунометаболические эффекты полисахаридов различного видового происхождения / Г.А. Лазарева, И.Л. Бровкина, В.Н. Рыбников // Иммунометаболические эффекты регуляторов энергетического обмена при нарушении гомеостаза / под ред. Л.Г. Прокопенко. - Курск, 2006. - С. 245-273.

27. Рыбников, В.Н. Иммунометаболические эффекты, вызываемые N-ацетилнейраминовой кислотой, водо- и жирорастворимыми витаминами при острой кровопотере / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина, Л.Г. Прокопенко // Системный анализ и управление в биомедицинских системах. - 2007. - Т. 6, № 3. - С. 634-637.

28. Бровкина, И.Л. Экстракорпоральное иммуномодулирующее действие гидролитических ферментов и витаминов / И.Л. Бровкина, Л.Г. Прокопенко, В.Н. Рыбников // Вестн. новых мед. технологий. - 2008. - Т. XV, № 2. - С. 19-21.

29. Влияние гидролитических ферментов и витаминов на иммуномодулирующие свойства эритроцитов и лейкоцитов при острой кровопотере / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина, Л,И. Лазарев, Л.Г. Прокопенко // Аллергология и иммунология. - 2008. - Т. 9, № 3. -

C. 317-318.

30. Влияние окислительно-модифицированных липопротеинов на иммуносупрессирующие свойства тромбоцитов и эритроцитов при острой кровопотере / В.Н. Рыбников,

И.Л. Бровкина, А.И. Лазарев, Л.Г. Прокопенко // Аллергология и иммунология. -2008.-Т. 9, №3.-С. 318.

31. Иммунометаболические эффекты протеолитических ферментов и жирорастворимых витаминов при острой кровопотере / А.И. Лазарев, И.Л. Бровкина, В.Н. Рыбников, Л.Г. Прокопенко Н Курский науч.-практ. вестн. «Человек и его здоровье». - 2008. -№ 1,-С. 41-47.

32. Зритроцитзависимые эффекты лекарственных и физиотерапевтических средств / А.И. Лазарев, И.Л. Бровкина, В.П. Гаврилюк, и др. - Курск: ГОУ ВПО КГМУ Росздра-ва, 2008. - 336 с.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ААП - агантипротеаза, мкмоль/л

АГП - ацилгидроперекиси, AD233 на 1 мл плазмы

АЗКЦ - антителозависимая клеточная цитотоксичность

АЛТ - аланинаминотрансфереза, ммоль/ч*л

АМГ - а2-макроглобулин, мкмоль/л

АНК - N-ацетилнейраминовая кислота

АОК , - антителообразующие клетки, 10э/селезенку

ACT — аспартатаминотрансфераза, ммоль/ч-л

АТФ - аденозинтрифосфат

БФГ - 2,3-юифосфоглицерат

ВФСС - высокомолекулярная фракция супернатантов спленоцитов

Г - гиалуронидаза

ГА - глюкозамин

ГАГ - гликозаминогликан, г/л

ГАГ-Р - гликозаминогликан, Polygonaceae

ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа

ГИО - гуморальный иммунный ответ

ГК - гиалуронат калия

ГР - глутатионредуктаза, мкмоль/мл эритроцитов

ДК - диеновые конъюгаты, нмоль/л

КПК - крысы после кровопотери 2% от массы тела

ЛНП - липопротеиды низкой плотности, усл. ед.

МДА - малоновый диальдегид, мкмоль/л

НАДФН - никотинамиддинуклеотидфосфат восстановленный

НСТ-сп. - тест восстановления нитросинего тетразолия спонтанный, %

НСТ-ст. - тест восстановления нитросинего тетразолия стимулированный, %

НФСС - низкомолекулярная фракция супернатантов спленоцитов

ОБ - общий белок, г/л

ОРН - окислительный резерв нейтрофилов

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПЯЛ - полиморфноядерные лейкоциты

РА - ретинола ацетат

РМЛ - разница массы лимфоузлов, мг

СВМОЛ - строма, включающая менадион, обработанная лизоцимом

СОД - супероксидцисмутаза, ед/млн. эритроцитов

СЭОГ - строма эритроцитов, обработанная гликозаминогликаном

СЭОМ - строма эритроцитов, обработанная менадионом

СЭОМГ - строма эритроцитов, обработанная менадионом

и гликозаминогликаном

ТА - токоф срола ацетат

ТАГ - триацилглицериды

ФАН - функциональная активность нейтрофилов

ФДФ - фруктозо-2,6-дифосфат, рМ/106 лейкоцитов

ФИ - фагоцитарный индекс, %

ФМА - функционально-метаболическая активность

ФЧ - фагоцитарное число (среднее количество поглощенных

частиц латекса на один фагоцит), абс.

ХОЛ - холестерин, ммоль/л

ЩФ - щелочная фосфатаза, ммоль/ч*л

ЭБ - эритроциты барана

ЭКПГ - эритроциты крыс, получавших гиалуронидазу

ЭКПЛ - эритроциты крыс, получавших лизоцим

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 15.06.2009 г. Подписано в печать 17.06.2009 г. Формат 30x42'/g Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 2,0. Тираж 100 экз. Заказ № 84А. Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.

Различные' формы нарушения гомеостаза характеризуются иммуносу-прессией, основными причинами развития которой является усиление генерации активных метаболитов кислорода, снижение антиокислительного потенциала тканей, повышение интенсивности процессов перекисного окисления липидов мембран, снижение энергообеспечения клеток, нарушение структуры и функции иммуноцитов (Прокопенко Л.Г. и др., 1999; Новицкий В.В. и др., 2003).

Наряду с принципиально общими механизмами развития метаболической иммуносупрессии при состояниях, характеризующихся выраженным стрессорным компонентом (алиментарные нагрузки, голодание, охлаждение, физические нагрузки), имеют место характерные для них особенности, обусловленные природой индуцирующего агента и первичным звеном его воздействия на клетки и организм в целом (Прокопенко Л.Г., Бровкина И.Л., 2003). Общность направленности и в значительной степени выраженность ' иммунометаболических сдвигов, наблюдающиеся при различных формах стресса и патологии, сочетается с неодинаковой эффективностью корригирующего действия различных фармакологических средств.

Потеря значительного количества крови, как правило, сочетается с травматизацией тканей, а иногда с действием наркотизирующих веществ. Такая форма стресса является одной из наиболее частых в условиях чрезвычайных ситуациий, а также хирургической и акушерско-гинекологической практики. Иммунометаболические сдвиги, возникающие после острых кровопо-терь, изучены недостаточно.

Известно, что умеренная острая кровопотеря приводит к снижению ан-тиоксидантного потенциала гепатоцитов, усилению перекисного окисления и нарушению энергетического обмена в клетках, повышению проницаемости клеточных мембран гепатоцитов (Матвеев С.Б. и др., 1991,1999). Кровопотеря сопровождается увеличением числа ретикулоцитов и снижением количества зрелых эритроцитов в периферической крови, изменением деформируемости этих клеток, снижением числа тромбоцитов, повышением их адгезивных и агрегативных свойств (Соловьев С.В1., 1989). Эритроциты и тромбоциты оказывают существенное влияние на функциональную активность имму-ноцитов (Прокопенко Л.Г., Сипливая Л.Е, 1992). Значительные кровопотери, имеющие место при травмах и хирургических вмешательствах, сопровождаются нарушением иммунологических функций (Прокопенко Л.Г. и др., 2003).

Существенную роль в этом играют гуморальные факторы, выделяемые клетками печени, почек и костного мозга (Ляхов В.В. и др., 1987; Прокопенко Л.Г. и др., 1997; Афанасьев В.А., Ласкова И.Л., 1997).

Механизм нарушения иммунологической реактивности изучен недостаточно. Соответственно этому мало разработаны способы нммунореабили-тации после острых кровопотерь.

Анализ более 500 работ, опубликованных в последние 15 лет показал,. что многие фитопрепараты обладают иммуномодулирующими свойствами, обусловленными наличием в них каротиноидов, сапонинов, флавоноидов и,' особенно, полисахаридных комплексов (Хаитов P.M. и др., 1995; Mironet А. et al., 1995; Du J.-Y. et al., 1996).

Гликозаминогликаны различного видового происхождения корригируют развитие различных форм иммунного ответа при токсических поражениях печени, интенсивных физических нагрузках, алиментарных нарушениях гомеостаза, остром тепловом и холодовом стрессах (Конопля Е.Н., 1997; Прокопенко Л.Г. и др. 1999; Байбурин Ф.Я. и др., 2000).

В составе природных фитопрепаратов содержатся ГАГ, которые могут взаимодействовать с другими соединениями, обладающими иммуномодулирующими свойствами. В то же время, механизмы взаимодействия ГАГ с жи-'ро- и водорастворимыми витаминами мало изучены, поэтому большой научный и практический интерес представляет выяснение иммуномодулирующей эффективности различных сочетаний химических соединений, входящих в состав фитопрепаратов.

В/ патогенезе заболеваний, характеризующихся нарушением окислительно-энергетического гомеостаза, важную роль играют эритроциты. Снижение антиокислительного и энергетического потенциалов этих клеток лежит в основе нарушения их адсорбционных и адгезивных свойств, транспортной, гепатопротекторной и иммунорегуляторной функций (Прокопенко Л.Г. и др., 1993).

Коррекция окислительного и энергетического статусов эритроцитов в условиях стресса и патологии, вероятно, может ослабить выраженность или даже отменить негативные иммунометаболические сдвиги, вызванные стрес-сорными- воздействиями. Выраженные нарушения* иммунометаболичсекого состояния эритроцитов t наблюдаются при массивных кровопотерях (Прокопенко Л.Г. и др., 2000; Лазарева Г. А., Конопля А. А., 2003). В -связи* с этим, возникло предположение о возможности ослабить негативные последствия^ кровопотери путем- применения препаратов, влияющих на структуру мембраны эритроцитов путем применения препаратов, влияющих на структуру-мембраны эритроцитов и их метаболическую активность. Можно было предположить, что такое воздействие окажут полисахариды (в частности глико-заминогликаны), продукты их ферментативной фрагментации, полиненасыщенные фосфолипиды, а также жиро- и некоторые водорастворимые витами-еы.

Водорастворимые витамины и их производные являются кофермента-ми фераз, оксидоредуктаз, лиаз и лигаз. Неизвестны коферментные функции, выполняемые водорастворимыми витаминами в реакциях, катализируемых гидролазами. Последние присутствуют во всех компартментах клеток и межклеточных жидкостях. Они вызывают распад белков, полисахаридов, липи дов и образующиеся при этом фрагменты вызывают выраженные метаболические, иммунологические и физиологические эффекты. Не вызывает сомнения тот факт, что возникновение и выраженность этих эффектов во многих случаях обусловлены взаимодействием ферментов и продуктов их каталитической активности с другими соединениями постоянно присутствующими в клетках и неклеточных жидкостях в частности с витаминами. Особый интерес представляет взаимодействие химических соединений на мембранах клеток, с которыми связаны важнейшие для жизнедеятельности клетки, ферменты и. их ансамбли. В первую очередь внимание привлекает взаимодействие лекарственных соединений и компонентов плазмы крови с эритроцитами. Эти клетки существенно преобладают в крови, а их мембрана обладает выраженными адсорбционными свойствами, обусловливающими их способность выполнять роль транспортеров различных соединений. Все изложенное обусловливает перспективность изучения эритроцитзависимых эффектов взаимодействия гидролитических ферментов и витаминов.

Не исключено, что изучение действия этих препаратов, введенных по отдельности и, особенно в различных сочетаниях, позволит выявить лекарственные композиции, эффективно корригирующие иммунометаболические процессы и функциональную активность клеток различны физиологических систем при кровопотерях и других состояниях, характеризующихся нарушением структуры, метаболизма и функции эритроцитов.

Цель — выявление иммунометаболических и гепатопротекторных эритроцитзависимых эффектов взаимодействия гликозаминогликанов, гликози-даз, протеаз и витаминов при острой кровопотере.

Задачи.

1. Изучение иммунометаболических эффектов взаимодействия гликозаминогликанов растительного происхождения и жирорастворимых витаминов при кровопотере.

2. Выявление иммунометаболических эффектов взаимодействия гликозаминогликанов растительного происхождения и водорастворимых витаминов после кровопотери.

3. Установление иммунометаболических эффектов взаимодействия гликоза-миногликанов животного происхождения и витаминов при кровопотере.

4. Изучение иммунометаболических эффектов взаимодействия) глико-зидаз и витаминов после кровопотери.

5. Изучение иммунометаболических эффектов взаимодействия витаминов и продуктов фрагментации гликозаминогликанов при кровопотере.

6. Выяснение роли эритроцитов в реализации иммунометаболических эффектов.взаимодействия гликозаминогликанов, гликозидаз и витаминов после кровопотери.

7. Выявление гепатопротекторных эффектов взаимодействия гликозаминогликанов, гликозидаз и витаминов после кровопотери.

8. Изучение иммунометаболических эффектов совместного введения протеолитических ферментов и витаминов после кровопотери.

Научная новизна. Острая кровопотеря1 вызывает развитие иммуносу-прессии, в реализации которой принимают участие эритроциты и тромбоциты. Гликозаминогликаны растительного происхождения как иммунокоррек-торы при кровопотере более эффективны, чем гликозаминогликаны животного происхождения. Иммуностимулирующее действие продуктов фрагментации гликозаминогликанов животного происхождения более выражено, чем высокомолекулярных соединений. Иммунометаболические эффекты гликозаминогликанов различного видового происхождения и гликозидаз при кровопотере усиливаются жиро- и водорастворимыми витаминами. Наиболее эффективно при этом совместное применение гликозаминогликанов и гликозидаз с витаминами А, К, В'6, и BJ2. В реализации иммунотропного действия совместного применения гликозидаз с витаминами А и К важную роль играют тяжелые эритроциты. Высокой иммунометаболической активностью обладает строма эритроцитов, включающая менадион и обработанная лизоци-мом. Гликозаминогликаны или лизоцим, введенные с витаминами А или К, вызывают выраженный гепатопротекторный эффект. Иммунометаболические эффекты гликовитаминных взаимодействий опосредуются соединениями, выделяющимися различными популяциями спленоцитов. Протеазы по отдельности и в сочетании с жиро или водорастворимыми витаминами в норме или после кровопотере оказывают разнонаправленные иммунометаболиче-ские эффекты. Папаин не влияет, а лизоцйм или террилитин по отдельности, но в большей степени в сочетании с витаминами, повышают ФМА нейтро-филов и иммунную реактивность крыс после кровопотери. Строма эритроцитов крыс, полученная после кровопотери реагирует на кобаламин повышением имуномодулирующей активности, индуцируемой лизоцимом и террили-тином

Практическая значимость. Экспериментально обоснована перспектива изучения иммуномодулирующего, гепато- и актопротекторного действия лизоцима в сочетании с витаминами А, К, Вб или Bi2 при массивных крово-потерях в хирургической, травматологической и акушерско-гинекологической практике. Показана возможность получения высокоэффективных иммунокорректоров, гепато- и актопротекторов на основе стромы эритроцитов, экстракорпорально взаимодействующих с менадионом и лизоцимом. Обоснована целесообразность изучения биологических свойств продуктов фрагментации гликозаминогликанов, а также выявление и изучение эффектов, вызываемых активаторами гликозидаз. Показана взаимосвязь фармакологических эффектов действия витаминов и гликолитических ферментов при кровопотере, обоснована необходимость изучения ее механизма в здороI вом организме и при других формах нарушения гомеостаза. Установлены стимулирующие эффекты террилитина и лизоцима, как по отдельности, так и в сочетании с витаминами на функциональную активность нейтрофилов и иммунологическую реактивность крыс после кровопотери. Обнаружены им-муномодулирующие свойства стромы эритроцитов, индуцированной лизоцимом или террилитином, полученной после кровопотери и обработанной кобаламином.

Материалы диссертации включены в рабочие программы кафедр фармакологии, биохимии, патофизиологии, спортивной медицины, хирургии, акушерства и гинекологии Курского государственного медицинского университета, Российского государственного медицинского университета, Нии жегородской государственной медицинской академии, медицинских факультетов Белгородского и Орловского государственных университетов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Различие иммунометаболической активности гликозаминогликанов растительного и животного происхождения.

2. Эффективность иммунометаболического взаимодействия гликозаминогликанов и витаминов. 1

3. Особенности иммунометаболических эффектов взаимодействия гли-козидаз и витаминов.

4. Интегрирующая роль эритроцитов в реализации иммунометаболических эффектов взаимодействия гликозидаз и витаминов.

5. Гепатопротекторные эффекты взаимодействия гликозаминогликанов, гликозидаз!и витаминов.

6. Сочетанное применение террилитина или лизоцима с ретинола ацетатом или менадионом вызывает более выраженный иммуномодулирующий-эффект, чем раздельное введение препаратов.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на конференциях Курского государственного медицинского университета: конференциях, посвященных 65 и 66-летию КГМУ «Актуальные проблемы медицинской науки и фармации» (Курск, 2000, 2001), IV съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Москва, 2000), VII и X Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2000, 2003), Международной научно-практической конференции «Современные технологии фитонутрициоло-гии в акушерстве, гинекологии и педиатрии» (Москва, 2003), V Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, 2007), на совместном заседании кафедр фармакологии, фармацевтической и токсикологической химии с курсом аналитической химии, биохимии, спортивной медицины и медицинской реабилитации, акушерства и гинекологии, акушерства и гинекологии ФПО, микробиологии и патофизиологии Курского государственного медицинского университета (2008).

Публикации. По материалам диссертации в центральной и местной печати опубликовано 32 работы, в том числе в 10, рекомендуемых ВАК РФ изданиях, в которых содержится весь объем информации, касающейся темы диссертации.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 211 страницах машинописного текста, иллюстрирована 64 таблицами и 16 рисунками, состоит из введения, обзора литературы (4 главы), описания методов исследования, изложения собственных результатов (11 глав), заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 280 отечественных и 111 иностранных источников.

4. Результаты работы, выразившиеся в создании глико-витаминных препаратов могут быть использованы в производственных условиях для получения фармакологических средств, обладающих имумнометаболическими и гепатопротекторными эффектами при острой кровопотере.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Результаты исследований, основные положения которых включены в монографии: «Метаболическая иммуномодуляция» (Курск, 2000); «Иммуно-метаболические эффекты регуляторов энергетического обмена при нарушении гомеостаза» (Курск, 2006); «Эритроцитзависимые эффекты лекарственных и физиотерапевтических средств» (Курск, 2008) могут использоваться в учебном процессе медицинских вузов с целью углубления и расширения знаний о роли эритроцитов в реализации иммунометаболического и гепатопро-текторного действия препаратов гликозаминогликанов, гликозидаз и витаминов при кровопотере.

2. Материалы диссертации вошли в учебные рабочие программы и включены в лекционные курсы на кафедрах биологической химии, фармакологии, патофизиологии, акушерства и гинекологии, микробиологии Курского и Волгоградского государственных медицинских университетов, Воронежской и Ивановской государственных медицинских академий, медицинских факультетах Орловского и Белгородского государственных университетов.

3. Материалы по использованию композиций препаратов гликозаминогликанов, гликозидаз различного видового происхождения в сочетании с витаминами могут быть использованы в клинической практике после клинической апрбации для коррекции иммунометаболического статуса после кровопотери.