Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуномодулирующее, антиоксидантное и актопротекторное действие нафтохинонов в покое и при интенсивных физических нагрузках

{} !.;!л,"| Г";7

На правах рукописи

РЫБНИКОВ Владимир Николаевич

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ, АНТИОКСИДАНТНОЕ И АКТОПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ НАФТОХИНОНОВ В ПОКОЕ И ПРИ ИНТЕНСИВНЫХ ФИЗИЧЕСКИХ НАГРУЗКАХ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

КУРСК -1997

Работа выполнена в Курском государственном медицинском университете Научный руководитель:

— доктор медицинских наук, профессор И.ЛЛаскова

Официальные оппоненты:

— доктор биологических наук, член-корр. РАЕН, профессор ПА.Чалый

— кандидат медицинских наук С.В.Безгина Ведущее учреждение:

Российский государственный медицинский университет им. Н.И.Пирогова (г.Москва)

. Защита состоится ЧЬ" ЩухЯ/ 1997 г. в час. на заседании диссертационного совета К. 084.57.01. при Курском государственном медицинском университете (305033, г.Курск, ул. К.Маркса, 3.)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета. Автореферат разослан" '>" (ЛСС'<ЛУ 1997 года

Ученый секретарь диссертационного совета доцент

В.В.Новиков

Р 4107000000-112 без объявления 42 В (03) - 97

© Рыбников В.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Действие на неадаптированный организм любого достаточно сильного раздражителя, в том числе интенсивной физической нагрузки, приводит к развитию общего адаптационного синдрома, который включает стадии: тревоги, резистентности и иногда истощения (Ф.З.Меерсон, М.Г. Пшенникова, 1988).

Основную роль в формировании резистентности организма при действии на него чрезвычайных раздражителей играют нейроэндокринные механизмы -усиление секреции катехоламинов и глкжокортикоидов, а также повышение секреции инсулина (Л.Е.Панин, 1983).

Двигательная активность является обязательной при любом виде деятельности. Для людей, ведущих малоподвижный образ жизни, увеличение физической нагрузки до оптимального уровня является необходимым условием сохранения здоровья и высокой функциональной активности важнейших физиологических систем. Вместе с тем неадекватные физические нагрузки могут стать причиной существенных нарушений механизмов гомеостаза и, следовательно, привести к развитию характерных для таких нарушений заболеваний.

Физические нагрузки высокой мощности нередко приводят к развитию вторичного иммунодефицита, следствием которого является возникновение или обострение инфекционных, аллергических и аутоиммунных процессов, ускорение развития атеросклеротических изменений сосудов, гипертонической болезни, ишемической болезни сердца (ИДСуркина, 1981; В.А.Силуянова, 1982; В.А. Левандо, 1986). Более четверти спортсменов ежегодно болеют простудными заболеваниями (И.Д.Суркина, 1981). Причиной тяжелых заболеваний при физи-

ческих нафузках высокой интенсивности часто являются очаги хронической инфекции (тонзиллиты, отиты, холециститы, синуситы, гаймориты, бронхиты, кариозные зубы), обнаруживаемые у 20-25% обследуемых спортсменов (В.А.Силуянова,1982). С наличием очагов хронической инфекции у спортсменов связывают возникновение воспалительных и дистрофических изменений миокарда, абсцессов легких, панкреатитов, заболеваний почек и мочевыводя-щих путей, флебитов, артритов, артрозов.

Все изложенное обусловливает необходимость поиска способов эффективной коррекции функций иммунной системы у людей, выполняющих физическую работу высокой мощности.

При интенсивных физических нагрузках существенно возрастает потребность в витаминах. Детально изучено иммуномодулирующее действие жирорастворимых витаминов А и Е в норме, а также при различных формах стресса и патологии (К.Д.Плецитый,1989; К.Д.Плецитый, Т.В.Давыдова и др., 1989; ИЛЛаскова, 1990). Выявлена важная роль эритроцитов в реализации иммуно-модулирующих эффектов, вызываемых этими витаминами (Б.С.Утешев, А.И.Лазарев, 1996; Б.С.Утешев, И.Л.Ласкова,1996). Вместе с тем мало изученным остается иммуномодулирующее действие витамина К.

Цель работы: изучение иммуномодулирующего действия препаратов витаминов К1, Кг и К3 при интенсивных физических нагрузках.

Задачи работы: 1) сравнительное изучение иммуномодулирующей активности препаратов витамина К при интенсивных физических нагрузках; 2) изучение роли эритроцитов в реализации иммуномодулирующего действия препаратов витамина К; 3) изучение антиоксидантного и актопротекторного действия

препаратов витамина К при интенсивных физических нагрузках. 4) изучение иммуномодулирукнцей активности препаратов витамина К, иммобилизованных на эритроцитах.

Научная новизна. Выявлена высокая иммуномодулирующая, антиокси-дантная и актопротекторная активность нафтохинонов при интенсивных физических нагрузках. Установлено, что иммуномодулирующее, антиоксидантное и актопротекторное действие филлохинона опосредовано эритроцитами и цито-кинами, выделяемыми прилипающими к стеклу клетками селезенки.

Практическая значимость. Показана целесообразность использования нафтохинонов в качестве иммуномодулирующих, антиоксидантных и актопро-текторных средств при интенсивных физических нагрузках. Обоснована перспективность изучения иммуномодулирующего действия препаратов витамина К иммобилизованных на эритроцитах.

Апробация работы. Основные положения диссертации были обсуждены на III Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1996 г.); И Международном конгрессе по иммунореабилитации (Турция, 1996 г.); Итоговой научной конференции студентов и молодых ученых (Курск, 1996 г.); Научно-производственной конференции, посвященной 100-летию Курской биофабрики (Курск, 1996 г.); совместном заседании кафедр спортивной медицины и медицинской реабилитопогии, биохимии, акушерства и гинекологии КГМУ (1997 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора

литературы (главы 1 и 2), описания материалов и методов исследований (глава 3), изложения собственных исследований (главы 4-7), заключения и выводов. Работа изложена на 115 страницах машинописи и включает 29 таблиц, 2 рисунка; указатель литературы содержит 131 источник отечественной и 36 — зарубежной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Исследования проведены на крысах Вистар массой 180-200 г. Физическая нагрузка создавалась плаванием (слой воды не менее 60 см) с грузом 3-3,5% массы тела по 3 ч в день 5 дней подряд. Температура воды поддерживалась в пределах 30 ± 2 °С (Ю.Г.Бобков, В.М.Виноградов и др., 1984). Контролем служили животные, находившиеся в воде, но не плававшие (слой воды 5 см).

Развитие иммунного ответа индуцировали однократным внутрибрюшин-ным введением эритроцитов барана (ЭБ) в дозе 109 клеток на 1 кг массы тела одновременно с первым сеансом плавания. Интенсивность развития иммунного ответа на ЭБ оценивали на 5 сутки после иммунизации путем определения в селезенке числа клеток, образующих антитела (АОК) к ЭБ (К.Мальберг, Э.Зигль, 1987) методом прямого локального гемолиза, а также числа клеток, формирующих розетки (РОК) к ЭБ (Х.Зауэр, 1987). Для оценки выраженности гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) сенсибилизирующую дозу ЭБ (107 на 1 кг массы тела) вводили внутрибрюшинно, спустя 4 сут в подушечку правой лапки вводили разрешающую дозу (10® ЭБ на 1 кг массы). В подушечку левой лапки вводили 0,15 М раствор хлорида натрия. О выраженности ГЗТ судили по величине различия массы и количества кариоцитов регионарного и контрлатерапьного узлов спустя 24 ч после введения разрешающей дозы ЭБ.

Эритроциты крови крыс фракционировали в градиенте плотности яичного альбумина {Т.В.Кобозев, Н.А.Троицкая и др., 1978). Выделяли 3 фракции: легкие эритроциты (меньше 1,079 г/см3), промежуточные клетки (1,091-1,105 г/см3), тяжелые эритроциты (более 1,117 г/см3). Во избежания гемолиза тяжелой фракции фракционирование проводили при температуре 2-4°С. Полученные фракции эритроцитов использовали для введения аллогенным и сингенным животным.

Клетки селезенки фракционировали по их способности прилипать к стеклянной поверхности (П.Д.Дерфлинг, З.Вихнер, 1987). Соотношение прилипающих и неприлипающих клеток равнялось 1:4 -1:5. Жизнеспособность клеток определяли по поглощению трипанового синего. Прилипающие к стеклу клетки дополнительно фракционировали при температурном градиенте (С.В.Родионов, В.И.Патним и др.,1985). Выделяли клетки, прилипающие при температуре 2,10,25 и 37 °С. Количество клеток подсчитывали в камере Горяе-ва. Для контроля клеточного состава суспензий проводили микроскопию мазков, окрашенных по Романовскому. Прилипающие и неприлипающие клетки селезенки культивировали в среде 199, содержащей 5% телячьей эмбриональной сыворотки и антибиотики (пенициллин и стрептомицин) в течение 3-6 часов в ламинарбоксе при периодическом обновлении газовой среды (95% Ог и 5% СОг). В некоторых опытах спленоциты культивировали с аплогенными эритроцитами или их фракциями при соотношении клеток 1:2.

Надосадочные жидкости фракционировали с помощью сефадекса G-150, при этом получали 3 фракции: фракция I - содержала белки с молекулярной массой (ММ), превышающей 150 кД, фракция I) - преимущественно белки с ММ 50-60 кД, и фракция III - белки с ММ 10-15 кД и ниже. Иммуномодулирующую

активность надосадочных жидкостей и их фракций определяли путем однократного или двукратного внутрибрюшинного введения их интактным животным в объеме, содержащем соответственно 5 и 2 мг белка на 1 кг массы тела, при одновременной инъекции антигена.

Оценку выраженности окислительного стресса проводили путем определения в сыворотке крови концентрации диеновых конъюгагов жирных кислот (ДК) и малонового диапьдегида (МДА) (В.И.Венисович, Л.И.Идельсон, 1973), в эритроцитах - активности супероксиддисмутазы (СОД) и глутатионредуктазы (ГР) (Е.В. Макаренко, 1988).

Изучено антиоксидантное и иммуномодулирующего действие филлохино-на (витамин КО, менадиона (витамин Кг) и викасола (аналог витамина К3). Все препараты вводили внутрижелудочно 5-кратно с интервалом 24 ч непосредственно после окончания сеанса плавания. Разовые дозы препаратов равнялись: филлохинона 1 мг/кг и 5 мг/кг; менадиона 0,5 мг/кг и 3 мг/кг; викасола 0,5 мг/кг и 3 мг/кг. Выбор доз филлохинона основан на данных литературы о нормализующем влиянии их на процессы обезвреживания ксенобиотиков в печени (ААПентюк, Н.Г.Богданов, Н.БЛуцюк, 1994). Дозы филлохинона, менадиона и викасола примерно эквимолярны.

Включение викасола в строму эритроцитов проводили по методу, разработанному для антибиотиков (Ж.Ш.Жумадилов, Р.В.Макаренкова, 1990). Эритроциты крыс, выделенные из 1 мл крови, дважды отмывали изотоническим раствором хлорида натрия путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 мин при 4 °С. К осадку эритроцитов добавляли семикратный объем охлажденной до 0 °С дистиллированной воды и центрифугировали при 8000 об/мин в течение 25 мин при 4 °С. К полученной строме прибавляли семикрат-

ный объем викасола, содержащий различные дозы препарата охлажденного до О °С. Взвесь инкубировали в течение 20 мин при 4 °С, затем добавляли 1/9 объема 9% хлорида натрия для восстановления целостности эритроцитарной стромы и инкубировали в течение 30 мин при 37 °С. После включения витаминов, эритроцитарную строму дважды отмывали изотоническим раствором хлорида натрия и осаждали центрифугированием при 8000 об/мин в течение 10 мин.

Результаты исследований обрабатывали статистически, вычисляли средние арифметические и их стандартные ошибки. Существенность различий средних величин оценивали по показателю Стьюдента (Г.Ф.Лакин, 1980) и по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни (Е.В.Гублер, ААГенкин, 1973).

Результаты исследования. Изучено влияние филлохинона, менадиона и викасола на развитие различных форм иммунного ответа в норме и при интенсивных физических нагрузках.

Установлено, что введение неплававшим крысам филлохинона и менадиона в обеих выбранных дозах стимулировало развитие гуморального иммунного ответа (ГИО) и ГЗТ, индуцированные ЭБ. Викасол вызывал хелперный эффект у неплававших животных только при введении в дозе 3 мг/кг.

Филлохинон в дозе 1 мг/кг усиливал, а в дозе 5 мг/кг нормализовал развитие ГИО и ГЗТ у плававших крыс. Менадион повышал выраженность обеих форм иммунного ответа только в дозе 3 мг/кг. Викасол в дозе 3 мг/кг усиливал развитие ГИО, но не влиял на выраженность ГЗТ (таблица 1).

Таблица 1.

Иммуномодулирующий эффект препаратов витамина К при внутрижелудочном введении в условиях физической нагрузки

Условия опыта Доза, мг Числ о крыс Количество Разница

АОК РОК Массы Кол-ва кариоцитов

1. Контроль (без введения препарата) 8 23.9 ± 2.8 47.6 ± 5.1 7.4 ± 0.9 9.6 + 1.2

2. Плавание — 8 7.5 ± 0.9 24.8 А 3.0 2.6 ± 0.5 4.2 ± 0.6'1

3. Плавание, введение филлохинона 1 8 13.4 ±1.8*^ 35.0*4.2*^ 4.9 ± О-в*1-* 6.6 10.9*1-*

5 8 21.3 ±2.7** 45.7 ± 5.2** 7.1 ± 0.9** 9.0 ± 1.3**

4. Плавание, введение менадиона 0.5 8 7.9 ± 1.1 41 26.0 ± 3.2 3.0 ± 0.6 *' 4.8 ±0.9*'

3 8 12.511.4*1-* 37.2 ±4.5*^ 5.7 ± 0.7*1* 7.0 ± 1.0*^

5. Плавание, введение ви-касола 0.5 8 7.2 ± 0.8 *' 21.8 ±2.7 *' 2.9 ± 0.7 *' 4.5 ±0.8*'

3 8 13.2 ±1.7*1"£ 32.4 ± 3.8*^ 2.4 ± 0.5*1 3.9 ± 0.6*1

Примечание: В этой и всех последующих таблицах: * - существенность различия с вероятностью 95%, цифрами - номера групп; количество АОК -тыс/орган; РОК - млн/орган; разница массы лимфоузлов - мг; разница количества кариоцитов - тыс.

Внутримышечное введение филлохинона в дозе 1 мг/кг, менадиона и ви-касола в дозе 0,5 мг/кг у неплававших крыс вызывало примерно одинаковое усиление ГИО и ГЗТ, выраженность которого не отличалось от той, которая наблюдалась при внутрижелудочном введении препаратов в дозах соответственно равных 5 и 3 мг/кг. Инъекции филлохинона и менадиона в дозах соответственно равных 5 и 3 мг/кг стимулировали развитие обеих форм иммунного ответа в такой же степени как дозы 1 и 0,5 мг/кг. Викасол в дозе 3 мг/кг вызывал

слабо выраженный, но статистически существенный супрессорный эффект. У плававших крыс филлохинон и менадион вызывали дозозависимое усиление ГИО и ГЗТ, а викасол усиливал ГИО, но не влиял на ГЗТ.

Изучение иммуномодулирующих свойств эритроцитов неплававших крыс, получавших филлохинон, менадион и викасол показало, что они стимулировали развитие иммунного ответа у аллогенных животных. Более выраженный эффект вызывали эритроциты животных, которым вводили филлохинон.

Некоторые биологически активные соединения (протеолитические и гли-колитические ферменты, полиненасыщенные фосфолипиды) обладают свойством индуцировать появление иммуностимулирующих свойств у тяжелых эритроцитов (Л.Г.Прокопенко, Г.А.Чалый и др., 1994). Принимая во внимание это обстоятельство, изменение иммуномодулирующих свойств у эритроцитов плававших крыс после введения им нафтохинонов, можно объяснить снижением иммуносупрессирующих свойств у легких эритроцитов или индукцией иммуностимулирующих свойств у тяжелых эритроцитов. Для решения этого вопроса эритроциты плававших и получавших препарат крыс фракционировали в градиенте плотности яичного альбумина (см. главу материалы и методы). Определение иммуномодулирующих свойств фракций показало, что препараты витамина К не влияют на иммуносупрессирующие свойства легких эритроцитов плававших животных, но индуцируют появление иммуностимулирующих свойств у тяжелых клеток. Наиболее выраженной стимулирующей активностью обладают тяжелые эритроциты крыс, получавших филлохинон, наименее выраженной - клетки животных, которым вводили викасол (таблица 2).

Таблица:

Влияние фракций эритроцитов плававших и получавших нафтохиноны животных на развитие иммунного ответа у аллогенных реципиентов

Условия опыта Легкие эритроциты Промежуточные эритроциты Тяжелые эру троциты

1. Введение эритроцитов интактных крыс 24.6 + 2.8 56,2 + 6,0 22.8 ± 2,6 55,0 ± 6. 2 25.1 ±3.0 58,6 ± 6,3

2. Введение эритроцитов плававших крыс 9.4 ± 1.2 ** 31.5 ± 3.8 *1 20.6 ± 2.5 52.6 ±5.6 23.3 ± 2.9 55.4 ± 6.0

3. Введение эритроцитов плававших и получавших филлохинон крыс 10,2 ± 1,4 29,8 ± 3,4 21.8 ±2.7 56,4 ± 5,3 65,3 + 7.1*^ 117,0 ± 12,4*1х

4. Введение эритроцитов плававших и получавших менадион крыс 8.8 ±1.0 32.5 ± 3.7 и 23.0 ± 2.9 54.2 ±6.1 52.4 ± б.О*1^ 83.7 ± 9.0

5. Введение эритроцитов плававших и получавших вика-сол крыс 11.0 ±1.7 30.8 ± 3.9 *1 20.5 ± 2.8 53.0 ± 5.8 43.6 ± 5.2 70.1 ± 7.9*1-2

Примечание: Каждая средняя получена в опытах на 8 крысах; в чиспител АОК, в знаменателе - РОК

Иммуностимулирующий эффект, вызываемый эритроцитами животнь» получавших инъекции эссенциале или липостабила, обусловлен их активизм рующим влиянием на выделение хелперных цитокинов прилипающими к стекп клетками селезенки (Н.А.Конопля, 1995). Учитывая это, было изучено влиянки эритроцитов плававших и получавших филлохинон (5 мг/кг) крыс на выделени« цитокинов клетками селезенки интактных животных. Оказалось, что такие эри троциты индуцировали выделение сгшеноцитами, прилипающими к стеклу пр| 4-10 °С, иммуносупрессирующего фактора, а клетками, прилипающими при 32 37 °С - хелперного фактора. Это позволяет считать, что в сосудистом русл» плававших и получавших филлохинон крыс есть популяции эритроцитов, одж из которых обладают свойством индуцировать выделение супрессирующего, <

другие - хелперного фактора различными по адгезивным свойствам фракциями спленоцитов.

Результаты проведенных экспериментов позволяют считать, что более эффективными средствами из числа препаратов является филлохинон и, что его иммуномодулирующий эффект опосредован эритроцитами и выделенными под их влиянием цитокинами прилипающими к стеклу клетками селезенки. Действие филлохинона отличается от эффектов, вызываемых витамином Е и сходно с влиянием полиненасыщенных фосфолипидов.

Введение интактным крысам супернатанта спленоцитов, содержащего иммуносупрессирующий фактор, не оказывало влияния на содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и активность ферментов в сыворотке крови. В отличие от этого введение плававшим, не получавшим филлохинон крысам супернатанта спленоцитов, содержащего хелперный фактор, снижало величины показателей, характеризующих выраженность ПОЛ и проницаемость мембран гепатоцитов. Таким образом, антиоксидантное действие филлохинона при интенсивных физических нагрузках опосредуется факторами, выделяющимися клетками селезенки. Вероятно, эти факторы являются элементами механизма, обеспечивающего сохранение структурного гомеостаза при интенсивных физических нагрузках.

Установлено, что выполнение интенсивной физической нагрузки приводит к снижению активности СОД и ГР в эритроцитах. Введение плававшим крысам высокомолекулярной фракции супернатантов спленоцитов (ВФСС) существенно повышало активность СОД и ГР, а инъекции плававшим крысам низкомолекулярной фракции супернатантов спленоцитов (НФСС) не влияли на биохимические показатели эритроцитов. Таким образом, в составе ВФСС плававших

животных, получавших филлохинон, содержится фактор, активирующий синтез (или повышающий активность) антиоксидантных ферментов и таким путем ограничивающий выраженность ПОЛ клеточных мембран. Эритроциты плававших крыс, получавших инъекции высокомолекулярной фракции, не обладали иммуносупрессирующими свойствами, а эритроциты животных, которым вводили низкомолекулярную фракцию, при аллогенном переносе супрессиро-вапи развитие иммунного ответа на ЭБ.

Установлено, что введение филлохинона (5-кратно по 5 мг/кг) повышало способность крыс выполнять физическую нагрузку субмаксимальной (ФНСИ) (продолжительность плавания с грузом, составляющим 8% массы тела) и максимальной (ФНМИ) (число крыс, плавающих с грузом 20% в течение 1 мин) интенсивности. Пятикратное плавание с грузом 3-4% массы тела в течение 4 ч снижало работоспособность животных. Введение им филлохинона или менади-она (по 5 или 3 мг/кг соответственно) повышало способность крыс выполнять физическую работу субмаксимальной и максимальной интенсивности (таблица 3). Инъекции викасола крысам, находившимся в состоянии покоя, не влияли на физическую работоспособность, а введение этих препаратов 5-кратно плававшим крысам повышало их способность выполнять субмаксимальную нагрузку, но не влияло на возможность выполнения максимальной нагрузки. Вероятно, повышение физической работоспособности при поступлении в организм филлохинона обусловлено мембранопротекторным действием препарата, а также появлением под его влиянием у тяжелых эритроцитов свойства индуцировать выделение различных биологически активных соединений моноцитами /макрофагами селезенки. Актопротекгорный эффект менадиона и викасола

Таблица 3.

Влияние стабилизаторов клеточных мембран на физическую работоспособность крыс, находившихся в состоянии покоя и выполнявших

физическую нагрузку

Условия опыта ФНСИ, мин ФНМИ, число крыс

1. Контроль (неплававшие и неполучавшие препаратов) 6.3 ± 0.5 27

2. Введение филлохинона 11.6±0.9*1 36

3. Введение менадиона 10.1 ¿О.в*1 37

4. Введение викасола 5.8 ±0.5 41 28

5. Плавание 4.1 ± 0.3 -1 16*'

6. Плавание, введение филлохинона 6.8 ± 0.6 ^ 29 *э

7. Плавание, введение менадиона 6.0 ± 0.4 23 *а

8. Плавание, введение викасола 5.6 ± 0.4 *9 17*'

Примечание: 1) в этой и последующих таблицах ФНСИ определяли в опытах на 20, ФНМИ - на 40 крысах в каждой группе;

2) существенность различия показателей ФНМИ определяли с помощью точного метода Фишера.

связан, по-видимому, только с их стабилизирующим влиянием на мембраны клеток (в том числе и миоцитов) плававших крыс. Учитывая результаты проведенных экспериментов, интересно было изучить влияние аллогенных эритроцитов крыс, получавших филлохинон (ЭКПФ) на физическую работоспособность интактных плававших крыс.

Установлено, что 5-кратное введение ЭКПФ (по 10е клеток на 1 кг массы тела) повышает способность плававших и неплававших животных выполнять физическую работу субмаксимальной и максимальной интенсивности. Актопро-текгорный эффект обусловлен фракцией тяжелых эритроцитов. Легкие и про-

межуточные по плотности ЭКПФ не оказывали влияния на физическую работоспособность плававших и неплававших крыс.

При введении ЭКПФ крысам клетки селезенки, прилипающие к стеклу при 4-10 °С, выделяют иммуносупрессирующий, а клетки, проявляющие адгезивные свойства при 32-37 °С - хелперный фактор. Исследованы влияния супернатан-тов, содержащих супрессирующий и стимулирующий факторы, на физическую работоспособность плававших и неплававших крыс. Введение неплававшим крысам супернатанта, содержащего супрессирующий фактор, не оказывало влияния на их работоспособность. Инъекции супернатанта, в состав которого входит хелперный фактор, увеличивали способность неплававших животных выполнять работу субмаксимапьной интенсивности. Супернатант, содержащий супрессирующий фактор, не влиял на работоспособность, а супернатант, в состав которого входит стимулирующий фактор, увеличивал возможность выполнения мышечной работы плававшими животными. Фракционирование супернатанта, содержащего стимулирующий фактор на сефадексе (3-150, показало, что иммуностимулирующая и актолротекторная активности обнаруживаются в составе фракции, основную массу которой составляют белки с молекулярной массой 10-15 кД. Это позволяет предположить, что оба вида активности обусловлены наличием во фракции близких по структуре факторов.

Изучено влияние викасола, включенного в строму эритроцитов (ВВСЭ) ин-тактных крыс на развитие иммунного ответа, индуцированного ЭБ у неплававших и плававших крыс. ВВСЭ вводили интактным и плававшим крысам (внутрибрюшинно, 5-кратно с интервалом 24 ч по 10е клеток на 1 кг массы тела), одновременно с первой инъекцией животных иммунизировали ЭБ. Контролем служили животные, получавшие инъекции стромы эритроцитов, не содер-

жащей викасол. ВВСЭ стимулировала развитие иммунного ответа на ЭБ у ин-тактных крыс (таблица 4).

Таблица 4.

Влияние викасола, включенного в строму эритроцитов (ВВСЭ), на развитие иммунного ответа у интакгных плававших животных

Условия опыта Количество АОК Количество РОК

1. Контроль (без введения эритроцитов) 27.1 ± 2.8 46.8 ±5.2

2. Введение эритроцитов без нафтохино-нов 23.1 ±2.7 48.0 ++5.3

3. Введение ВВСЭ (0.1 мг) 74.8 ±8.3 95.2 ± 10.6

4. Введение ВВСЭ (0.2 мг) 62.3 ±6.8*^ 128.1 ± 13.8

5. Введение ВВСЭ (0.5 мг) 54.0 ±6.1 79.4 ±8.8

6. Плавание 9.6 ± 1.3 25.0 ±3.1 41

7. Плавание, введение эритроцитов без нафтохинонов 9.8 ±1.2^ 23.4 ±2.8^

8. Плавание, введение ВВСЭ (0.1 мг) 13.8 ±1.8 35.4 ± 4.0

9. Плавание, введение ВВСЭ (0.2 мг) 20.6 ± 2.4 *0,/ 44.0 ±5.1

10. Плавание, введение ВВСЭ (0.5 мг) 14.2 ± 1.7 36.6 ±4.3*"''

Примечание: в скобках указано содержание ампульного препарата в инкубационной среде.

Наиболее эффективной была строма с включенным в нее викасолом при содержании его в инкубационной среде в дозе 0,2 мг. Строма эритроцитов, полученная при содержании викасола 0,2 мг, нормализовала развитие иммунного ответа у плававших крыс, а строма в которую викасол включался при содержании его в среде 0,1 мг или 0,5 мг усиливала, но не нормализовала этот процесс у плававших животных.

Изучено влияние викасола адсорбированного на эритроцитах (ВАЭ) и ВВСЭ на выделение цитокинов клетками селезенки крыс. Оказалось, что ВАЭ индуцирует выделение иммуностимулирующего фактора прилипающими к

стекпу клетками селезенки. ВВСЭ активирует выделение иммуностимулирующего фактора прилипающими и неприлипающими клетками. Супернатант прилипающих спленоцитов (СПС) нормализует или снижает величины показателей ПОЛ и активность антиоксидантной системы (АОС), а также повышает физическую работоспособность. Иммунологически активный супернатант неприпи-пающих спленоцитов (СНС) не оказывал влияния на определявшиеся показатели антиоксидантного статуса и физическую работоспособность (таблица 5).

Таблица 5.

Влияние супернатантов спленоцитов крыс, получавших инъекции ВАЭ и ВВСЭ, на антиоксидантный статус и физическую работоспособность плававших животных

Условия опыта ДК МДА сод ГР ФНСИ ФНМИ

1. Контроль (без введения супернатантов) 8.8 ±1.3 21.4 ±2.6 40.6 ± 3.7 96.7 ± 9.4 6.3 ±0.4 26

2. Введение СПС крыс, получавших ВАЭ 5.7 ±1.4*1 13.2 ±1.6 *' 49.2 ± 4.1 112.3±13.0 41 12.4±0.9 *п 37*'

3. Введение СНС крыс, получавших ВАЭ 6.3 ±1.2 23.0 ± 2.8 43.0 + 3.9 95.5 ±10.2 6.9 ± 0.7 24

4. Введение СПС крыс, получавших ВВСЭ 6.0 ±1.3*' 12.5 ± 1.4 *1 52.6 ±5.9 *' 120.4+ 15.3*1 14.0± 1.2*' 41 11

5. Введение СНС крыс, получавших ВВСЭ 8.5 ± 1.4 20.7 ±2.8 39.3 ±4.0 92.8 ±9.5 5.9 + 0.5 24

Можно предположить, что небольшие дозы викасола, связанного с эпитопами мембраны эритроцитов, являются индукторами цитокинвыделительной функции макрофагов, а относительно большие дозы викасола включенного в строму эритроцитов, усиливают выделение гепатоцитами протеаз, активирующих продукцию различными популяциями спленоцитов.

Стабильность восстановленной стромы эритроцитов, вероятно, можно повысить путем обработки ее эссенциале. Полиненасыщенные фосфолипиды этого препарата, включаясь в билипидный слой стромы, по-видимому, служат дополнительным фактором сшивки и вызывают изменение композиции эпито-пов поверхностного слоя мембраны. Последнее может быть причиной повышения эффективности взаимодействия стромы с макрофагальными и лимфоид-ными клетками, приводящего к выделению иммунорегуляторных цитокинов. Принимая во внимание эти исходные положения, была предпринята попытка получения иммобилизованных с помощью стромы эритроцитов викасола и полиненасыщенных фосфолипидов эссенциале. С этой целью получали ВВСЭ и инкубировали его с эссенциале (10е частиц восстановленной стромы + 1 мл эссенциале, инкубация 2 ч при 37 °С). После инкубации строму дважды отмывали холодным изотоническим раствором хлорида натрия. Полученный препарат вводили по принятой схеме интактным и плававшим крысам, иммунизированным ЭБ. Установлено, что викасол и эссенциале, соиммобилизованные с помощью стромы эритроцитов (ВЭССЭ), стимулировали развитие иммунного ответа на ЭБ в большей степени, чем ВВСЭ (количество АОК в селезенке больше в 2,2, а РОК - в 1,6 раза).

Сравнительная характеристика иммобилизованных препаратов викасола представлена в таблице 6.

Таблица 6.

Сравнительная иммуномодулирующая эффективность иммобилизованных

препаратов викасола

Характеристика ВАЗ ввез ВЭССЭ

Иммуномодулирующий Стимуляция Выраженная Сильно выражен-

эффект стимуляция ная стимуляция

Отсроченный иммуномодулирующий эффект Супрессия Стимуляция Стимуляция

Индукция выделения хел-лерных цитокинов ПКС Выявлена Выявлена Выявлена

Индукция выделения хел-перных цитокинов НКС Не выявлена Выявлена Выявлена

Эффективность при физической нагрузке Высокая Высокая Высокая

Эффективность при физической нагрузке, сочетающейся с охлаждением Низкая Высокая Высокая

ВЫВОДЫ.

1. Физическая нагрузка высокой интенсивности супрессирует развитие ГИО и ГЗТ, индуцированные ЭБ. Препараты витамина К (филлохинон, менади-он и викасол) усиливают развитие обеих форм иммунного ответа у животных, выполнявших интенсивную физическую нагрузку. Наиболее выраженный имму-номодулирующий эффект вызывает филлохинон.

2. Физическая нагрузка высокой интенсивности повышает содержание в крови соединений, характеризующих выраженность ПОЛ (ДК и МДА) и актив-

ность ферментов АОС в эритроцитах (СОД и ГР), а также индуцирует появление у эритроцитов иммуносупрессирующих свойств. Филлохинон снижает содержание ДК и МДА, активность СОД и ГР, индуцирует появление у тяжелых эритроцитов иммуностимулирующих свойств.

3. Эритроциты плававших животных, получавших филлохинон, индуцируют выделение клетками селезенки, прилипающими к стеклу при 4-10 °С имму-носупрессирующего фактора, а клетками, прилипающими при 32-37 °С -хелперного фактора. Супернатант спленоцитов, содержащий иммуносупресси-рующий фактор, не оказывает влияния на содержание ДК и МДА в сыворотке, активность СОД и ГР в эритроцитах. Супернатант, содержащий хелперный фактор снижает величину показателей ПОЛ в сыворотке и активность ферментов АОС в эритроцитах.

4. Филлохинон повышает физическую работоспособность находящихся в покое и выполняющих физическую нагрузку животных. Актопротекторное действие филлохинона опосредовано фракцией супернатанта прилипающих к стеклу клеток селезенки, содержащих иммуностимулирующий фактор.

5. Викасол, адсорбированный на эритроцитах (ВАЭ), включенный в строму эритроцитов (ВВСЭ) и соиммсбилизованный с эссенциале с помощью стромы эритроцитов (ВЭССЭ) стимулирует развитие иммунного ответа в покое и при выполнении физической нагрузки. ВЭССЭ вызывает более выраженный и продолжительный иммуностимулирующий эффект, чем ВАЭ и ВВСЭ.

6. ВАЭ индуцирует выделение иммуностимулирующих факторов прилипающими к стеклу клетками селезенки. ВВСЭ и ВЭССЭ активируют аналогичную функцию прилипающих и неприлипающих спленоцитов. В супернатантах прилипающих клеток содержатся цитокины, повышающие содержание альфа-1-

антипротеазы (ААП) и альфа-2-макроглобулина (AMГ), а в супернатантах не-прилипающих клеток - факторы, блокирующие этот эффект.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. ИЛЛаскова, В.Н.Рыбников. Иммуномодулирующая активность препаратов витамина К при интенсивных физических нагрузках // Тезисы докладов научно - производственной конференции "100 лет Курской биофабрике и агробиологической промышленности России".- Курск. -1996. - с. 180.

2. ИЛЛаскова, С.А.Лосенок, В.Н.Рыбников. Метаболическая коррекция иммунного ответа при различных формах стресса и патологии И Актуальные проблемы медицины и фармации. Материалы итоговой научной конференции студентов и молодых ученых. - Курск. -1996. - с.4-5.

3. В.Н.Рыбников, ИЛЛаскова. Метаболическая иммунокоррекция при интенсивных физических нагрузках // III Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". Москва. -1996. - с.195-196.

4. В.Н.Рыбников, ИЛЛаскова. Иммуномодулирующее действие препаратов витамина К. II III Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". Москва.-1996. - с. 196.

5. В.Н.Рыбников, ИЛЛаскова. Иммуномодулирующее действие препаратов витамина К. II International journal on Immunorehabilitation. - 1996. - N 2.-Supp. 101.

6. И ЛЛаскова, В.Н.Рыбников. Эритроциты как трансмиссеры иммуномо-дулирующего действия препаратов витамина К. // Юбилейный сборник научных трудов к 20-летию областной детской больницы г. Курска. - Курск. - 1997. -с. 14-15.

-237. И.Л.Ласкова, В.Н.Рыбников. Иммуномодулирующее действие сыворотки, содержащей антитела к рецепторам опиатных пептидов в покое и при физических нагрузках. // Юбилейный сборник научных трудов к 20-летию областной детской больницы г.Курска. - Курск. -1997. - с.15-17.

8. В.Н.Рыбников, И.Л.Ласкова, Л.Г.Прокопенко. Нафтохиноны как иммуно-модуляторы при интенсивных физических нагрузках // Антибиотики и химиотерапия. - 1997. - N 3. - с.6-10.