Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуномодулирующее действие иммуноглобулинов для внутривенного введения у женщин с привычным невынашиванием беременности и антифосфолипидным синдромом

На правах рукописи

Соловьёва Анна Евгеньевна

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ДЛЯ ВНУТРИВЕННОГО ВВЕДЕНИЯ У ЖЕНЩИН С ПРИВЫЧНЫМ НЕВЫНАШИВАНИЕМ БЕРЕМЕННОСТИ И АНТИФОСФОЛИПИДНЫМ СИНДРОМОМ

14 00 36 - аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ООЗ

Москва - 2008

003168652

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им В Н Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи» Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, Сотникова Наталья Юрьевна

профессор

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, Семенков Виктор Фадеевич

профессор

Доктор биологических наук Лютов Андрей Германович

Ведущая организация Федеральное i осударственное учреждение «Научный центр акушерства, гинекологии и псринатологии имени академика В И Кулакова Росмедтехнологий»

Защита диссертации состоится «ЛгС » с-С-С С2<А~- 2008 года, в «_»

часов на заседании диссертационного совета Д 208 046 02 при Федеральном государственном учреждении науки «Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им Г Н Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, по адресу 125212, г Москва, ул Адмирала Макарова, 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН МНИИЭМ им Г Н Габричевского, г Москва

Автореферат разослан « » к' 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат медицинских наук, JIИ Новикова

Общая характеристика работы Актуальность исследования. В условиях снижения воспроизводства, ухудшения показателей соматического и репродуктивного здоровья населения сохранение каждого плода и новорожденного становится одной из самых актуальных задач (Агаджанова А А, 2002, Сидельникова В М, 2005) Проблема невынашивания имеет не только медицинское, но и большое социальное значение, так как невынашивание беременности приводит к снижению рождаемости, влияет на физическое и психологическое здоровье женщин, на их семейное благополучие и трудоспособность (Ледина А В ,2000, Сидельникова В М, 2001)

Невынашивание беременности (НБ) является сложной, многофакторной патологией причины этого состояния очень разнообразны (Серов В Н, 2000) Наибольший интерес представляет невынашивание беременности на ранних сроках, т к в данном случае иммунологические причины невынашивания выходят на первый план (Кулаков В И, 1999, Милько-Черноморец Ю В , 1999) Инфекция является одной из причин приводящей к формированию изменений в иммунной системе, что ведет к углублению иммунных нарушений и усилению угрозы выкидыша (Калиев ЮШ, 1999, Крысова Л А, 1999) По данным зарубежных авторов частота этой патологии в популяции составляет 2 - 5 % и не имеет тенденции к снижению (Веег А Е, 2000) Установлено, что риск потери беременности после первого выкидыша составляет 13 — 17%, что соответствует частоте спорадического выкидыша в популяции, тогда как после двух предшествующих самопроизвольных прерываний риск потери желанной беременности возрастает более чем в два раза и составляет 36 - 38% (Барсегян О К ,1999, Сидельникова В М, 2001)

Помимо инфекции, в последние годы среди иммунологических аспектов невынашивания беременности большое внимание привлекает роль аутоиммунных процессов, в частности роль антифосфолипидных антител в акушерской патологии (Насонова Е А,1999, Макацария АД, 2001) Бактериальные и вирусные возбудители являются важным фактором,

способствующим развитию аутоиммунных процессов, в связи с их способностью тесно связываться с мембраной клетки, вступать с ней в межмембранное взаимодействие, в результате чего начинается выработка антител против собственных клеток и развитие аутоиммунного процесса Сочетание антифосфолипидного синдрома с инфекционными факторами осложняет течение беременности, и может определять ее исход В структуре причин привычного невынашивания беременности (ПНБ) антифосфолипидный синдром составляет 27 - 42%, причем без проведения адекватной терапии гибель плода наблюдается у 90-95 % женщин, имеющих аутоантитела к фосфолипидам (Мальцева Л И, 2000, Карпенко Л В , 2002)

В лечении женщин с невынашиванием беременности все чаще используют иммуноглобулины для внутривенного введения (Васильева О Ю, 2000) Однако, несмотря на то, что проблеме лечения невынашивания беременности посвящено большое количество работ, включая и использование препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения (ИГВВ), дифференциальный подход к назначению отечественных препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения различного типа у женщин с привычным невынашиванием беременности и антифосфолипидным синдромом остается мало изученным Механизм иммуномодулирующего эффекта иммуноглобулинов для внутривенного введения пока остается не достаточно выясненным

Кроме того, использование импортных препаратов ИГВВ представляет большую экономическую проблему для пациентов, в связи, с чем чрезвычайно важным и актуальным является изучение свойств новых отечественных препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения различного типа и выявление механизма их действия

Цель исследования уточнить роль естественных киллеров в патогенезе привычного невынашивания беременности ранних сроков и формировании антифосфолипидного синдрома, выявить механизмы влияния отечественных препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на

функциональные характеристики естественных киллеров, и обосновать, в условиях in vitro, показания для их дифференцированного назначения больным с привычным невынашиванием беременности ранних сроков и антифосфолипидным синдромом

Задачи исследования:

1 Оценить инфекционный статус женщин с привычным невынашиванием беременности ранних сроков при наличии или отсутствии АФС

2 Охарактеризовать содержание различных популяций естественных киллеров и уровень их активации при привычном невынашивании беременности ранних сроков и АФС

3 Установить влияние, m vitro, отечественных иммуноглобулинов для внутривенного введения на процессы активации естественных киллеров при привычным невынашиванием беременности при наличии или отсутствии АФС

4 Выявить влияние отечественных иммуноглобулиновых препаратов для внутривенного введения на продукцию ИФНу, ФНОа при привычном невынашивании беременности и АФС

5 Провести сравнительный анализ иммуномодулирующего действия отечественных препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения в экспериментальных условиях и обосновать возможность их дифференцированного назначения больным с привычным невынашиванием беременности при наличии или отсутствии АФС

Научная новизна:

• Выявлено, что у женщин с привычным невынашиванием беременности и АФС повышена частота выявления маркеров микоплазменной и хламидийной инфекции

• Доказано, что нарушение активации ЕК, спонтанной продукции ФНОа, ИФНу и рецепции этих цитокинов играет важную роль в патогенезе

привычного невынашивания беременности ранних сроков и развитии антифосфолипидного синдрома

• Установлено, что у женщин с привычным невынашиванием беременности с АФС наблюдается высокий уровень всех популяций ЕК, дисбаланс спонтанной продукции ФНОа, ИФНу и усиление рецепции данных цитокинов

• В условиях in vitro выявлено, что отечественные иммуноглобулины для внутривенного введения «четвертого поколения» «Габриглобин» и «антицитомегаловирусный иммуноглобулин» повышают процессы активации ЕК, ингибируют спонтанную продукцию ФНОа, а также усиливают внутриклеточный синтез ИФНу и его рецепцию при привычном невынашиванием беременности у женщин с АФС и без АФС

• В экспериментальных условиях установлено, что «Габриглобин» оказывает более активное влияние на иммунную систему при ПНБ и АФС, в то время как «антицитомегаловирусный иммуноглобулин» - при ПНБ без АФС

Практическая значимость работы:

Учитывая механизм действия «Габриглобина» и «антицитомегаловирусного иммуноглобулина», обосновано

дифференцированное назначение отечественных препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения женщинам с привычным невынашиванием беременности с АФС и без АФС На препарат «Габриглобин» подана заявка на изобретение, как средства для лечения женщин с привычным невынашиванием беременности при наличии или отсутствии антифосфолипидного синдрома (приоритетная справка N° 2007126885 от 16 07 07г)

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Привычное невынашивание беременности и АФС сопровождаются изменением содержания различных популяций естественных киллеров, а также спонтанной продукции и рецепции ФНОа и ИФНу

2 Отечественные препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения - «Габриглобин» и «антицитомегаловирусный иммуноглобулин» в условиях эксперимента влияют на процессы активации ЕК, продукцию и рецепцию цитокинов МНК при привычном невынашивании, причем характер влияния различен при наличии и отсутствии АФС, что позволяет дифференцированно назначать их пациентам

Апробация работы. Диссертация прошла апробацию на заседании Ученого совета ФГУ «Ив НИИ М и Д им В Н Городкова Росмедтехнологий» от 19 ноября 2007г Материалы диссертации доложены и обсуждены на 1 республиканской конференции «Иммунология репродукции» (Иваново, 2005 г ), XI Всероссийском научном Форуме им В И Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2007 г )

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 126 страницах машинописного текста Работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 2 глав собственного исследования, главы «Обсуждение результатов», выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 194 источника отечественных и зарубежных авторов Работа иллюстрирована 5 рисунками и 15 таблицами

Содержание работы. Материалы и методы исследований. В соответствии с поставленными задачами было проведено клинико-иммунологическое обследование 56 небеременных женщин с привычным невынашиванием беременности и 20 женщин с ненарушенной фертильной функцией На основании клинического обследования женщин, проводимого врачом акушером-гинекологом на базе 3 гинекологического отделения ФГУ «Ивановского НИИ материнства и детства им В Н Городкова», они были разделены на три группы наблюдений (таблица 1)

Таблица 1.

Группы наблюдений.

контрольная группа, п=20 I группа, п=27 II группа, п=29

здоровые женщины, матери одного и более детей, не имеющие самопроизвольных выкидышей в анамнезе небеременные женщины с привычным невынашиванием беременности ранних сроков без АФС небеременные женщины с привычным невынашиванием беременности ранних сроков и АФС (при двукратных положительных тестах на волчаночный антикоагулянт с интервалом в 6-8 недель)

Инфекционный статус оценивали, путем определения антител к возбудителям инфекций в периферической крови и выявления ДНК возбудителей в мазках-соскобах Антитела против инфекционных возбудителей определяли методом ELISA на микропланшетном ридере Multiscan EX Labsystems (Финляндия) с использованием коммерческих систем ЗАО «Вектор-Бест» Определяли уровень IgM и IgG антител к HSV 1, 2, CMV, Chlamydia trachomatis, и содержание IgA и IgG AT к Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis

Для выявления ДНК возбудителей инфекций в мазках-соскобах из цервикального канала методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени определяли наличие ДНК HSV 1, 2, CMV, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hominis с использованием коммерческих систем НПФ «ДНК-Технология» (Россия) на приборе iCycler (BIO-RAD, США)

Определение волчаночного антикоагулянта клотинговым методом с использованием наборов Staclot LA (Diagnostika Stago, США)

Материалом для исследования служила периферическая венозная кровь Кровь забирали в центрифужные пробирки, содержащие 2,7% раствор ЭДТА из расчета 3 мл крови на 1 мл раствора ЭДТА

Выделение обогащенных популяций мононуклеарных клеток из периферической крови осуществляли стандартным методом скоростного центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина (d=l,078)

Поверхностный фенотип клеток определяли с помощью моноклональных антител (мАТ) (Immunotech,Франция, Caltag laboratories, США, НПЦ «МедБиоСпектр», Россия) методом двухцветной проточной цитофлюориметрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, США) В качестве флюорохромных меток использовали флюоресцеин изотиоционат (FITC) и фикоэритрин (РЕ)

Процедуру окрашивания и фиксации клеток проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика При проведении проточной цитометрии клетки использовали в конечной концентрации 1x106 кл/мл

К 50 ц1 суспензии клеток в концентрации 1x106 кл/мл одновременно добавляли 20|il мАТ, меченных FITC и/или 20 ц1 мАТ, меченных РЕ, инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут, затем клетки отмывали в 1 мл фосфатного буфера (PBS), содержащего 0,1% раствор азида натрия, и фиксировали в соответствии со стандартной процедурой

Для анализа неспецифического окрашивания использовали Simultest Control (мышиные IgGl-FITC + IgG2a-PE) ("Becton Dickinson", США) Клетки метили анти-CD45 и aiiTH-CD14 мАТ для наложения оптимального окна дискриминации (гейта) дня лимфоцитов и моноцитов/макрофагов на точечном графике прямого и бокового светорассеяния При анализе лимфоцитарный гейт включал не менее 95-98% клеток с фенотипом CD45+CD14-, моноцитарный/макрофагальный гейт включал не менее 93-96% клеток с фенотипом CD45+CD14+ В каждом образце анализировали не менее 10000 клеток Анализ результатов проводили в программе "LYSYS И"

Для оценки индуцированного ответа мононуклеарные клетки в концентрации 1x106 кл/мл инкубировали в среде RPMI - 1640 с комплексом неспецифических стимуляторов (ФМА) (10 нг/мл форбол миристилацетата (Sigma,США), 1цМ иономицина (Sigma,США), 2цМ моненсина (Sigma,США)

Для оценки влияния препаратов иммуноглобулинов клетки инкубировали с «антицитомегаловирусным иммуноглобулином» (1мг/мл) и с «Габриглобином» (1мг/мл) Производство «Габриглобина» налажено на Ивановской Областной станции переливания крови, получено регистрационное удостоверение - № 001529/01-2002, на базе данного учреждения выпущена экспериментальная партия «антицитомегаловирусного иммуноглобулина» (находится на стадии разработки) Во всех пробах клетки активировали в течение 1 часа в термостате при температуре 37°С Затем клетки отмывали от стимулятора или препарата иммуноглобулинов физиологическим раствором центрифугированием при 1500 об/мин 5 мин Надосадочную жидкость удаляли, а клеточный осадок ресуспендировали в среде RPMI - 1640 с глютамином и инкубировали 24-часа при 37°С и 5% С02 Надосадочную жидкость, содержащую продукты культивирования, отбирали и фильтровали через миллипоровые фильтры диаметром 0,22|лм (Synpor, Чехия) Супернатанты (СН) клеточных культур соответствующих групп пулировали (не менее 10 индивидуальных СН в каждом пулированном образце) и хранили в стерильных флаконах при -20°С

Экспрессию акгивационных маркеров и синтез цитокинов оценивали по окончании инкубации В качестве контроля для всех проб использовали клетки, инкубировавшиеся в аналогичных условиях в среде RPMI - 1640 с глютамином Подсчет концентрации и жизнеспособности лимфоцитов до и после инкубации показал, что жизнеспособность клеток во всех случаях была 95% и выше

Определение содержания цитокинов в супернатантах 24-часовых клеточных культур проводилось тест-системами для метода ELISA (ЗАО «Вектор Бест», Россия) на микропланшетном ридере Multiscan EX Labsystems (Финляндия)

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы Microsoft Excel Version 7 0 из комплекта Microsoft Office 2000

Результаты исследования и их обсуждение. Возраст женщин в первой группе составил в среднем 28,27 + 1,09 лет, во второй группе - 27,54 + 1,02 лет, в контрольной группе - 25,6 + 0,29 лет (р>0,05, во всех случаях)

В ходе исследования провели оценку инфекционного фона методом ИФА и ПЦР Исследование инфекционного фона методом ИФА, показало, что в группе женщин с ПНБ и АФС достоверно чаще встречались IgM антитела к Chlamydia trachomatis (13,8%) по сравнению с параметрами группы контроля (0%) и группы женщин без АФС (0%) (р<0,05, в обоих случаях)

Таблица 2.

Частота выявления ДНК возбудителей инфекций в урогенитальных мазках женщин с ПНБ в зависимости от наличия или отсутствия АФС

Показатель Контроль n=20 ПНБ без АФС n=27 ПНБ с АФС n=29

HSV 1,11 0 0 1(3,5%)

CMV 2 (10%) 3(11,1%) 1 (3,5%)

Chlamydia trachomatis 0% 0% 0%

Mycoplasma hominis 0% 0% 4(13,8%) л

Ureaplasma urealyticum 1 (5%) 10 (37,0%)" 8 (27,6%)

п - число обследованных,

* - различия статистически достоверны по сравнению с показателями группы контроля, * - р<0,05, ** - р<0,01

л - различия статистически достоверны по сравнению с группой женщин без АФС, Л - р<0,05

Определение ДНК возбудителей урогенитальных инфекций в мазках-соскобах из цервикального канала методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, показало, что в группе женщин с ПНБ и АФС частота выявления ДНК Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum была достоверно выше в сравнении с показателями контрольной группы (р<0,05) (таблица 2) При сравнении показателей женщин с ПНБ без АФС и с АФС у последних отмечался значительно более высокий уровень частоты выявления ДНК Mycoplasma hominis (р<0,05) В группе женщин с ПНБ без АФС достоверно чаще встречалась ДНК Ureaplasma urealyticum по сравнению с группой здоровых женщин (р<0,01) В остальных случаях достоверные различия по уровню инфицирования цервикального канала HSV 1, 2, CMV, Chlamydia trachomatis между группами отсутствовали (р>0,05 во всех случаях)

Таким образом, у женщин с привычным невынашиванием беременности и антифосфолипидным синдромом чаще выявляются маркеры активной микоплазменной и хламидийной инфекции По-видимому, именно данная инфекция может быть одним из факторов, участвующих в развитии АФС у женщин с ПНБ

По данным литературы, многие авторы важную роль в невынашивании беременности инфекционного генеза отводят естественным киллерам (ЕК), однако их роль остается не до конца изученной Остаются неясными и процессы активации различных популяций ЕК при привычном невынашивании беременности

В ходе работы была проведена оценка уровня различных субпопуляций естественных киллеров (СБ16+, СБ56+, СБ16+С056+) в периферической крови у обследованных групп женщин

У женщин с привычным невынашиванием беременности и АФС (II группа) в периферической крови было достоверно повышено количество всех изучавшихся субпопуляций ЕК СБ 16+ - 13,54 ± 1,00%, СЭ56+ - 11,27 ± 0,71%, С016+СБ56+ - 5,78 + 0,72%, по сравнению с аналогичными показателями женщин контрольной группы - СБ16+- 9,73 ± 0,69%, СЭ56+ -6,11 ±0,78%, С016+СБ56+ - 3,21 ± 0,64% (р<0,01, р<0,001 и р<0,05 соответственно) Сопоставление результатов группы женщин с ПНБ без АФС (I группа) с показателями группы контроля показало достоверное увеличение у них содержания ЕК с фенотипом С056+ - 8,95 + 0,86% (р<0,05) При сравнении параметров женщин с ПНБ без АФС и с АФС у последних отмечался достоверно более высокий уровень всех типов ЕК, в том числе и активированных (СБ16+СБ56+) (р<0,05, р<0,05 и р<0,01, соответственно) В то же время, по нашим данным, уровень ранней активации ЕК у женщин с ПНБ без АФС и с АФС достоверно не отличался от показателей группы контроля (р>0,05)

Еще одним параметром, позволяющим оценить функциональное состояние ЕК, является продукция цитокинов, характерных для этой клеточной

популяции, таких как ИФНу и ФНОа Литературные данные о продукции этих цитокинов при ПНБ противоречивы Продукция цитокинов отражает направленность иммунного ответа и его изменения при развитии патологических процессов (Ковальчук ЛВ, 2001, Симбирцев АС, 2002) Нарушение их продукции играет важную роль при невынашивании беременности

Таблица 3.

Исходный уровень продукции цитокинов in vitro у женщин с ПНБ в зависимости от наличия или отсутствия АФС.

Параметр, пг/мл Контроль I группа Игруппа

п=5 п=5 п=5

ФНОа 179,24+10,47 241,88 +58,24 268,00 + 31,77*

ИФНу 20,11 + 0,78 18,32 + 5,53 12,39+ 1,49**

»-достоверность различий по сравнению с исходным уровнем группы контроля, * -р<0,05, ** - р<0,01

У женщин с ПНБ и АФС (II группа) спонтанная продукция ФНОа в супернатантах исходного уровня отличалась достоверным увеличением таковой по сравнению с показателями контрольной группы (р<0,05), в то же время продукция ИФНу была значительно ниже показателей группы контроля (р<0,01) (таблица 3) Известно, что усиление выработки ФНОа характерно для воспалительной реакции и могло быть обусловлено выявленными нами изменениями инфекционного фона в обеих клинических группах Установлено, что ИФНу играет важную роль в обеспечении инвазии трофобласта и модификации спиральных артерий матки, поэтому снижение его продукции при невынашивании беременности ранних сроков может вести к нарушению плацентации и преждевременному прерыванию беременности на ранних сроках

Важно оценить не только синтез цитокинов, но и их рецепцию

Таблица 4.

Уровень активации различных популяций естественных киллеров у женщин с ПНБ в зависимости от наличия или отсутствия АФС

Показатель, % контроль I группа ПНБ без АФС II группа ПНБ с АФС

С069+ 3,44 + 0,17 (п=5) 3,15 + 0,47 (п=5) 3,72+ 0,82 (п=5)

С016+СБ69+ 1,87 + 0,36 (п=15) 1,88 + 0,26 (п=22) 2,81 + 0,59 (п=24)

СБ56+СР69+ 1,81+0,36 (п=15) 2,21+0,22 (п=22) 2,96 + 0,57 (п=24)

С0119+ 3,52 + 0,6 (п=5) 2,36 +0,31 (п=5) 3,76 + 0,26™ (п=5)

СВ16+СВ119+ 1,88 + 0,24 (п=15) 2,23 +0,29 (п=22) 2,18 + 0,20 (п=24)

СБ56+СВ119+ 1,23+0,18 (п=15) 1,69 + 0,25 (п=22) 2,82 + 0,31 ***ЛЛ (п=24)

СБ120а+ 1,48 + 0,18 (п=5) 1,76 + 0,16 (п=5) 2,50 + 0,26* (п=5)

СБ16+С0120а+ 1,23 + 0,22 (п=15) 2,05 + 0,24* (п=22) 2,75 + 0,48 ** (п=24)

СБ56+С0120а+ 1,58 + 0,30 (п=15) 1,99 + 0,30 (п=22) 4 3-1-0 зз ***ллл ' "(п=24)

С0120Ь+ 2,14 + 0,16 (п=5) 2,88 + 0,57 (п=5) 2,90 + 0,33 (п=5)

СВ16+СБ120Ь+ 1,59 + 0,24 (п=15) 1,73+0,26 (п=22) 2,50 + 0,36* (п=24)

СБ56+С0120Ь+ 1,65 + 0,22 (п=15) 2,12 + 0,18 (п=22) 4 "74 + 0 47 ***ллл ~~(п=24)

* - различия статистически достоверны по сравнению с показателями группы контроля, * - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001,

Л - различия статистически достоверны по сравнению с группой женщин без АФС, ** - р<0,01, - р< 0,001

Исследования показали значительное увеличение ЕК, экспрессирующих рецепторы к ИФНу (СС56+СВ119+) (р<0,001), ФНОа I типа (С1)16+СБ120а+, СБ56+СБ120а+) (р<0,01, р<0,001, соответственно) и ФНОа II типа

(CD56+CD120b+) (p<0,001), в группе женщин с ПНБ и АФС, по сравнению с параметрами группы контроля (таблица 4)

В то же время для группы женщин с ПНБ без АФС было характерно повышение содержания CD 16+ ЕК, экспрессирующих маркер CD120a+, в сравнении с показателями контрольной группы женщин (р<0,05)

При сравнении параметров женщин с ПНБ с АФС и без АФС было установлено, что увеличение содержания ЕК с фенотипом CD56+, экспрессирующих CD 120а и CD120b молекулы (р<0,001, во всех случаях), а также CD56+CD119+ лимфоцитов (р<0,01) и CD119+ клеток в общей популяции лимфоцитов (р<0,01) было более выраженным у женщин с ПНБ и АФС

Известно, что рецепторы к ФНОа 1 типа определяют проведение проапоптотического сигнала в клетку, а рецепторы 2 типа связаны с усилением клеточной пролиферации (Симбирцев А С , 2004) Складывается впечатление, что у женщин с АФС нарушен баланс апоптоза и пролиферации ЕК, что может приводить к накоплению ЕК Это предположение согласуется с нашими данными о повышении количества ЕК, наиболее выраженным у женщин с АФС

При лечении женщин с ПНБ часто используют ИГВВ, однако механизм их действия не достаточно изучен Практически отсутствуют сведения об их влиянии на функциональное состояние ЕК (Imbach Р ,1999)

До последнего времени арсенал отечественных препаратов ИГВВ был представлен лишь внутривенным иммуноглобулином человека нормальным, в то время как в зарубежной клинической практике используется более 20 наименований препаратов ИГВВ (Мигунов В Н, 2000)

В настоящее время в России, в МНИИЭМ им Г Н Габричевского создан новый препарат мономерного, нерасщепленного иммуноглобулина "четвертого поколения" с полностью сохраненными свойствами, прошедший клинические испытания, пригодный для внутривенного введения, получивший коммерческое название - «Габриглобин» (Соловьев С К , 2002, Апешкин В А ,

Лютов А Г , 2007) Эксклюзивным правом производства препарата по патенту № 2122864 обладает ФГУН "Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им Г Н Габричевского" и Российское фармацевтическое предприятие ЗАО "Иммуно-Гем" (Лютов А Г , 2006)

«Габриглобин» - первый отечественный препарат в России, имеющий неповрежденную молекулу IgG, период его полу выведения составляет около 30 сут, содержание мономера более 95%, впервые препарат имеет величину рН 4,2 и это единственный отечественный иммуноглобулин, пригодный для заместительной терапии Обладает антительной активностью против различных вирусов и бактерий (Алешкин В А, Лютов А Г, 2007)

Также в ФГУН «МНИИЭМ им Г Н Габричевского» создан «антицитомегаловирусный иммуноглобулин» (находится на стадии разработки) У «антицитомегаловирусного иммуноглобулина» действующим началом является мономерный IgG, обладающий специфической антительной активностью против цитомегаловируса (Лютов А Г , 2000)

Несмотря на клинические испытания «Габршлобина» и разработку «антицитомегаловирусного иммуноглобулина», работ, которые бы рассматривали механизм их действия, нет Знание механизмов этих препаратов действия позволит значительно повысить эффективность практического использования ИГВВ для лечения невынашивания беременности и антифосфолипидного синдрома

В связи с этим, нами были проведены экспериментальные исследования 2-х отечественных препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения - «Габриглобина» и «антицитомегаловирусного иммуноглобулина» in vitro на продукцию цитокинов (ИФНу, ФНОа) и функциональное состояние ЕК Действие иммуноглобулинов оценивали в сравнении с исходным уровнем и уровнем активности при взаимодействии с комплексом ФМА (10 нг/мл форбол миристилацетата (Sigma,США), 1цМ иономицина (Sigma,США), 2цМ моненсина (Sigma,США))

Полученные нами результаты показали, что ФМА достоверно повышал содержание СЭ69+ клеток в общей популяции лимфоцитов во всех исследуемых группах (контрольная группа - р<0,01,1 группа - р<0,05, II группа - р<0,05), повышал содержание активированных СБ16+ ЕК в периферической крови полученной от женщин контрольной группы и женщин с ПНБ с АФС, а также активированные СБ56+ ЕК от здоровых женщин (р<0,01, р<0,05, р<0,05, соответственно) Существенно увеличивал содержание СБ119+ клеток в общей популяции лимфоцитов выделенных из периферической крови в контрольной группе и у женщин с ПНБ без АФС по отношению к исходным данным, повышал уровень СБ 16+, экспрессирующих рецепторы к ИФНу, в группе женщин с ПНБ с АФС, а также С056+, экспрессирующих СБ119 молекулы во всех исследуемых группах (р<0,05, во всех случаях) (таблица 5, 6)

Культивирование клеток с «антицитомегаловирусным

иммуноглобулином» достоверно повышало содержание СП69+ клеток в общей популяции лимфоцитов выделенных из периферической крови женщин контрольной группы и с ПНБ без АФС (I группа) (р<0,01 и р<0,05, соответственно), в последней также повышал активированные СБ56+ ЕК (р<0,05) Значительно увеличивал содержание СБ 119+ клеток в общей популяции лимфоцитов в группе контроля и в группе женщин с ПНБ без АФС (р<0,05, в обоих случаях), повышал уровень СБ 16+, экспрессирующих СЭ119 молекулы, в группе женщин с ПНБ без АФС и с АФС (р<0,05, в обоих случаях), а также СБ56+, экспрессирующих рецепторы к ИФНу (СБ119+), в I группе по отношению к исходным данным (р<0,05)

Было установлено, что добавление в культуральную среду «Габриглобина» приводило к достоверному увеличению содержания СБ69+ клеток в общей популяции лимфоцитов полученных из периферической крови здоровых женщин и женщин с ПНБ и АФС (II группа) (р<0,05), уровня СБ69+ клеток в популяции СБ 16+ ЕК (р<0,01) в группе контроля и уровня СВ56+СБ69+ лимфоцитов женщин с ПНБ без АФС (р<0,05)

Таблица 5.

Влияние in vitro «Габриглобина» и «антицнтомегаловирусного иммуноглобулина» на уровень спонтанной экспрессии CD69 молекул на поверхности различных субпопулядий ЕК при ПНБ с АФС и без АФС.

Группы наблюдений

Контроль I группа Пгруппа

п= =5 п= =5 п =5

Параметр, % Исходный уровень Стимулятор Антицитомегаловир ИГ | Габриглобин j Исходный уровень j Стимулятор Антицитомегаловир ИГ Габриглобин Исходный уровень Стимулятор Антицитомегаловир ИГ Габриглобин

3,44 6,58 5,86 6,4 3,15 8,63 5,23 4,85 3,72 9,00 7,15 9,22

+ о + + + + + + + + + + + +

D и 0,17 0,44 0,42 1,02 0,47 1,49 0,6 0,97 0,82 1,42 1,70 1,55

** ** * * * * *

* 1,48 2,96 1,70 2,96 1,65 2,5 1,80 2,23 2,96 5,34 3,06 3,20

40 О + + + ± + + + + + + + +

+ ю 0,22 0,34 0,29 0,41 0,32 0,64 0,41 0,53 0,62 0,54 0,93 0,90

О О ** * *

+ ON чо а и + чо 1,90 3,92 2,08 1,52 1,98 2,65 3,76 3,94 2,74 3,72 2,92 3,22

+ + + + + + + + + + + +

0,55 0,53 0,64 0,24 0,29 0,65 0,55 0,56 0,44 0,54 0,61 0,99

О и * * *

* - различия статистически достоверны по сравнению с исходными данными

внутри группы, * - р<0,05, ** - р<0,01

Таблица 6.

Влияние in vitro ИГВВ на содержание CD16+ и CD56+ ЕК экспрессирующих на своей поверхности CD119 молекулы при ПНБ в зависимости от наличия или отсутствия АФС.

Группы наблюдений

Контроль I группа Ilrpynna

п= 5 п= 5 п =5

чО >4 и S л и ¡5 и S

и СО о, 1 Е (L) Ш о. я а а> и а s Ш X

а. t- § О \о О. н VO а, н 5 ю

СО С >я ч и « ч >> 2 о S 8 В я 5 '5 ч и Е

в ч о X S н и е К а о. ю ^ § о X S н и а. ю я U В 3 X в н и о н в Я о. о 03

К н и < К н X < S н в <

3,52 6,22 5,50 5,76 2,36 3,50 3,54 3,86 3,76 4,83 4,43 6,06

+ + + + + + + + + + + + +

S 0,6 0,90 0,40 0,62 0,31 0,35 0,35 0,53 0,26 0,98 0,38 0,49

и * * * * * * **

+ 1,58 1,88 2,54 4,48 1,80 1,50 3,60 3,12 1,92 3,22 3,16 2,96

о + + + + + + + + + + + +

о + 0,32 0,44 0,31 0,60 0,09 0,15 0,63 1,21 0,27 0,41 0,26 0,32

а ** * * * *

и

+ 1,52 4,48 2,72 2,66 1,66 2,64 4,54 1,48 2,58 4,86 1,42 4,04

Q + + + + + + + + + + + +

и + 0,24 0,73 0,46 0,26 0,13 0,30 1,14 0,55 0,42 0,62 0,44 0,46

Q и * * * * * *

* - различия статистически достоверны по сравнению с исходными данными

внутри группы, * - р<0,05, ** - р<0,01

«Габриглобин» значительно повышал содержание СО 119+ клеток в общей популяции лимфоцитов полученных из периферической крови всех обследованных групп женщин (контрольная группа - р<0,05,1 группа - р<0,05,

II группа - р<0,01), а также увеличивал уровень СБ 16+ ЕК, экспрессирующих СС119 молекулы, в группе женщин с ПНБ с АФС и контрольной группе (р<0,01, р<0,05, соответственно), содержание С056+С0119+ лимфоцитов в контрольной группе женщин и во II группе по отношению к исходным данным (р<0,05, в обоих случаях)

В работе также оценивали влияние «Габриглобина» и «антицитомегаловирусного иммуноглобулина» на особенности спонтанной продукции ФНОа и ИФНу, которые оценивали по содержанию данных цитокинов в супернатантах коротко живущих культур мононуклеарных клеток при привычном невынашивании беременности без АФС и с АФС (таблица 7, 8)

Таблица 7.

Влияние in vitro «Габриглобина» и «антицитомегаловирусного иммуноглобулина» на продукцию ИФНу у женщин с ПНБ в зависимости от наличия или отсутствия АФС.

Параметр, пг/мл Контроль п=5 I группа п=5 Игруппа п=5

Исходный уровень 20,11 + 0,78 18,32+5,53 12,39 ±1,49

Стимулирующий комплекс 25,91 + 1,33** 15,78 + 3,49 11,55 ±1,61

Антицитомегало-вирусный ИГ 16,91 ± 1,78 35,31 +4,63* 9,52 ±3,30

Габриглобин 17,48 + 2,06 20,07+ 1,96 20,27 ±2,43*

* - достоверность различий в сравнении с исходным уровнем внутри группы,

*-р<0,05,**-р<0,01

В результате исследования было установлено, что секреция провоспапительного цитокина ИФНу достоверно повышалась в пробе с ФМА в контрольной группе по сравнению с исходным уровнем (р<0,01)

Добавление в культуральную среду «антицитомегаловирусного иммуноглобулина» приводило к значительному снижению секреции ФНОа у

всех исследуемых групп женщин (контрольная группа - р<0,05, I группа -р<0,05, II группа - р<0,05), а также к достоверному увеличению концентрации ИФНу в супернатантах в I группе (р<0,05)

При культивировании клеток с «Габршлобином» выявлялось существенное снижение уровня ФНОа в СН всех исследуемых групп (р<0,01, р<0,05, р<0,05, соответственно), и в то же время увеличение спонтанной продукции ИФНу при ПНБ с АФС (р<0,05)

Таблица 8.

Влияние in vitro «Габриглобина» и «антицитомегаловирусного иммуноглобулина» на продукцию ФНОа при ПНБ в зависимости от наличия или отсутствия АФС.

Параметр, пг/мл Контроль п=5 I группа п=5 Пгруппа п=5

Исходный уровень 179,24 ±10,47 241,88+58,24 268,00 ±80,13

Стимулирующий комплекс 151,22 + 71,58 129,95 ± 69,45 198,95 ±79,75

Антицитомегаловирусный ИГ 85,24± 22,61* 45,03 ± 3,92* 44,93± 20,76*

Габриглобин 179,24+10,47 48,42 + 3,68* 268,00 ±80,13

* - достоверность различий в сравнении с исходным уровнем внутри группы,

* -р<0,05,** -р<0,01

Таким образом, «Габриглобин» и «антицитомегаловирусный иммуноглобулин» при привычным невынашиванием беременности без АФС и с АФС in vitro, ингибируют спонтанную продукцию ФНОа и стимулируют внутриклеточный синтез ИФНу

Различия в действии изучавшихся препаратов иммуноглобулинов были выявлены как по сравнению с исходным уровнем, так и между собой

Мы провели сравнительный анализ иммуномодулирующего действия препаратов для внутривенного введения, который позволил обосновать их

дифференцированное назначение больным с ПНБ в зависимости от наличия АФС

При оценке действия «Габриглобина» т vitro было выявлено, что в группе женщин с привычным невынашиванием беременности без АФС препарат значительно увеличивал содержание CD119+ лимфоцитов, CD56+CD69+ и ингибировал продукцию ФНОа по сравнению с показателями исходного уровня (р<0,05, во всех случаях) Тогда как в группе женщин с привычным невынашиванием беременности с АФС «Габриглобин» повышал содержание CD69, CD119+, CD16+CD119+, CD56+CD119+, ИФНу и снижал продукцию ФНОа (р<0,05, р<0,01, р<0,05, р<0,05, р<0,05, р<0,05, соответственно)

«Антицитомегаповирусный иммуноглобулин» в экспериментальных условиях повышал уровень CD16+ ЕК, экспрессирующих CD119 молекулы, а также снижал продукцию ФНОа при привычном невынашивании беременности с АФС по сравнению с показателями исходного уровня (р<0,05, в обоих случаях) В то время как в I группе женщин значительно увеличивался уровень CD69, CD56+CD69+, CD119+, CD16+CD119+, CD56+CD119+, ИФНу и снижалась продукция ФНОа по сравнению с исходным уровнем (р<0,05, во всех случаях)

Проведенный сравнительный анализ иммуномодулирующего действия «Габриглобина» и «антицитомегаловирусного иммуноглобулина» показал, что «Габриглобин» оказывал более интенсивное воздействие на иммунологические параметры при привычном невынашивании беременности и АФС, значительно увеличивая содержание CD119+ лимфоцитов, CD56+CD119+ и продукцию ИФНу по сравнению с показателями пробы с «антицитомегаловирусным иммуноглобулином» (р<0,05, р<0,01, р<0,05, соответственно) (рисунок 1) Тогда как «антицитомегаловирусный иммуноглобулин» увеличивал содержание CD56+CD119+ и внутриклеточную секрецию ИФНу в супернатантах относящихся к I группе, по сравнению с показателями пробы с «Габриглобином» (р<0,05, в обоих случаях)

СБ119+

СВ56+СШ19+

контроль

ПНБ без АФС

в)

пг/мл

□ Антицитомегаловирусный ИГ НГабриглобин

Рисунок 1. Сравнительная характеристика влияния «Габршлобина» и «антицитомегаловирусного иммуноглобулина» на содержание СБ119+ лимфоцитов (а) и СВ56+СОИ9+ЕК (б), на продукцию ИФНу (в) при ПНБ с АФС и без АФС

Таким образом, препарат «Габриглобин» оказывал более активное влияние на иммунную систему при ПНБ и АФС, в то время как «антицитомегаловирусный иммуноглобулин» был более активен при ПНБ без АФС.

Из литературы известно, что иммуноглобулины содержат антиидиотипические антитела против ассоциированного с волчанкой 4В4

ИФНу

контроль ПНБ без АФС ПНБ и АФС

перекрестно реагирующего идиотипа, за счет уменьшения производства аутоантител в результате подавления активности В-клеток, нейтрализации аутоантител и аутоантигенов, восстановление иммунного баланса, что подтверждено результатами наших исследований

Результатом активации ЕК (С056+), рецепции ИФНу ЕК (СБ16+СОП9+ и С056+С0119+) и модуляции спонтанной продукции провоспалительных цитокинов (ФНОа и ИФНу) под влиянием «Габриглобина» может быть усиление противовирусной и противоинфекционной защиты, улучшение плацентации и обеспечение инвазии трофобласта, а ингибирование продукции ФНОа может способствовать подавлению воспалительной реакции при привычном невынашивании беременности, что позволит предотвратить угрозу наступления выкидыша, связанного с активацией бактериально-вирусной инфекции, и предупредить развитие воспалительных осложнений, сократить сроки заболеваний и способствовать более благоприятному их исходу

Выявленные иммуномодулирующие свойства у отечественных препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения свидетельствует о необходимости исследования в данном направлении

Суммируя все выше изложенное, можно заключить, что ПНБ сопровождается нарушением количества и функции ЕК, которые были более выражены у женщин с АФС Отечественные препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения способны оказывать иммуномодулирующий эффект, нормализуя функции иммунной системы Однако их действие зависит от исходного состояния иммунокомпетентных клеток, что требует дифференцированного подхода к их назначению

Выводы

1 У женщин с привычным невынашиванием беременности ранних сроков и антифосфолипидным синдромом чаще, чем у женщин с привычным невынашиванием беременности без АФС, выявляются маркеры активной бактериальной инфекции микоплазмы (13% и 0%), хламидии (13% и 0%)

2 При привычном невынашивании беременности ранних сроков без антифосфолипидного синдрома повышается уровень периферических CD56+ ЕК и количество CD16+ ЕК, экспрессирующих рецепторы для ФНОа I типа При привычном невынашивании беременности с антифосфолипидным синдромом отмечается увеличение содержания всех популяций ЕК и CD56+ ЕК, экспрессирующих рецепторы к ИФНу, а также количества всех популяций ЕК, экспрессирующих ФНОаК1 и ФНОа 2-го типа, CD120a+ лимфоцитов, усиление спонтанной продукции ФНОа и снижение синтеза ИФНу

3 В условиях in vitro, «Габриглобин» и «антицитомегаловирусный иммуноглобулин» повышают количество активированных ЕК с фенотипом CD56+, и CD119+ лимфоцитов выделенных из периферической крови женщин с привычным невынашиванием беременности независимо от наличия антифосфолипидного синдрома, а при невынашивании с антифосфолипидным синдромом - количество CD 16+ ЕК, экспрессирующих рецепторы к ИФНу

4 Отечественные иммуноглобулины для внутривенного введения -«Габриглобин» и «антицитомегаловирусный иммуноглобулин» при их воздействии на культуру мононуклеарных клеток ингибируют спонтанную продукцию ФНОа и стимулируют внутриклеточный синтез ИФНу при привычном невынашивании беременности без антифосфолипидного синдрома и с антифосфолипидным синдромом

5 Показано, что при привычном невынашивании беременности и антифосфолипидном синдроме, в экспериментальных условиях, препарат «Габриглобин» оказывает более активное влияние на иммунную систему повышая количество активированных лимфоцитов, рецепцию ими ИФНу и рецепцию ИФНу ЕК с фенотипом CD56+ В то время как «антицитомегаловирусный иммуноглобулин» повышает количество CD69+ лимфоцитов выделенных из периферической крови женщин с привычным невынашиванием беременности без антифосфолипидного синдрома, и рецепцию ИФНу как CD16+, так и CD56+ ЕК

Практические рекомендации

На основании полученных результатов отечественный иммуноглобулин для внутривенного введения - «Габриглобин» может быть использован в комплексе прегравидарной подготовки женщин при невынашивании беременности инфекционного и аутоиммунного генеза (АФС), для нормализации функций иммунной системы

Список опубликованных работ по теме диссертации

1 Соловьева А Е, Сотникова Н Ю , Вторушина В В Соотношение различных популяций естественных киллеров и уровень их активации у женщин с привычным невынашиванием беременности // Russian Journal of Immunology -2005 - V 9 - Suppl 2 -P 179-180

2. Кривенцова T А , Сотникова Н Ю , Вторушина В В , Бойко Е JI, Соловьева А Е Особенности активации лимфоцитов периферической крови у женщин с привычным невынашиванием беременности ранних сроков беременности и антифосфолипидным синдромом // Russian Journal of Immunology -2005 -V9 -Suppl 2 -P 166-167

3 Соловьева A E, Сотникова H Ю , Вторушина В В Иммунологические аспекты привычного невынашивания беременности инфекционного генеза в сочетании с АФС // «Медицинская иммунология» - Санкт-Петербург - 2006 - Том 8 - №23 - С 322

4 Соловьева А Е, Сотникова Н Ю Влияние иммуномодуляторов на продукцию цитокинов in vitro у женщин с привычным невынашиванием беременности // Материалы V конференции иммунологов Урала ж «Иммунология Урала» - Оренбург - 1 (5) 2006 - С 122

5 Соловьева А Е, Сотникова Н Ю Особенности иммуномодулирующего действия иммуноглобулинов для внутривенного введения у женщин с привычным невынашиванием беременности // Академический журнал Западной Сибири - Тюмень - 2006 - №4 - С 31

6 Соловьева А Е, Сотникова Н Ю, Вторушина В В Влияние иммуномодуляторов на процессы активации естественных киллеров in vitro у женщин с привычным невынашиванием беременности // Материалы научной конференции, посвященной 85-летию со дня рождения академика РАМН И Н Блохиной Под ред Проф Е И Ефимова «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний» -ННовгород Изд-во ННГУ им Лобачевского, 2006 -С 181

7 Соловьева А Е , Сотникова Н Ю , Вторушина В В , Кривенцова Т А Спонтанная продукция ИФНу и ФНОа периферическими МНК женщин с невынашиванием беременности ранних сроков инфекционного генеза и антифосфолипидным синдромом// «Медицинская иммунология» - Санкт-Петербург - 2007 - Том 9 - № 2-3 - С 263

8 Соловьева А Е , ЕЛ Бойко, В В Вторушина, Т. А Кривенцова, Л В Посисеева, Сотникова Н Ю Характеристика различных субпопуляций естественных киллеров и уровень их активации у женщин с привычным невынашиванием беременности инфекционного генеза и антифосфолипидным синдромом// Вестник новых медицинских технологий - Тула - 2007 - Том XIV -№2 -С 59-60

9 Сотникова Н Ю , Соловьева А Е , Вторушина В В , Кривенцова Т А «Средство для лечения женщин с привычным невынашиванием беременности при наличии или отсутствии антифосфолипидного синдрома» - приоритетная справка № 2007126885 от 16 07 07г

Перечень условных сокращений

АФС - антифосфолипидный синдром ВА - волчаночный антикоагулянт ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ЕК - естественные киллеры

ИГВВ - иммуноглобулин для внутривенного введения

ИГВМ - иммуноглобулин для внутримышечного введения

ИГ - иммуноглобулин

ИФ А - иммуноферментный анализ

ИФНу - интерферон

мАТ - моноклональные антитела

МНК - мононуклеарные клетки

ПНБ - привычное невынашивание беременности

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СН - супернатант

ФНОа - фактор некроза опухоли

CD - кластер дифференцировки клеток

CMV - цитомегаловирус

ELISA - иммуноферментный анализ

FITC — флюоресцеин изотиоционат

HSV I, II - вирус простого герпеса I, Итипа

Ig А - иммуноглобулин класса А

Ig G - иммуноглобулин класса G

Ig М - иммуноглобулин класса М

РЕ - фикоэритрин

Подписано в печать 17 04 2008 Формат 60><84 1/16 Печать плоская Уч-изд л 1,16 Печл 1,5 Уел печ л 1,75 Заказ № 41 Зт Тираж 105 экз

Изд Лицензия ЛР №010221 от 03 04 1997 Отпечатано в ОАО «Издательство «Иваново» 153012, г Иваново, ул Советская 49 Тел 32-67-91 E-mail naivan@mail ru

Актуальность исследования.

В условиях снижения воспроизводства, ухудшения показателей соматического и репродуктивного здоровья населения сохранение каждого плода и новорожденного становится одной из самых актуальных задач (3, 6, 25, 34).

Проблема невынашивания имеет не только медицинское, но и большое социальное значение, так как невынашивание беременности приводит к снижению рождаемости, влияет на физическое и психологическое здоровье женщин, на их семейное благополучие и трудоспособность (31,36, 50, 64, 98, 99,100).

Невынашивание беременности (НБ) является сложной, многофакторной патологией: причины этого состояния очень разнообразны (92, 93, 106). Наибольший интерес представляет невынашивание I беременности на ранних сроках, т.к. в данном случае иммунологические причины невынашивания выходят на первый план (49, 50, 103). Инфекция является одной из причин приводящей к формированию изменений в иммунной системе, что ведёт к углублению иммунных нарушений и усилению угрозы выкидыша, в связи, с чем в последние годы все большее внимание уделяется изучению невынашивания беременности инфекционного генеза (4, 42, 96, 108).

Помимо инфекции, в последние годы среди иммунологических аспектов невынашивания беременности большое внимание привлекает роль аутоиммунных процессов, в частности роль антифосфолипидных антител в акушерской патологии (41, 60, 63, 68, 70, 73, 80, 142, 176). Бактериальные и вирусные возбудители являются важным фактором, способствующим развитию аутоиммунных процессов, в связи с их способностью тесно связываться с мембраной клетки, вступать с ней в межмембранное взаимодействие, в результате чего начинается- выработка антител против собственных клеток и развитие аутоиммунного процесса. Сочетание антифосфолипидного синдрома с инфекционными факторами осложняет течение беременности, и может определять ее исход. В структуре причин привычного невынашивания беременности (ПНБ) антифосфолипидный синдром составляет 27 - 42%, причем без проведения адекватной терапии гибель плода наблюдается у 90-95 % женщин, имеющих аутоантитела к фосфолипидам (75, 84).

В настоящее время для лечения женщин с привычным невынашиванием беременности помимо местного применения препаратов, содержащих иммуноглобулины классов G, М, А и иммуноглобулинов для внутримышечного введения (ИГВМ), применяют иммуноглобулины для внутривенного введения (ИГВВ) (86, 111, 117).

Терапевтическое значение ИГВВ в лечении невынашивания противоречиво* (143, 160, 170). Однако сторонники его использования при невынашивании' иммунного генеза предполагают, что механизм действия ИГВВ может опосредоваться подавлением цитотоксической активности и смещением клеточного равновесия в сторону Т112-зависимого типа иммунного ответа, более благоприятного для развивающегося эмбриона (136). Механизм иммуномодулирующего эффекта иммуноглобулинов для внутривенного введения пока остается не достаточно выясненным, несмотря на положительный опыт практического применения различных препаратов ИГВВ при антифосфолипидном синдроме с целью предотвращения привычного выкидыша (181).

Использование импортных препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения представляет большую экономическую проблему для пациентов, в связи, с чем чрезвычайно важным и актуальным является изучение свойств новых отечественных препаратов ИГВВ различного типа и выявление механизма их действия.

Цель исследования: уточнить роль естественных киллеров в патогенезе привычного невынашивания беременности ранних сроков и формировании антифосфолипидного синдрома; выявить механизмы влияния отечественных препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения на функциональные характеристики естественных киллеров, и обосновать, в условиях in vitro, показания для их дифференцированного назначения больным с привычным невынашиванием беременности ранних сроков и антифосфолипидным синдромом. Задачи исследования:

1. Оценить инфекционный статус женщин с привычным невынашиванием беременности ранних сроков при наличии или отсутствии АФС.

2. Охарактеризовать содержание различных популяций естественных киллеров и уровень их активации при привычном невынашивании беременности ранних сроков и АФС.

3. Установить влияние, in vitro,' отечественных иммуноглобулинов для внутривенного введения на процессы активации естественных киллеров при привычным невынашиванием беременности при наличии или отсутствии АФС.

4. Выявить влияние отечественных иммуноглобулиновых препаратов для внутривенного введения на продукцию ИФНу, ФНОа при привычном невынашивании беременности и АФС.

5. Провести сравнительный анализ иммуномодулирующего действия отечественных препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения в экспериментальных условиях и обосновать возможность их дифференцированного назначения больным с привычным невынашиванием беременности при наличии или отсутствии АФС.

Научная новизна:

• Выявлено, что у женщин с привычным невынашиванием беременности и АФС повышена частота выявления маркеров микоплазменной и хламидийной инфекции.

• Доказано, что нарушение активации ЕК, спонтанной продукции ФНОа, ИФНу и рецепции этих цитокинов играет важную роль в патогенезе привычного невынашивания беременности ранних сроков и развитии антифосфолипидного синдрома.

• Установлено, что у женщин с привычным невынашиванием беременности с АФС наблюдается высокий уровень всех популяций ЕК, дисбаланс спонтанной продукции ФНОа, ИФНу и усиление рецепции данных цитокинов.

• В условиях in vitro выявлено, что отечественные иммуноглобулины для внутривенного введения «четвёртого поколения» «Габриглобин» и «антицитомегаловирусный иммуноглобулин» повышают процессы активации ЕК, ингибируют спонтанную продукцию ФНОа, а также усиливают внутриклеточный синтез ИФНу и его рецепцию при привычном невынашиванием беременности у женщин с АФС и без АФС.

• В экспериментальных условиях установлено, что «Габриглобин» оказывает более активное влияние на иммунную систему при ПНБ и АФС, в то время как «антицитомегаловирусный иммуноглобулин» - при ПНБ без АФС.

Практическая значимость работы:

Учитывая механизм действия «Габриглобина» и «антицитомегаловирусного иммуноглобулина», обосновано дифференцированное назначение отечественных препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения женщинам с привычным невынашиванием беременности с АФС и. без АФС. На препарат «Габриглобин» подана заявка на изобретение, как средства для лечения женщин с привычным невынашиванием беременности при наличии или отсутствии антифосфолипидного синдрома (приоритетная справка № 2007126885 от 16.07.07г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Привычное невынашивание беременности и АФС сопровождаются изменением содержания различных популяций естественных киллеров, а также спонтанной продукции и рецепции ФНОа и ИФНу.

2. Отечественные препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения- - «Габриглобин» и «антицитомегаловирусный иммуноглобулин» в условиях эксперимента влияют на процессы активации ЕК, продукцию и рецепцию цитокинов МНК при привычном невынашивании, причем характер влияния различен при наличии и отсутствии АФС, что позволяет дифференцированно назначать их пациентам.

Апробация работы:

Диссертация, прошла апробацию на заседании Учёного совета ФГУ «Ив НИИ М и Д им.В.Н.Городкова Росмедтехнологий» от 19 ноября 2007г. Материалы диссертации, доложены и обсуждены на 1 республиканской конференции «Иммунология репродукции» (Иваново, 2005 г.), XI Всероссийском научном Форуме им. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2007 г.).

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Личное участие автора: автор проводил анализ иммунологических данных, выкопировку из историй болезни, статистическую обработку и анализ результатов. Автором самостоятельно были сделаны обобщения, определены основные положения и выводы диссертации.

Структура и объём диссертации:

Материалы диссертации изложены на 126 страницах, машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы, исследования», 2 глав собственного исследования, главы «Обсуждение результатов», выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 194 источника из них 129 ссылок на отечественных, 65 - на зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 5 рисунками и 15 таблицами.

ВЫВОДЫ

1. У женщин с привычным невынашиванием беременности ранних сроков и антифосфолипидным синдромом чаще, чем у женщин* с привычным невынашиванием беременности без АФС, выявляются маркёры активной-бактериальной инфекции: микоплазмы (13% и 0%), хламидии (13% и 0%).

2. При привычном невынашивании беременности ранних сроков без антифосфолипидного синдрома повышается уровень периферических CD56+ ЕК и количество CD 16+ ЕК, экспрессирующих рецепторы для ФНОа I типа. При привычном невынашивании беременности с антифосфолипидным синдромом отмечается увеличение содержания всех популяций ЕК и CD56+ ЕК, экспрессирующих рецепторы к ИФНу, а также количества всех популяций ЕК, экспрессирующих ФНОаШ и ФНОа 2-го типа, CD120a+ лимфоцитов, усиление спонтанной продукции ФНОа и снижение синтеза ИФНу.

3. В условиях in vitro, «Габриглобин» и «антицитомегаловирусный иммуноглобулин» повышают количество активированных ЕК с фенотипом CD56+, и CD119+ лимфоцитов выделенных из периферической крови женщин с привычным невынашиванием беременности независимо от наличия антифосфолипидного синдрома, а при невынашивании с антифосфолипидным синдромом - количество CD 16+ ЕК, экспрессирующих рецепторы к ИФНу.

4. Отечественные иммуноглобулины для внутривенного введения -«Габриглобин» и «антицитомегаловирусный иммуноглобулин» при их воздействии на культуру мононуклеарных клеток ингибируют спонтанную продукцию ФНОа и стимулируют внутриклеточный синтез ИФНу при привычном невынашивании беременности без антифосфолипидного синдрома и с антифосфолипидным синдромом.

5. Показано, что при привычном невынашивании беременности и антифосфолипидном синдроме, в экспериментальных условиях, препарат «Габриглобин» оказывает более активное влияние на иммунную систему повышая количество активированных лимфоцитов, рецепцию ими ИФНу и рецепцию ИФНу ЕК с фенотипом CD56+. В то время как «антицитомегаловирусный иммуноглобулин» повышает количество CD69+ лимфоцитов выделенных из периферической крови женщин с привычным невынашиванием беременности без антифосфолипидного синдрома, и рецепцию ИФНу как CD 16+, так и CD56+ ЕК.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

На основании полученных результатов отечественный иммуноглобулин для внутривенного введения - «Габриглобин» может быть использован в комплексе прегравидарной подготовки женщин при невынашивании беременности инфекционного и аутоиммунного генеза (АФС), для нормализации функций иммунной системы.