Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Иммунометаболические эффекты, вызываемые регуляторами энергетического обмена при алкогольной интоксикации

На правах рукописи

Павлова Марина Вячеславовна

ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ, ВЫЗЫВАЕМЫЕ РЕГУЛЯТОРАМИ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА ПРИ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Курск-2007

003173870

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Быстрова Наталья Анатольевна доктор медицинских наук, профессор Бровкина Инна Леонидовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Провоторов Владимир Яковлевич кандидат медицинских наук Толмачев Николай Егорович

Ведущее учреждение:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «у9 » ноября 2007 г в М/ часов на заседании диссертационного совета К 208 039 01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (305041, г Курск, ул К Маркса, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Росздрава

Автореферат разослан « 20071

Ученый секретарь диссертационного совета

Пашин Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение аддиктивных состояний выявили нарушения взаимодействия нейромедиаторных, нейроэндокринных, биохимических и иммунологических процессов организма, позволили установить, что иммунная система и механизмы психонейроиммуномодуляции участвуют в формировании основных синдромов алкоголизма (Анохина И П. и др, 1998, Семке В Я и др , 2003) Как показывают исследования, проведенные другими авторами, вторичная иммунная недостаточность, снижение защитных иммунных механизмов, присоединение на этом фоне соматической патологии и асте-низация организма являются ведущими в механизмах формирования терапевтической резистентности при алкоголизме и срыва ремиссий в процессе терапии сформировавшейся зависимости (Бохан НА и др , 2001)

Этанол - вещество, сочетающее в себе свойства медицинского препарата, естественного метаболита организма, токсического ксенобиотика, пищевого продукта и алиментарного фактора, избыточное поступление которого нарушает метаболические процессы и физиологические функции После кратковременной алкогольной интоксикации имеет место угнетение генерации макроэр-гических соединений в эритроцитах, приводящее к нарушению двойного фос-фолипидного слоя мембраны клеток и интегрированных в них белков (Бохан Н А, Прокопьева В Д, 2004)

При длительном поступлении этанола в организм дезорганизуется метаболизм в гепатоцитах, которые вместе с эритроцитами образуют функциональную систему метаболической регуляции иммунологических процессов (Прокопенко Л Г и др , 2003, Лазарева ГА и др , 2006) Ослабление функции этой системы может быть одной из основных причин возникновения иммунодефицита при алкогольной интоксикации.

Поэтому изучение влияния этанола на показатели иммунного гомеостаза и поиск фармакологических средств коррекции выявленных нарушений в условиях эксперимента является актуальным и перспективным направлением Про-тективный эффект при токсических поражениях достигается применением лекарственных препаратов, обладающих антиоксидантной активностью (Лазарева Г А и др , 2006) Не ясно, может ли быть достигнут такой эффект в условиях этанольной интоксикации введением препаратов, объединенных в группу регуляторов энергетического обмена, влияющих на углеводный и липидный обмены (Прокопенко Л Г и др , 2000)

Цель работы: оценить иммунометаболические эффекты препаратов, регулирующих углеводный и липидный обмен, у животных в условиях алкогольной интоксикации

Задачи исследования:

1 Установить особенности нарушений иммунного и антиоксидантного статусов и функции гепатоцитов в условиях однократного и многократного поступления этанола

2 Изучить иммунометаболические эффекты тиамина и рибоксина при однократном и многократном поступлении этанола

3 Определить иммунометаболические эффекты биотина и элькара в условиях одно- и многократного поступления этанола

4 Оценить эффективность применения милдроната и эссенциале в коррекции иммунометаболических нарушениях при алкогольной интоксикации

5 Установить роль тромбоцитов и эритроцитов в реализации иммуномо-дулирующего действия препаратов, регулирующих энергетический обмен в условиях однократного и многократного поступления этанола

Научная новизна.

Установлены особенности нарушений иммунологической реактивности, функционально-метаболической активности нейтрофилов периферической крови, процессов перекисного окисления липидов, активности каталазы и функции гепатоцитов и эритроцитов в условиях одно- и многократного поступления этанола Выявлена иммунокорригирующая эффективность применения препаратов, регулирующих углеводный и липидный обмены, при однократном и многократном поступлении в организм этанола Выявлена взаимосвязь гепатоцитов, эритроцитов и тромбоцитов в развитии иммуносупрессии при поступлении этанола и реализации иммуномодулирующего действия препаратов, регулирующих энергетический обмен Выявлена взаимосвязь метаболических и иммунологических эффектов, вызываемых препаратами, регулирующими энергетический обмен, в условиях одно- многократного поступления этанола

Практическая значимость.

Экспериментально обоснована целесообразность клинического изучения использования сочетанного применения тиамина и рибоксина для коррекции иммунометаболических нарушений, возникающих при однократном поступлении этанола, и сочетаний элькара и биотина, милдроната с рибоксином или эссенциале при многократном введении этанола

Обоснована перспективность изучения тромбоцитарноэритроцитарного механизма иммуносупрессии и воздействия лекарственных препаратов в регуляции иммунологических функций при алкогольной интоксикации

Показана целесообразность изучения в клинике взаимосвязи между им-муномодулирующим и гепатопротекторным эффектами препаратов, регулирующих процессы энергообеспечения клеток, при алкогольной интоксикации

Материалы диссертации включены в учебные рабочие программы и используются в лекционных курсах и на практических занятиях ряда кафедр Курскою, Российского, Воронежского государственных медицинских университетов и академий и медицинских факультетов Белгородского и Орловского государственных университетов

Основные положения, выносимые на защиту.

1 В условиях одно- или многократного поступления этанола имеют место нарушения различных звеньев иммунитета

2 В условиях однократного поступления этанола регуляторы углеводного обмена (тиамин и рибоксин) нормализуют иммунометаболический статус

3 Применение регуляторов липидного обмена (элькара и биотина) при многократном поступлении этанола корригируют и нормализуют нарушенные параметры иммунного и метаболического статусов

4 Появление иммуносупрессирующих свойств у легких эритроцитов при однократном поступлении этанола вызваны изменениями структуры их мембран, а при многократном поступлении этанола - связывающимися с их мембраной липопротеидами низкой плотности и гликозаминогликанами сыворотки

5 Тромбоциты играют важную роль в развитии иммуносупрессии при многократном поступлении в организм этанола и участвуют в реализации им-муномодулирующего действия препаратов, регулирующих энергетический обмен

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на научных конференциях Курского государственного медицинского университета и Центрально-Черноземного научного центра РАМН (2005, 2006), Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004), Российской научной конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2006), V Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии, V Европейском конгрессе по астме (Москва, 2007) и совместном заседании кафедр фармакологии, фармацевтической, токсикологической и аналитической химии, микробиологии, биологической химии Курского государственного медицинского университета (2007)

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста, иллюстрирована 40 таблицами и 12 рисунками, состоит из введения, обзора литературы (2 главы), описания методов исследования, изложения собственных результатов (5 глав), заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 124 отечественных и 83 иностранных источников

Публикации. По материалам диссертации в центральной и местной печати опубликовано 12 работ, в том числе 3 - в рекомендуемых изданиях ВАК РФ Опубликованные материалы содержат полный объем информации, касающейся темы диссертации

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Экспериментальные исследования. Исследования проведены на крысах Вистар массой 160-200 г В опытах использовали животных, прошедших карантинный режим вивария Курского государственного медицинского университета и не имевших внешних признаков каких-либо заболеваний Все животные содержались в одинаковых условиях, на обычном пищевом режиме Для получения статистически достоверных результатов группы формировали из 8-10 животных В контрольные и опытные группы входили животные одного возраста, полученные из питомника одновременно Разброс в группах по исходной массе не превышал ±10% Все исследования проводили в одно и то же время суток с 8 до 12 часов с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (г Страсбург, Франция, 1986) Животных выводили из опыта декапитацией под эфирным наркозом Исследованию подвергали плазму, сыворотку крови, эрит-

роциты, полинуклеарные лейкоциты, лимфоциты периферической крови, ткань селезенки и подколенных лимфатических узлов

Экспериментальные модели. Животным внутрижелудочно вводили 20%-ный раствор этанола однократно в дозе 1,4 мл / 100 г или 30-кратно через 24 часа по 0,3 мл / 100 г (Островский ЮМ и др , 1998)

Использование фармакологических препаратов. Используемые препараты, способ и кратность их введения представлены в таблице 1 Способ введения препарата соответствовал рекомендациям, приведенным в справочнике М Д Машковского «Лекарственные средства», и инструкциям по применению препаратов Выбор дозы основывался на данных экспериментального определения эффективности препаратов (Прокопенко Л Г и др , 2000)

Приготовление антигена. Схемы иммунизации. Оценка интенсивности развития иммунного ответа и функционально-метаболической активности нейтрофилов периферической крови. В качестве антигенов в опытах использовались эритроциты барана Для развития гуморального иммунного ответа ЭБ вводили внутрибрюшинно однократно из расчета 2x109 клеток на 1 кг массы тела Выраженность ГИО оценивали на пятые сутки после иммунизации путем определения в селезенке числа антителообразующих клеток (Маль-берг К , Зигль Э , 1987)

Таблица 1

Применение препаратов __

Схема введения

Препарат Фирма-изготовитель Способ введения Разовая доза, мг/ki Количество инъекций (введений) Интервал между шъекциями (введениями), ч.

Тиамин хлорид «Верофарм» Внутримышечно 1 5 12

Рибоксин «Вирион» Внутривенно 2 5 12

Элькар «Пик-фарма» В нутрижелудочно 10 5 12

Биотин «Rosher» Внутримышечно 5 5 12

Милдронат «Grindeks» Внутривенно 5 5 12

Эссенциале(полиненасыщенные фосфолипиды) «Рон-Пуленк Рорер» Внутривенно 5 5 12

Примечание, при сочетанием введении препаратов использовались дозы, равные половине тех, которые применялись при раздельном введении

ГЗТ у крыс индуцировали внутрибргошинным введением 108 ЭБ в 0,5 мл 0,15 М раствора натрия хлорида (сенсибилизирующая доза) Через 4 суток в подушечку стопы правой лапки вводили 106 ЭБ в 0,1 мл физраствора (разре-

шающая доза) Спустя 24 ч выделяли регионарный (по месту введения ЭБ) и контрлатеральный подколенный лимфоузлы О выраженности ГЗТ на ЭБ судили по разнице масс регионарного и контрлатерального лимфатических узлов и по разнице количества в них кариоцитов (Федосеева Т В и др., 1993)

Для получения суспензии лейкоцитов гепаринизированную венозную кровь (25 ЕД/мл крови) смешивали с 3%-ным желатином (0,1 мл/мл крови) и выдерживали 15-20 мин при 37°С После оседания эритроцитов слой плазмы, обогащенной лимфоцитами переносили в силиконизированные пробирки Клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 1500 об/мин, дважды отмывали раствором Хенкса и помещали в среду 199 Количество клеток подсчитывали под световым микроскопом в камере Горяева

Функционально-метаболическую активность нейтрофилов периферической крови оценивали по величинам фагоцитарного числа, фагоцитарного индекса и индекса активности фагоцитов (Медведев А Н , Чаленко В В , 1991), показателей спонтанного и индуцированного зимозаном НСТ-теста, функциональному резерву нейтрофилов (Щербаков В И , 1989)

Выделение, фракционирование и обработка эритроцитов. Донорами крови служили животные опытных и контрольных групп Кровь получали из яремной вены под эфирным наркозом через 24 ч после последнего воздействия или введения исследуемых препаратов

Эритроциты выделяли двухкратным отстаиванием в 10 мл Ыа-фосфатного буфера, содержащего 3% декстрана Т-500, и последующей очисткой с помощью ИВБ-целлюлозы в Ыа-фосфатном буфере (Веи^ег В и др, 1985) и фракционировали в градиенте плотности яичного альбумина (Кобзев ТВ и др, 1978) или градиенте концентрации сахарозы (Иванов В П и др , 2004)

В части опытов эритроциты опытных крыс экстракорпорально обрабатывали сывороткой аллогенных животных (Прокопенко Л Г , Яхонтов Ю О , 1979) или выделенной из нее гепаринмарганцевым методом фракцией липопротеидов низкой и очень низкой плотности (Холодова Ю Д, Чаяло П П , 1990) Иммуно-модулирующие свойства эритроцитов интактных животных, обработанных сывороткой или препаратами и их фракций, определяли путем трехкратного (с интервалом 24 ч) внутрибрюшинного введения (по 1x108 клеток на 1 кг массы) интактным или опытным аллогенным реципиентам Иммунизацию животных ЭБ проводили в последний день введения эритроцитов

Выделение N0 лейкоцитами устанавливали с помощью реакции Гиса (Голиков П П и др , 2003) Тромбоциты выделяли из плазмы путем центрифугирования в градиенте плотности человеческого альбумина 15 мин при 1000g (Коган АХ и др , 1992)

Определение биохимических параметров. В сыворотке крови экспериментальных животных определяли концентрацию триацилглицеролов, общего билирубина и холестерина, активность АСТ и АЛТ, ЩФ Величины всех перечисленных показателей определяли унифицированными методами с использованием стандартных наборов реактивов (Меньшиков В В , 1987) Для определения повреждения печени индикаторами синдрома цитолиза являлась актив-

ность ACT и АЛТ, синдрома холестаза - активность ЩФ и концентрация билирубина (Подымова С Д, 1998, Титов В Н , 1996)

Выраженность ПОЛ оценивали по содержанию ацилгидроперекисей и малонового диальдегида (Бенисович В И , Идельсон Л И , 1973, Гаврилов В Б , Мишкорудная М И , 1983) Кроме этого, в сыворотке крови определяли активность каталазы (Подильчак М А , 1967)

Энергообеспечение эритроцитов оценивали по содержанию в них АТФ и 2,3-бисфосфоглицерата (Виноградова ИЛ и др , 1980), а их антиоксидантный потенциал - по активности супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы (Макаренко Е В , 1988) Количество МДА в тромбоцитах оценивали по Е В Негреску (1992) Иммуносупрессорный потенциал крови оценивали по концентрации в сыворотке ЛНП и ЛОНП (Колб В Г , Камышников В С , 1976) и глюкозаминог-ликанов (Мурашов Б Ф и др , 1986), кроме этого определялась активность альфа-1-антипротеазы и альфа-2-макроглобулинов (Нартикова В Ф , Пасхина Т С , 1979)

Статистическая обработка полученных результатов. Статистическую обработку результатов исследования проводили путем вычисления средних арифметических (М) и стандартных ошибок (а), и средних ошибок средних (ш) (Лакин ГФ, 1980) Существенность различий средних величин оценивали по критериям Стьюдента и Вилкоксона-Манна и Уитни (Гублер Е В , Генкин А А , 1973, Гублер Е В , 1978)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Иммунные нарушения, состояние перекисного окисления липидов и функционально-метаболическая активность гепатоцитов в условиях одно-н многократного поступления этанола. Однократное и многократное поступление этанола снижает выраженность ГИО и ГЗТ у крыс, индуцированного ЭБ, что проявляется снижением количества АОК (соответственно в 2,0 и 3,2 раза) и РМЛ (на 28,0% и 33,0%) и РКЛ (на 30,5% и 27,7%), уменьшает фагоцитарную и кислородзависимую активность нейтрофилов периферической крови, при этом многократное поступление достоверно больше супрессирует кислородзависимую активность ПЯЛ (рис 1)

Введение этанола снижает активность каталазы и повышает более чем в 2 раза концентрацию продуктов ПОЛ - МДА и АГП При этом в условиях однократного поступления этанола концентрация МДА и АГП выше, чем в группе животных, получавших этанол многократно

Однократное поступление этанола не влияет на функцию гепатоцитов, тогда как многократное поступление в организм животных этанола приводит к развитию синдромов цитолиза и холестаза, что проявляется повышением активности ACT, АЛТ, ЩФ и концентрации билирубина

Рисунок 1. Иммунометаболические эффекты однократного и многократного введения этанола.

Иммуномодулирующая активность компонентов плазмы и эритроцитов периферической крови в условиях поступления этанола. Фракция легких эритроцитов крыс, одно- и многократно получавших этанол, снижает выраженность ГИО и ГЗТ на ЭБ и угнетает поглотительную способность и окислительную активность нейтрофилов периферической крови, что проявляется снижением более чем в 2 раза количества АОК, показателей РМЛ, ИАФ и ФРН. Тяжелые эритроциты вне зависимости от кратности поступления этанола не обладают иммуносупрессирующими свойствами (рис. 1).

Введение легких эритроцитов, обработанных сывороткой крыс, многократно получавших этанол, вызывает выраженное снижение показателей ГИО, ГЗТ и ФМА нейтрофилов периферической крови, тогда как легкие эритроциты, обработанные сывороткой животных, получавших этанол однократно, не обладают данными свойствами (рис. 1).

Этанол вызывал нарушение энергообеспечения лёгких и тяжелых эритроцитов, характеризующееся снижением содержания в этих клетках макроэр-гических соединений БФГ и АТФ, только при однократном его поступлении, тогда как после многократного поступления этанола изменений в энергетическом статусе не выявлено (рис. 1).

Кроме этого, однократное введение этанола сопровождалось увеличением в плазме крови активности антипротеолитических белков (ААП и АМГ), а также концентрации ГАГ. Многократное же введение этанола не влияет на активность ААП и АМГ, но повышает концентрацию в сыворотке крови ГАГ и ЛНП (рис. 1).

Иммунометаболнческие эффекты, вызываемые тиамином и рибоксином при поступлении этанола. Первоначально нами изучалось влияние препаратов регуляторов обмена углеводов в условиях однократного приема этанола. Изучение влияния тиамина и рибоксина на иммуннологическую реактивность показало, что раздельное введение тиамина и рибоксина повышает количество АОК и РМЛ и РКЛ, но не до контрольных значений. Совместное введение обоих препаратов нормализует выраженность ГИО и ГЗТ на ЭБ (рис. 2).

АОК

Рнсунок 2. Влияние тиамина и рибоксина на формирование ГИО и ГЗТ, ФМА нейтрофилов периферической крови и содержание макроэргических соединений в эритроцитах крыс, однократно получавших этанол. Примечание: 1 - радиус окружности - контроль (без введения этанола);

2 - заштрихованное поле - крысы, получавшие этанол;

3 - ........... — крысы, получавшие этанол и тиамин;

4 ---— ■ — крысы, получавшие этанол и рибоксин;

5 - - - крысы, получавшие этанол, рибоксин и тиамин;

6 -О- р<0,05 между показателями по отношению к контролю;

7 - т - тяжелые эритроциты, л - легкие эритроциты.

Тиамин при однократном поступлении этанола нормализует ФЧ и повышает ФИ, что приводит к повышению ИАФ, кроме этого повышается кислород-зависимая активность нейтрофилов периферической крови, что проявляется усилением как НСТ-сп., так и НСТ-стим., приводящее к нормализации функционального резерва ПЯЛ. Рибоксин в данных условиях корригирует ФИ и ИАН, НСТ-сп., не влияет на ФЧ, но нормализует показатели НСТ-стим. и ФРН. Совместное введение препаратов нормализует как фагоцитарную активность, так и кислородзависимый метаболизм нейтрофилов периферической крови (рис. 2).

При однократном приеме этанола раздельное применение тиамина и ри-бокисна повышает концентрацию БФГ и АТФ в обеих фракциях эритроцитов, но не до уровня контрольной группы, тогда как их совместное использование нормализует энергетический статус как у тяжелых, так и у легких эритроцитов (рис 2)

Раздельное применение обоих препаратов уменьшает иммуносупресси-рующий эффект фракции легких эритроцитов крыс в количестве АОК и РМЛ, совместное же применение тиамина и рибоксина отменяет иммуносупресси-рующий эффект легких эритроцитов и не влияет на иммуномодулирующие свойства тяжелых эритроцитов

Раздельное введение тиамина и рибоксина снижает выраженность имму-носупрессирующего влияния легкой фракции эритроцитов в отношении ФМА нейтрофилов периферической крови, тогда как совместное их использование отменяет появление у легких эритроцитов иммуномодулирующих свойств

Тиамин и рибоксин при раздельном применении не влиял на активность ААП и АМГ и концентрацию ГАГ и ЛНП, тогда как сочетанное их использование позволило корригировать активность протеаз АМГ и ААП

В условиях многократного поступления этанола оба препарата оказались не эффективными в коррекции нарушенных показателей выраженности ГИО и ГЗТ

Тиамин и рибоксин, введенные раздельно, в условиях многократного поступления этанола не влияет на ФМА нейтрофилов периферической крови, тогда как совместное введение препаратов незначительно повышает фагоцитарную и кислородзависимую их активность

В условиях многократного поступления этанола регуляторы углеводного обмена не изменяют энергетический потенциал эритроцитов, концентрация в них БФГ и АТФ не изменяется

В отличие от однократного поступления этанола, в условиях многократного его введения тиамин и рибоксин как при раздельном, так и при совместном введении не влияют на выраженность иммуносупрессорных свойств легких эритроцитов интенсивность ГИО и ГЗТ у интактных животных при введении легких эритроцитов животных, получавших этанол и препараты по указанной схеме, не изменялась Тиамин и рибоксин в условиях многократного поступления этанола в малых дозах в организм животных не влияют на активность в крови ААП и АМГ и не изменяют концентрацию ГАГ и ЛНП

Для уточнения механизма иммунокорригирующего действия тиамина и рибоксина изучено влияние на иммунологическую реактивность здоровых крыс эритроцитов здоровых животных, обработанных сывороткой крыс, получавших помимо этанола оба этих препарата

Установлено, что обработка эритроцитов сывороткой животных, однократно получавших этанол и регуляторы углеводного обмена не приводила к изменению их иммуномодулирующей активности

Введение эритроцитов здоровых крыс, обработанных сывороткой животных, многократно получавших этанол, и препараты по принятой схеме, не изменяла их иммуносупрессорную активность

Иммунометаболическне эффекты элькара и биотина при алкогольной интоксикации. Раздельное введение элькара и биотина в условиях однократного поступления этанола не влияет на количество АОК и PMJ1 и PKJ1, ФМА нейтрофилов периферической крови, концентрацию БФГ и АТФ в легкой и тяжелой фракциях эритроцитов, а совместное введение препаратов незначительно повышает выраженность ГИО и ГЗТ на ЭБ, корригирует фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови, нормализует их кислородзави-симый метаболизм и отменяет супрессирующий эффект у легких эритроцитов

Эритроциты животных, получавших однократно этанол, элькар и биотин раздельно или совместно, при аллогенном переносе не изменяли ФМА ПЯЛ периферической крови Введение интактным крысам фракций эритроцитов животных после однократного поступления этанола, получавших раздельно или совместно элькар и биотин различно влияют на ФМА нейтрофилов периферической крови Легкая фракция таких животных при аллогенном переносе угнетала ФМА нейтрофилов, тяжелая фракция оставалась неактивной Элькар и биотин на фоне однократного поступления этанола при раздельном и совместном применении не влияет на активность ААП и AMT и концентрацию ГАГ

При изучении влияния элькара и биотина в условиях многократного поступления этанола на иммунную реактивность установлено, что раздельное введение элькара и биотина повышает количество АОК и РМЛ и РКЛ, показатели ФМА нейтрофилов периферической крови, но не до контрольных значений Совместное введение обоих препаратов нормализует выраженность ГИО и ГЗТ на ЭБ и ФМА ПЯЛ (рис 3)

При изучении влияния элькара и биотина на выраженность иммуномоду-лирующих свойств у эритроцитов крыс, многократно получавших этанол, при аллогенном переносе выявлено, что раздельное применение обоих препаратов уменьшает иммуносупрессирующий эффект у фракции легких эритроцитов крыс в отношении выраженности ГИО и ГЗТ на ЭБ, не влияя на иммуномоду-лирующие свойства у тяжелых эритроцитов Совместное применение элькара и биотина отменяет иммуносупрессирующий эффект у легких эритроцитов

Раздельное введение элькара и биотина снижает выраженность супресси-рующего влияния легкой фракции эритроцитов крыс, получавших многократно этанол, в отношении ФМА нейтрофилов периферической крови, а совместное использование препаратов отменяет появление у легких эритроцитов супрес-сорных свойств

Элькар и биотин при раздельном и совместном применении не влияет на активность ААП и АМГ в условиях многократного введения этанола Раздельное их применение снижает, но не до контрольных значений ГАГ и ЛНП, тогда как сочетанное их использование нормализует содержание ГАГ и ЛНП в сыворотке крови животных, многократно получавших этанол

АОК

нейтрофилов периферической крови и содержание макроэргических соединений в эритроцитах крыс, многократно получавших этанол. Примечание: 1 - радиус окружности - контроль (без введения этанола);

2 - заштрихованное поле - крысы, получавшие этанол;

3 - ........... - крысы, получавшие этанол и элькар;

4 - —--- - крысы, получавшие этанол и биотин;

5--- крысы, получавшие этанол, элькар и биотин;

6 - О- р<0,05 между показателями по отношению к контролю.

7 - т — тяжелые эритроциты, л - легкие эритроциты.

Сыворотка животных, получавших элькар и биотин на фоне многократного поступления этанола, отменяет появление у легкой фракции эритроцитов здоровых крыс иммуносупрессирующей активности. Введение такой фракции эритроцитов не изменяет показатели ГИО и ГЗТ у интактных животных.

Для установления природы иммуносупрессирующих сывороточных субстанций, сыворотка предварительно обрабатывалась гепаринмарганцевой смесью для осаждения ЛНП и ЛОНП и/или гиалуронидазой для разрушения ГАГ.

Установлено, что осаждение ЛНП, ЛОНП или разрушение ГАГ снижало способность сыворотки вызывать у легкой фракции эритроцитов появление иммуносупрессирующей активности, тогда как осаждение ЛНП и ЛОНП и разрушение ГАГ отменяло способность сыворотки влиять на появление иммуно-супрессорных свойств у легких эритроцитов интактных животных.

Таким образом, в сыворотке крови животных, получавших этанол многократно, накапливаются ЛНП, ЛОНП и ГАГ, которые являются основной причиной появления при обработке сывороткой иммуносупрессирующей активности у легкой фракции эритроцитов интактных животных.

Иммуномодулнрующне эффекты, вызываемые регуляторами энергетического обмена в сочетании с милдронатом и эссенциале при поступлении этанола. Введение милдроната не оказывало влияния на ФМА нейтрофи-лов, развитие ГИО и ГЗТ при однократном введении этанола, но усиливало иммунологические функции при его многократном поступлении Инъекции милдроната с тиамином или рибоксином не влияли на показатели функции нейтро-филов и иммунологической реактивности у крыс однократно и многократно получавших этанол (табл 2)

Таблица 2

Влияние милдроната на иммуномодулирующие эффекты, вызываемые тнамином, рибоксином, элькаром и биотином при однократном введении

этанола

Условия опыта ИАФ ОРН АОК РМЛ

I Контроль 52,4±5,2 29,3±3,2 28,54±2,9 4,8*0,6

2 Этанол 34,4*3,6"' 12,7±1,4'' 13,4*,6'' 2,7*0,3"'

3 Этанол и введение милдроната 32,6*3,0*' 13,5*1,6*' 12,3±1,4*' 2,8*0,3*'

4 Этанол и введение милдроната и тиамина 32,8*3,4*' 14,0±1,7*' 14,6*1,8*' 2,9*0,3*'

5 Этанол и введение милдроната и рибоксина 36,8*3,5'' 12,3*1,5'' 12,9*1,5'' 2,6*0,3*'

6 Этанол и введение милдроната и элькара 33,4*3,2'' 12,0±1,5'! 11,5*1,3*' 2,9*0,3*'

7 Этанол и введение милдроната и биотина 41,7*3,9*'"6 22,8*1,б''"6 20,5*1,7*1"6 3,8±0,4*'"4

Примечание здесь и на последующих таблицах и рисунках звездочкой отмечены достоверные отличия средних арифметических (р < 0,05), цифры рядом со звездочкой -по отношению к показателям какой группы эти различия

Сочетанное применение милдроната с элькаром не вызывало иммуномо-дулирующего эффекта при однократном и многократном поступлении этанола Совместное введение милдроната с биотином при однократном введении этанола повышало ФМА нейтрофилов и усиливало развитие клеточной и гуморальной форм ответа, и было неэффективным при многократном его поступлении

Введение милдроната, а также милдроната с тиамином или элькаром не влияло на иммуносупрессирующую активность легких эритроцитов крыс, однократно и многократно получавших этанол, а в сочетании с биотином отменяли активность клеток обеих групп животных (табл 3)

Введение милдроната усиливало, но не нормализовало выраженность показателей, характеризующих ФМА ПЯЛ, иммунологическую реактивность и состояние мембраны гепатоцитов Рибоксин, элькар и эссенциале в выбранных дозах не оказывали существенного влияния на функции иммуноцитов и состояние мембран

Таблица 3

Влияние милдроната на иммуномодулирующие эффекты, вызываемые эритроцитами крыс, многократно получавших этанол _(КМПЭ) и тиамин, рибоксин, элькар или биотин_

Условия опыта ИАФ ОРН АОК РМЛ

1 Контроль 26,5±2,4 4,6*0,6 28,5*2,9 4,6*0,6

2 Введение эритроцитов КМПЭ 11,3*1,5*' 2,6*0,3*' 17,1*2,1*' 2,8*0,4''

3 Введение эритроцитов КМПЭ, получавших милдронат 13,0*1,7*' 2,8*0,4*' 18,6*2,3'' 2,7*0,4*'

4 Введение эритроцитов КМПЭ, получавших милдронат и тиамин 10,8*1,4'' 2,5*0,4"' 16,7*2,2*' 2,5*0,3''

5 Введение эритроцитов КМПЭ, получавших милдронат и рибоксин 12,6±1,6*' 2,8*0,4*' 19,0*2,2'' 2,5*0,4*'

6 Введение эритроцитов КМПЭ, получавших милдронат и элькар 11,8*1,7*' 2,3*0,4*' 15,9*2,1'' 2,6*0,4''

7 Введение эритроцитов КМПЭ, получавших милдронат и биотин 25,1*2,8*2 5 4,5*0,б*2 5 28,3*3,2 4,7*0,5*"

Введение милдроната усиливало, но не нормализовало выраженность показателей ФМА ПЯЛ, иммунологическую реактивность и состояние мембраны гепатоцитов Рибоксин и эссенциале в выбранных дозах не оказывали существенного влияния на функции иммуноцитов и состояние мембран

В сочетании с рибоксином милдронат нормализовал ФМА ПЯЛ, развитие ГИО и ГЗТ Совместное применение милдроната с эссенциале нормализовало большинство определявшихся показателей функциональной активности иммуноцитов и гепатоцитов В эритроцитах крыс, получавших этанол, милдронат и рибоксин или эссенциале, уменьшалась выраженность изменений БФГ, АТФ, СОД, АГП и МДА (табл 4).

Легкие эритроциты таких животных при аллогенном переносе не влияли на ФМА ПЯЛ, развитие ГИО и ГЗТ

На основании полученных данных, можно прийти к заключению о важной роли эритроцитов в развитии иммуносупрессии при поступлении алкоголя в реализации иммуномодулирующего действия регуляторов энергетического обмена и полиненасыщенных фосфолипидов

Проведенные ранее исследования показали, что при различных формах нарушения энергетического гомеостаза тромбоциты приобретают иммуносу-прессирующие свойства. Они индуцируются липопро те идами низкой и очень низкой плотности и опосредуемые легкими эритроцитами (Прокопенко Л Г и др , 2001, Лазарева ГА и др , 2006)

Таблица 4

Влияние милдроната, рибоксина и эссенциале на окислительно-энергетический потенциал эритроцитов при поступлении алкоголя

Показатели Коитроль Введение этанола Введение этанола, милдроната и рибоксина Введение этанола, милдроната и эссенциале

1 2 3 4

БФГ 5,3±0,6 3,2±0,2"' 4,8±0,5'' 5,1±0,6"'

АТФ 1,7±0,2 0,8±0,1"' 1,8±0,2'' 1,5*0,2''

сод 54,7±4,0 41,2±3,5'' 51,6*3,9'' 54,0*4,5''

ГР 112,3±12,2 117,6±19,4 108,5±15,1 114,7±14,7

АГП 1,4±0,2 3,4±0,7"' 1,6±0,3''! 1,3±0,2"'!

МДА 33,7±3,9 45,0±4,б'' 36,1±4,2'2 31,7±4,8''

Выраженная имуносупрессирующая активность характерна для окислительно-модифицированных липопротеинов низкой плотности Они индуцируются активированными формами кислорода генерация, которых резко усиливается при токсических поражениях печени, вызываемых ксенобиотиками и этанолом (Зинчук В В , Ходосовский М Н , 2006) Одной из наиболее часто возникающих окислителей является стабильный оксид азота и его радикал, генерируемые в больших количествах клетками печени и крови (Серая И П , Нарциссов Я Р , 2006)

Нейтрофилы алкоголизированных крыс, инкубированные в полной среде (30 мин , 37°С), выделяют большее количество оксида азота, чем нейтрофилы интактных животных (содержание N0 в среде соответственно равнялось 0,45 и 1,15 нмоль/ 5 х 106 клеток) Клетки осаждали центрифугированием (10мин, 200 д), к надосадочной жидкости добавляли фракцию липопротеинов низкой и очень низкой плотности, выделенную из сыворотки интактных крыс гепарин-марганцевой смесью, и инкубировали 1 час При инкубации в среде увеличивалось содержание МДА на 7-12% по сравнению с исходным уровнем в той же пробе Это позволяет считать, что под влиянием N0 среды происходит окислительная модификация ЛНП и ЛОНП

Тромбоциты интактных крыс (Ю8) инкубировали в полной среде (2 мл), содержащей окислительно - модифицированные ЛНП и ЛОНП (ОМЛП) После инкубации (1ч, 37°С) тромбоциты осаждали центрифугированием и определяли в них содержание МДА До инкубации оно равнялось 0,54, после инкубации 1,63 нмоль/108 тромбоцитов Таким образом, под влиянием ОМЛП произошла окислительная модификация тромбоцитов

Эритроциты интактных животных инкубировали с окислительно - модифицированным тромбоцитами (108 тромбоцитов, 107 эритроцитов в 1 мл среды 1 час при 37°С) (ОМТ) После инкубации и отделения тромбоцитов в эритроцитах обнаруживалось увеличение содержания продуктов ПОЛ и снижение концентрации БФГ Такие эритроциты при аллогенном переносе супрессировали развитие иммунного ответа у интактных крыс (в норме АОК - 26,4±2,1

тыс/селезенка после инкубации с тромбоцитами - 12,6±1,0 тыс/селезенка). Инкубация ОМТ с нейтрофилами интактных животных ингибировала их ФМА (в норме ИАФ = 64,2±5,8, ОРН = 17,8±1,5; после инкубации с тромбоцитам ИАФ=47,5±3,9; ОРН=9,4±1,0). ОМТ in vitro не влияли на величину метаболических маркеров активации лимфоцитов (содержание в них фруктозо-2,6-дифосфата и концентрация лактата после инкубации с тромбоцитами оставались таким же как до нее).

Установлено, что внесение в среду инкубации тромбоцитов и эритроцитов диклофенака или изоптина не влияло на появление иммуносупрессирующих свойств у эритроцитов. Вероятно, появление иммуносупрессирующих свойств у эритроцитов не зависит от изменения содержания простагландинов и Са2+ в эритроцитах. Добавление в среду инкубации тромбоцитов и нейтрофилов диклофенака увеличивало ФМА последних, а внесение изоптина не влияло на показатели защитной функции этих клеток (рис. 4).

80 70 60 50 40 -30 20 10 -0

►1,3

30

25 Н

20

10

5 -

•1 *1

2 3

Рисунок 4. Влияние диклофенака и изоптина на сниженную тромбоцитами ФМА нейтрофилов in vitro.

Примечания: А - ИАФ; Б - ОРН. По оси абсцисс: 1. Контроль (без добавления тромбоцитов); 2. Тромбоциты (без добавления препаратов); 3. Тромбоциты + диклофе-нак; 4. Тромбоциты + изоптин.

Введение алкоголизированным крысам эссенциале предотвращало появление у тромбоцитов свойства оказывать влияние на метаболизм и функцию эритроцитов и нейтрофилов интактных крыс. Рибоксин и милдронат такого эффекта не вызывали. Инъекции интактным животным рибоксина предотвращали снижение содержания БФГ и увеличение концентрации МДА в эритроцитах, а также появление иммуносупрессирующих свойств у этих клеток после инкубации их с тромбоцитами алкоголизированных крыс. Эссенциале и милдронат не снижали чувствительность эритроцитов и нейтрофилов интактных крыс к действию тромбоцитов алкоголизированных животных (табл. 5).

При введении интактным крысам милдроната нейтрофилы приобретали резистентность, эритроциты сохраняли чувствительность к действию тромбоцитов алкоголизированных животных

Однонаправленность действия милдроната, рибоксина и эссенциале при введении в организм алкоголизированных животных и в культуральную среду, содержащую тромбоциты крыс получавших этанол, позволяет считать, что тромбоциты во взаимодействии с эритроцитами играют важную роль в развитии им-муносупрессии при длительном поступлении в организм этанола и в реализации иммуномодулирующего действия изученных препаратов

Таблица 5

Влияние эссенциале и рибоксина на иммуносупрессирующие свойства

тромбоцитов и эритроцитов

Клетки животных, получавших препараты Клетки животных, не получавшие препараты Эффект при алло-генном переносе

Тромбоциты крыс, получавших этанол и эссенциале Тромбоциты крыс, получавших этанол и рибоксин Тромбоциты крыс, получавших этанол и милдро-нат Тромбоциты крыс, получавших эссенциале Тромбоциты крыс, получавших рибоксин Тромбоциты крыс, получавших милдронат Эритроциты интактных крыс Эритроциты интактных крыс Эритроциты интактных крыс Тромбоциты крыс, получавших этанол Тромбоциты крыс, получавших этанол Тромбоциты крыс, получавших этанол Нет эффекта (АОК=2б,7±2,1, РМЛ=5,2±0,4) Супрессия (АОК=14,5±1,2, РМЛ=3,1±0,2) Супрессия (А0к=13,6±0,2, РМЛ=3,3±0,2) Супрессия (АОК=12,8±1,0, РМЛ=3,0±0,2) Нет эффекта (АОК=25,3±2,2, РМЛ=5,0±0,4) Супрессия (АОК=15,1±1,3, РМЛ=3,4±0,3)

ВЫВОДЫ

1 Однократное введение большой дозы (1,4 мл/100 г 20%-го раствора) или многократное введение малых доз этанола (0,3 мл/100 г 20%-го раствора в течение 30 дней) снижают функционально-метаболическую активность ней-трофилов периферической крови, угнетают развитие гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа, индуцируют появление иммуносупрессирующих свойств у легких эритроцитов

2 Введение крысам, однократно получавшим этанол, тиамина (1 мг/кг) или рибоксина (2 мг/кг) уменьшает выраженность изменений иммунометаболиче-ских параметров, а сочетанное введение препаратов (0,5 и 1 мг/кг, соответственно) нормализует величины показателей иммунометаболического статуса, тогда как раз-

дельное и совместное введение элькара (10 и 5 мг/кг) и биотина (5 и 2,5 мг/кг) не оказывают существенного влияния на нарушенные параметры иммуннометабо-лического статуса

3 Инъекции элькара (5 мг/кг) и биотина (2,5 мг/кг) крысам, многократно получавшим этанол, уменьшали выраженность изменений или нормализовали функционально-метаболическую активность нейтрофилов периферической крови, развитие гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа, отменяли иммуносупрессирующие свойства у легких эритроцитов, а введение тиамина (0,5 мг/кг) и рибоксина (1 мг/кг) оказывается малоэффективным

4 Появление иммуносупрессирующих свойств у легких эритроцитов после однократного введения больших доз этанола обусловлено изменениями структуры их мембран, а после многократного поступления этанола — связывающимися с их мембраной липопротеидами низкой плотности и глико-заминогликанами сыворотки

5. Введение алкоголизированным крысам милдроната (5 мг/кг) повышало функционально-метаболическую активность нейтрофилов периферической крови, иммунологическую реактивность и состояние мембраны гепатоцитов, а в сочетании с рибоксином (1 мг/кг) или эссенциале (2,5 мг/кг) милдронат (2,5 мг/кг) корригировал и нормализовал показатели иммунометаболического статуса

6 Тромбоциты алкоголизированных крыс in vitro снижали концентрацию макроэргических соединений и повышали содержание продуктов перекисного окисления в эритроцитах интактных крыс, индуцировали у этих клеток появление иммуносупрессирующей активности и угнетали функционально-метаболическую активность нейтрофилов периферической, что отменялось ингибитором циклооксигеназы - диклофенаком

7. Эссенциале (5 мг/кг), введенный алкоголизированным крысам, предотвращал появление у тромбоцитов свойства оказывать влияние на функцию эритроцитов и нейтрофилов Рибоксин (2 мг/кг) предотвращал индуцируемое этанолом появление иммуносупрессирующих свойств у эритроцитов интактных крыс после инкубации с тромбоцитами алкоголизированных животных. При введение интактным крысам милдроната (5 мг/кг) нейтрофилы приобретали резистентность к действию тромбоцитов алкоголизированных животных

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Рекомендовать клиническое апробирование сочетания препаратов тиамина и рибоксина для коррекции иммунометаболических нарушений, возникающих при однократном поступлении больших доз этанола

2. Апробировать в клинических условиях сочетание препаратов элькара с биотином, милдроната с рибоксином или с эссенциале с целью коррекции иммунометаболических нарушений, возникающих при многократном поступлении в организм малых доз этанола

3. Рекомендовать yi дубленное изучение в эксперименте молекулярных аспектов взаимодействия препаратов, регулирующих углеводный и липидный обмены, на уровне эритроцитов, тромбоцитов и гепатоцитов

4 Включить в учебный процесс медицинских вузов сведения об использовании препаратов - регуляторов энергетического обмена для коррекции иммунных и метаболических нарушений, возникающих при однократном и многократном поступлении в организм этанола

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Павлова, MB Изучение влияния липидной нагрузки на привыкание крыс к этанолу / М В Павлова // Материалы 66-й межвузовской науч конф студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы медицины и фармации» -Курск КГМУ, 2001 -С 43-44

2 Павлова, М В Активаторы углеводного и липидного обменов как модуляторы иммуномодулирующих эффектов этанола / М В Павлова // Материалы 68-й межвузовской науч конф студентов и молодых ученых - Курск КГМУ, 2003 -Ч I -С 42

3 Павлова, М В Метаболическая коррекция нарушений иммунологических функций, вызываемых этанолом / MB Павлова, ГН Рыжикова // Тез докл XI Рос нац конгр «Человек и лекарство» - М, 2004 - С 829

4 Павлова, М В Этанол как модулятор иммуностимулирующего действия гликолитических ферментов / М В Павлова, Г Н Рыжикова // Тез докл XI Рос нац конгр «Человек и лекарство» - М , 2004 - С 829

5 Павлова, М В Иммунометаболические эффекты, вызываемые бенфо-тиамином и рибоксином при алкогольной интоксикации / MB Павлова, Н А Быстрова // Материалы Всероссийской науч -практ конф, посвящ 120-летию ветеринарной службы Курской области - Курск, 2005 - С 276-280

6 Павлова, М В Роль эритроцитов в реализации иммунометаболических эффектов карнитина и биотина при алкогольной интоксикации / М В. Павлова, Н А Быстрова // Материалы II заочной электронной межвузовской науч конф «Проблемы иммунопатологии и иммунореабилитации». - Курск КГМУ, 2005 - С 40-42

7 Метаболическая иммуномодуляция, вызываемая карнитином и биоти-ном при однократном и многократном поступлении в организм этанола / М В Павлова, Н А Быстрова // Медико-биологические аспекты мультифакто-риальной патологии материалы Росс науч конф с международным участием -Курск КГМУ, 2006 -Т 2 -С 324-328

8. Павлова, М В. Иммунометаболическое действие карнитина и биотина при алкогольной интоксикации / М.В. Павлова, H.A. Быстрова // Вестник Уральской медицинской академической науки. - Екатеринбург, 2006. - № 3-12 (14). - С. 176-177.

9 Павлова, М В Иммунометаболические эффекты взаимодействия регуляторов липидного обмена при алкогольной интоксикации / М В Павлова, Н А Быстрова // Курский науч -практ вестн «Человек и его здоровье» -Курск, 2006 -№4 -С. 11-16

10 Павлова, М В Иммуномодулирующие эффекты, вызываемые регуляторами энергетического обмена в сочетании с милдронатом и эссенциале при алкогольной интоксикации / М В Павлова, В Ю Чердаков // Молодежная наука и современность 72-я итог межвузовская конф студентов и молодых ученых -Курск КГМУ, 2006 -Ч I -С 40-41

11. Иммунометаболические нарушения в условиях экспериментальной этанольной интокцикации / М.В. Павлова, И.Л. Бровкина, H.A. Быст-рова, В.П. Гаврилюк // Вестник новых медицинских технологии. — 2007. — Т. XIV, №2.-С. 9-11.

12. Павлова, М.В. Эффективность коррекции иммунометаболических расстройств бенфотиамином и рибоксином в условиях острой и хронической этанольной интоксикации / М.В. Павлова // Аллергология и иммунология. - 2007. - Т. 8, № 1. - С. 10.

Список сокращений

ААП - альфа-1-антипротеазы, мкмоль/л

АГП - ацилгидроперекиси, AD233 на 1 мл плазмы

АЛТ - аланинаминотрансфераза, ммоль/чхл

AMT - альфа-2-макроглобулины, мкмоль/л

АОК - антителообразующие клетки, 103/селезенку

ACT - аспартатаминотрансфераза, ммоль/чхл

АТФ - аденозинтрифосфат, мкмоль/мл эритроцитов

БФГ - 2,3-бисфосфоглицерат, мкмоль/мл эритроцитов

ГАГ - гликозаминогликаны, г/л

ГР — глутатионредуктаза, мкмоль/мл эритроцитов

ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа

ГИО - гуморальный иммунный ответ

ИАФ - индекс активности фагоцитов

ЛНП - липопротеиды низкой плотности, условные единицы ЛОНП - липопротеиды очень низкой плотности, условные единицы МДА - малоновый диальдегид, мкмоль/л HCT - тест восстановления нитросинего тетразолия, % НСТ-сп - спонтанный тест восстановления нитросинего тетразолия, % НСТ-стим - стимулированный тест восстановления нитросинего тетразолия, %

ОРН - окислительный резерв нейтрофилов, % ПОЛ - перекисное окисление липидов ПЯЛ - полиморфноядерные лейкоциты PK Л - разница кариоцитов лимфоузлов, 106

РМЛ - разница массы регионарного и контрлатерального лимфоузлов, мг

СОД - супероксиддисмутаза, ЕД/мл эритроцитов

ФИ - фагоцитарный индекс, %

ФМА - функционально-метаболическая активность

ФРН - функциональный резерв нейтрофилов, %

ФЧ - фагоцитарное число

ЩФ - щелочная фосфатаза, ммоль/чхл

ЭБ - эритроциты барана

Лицензия ЛР № 020862 от 30 04 99 г Сдано в набор 01 10 2007 г Подписано в печать 03 10 2007 г Формат 30x42'/g Бумага офсетная Гарнитура Times New Rom Печать офсетная Уел печ л 1,0 Тираж 100 экз Заказ № 11А Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г Курск, ул К Маркса, 3

Актуальность проблемы. Изучение аддиктивных состояний выявили нарушения взаимодействия нейромедиаторных, нейроэндокринных, биохимических и иммунологических процессов организма, позволили установить, что иммунная система и механизмы психонейроиммуномодуляции участвуют в формировании основных синдромов алкоголизма (Анохина И.П. и др., 1998; Семке В.Я. и др., 2003). Как показывают исследования, проведенные другими авторами, вторичная иммунная недостаточность, снижение защитных иммунных механизмов, присоединение на этом фоне соматической патологии и асте-низация организма являются ведущими в механизмах формирования терапевтической резистентности при алкоголизме и срыва ремиссий в процессе терапии сформировавшейся зависимости (Бохан Н.А. и др., 2001).

Этанол — вещество, сочетающее в себе свойства медицинского препарата, естественного метаболита организма, токсического ксенобиотика, пищевого продукта и алиментарного фактора, избыточное поступление которого нарушает метаболические процессы и физиологические функции. После кратковременной алкогольной интоксикации имеет место угнетение генерации макроэр-гических соединений в эритроцитах, приводящее к нарушению двойного фос-фолипидного слоя мембраны клеток и интегрированных в них белков (Бохан Н.А., Прокопьева В.Д., 2004).

При длительном поступлении этанола в организм дезорганизуется метаболизм в гепатоцитах, которые вместе с эритроцитами образуют функциональную систему метаболической регуляции иммунологических процессов (Прокопенко Л.Г. и др., 2003; Лазарева Г.А. и др., 2006). Ослабление функции этой системы может быть одной из основных причин возникновения иммунодефицита при алкогольной интоксикации.

Поэтому изучение влияния этанола на показатели иммунного гомеостаза и поиск фармакологических средств коррекции выявленных нарушений в уеловиях эксперимента является актуальным и перспективным направлением. Про-тективный эффект при токсических поражениях достигается применением лекарственных препаратов, обладающих антиоксидантной активностью (Лазарева Г.А. и др., 2006). Не ясно, может ли быть достигнут такой эффект в условиях этанольной интоксикации введением препаратов, объединенных в группу регуляторов энергетического обмена, влияющих на углеводный и липидный обмены (Прокопенко Л.Г. и др., 2000).

Цель работы: оценить иммунометаболические эффекты препаратов, регулирующих углеводный и липидный обмен, у животных в условиях алкогольной интоксикации.

Задачи исследования:

1. Установить особенности нарушений иммунного и антиоксидантного г статусов и функции гепатоцитов в условиях однократного и многократного поступления этанола.

2. Изучить иммунометаболические эффекты тиамина и рибоксина при однократном и многократном поступлении этанола.

3. Определить иммунометаболические эффекты биотина и элькара в условиях одно- и многократного поступления этанола.

4. Оценить эффективность применения милдроната и эссенциале в коррекции иммунометаболических нарушениях при алкогольной интоксикации.

5. Установить роль тромбоцитов и эритроцитов в реализации иммуномо-дулирующего действия препаратов, регулирующих энергетический обмен в условиях однократного и многократного поступления этанола.

Научная новизна.

Установлены особенности нарушений иммунологической реактивности, функционально-метаболической активности нейтрофилов периферической крови, процессов перекисного окисления липидов, активности каталазы и функции гепатоцитов и эритроцитов в условиях одно- и многократного поступления этанола. Выявлена иммунокорригирующая эффективность применения препаратов, регулирующих углеводный и липидный обмены, при однократном и многократном поступлении в организм этанола. Выявлена взаимосвязь гепатоци-тов, эритроцитов и тромбоцитов в развитии иммуносупрессии при поступлении этанола и реализации иммуномодулирующего действия препаратов, регулирующих энергетический обмен. Выявлена взаимосвязь метаболических и иммунологических эффектов, вызываемых препаратами, регулирующими энергетический обмен, в условиях одно- многократного поступления этанола.

Практическая значимость.

Экспериментально обоснована целесообразность клинического изучения использования сочетанного применения тиамина и рибоксина для коррекции иммунометаболических нарушений, возникающих при однократном поступлении этанола, и сочетаний элькара и биотина, милдроната с рибоксином или эс-сенциале при многократном введении этанола.

Обоснована перспективность изучения тромбоцитарноэритроцитарного механизма иммуносупрессии и воздействия лекарственных препаратов в регуляции иммунологических функций при алкогольной интоксикации.

Показана целесообразность изучения в клинике взаимосвязи между им-муномодулирующим и гепатопротекторным эффектами препаратов, регулирующих процессы энергообеспечения клеток, при алкогольной интоксикации.

Материалы диссертации включены в учебные рабочие программы и используются в лекционных курсах и на практических занятиях ряда кафедр Курского, Российского, Воронежского государственных медицинских университетов и академий и медицинских факультетов Белгородского и Орловского государственных университетов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. В условиях одно- или многократного поступления этанола имеют место нарушения различных звеньев иммунитета.

2. В условиях однократного поступления этанола регуляторы углеводного обмена (тиамин и рибоксин) нормализуют иммунометаболический статус.

3. Применение регуляторов липидного обмена (элькара и биотина) при многократном поступлении этанола корригируют и нормализуют нарушенные параметры иммунного и метаболического статусов.

4. Появление иммуносупрессирующих свойств у легких эритроцитов при однократном поступлении этанола вызваны изменениями структуры их мембран, а при многократном поступлении этанола - связывающимися с их мембраной липопротеидами низкой плотности и гликозаминогликанами сыворотки.

5. Тромбоциты играют важную роль в развитии иммуносупрессии при многократном поступлении в организм этанола и участвуют в реализации им-муномодулирующего действия препаратов, регулирующих энергетический обмен.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на научных конференциях Курского государственного медицинского университета и Центрально-Черноземного научного центра РАМН (2005, 2006), Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004), Российской научной конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2006), V Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии, V Европейском конгрессе по астме (Москва, 2007) и совместном заседании кафедр фармакологии, фармацевтической, токсикологической и аналитической химии, микробиологии, биологической химии Курского государственного медицинского университета (2007).

Публикации. По материалам диссертации в центральной и местной печати опубликовано 12 работ, в том числе 3 - в рекомендуемых изданиях ВАК РФ. Опубликованные материалы содержат полный объем информации, касающейся темы диссертации.

выводы

1. Однократное введение большой дозы (1,4 мл/100 г 20%-го раствора) или многократное введение малых доз этанола (0,3 мл/100 г 20%-го раствора в течение 30 дней) снижают функционально-метаболическую активность ней-трофилов периферической крови, угнетают развитие гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа, индуцируют появление иммуносупрессирующих свойств у лёгких эритроцитов.

2. Введение крысам, однократно получавшим этанол, тиамина (1 мг/кг) или рибоксина (2 мг/кг) уменьшает выраженность изменений иммунометаболиче-ских параметров, а сочетанное введение препаратов (0,5 и 1 мг/кг, соответственно) нормализует величины показателей иммунометаболического статуса, тогда как раздельное и совместное введение элькара (10 и 5 мг/кг) и биотина (5 и 2,5 мг/кг) не оказывают существенного влияния на нарушенные параметры иммуннометабо-лического статуса.

3. Инъекции элькара (5 мг/кг) и биотина (2,5 мг/кг) крысам, многократно получавшим этанол, уменьшали выраженность изменений или нормализовали функционально-метаболическую активность нейтрофилов периферической крови, развитие гуморального иммунного ответа и гиперчувствительности замедленного типа, отменяли иммуносупрессирующие свойства у легких эритроцитов, а введение тиамина (0,5 мг/кг) и рибоксина (1 мг/кг) оказывается малоэффективным.

4. Появление иммуносупрессирующих свойств у легких эритроцитов после однократного введения больших доз этанола обусловлено изменениями структуры их мембран, а после многократного поступления этанола — связывающимися с их мембраной липопротеидами низкой плотности и глико-заминогликанами сыворотки.

5. Введение алкоголизированным крысам милдроната (5 мг/кг) повышало функционально-метаболическую активность нейтрофилов периферической крови, иммунологическую реактивность и состояние мембраны гепатоцитов, а в сочетании с рибоксином (1 мг/кг) или эссенциале (2,5 мг/кг) милдронат (2,5 мг/кг) корригировал и нормализовал показатели иммунометаболического статуса.

6. Тромбоциты алкоголизированных крыс in vitro снижали концентрацию макроэргических соединений и повышали содержание продуктов перекисного окисления в эритроцитах интактных крыс, индуцировали у этих клеток появление иммуносупрессирующей активности и угнетали функционально-метаболическую активность нейтрофилов периферической, что отменялось ингибитором циклооксигеназы - диклофенаком.

7. Эссенциале (5 мг/кг), введенный алкоголизированным крысам, предотвращал появление у тромбоцитов свойства оказывать влияние на функцию эритроцитов и нейтрофилов. Рибоксин (2 мг/кг) предотвращал индуцируемое этанолом появление иммуносупрессирующих свойств у эритроцитов интактных крыс после инкубации с тромбоцитами алкоголизированных животных. При введение интактным крысам милдроната (5 мг/кг) нейтрофилы приобретали резистентность к действию тромбоцитов алкоголизированных животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендовать клиническое апробирование сочетания препаратов тиамина и рибоксина для коррекции иммунометаболических нарушений, возникающих при однократном поступлении больших доз этанола.

2. Апробировать в клинических условиях сочетание препаратов элькара с биотином, милдроната с рибоксином или с эссенциале с целью коррекции иммунометаболических нарушений, возникающих при многократном поступлении в организм малых доз этанола.

3. Рекомендовать углубленное изучение в эксперименте молекулярных аспектов взаимодействия препаратов, регулирующих углеводный и липидный обмены, на уровне эритроцитов, тромбоцитов и гепатоцитов.

4. Включить в учебный процесс медицинских вузов сведения об использовании препаратов — регуляторов энергетического обмена для коррекции иммунных и метаболических нарушений, возникающих при однократном и многократном поступлении в организм этанола.