Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Иммунологический мониторинг пациентов после трансплантации печени

На правах рукописи

НИКУЛИНА ВАЛЕНТИНА ПЕТРОВНА

Иммунологический мониторинг пациентов после трансплантации печени

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 ОКТ 2014

Москва - 2014

005552835

Работа выполнена в Государственном бюджетном учреждении здравоохранения города Москвы «Научно-исследовательский институт скорой помощи им. Н.В. Склифосовского Департамента здравоохранения г. Москвы»

Научный руководитель

доктор медицинских наук

Годков

Михаил Андреевич

Официальный оппонент:

доктор медицинских наук, профессор, руководитель отдела медицинской биотехнологии ФГБУ «ГНЦ институт иммунологии ФМБА России

Атауллаханов Равшан Иноятович

Официальный оппонент:

доктор биологических наук, профессор, руководитель лаборатории естественного иммунитета ФГБУ «Научно - исследовательский

Пронин

Александр Васильевич

институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России

Ведущая организация:

ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им.В.И. Шумакова» Минздрава России»

Защита диссертации состоится «23» октября 2014 года в12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им.И.И. Мечникова» РАМН по адресу: 105064, г. Москва пер. Малый Казенный, д.5А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБУ «НИИ вакцин и сывороток им.И.И. Мечникова» РАМН, www.instmech.ru

Автореферат разослан « » сентября 2014 года

Ученый секретарь диссертационного совета к. б.н.

Яковлева И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

В современном мире все большее распространение получает проведение трансплантации органов пациентам в терминальной стадии заболеваний жизненно важных органов - сердца, печени, почек и т.д. Накоплен большой опыт по трансплантации органов, созданы фармакологические препараты для проведения эффективной иммуносупрессивной терапии, совершенствуются схемы и методы иммуносупрессии. Однако остаются нерешенными проблемы ранней диагностики острого клеточного отторжения, дифференциальной диагностики клеточного отторжения и воспалительных процессов бактериальной и вирусной природы. Изменения клинико-биохимических показателей не являются ранними и специфическими маркерами клеточного отторжения трансплантата и воспаления инфекционной природы. Пункционная тонко-игольная биопсия, считающаяся в настоящее время «золотым стандартом», в силу своей инвазивности может привести к осложнениям, также возможны расхождения гистологической картины с клинико - лабораторными данными [М.Ш. Хубутия, В.И. Шумаков 2005, C.B. Арзуманов 2008]. В связи с вышеизложенным поиск молекулярных маркеров иммунологического конфликта является приоритетным направлением в трансплантационной иммунологии с 80-х годов XX века [G. Kohler, С. Milstein, 1975].

Воспаление является общебиологическим процессом, имеющим гомео-статический характер, которое направлено на поддержание постоянства внутренней среды организма [В.В. Серов 1995]. Следовательно, активация иммунокомпетентных клеток в ответ на внедрение чужеродного антигена является нормальным физиологическим процессом, направленным на сохранение и поддержание внутреннего гомеостаза организма. Выраженность иммунного ответа (воспалительной реакции) и пролиферация иммунокомпетентных клеток, участвующих в воспалении, зависит от особенностей антигена и состояния иммунной системы организма. На современном этапе изучения механизмов формирования иммунного ответа известно, что при вне-

з

дрении в организм человека антигенов различной природы (вирусных, бактериальных, аллоантигенов), в пролиферацию вступают и выполняют эффек-торную функцию разные клоны иммунокомпетентных клеток [A.L. Taylor 2004, A. Nel 2004, D. Golshan 2007, M.B. Пащенков., Б.В. Пинегин 2010, A.A. Ярилин 2010].

Активация иммунных процессов в организме в ответ на пересадку ал-логенного органа развивается с первых минут после трансплантации. Наиболее значительные изменения в иммунной системе реципиента происходят в первые 2-3 недели после трансплантации [J.Y. Niederkorn 2006]. Иммунный ответ на аллоантигены значительно превышает ответ на вирусные и бактериальные антигены [Ц.В. Казанский 2005, D. Golshan 2007]. В силу этого, анализ динамики иммунокомпетентных клеток реципиента в ранние сроки после трансплантации может быть информативным для определения этапов формирования посттрансплантационного иммунитета, развития процессов отторжения или иммунного ответа на инфекцию и способствовать ранней ма-лоинвазивной диагностике и проведению дифференциальной диагностики осложнений различной природы.

Однако в настоящее время нет единой точки зрения на клиническое значение изменений отдельных иммунологических показателей периферической крови при формировании воспалительных процессов инфекционной природы и при отторжении трансплантата. В доступной литературе нами не найдены сведения о необходимом объеме лабораторных исследований, не определено диагностическое значение иммунологических исследований, отсутствуют данные об оптимальных сроках обследования пациентов после трансплантации печени (ТП). Поиск ответов на указанные вопросы определил цель и задачи нашей работы.

Цель исследования

Оптимизация диагностики ранних послеоперационных осложнений различной этиологии (инфекционно-воспалительного процесса и острого клеточного отторжения) на основании мониторинга иммунологических показателей в ранний период после трансплантации печени.

Задачи исследования:

1. На основании ежедневного мониторинга иммунологических показателей определить этапы формирования посттрансплантационного иммунного ответа у пациентов в ранние сроки после трансплантации печени.

2. Оценить выраженность и направленность иммунного ответа у пациентов с неосложненным течением послеоперационного периода, а также с воспалительными процессами различной этиологии (острым клеточным отторжением и инфекционными осложнениями бактериальной или вирусной природы).

3. Выявить прогностически и диагностически значимые иммунологические маркеры острого клеточного отторжения и воспалительных процессов различной этиологии; установить динамику изменений иммунологических маркеров в указанный период.

4. Разработать и апробировать алгоритм дифференциальной диагностики воспалительных процессов различной этиологии в первые две недели после трансплантации печени.

Научная новизна работы

Впервые проведен мониторинг основных популяций лимфоцитов, уровня иммуноглобулинов А, М, в, поглотительной активности и кислородного метаболизма нейтрофилов у пациентов в ранние сроки после ТП, позволивший проанализировать этапы формирования посттрансплантационного иммунитета.

Установлено, что наиболее информативными сроками для оценки формирования посттрансплантационного иммунитета являются 2, 5, 12 и 14 сутки после ТП.

Впервые определена клинико-диагностическая значимость изменений иммунологических показателей у пациентов с различным течением раннего периода после ТП.

Определены изменения анализируемых иммунологических показателей у пациентов с неосложненным течением раннего периода после ТП, соответствующие адекватному иммунному ответу («норме патологии») организма на операцию.

Установлено, что уже на 2 сутки после ТП анализ динамики количества лейкоцитов, нейтрофилов, абсолютного содержания С08+лимфоцитов и уровня ИРИ (С04+/С08+) позволяет оценить силу иммунного ответа на трансплантацию аллогенного органа и прогнозировать возможные осложнения.

Показаны статистически достоверные различия в иммунологических показателях у пациентов с инфекционными осложнениями различной природы и острым клеточным отторжением, что позволяет проводить дифференциальную диагностику инфекционных осложнений в первые 2 недели после ТП в78-86% случаев, а острое клеточное отторжение в 75% случаев.

Практическая значимость работы

Сформулированы принципы оценки иммунологических показателей и сроки проведения исследований после ТП, которые позволяют прогнозировать возможные осложнения различного генеза.

Комплекс иммунологических тестов, используемых в мониторинге, позволяет оценить индивидуальный иммунный ответ на трансплантацию аллогенного органа и проводимую иммуносупрессивную терапию, и, при необходимости, корректировать иммуносупрессивную нагрузку на организм реципиента.

Разработанный диагностический алгоритм дает возможность с помощью малоинвазивного анализа крови провести дифференциальную диагностику осложнений инфекционной природы и/или острого клеточного отторжения в ранние сроки после ТП и сократить время до начала этиотропной терапии.

Основные положения, выносимые на защиту

Проведен анализ результатов иммунологического мониторинга периферической крови пациентов в первые 2 недели после ТП, определены этапы формирования посттрансплантационного иммунитета и диагностически значимые сроки иммунологического обследования - 2, 5, 12, и 14,сутки после трансплантации печени.

Выявлены разнонаправленные изменения анализируемых иммунологических показателей при воспалительных процессах различного генеза, которые уже на 2 сутки после ТП позволяют выделить пациентов с высоким риском бактериальных осложнений, активации вирусной инфекции или острым клеточным отторжением.

Предложен комплекс диагностически значимых иммунологических показателей, анализ которых помогает проводить дифференциальную диагностику острого клеточного отторжения, воспалительных процессов вирусной или бактериальной природы.

Сформулирован и апробирован диагностический алгоритм, позволяющий в ранние сроки после ТП прогнозировать риск развития осложнений и проводить дифференциальную диагностику воспалительных процессов различного генеза.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на 1-й конференции Межрегиональной общественной организации «Общество трансплантологов» (Москва. 2009 г.); городском семинаре «Современные лабораторные технологии в диагностике неотложных состояний» (Москва, 2010 г.); VI Всероссийском съезде трансплантологов (Москва, 2012г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 научных работ, в том числе 3 статьи и 3 тезисов в журналах, входящих в перечень периодических изданий, рекомендуемых ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 159 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственно исследований, выводов, списка цитируемой литературы, включающей 112 источников, в том числе 86 иностранных. Работа иллюстрирована 35 рисунками и 8 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Характеристика групп пациентов: В работе использованы клинические данные и результаты лабораторного обследования 112 пациентов с циррозом печени различной этиологии, которым за период с 2005 по 2011год включительно проведена ТП в НИИ СП им. Н.В. Склифосовского. Среди обследованных - 43 женщины (38,4%) и 69 мужчин (61,6%) в возрасте от 16 до 68 лет. Причиной цирроза печени у 68 (61,3%) пациентов являлся активный вирусный гепатит. Тяжесть цирроза печени оценивали по шкале СЫУ-Р^И класс В и С (8-10 баллов). Всем пациентам с первых часов после ТП проводилась иммуносупрессивная терапия: 3- х компонентная схема включала ингибитор кальциневрина (сандиммун-неорал или циклоспорин А), преднизо-лон, препараты микофеноловой кислоты (майфортик или МФМ). В 4- х компонентную схему иммуносупрессии дополнительно включали препарат мо-ноклональных антител к СБ25 (даклизумаб или симулект).

В зависимости от течения послеоперационного периода, наличия осложнений и природы инфекционного агента, пациенты разделены на четыре группы. Характеристика групп пациентов, включая этиологию цирроза и проводимую иммуносупрессивную терапию, представлена в таблице 1.

Таблица 1. Клиническая характеристика обследованных пациентов.

О Контрольная группа (п=28) Без осложнений 1 группа (п=60) Бактериальные осложнения 2 группа (п—16) Вирусные осложнения 3 группа (п=8) Острое клеточное отторжение (ОКО) Р

Пол, м/ж 13/15 20/40 7/9 5/3 >0,05

Возраст при ТП, лет (М±а) 46,6 ±13,7 46,2 ± 11,8 44,1±12,3 40,9 ± 14,5 >0,05

Этиология цирроза Вирусная - 14 Аутоиммунный гепатит- 2 Первиный склерозирующий холангит- 1 Первичный билиарный цирроз -6 Б-нь Вильсона-Коновалова - 2 Алкогольная - 3 Вирусная - 37 Аутоиммунный гепатит- 2, Первичный склерозирующий холангит - 2, Первичный билиарный цирроз- 8 Б-нь Вильсона-Коновалова - 3 Алкогольная - 5 Криптогенная - 2 Гепатоцеллюлярный рак- 1 Синдром Бадда-Киари-1 Вирусная- 12 Б-нь Вильсона-Коновалова- 1 Криптогенная -2 Гепатоцеллюлярный рак -1 Зирусная - 6 Б-нь Вильсона -Коновалова - 1 Аутоиммунный гепатит - 1 >0,05

Иммуносупрес сивная терапия 3-х компонент.-16 4-х компонент.-12 3-х компонент.-38 4-х компонент.-22 3-х компонент.-12 4-х компонент.-4 3-х компонент.-5 4-х компонент.-З >0,05

Контрольную группу составили 28 реципиентов печени (15 мужчин и 13 женщин, возраст от 22 до 67 лет) с неосложненным течением раннего послеоперационного периода.

В группу пациентов с бактериальными осложнениями (1гр.) были включены 60 пациентов (20 женщин и 40 мужчин в возрасте от 16 до 68 лет) с гнойно-септическими воспалительными процессами, установленными на основании клинические данных и результатов бактериологического исследования (если возможно было получить материал для посева). Сроки появления бактериальных осложнений 10±2 сутки после ТП.

Группу с вирусной инфекцией (2 гр.) составили 16 пациентов (7 женщин и 9 мужчин в возрасте от 23 до 56 лет). При проведении ПЦР активная репликация вирусов семейства Herpesviridae выявлена у 5 пациентов: у 4-цитомегаловирус (CMV), у 1- Эпштейн - Барр вирус (EBV). У 4 пациентов с вирусом простого герпеса (HSV) диагноз устанавливали на основании клинической картины и результатов ИФА.

Активная репликация вируса гепатита С обнаружена у 5 пациентов и по результатам ПЦР составила 107-108 ME/мл. При проведении ИФА на наличие маркеров гепатита В у 2 пациентов обнаружены AT к HBsAg (более 200 U/lm).

В группу пациентов с острым клеточным отторжением (3 гр.) включены 8 пациентов (3 женщины и 5 мужчин в возрасте от 26 до 63 лет). Диагноз острого клеточного отторжения трансплантата (ОКО) установлен на основании клинической картины, результатов лабораторных исследований и подтвержден данными биопсии (5-9 баллов по Banff), за исключение одной пациентки, у которой биопсия не проводилась в связи с высоким риском кровотечения.

Методы обследования

Лабораторный мониторинг, включающий анализ биохимических, гематологических, иммунологических показателей, а так же показатели гемостаза, проводили ежедневно в течение 2 недель после ТП (табл.2),

В последующем исследования повторяли через 2-3 дня, в зависимости от клинического состояния пациента и/или необходимости проведения дополнительного обследования. Диагностику инфекций (ПЦР и ИФА) и бактериологический анализ биологических жидкостей (крови, мочи, мокроты, материала из ран) производили по показаниям. Иммунологический мониторинг включал:

Иммунофенотипирование лимфоцитов с определением относительного содержания CD3+, CD4+, CD8+, CD3"CD16+CD56+, CD19 популяций лимфоцитов в периферической крови методом проточной цитофлюоримет-рии. При проведении исследований использовали коммерческий набор моно-клональных антител (МКАТ) для четырехпараметрического анализа, включающий антитела (AT) для выделения лейкоцитарного пула - CD45, общего маркера Т-лимфоцитов - CD3+, лимфоцитов CD4+, цитотоксических CD8+ лимфоцитов, натуральных киллерных клеток CD3-CD16+CD56+, В лимфоцитов - CDI9+. В качестве негативного контроля использовали коммерческие сыворотки, содержащие изотипические антимышинные Ig конъюгированные с теми же флюорохромами (PerCP, FITC, АРС, РЕ). Для цитометрического анализа использовали программу MultiTest (Becton Dickinson, США).

Фенотипирование проводили на цитофлюориметре FACS Calibur с использованием МКАТ фирмы Becton Dickinson (США). После подсчета абсолютного количества лейкоцитов и лимфоцитов на гематологическом анализаторе, рассчитывали абсолютное число CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, CD3" CD16+CD56+ лимфоцитов (кл/мкл) и соотношение CD4+/CD8+ (ИРИ).

Фагоцитарную активность (ФА) и кислородный метаболизм нен-трофилов оценивали по поглотительной способности (латекс-тест) и мета-

болической активности (НСТ-тест спонтанный и индуцированный). Для исследования использовали венозную кровь пациента (Т.К. Бумагина, 1981г.).

Таблица 2. Схема лабораторного мониторинга пациентов в первые 2 недели после трансплантации печени

Вид исследования Сроки

1. Клинический анализ крови: количество лейкоцитов, тромбоцитов, лейкоцитарная формула, гемоглобин, гема-токрит о

2. Биохимический анализ крови: общ. белок, альбумин, глобулины, преальбумин, креатинин, мочевина, глюкоза, амилаза, ACT, АЛТ, ГГТП, ЩФ, К +, Na+, Са+, Mg+ я я о X ч и s

3. Исследование гемостаза: АЧТВ, MHO, ПДФ, антитромбин III, фибриноген, тромбиновое время, агрегация тромбоцитов, протеин С О

4.Иммунологический мониторинг

5. Определение концентрации иммуносупрессивного препарата 3 раза в неделю

6. Определение маркеров воспаления: СРБ и ПКТ

7. Диагностика инфекций HCV, HBV, CMV, EBV по показаниям

Гуморальное звено иммунной системы оценивали по концентрации в сыворотки крови иммуноглобулинов трех классов A, M, G. Исследование проводили с помощью нефелометра BN Prospec (Dade Behring, США).

Методы статистического анализа: Для проведения статистического анализа использовали программу Microsoft Office Exell 2007 и Graph Pad Prism 5 (версия 2007, США). С помощью программ рассчитывали значение средней величины (М), ошибку средней (m), стандартного отклонения (а), медиану, величину интерквартильного размаха (25 и 75%„). При проведении непараметрического анализа достоверность различий сравниваемых групп пациентов определяли с помощью критерия Манна-Уитни. При р<0,05 различия считали достоверно значимыми. Для оценки диагностической значимости, чувствительности и специфичности иммунологических маркеров использовали ROC- анализ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Мониторинг количества, состава и функции иммунокомпетентных клеток периферической крови пациентов в первые 2 недели после ТП

Анализ динамики иммунологических показателей, отражающих изменения популяций иммунокомпетентных клеток в период формирования иммунного ответа, выявил ключевые сроки (2, 5, 12, 14 сутки), в которые происходят важные процессы, приводящие к статистически достоверным изменениям количества и функциональной активности иммунокомпетентных клеток пациентов анализируемых групп. Полученные данные сравнивали с показателями в контрольной группе и с референтными значениями (Хаитов Р.В., Пинегин Б.В., 2001г.)

Анализ ежедневного мониторинга (15 суток) после ТП показал, что изменения количества иммунокомпетентных клеток и их активности зависят от: - этапов формирования посттрансплантационного иммунитета, происходящих в определенные временные интервалы после ТП;

- степени участия отдельных звеньев иммунной системы реципиента в иммунном ответе на различные АГ при формировании посттрансплантационного иммунитета;

- индивидуальных (генетических) особенностей иммунной системы реципиента.

У пациентов контрольной группы ответ иммунной системы на ТП и проводимую иммуносупрессию проявлялся в активации иммунологических механизмов, способствующих поддержанию иммунного гомеостаза. В эти сутки у пациентов контрольной группы зарегистрировано увеличение количества лейкоцитов, нейтрофилов, активности нейтрофилов в спонтанном НСТ-тесте (спНСТ-тест), снижение уровня ИРИ и количества С04+ и СБ8+ лимфоцитов, 1ЧК клеток, уровня иммуноглобулинов классов А, М (табл.3).

Наиболее выраженные изменения регистрируемых показателей у пациентов контрольной группы происходили в первую неделю после ТП и начала

13

иммуносупрессивной терапии. Со второй недели после ТП показатели изменялись в пределах референтных значений, за исключением С04+, СЭ8+ лимфоцитов и ЫК клеток, число которых было достоверно ниже референтных значений, что обусловлено направленной иммуносупрессивной терапией (табл.3).

Таблица 3.Динамика иммунологических показателей у пациентов контрольной группы в указанные сутки после ТП

Показатели (М± о) Сутки после ТП Рефер. интервал

2 5 12 14

Лейкоциты кл/мкл 7874,7± 3594,2 5425,6± 2782,2 9860,5±* 4511,6 7273± 2633,3 6500±2500

Нейтрофилы (кл/мкл) 7467,9±* 3078,4 4771,8± 2649,0 8554±* 4054,1 5921,5± 2421,9 3900±1900

CD4+(KJI/miüi) 140,5±102,7* 144,3±108,4* 489,8±227,* 551,5±238,1* 1008±453

CDS* (кл/мкл) 97,6±50,2* 78,5±54,1* 237,5±140,1* 250,5±121,9* 675±341

ИРИ (CD4/CD8) 1,4±0,5 1,9±1,0 2,1±0,5 2,3±0,7 1,9±0,4

ЫК(кл/мкл) 36,4±20,2* 41,7±24,3* 86,2±43,8* 65,4±43,6* 340±185

CD19(IOI/MK) 117,8±79,6* 256,3±128,9* 364,4±176,6 324,9± 189,6 375±295

спНСТ (%) 23±10,2* 15±4,4 14,1±4,5 16,2±5,8 10,0±5,0

IgA (г/л) 1,6±0,6 1,5±0,4 1,6±0,6 1,8±0,5 2,1 ±0,4

IgM (г/л) 1,2±0,5 1,3±1,2 2,8±0,6* 1,9±0,9 1,6±0,5

*р<0,05 в сравнении со средним значением референтного интервала

Описанные изменения у пациентов контрольной группы приняты нами за адекватный иммунный ответ иммунной системы на операционную травму, пересадку чужеродного органа, проводимую иммуносупрессию, и соответствовали «норме патологии» (Патент № 2314532 от 10.01.2008г.). 2. Анализ диагностически значимых иммунологических показателей у пациентов с осложнениями бактериальной природы

Результаты иммунологического мониторинга пациентов с бактериальными осложнениями (1 гр.) в период формирования осложнений (10±2 сутки после ТП) сравнивали с результатами пациентов контрольной группы, полученные в те же сроки.

При проведении статистического анализа выявлены достоверные различия между группами по количеству лейкоцитов и нейтрофилов (табл.4).

Таблица 4. Результаты анализа иммунологических показателей пациентов с бактериальными осложнениями

Показатели Контрольная группа Пациенты с бак. осложнениями (1 гр.) Р

Срлнач. <М) Медиана; 25 и75%0 Срлнач. (М) Медиана; 25 и75%0

Лейкоциты (кл/мкл) 6384,2 5580 4990;7580 11652,6 11293; 6925;14915 0,0172

Нейтрофилы (кл/мкл) 5411,3 4976; 3870;5830 11497,2 11010; 7050;13850 0,0245

спНСТ-тест (%) 13,6 14,0; 10,0; 19,0 17,0 16,0; 8,0; 25,0 0,3004

ИРИ (CD4/ CD8) 2,1 2,0; 1,6; 2,5 2,5 2,4; 1,7; 3,2 0,5981

CD8+ лимфоциты (кл/мкл) 114,6 111,0; 86,0;137,0 110,8 76,0; 40,0; 141,0 0,1926

По результатам 1ЮС- анализа площадь под кривой (А1ЛС) для нейтрофилов составила 0,87, для лейкоцитов -АиС=0,71, что соответствует хорошей диагностической значимости этих показателей. Чувствительность и специфичность показателей представлена в таблице 5. Показатель ИРИ (А11С =0,67) и спНСТ-тест (АиС=0,5) имели удовлетворительную и низкую диагностическую значимость, соответственно.

Таблица 5. Диагностическая значимость иммунологических показателей пациентов с бактериальными осложнениями (ЯОС-анализ)

Показатели Лейкоциты Нейтрофилы ИРИ

АиС 0,71 0,87 0,67

Чувствительность (%) 72,5 81 81

Специфичность (%) 60 70 27

При пороговом значении >7430 кл/мкл >5844 кл/мкл >1,7

У 65,7% пациентов с бактериальными осложнениями на 2 сутки после

ТП были выявлены изменения показателей, вошедших в диагностический

комплекс. В период клинических проявлений бактериального воспаления (на

15

10±2 сутки после ТП) диагностически значимые изменения указанных показателей определялись у 78% пациентов этой группы, У 22% пациентов содержание нейтрофилов и ИРИ регистрировалось в пределах референтных значений. Количество СП8+ и В-лимфоцитов, а также ЫК- клеток у пациентов 1 гр. было сопоставимо по значениям с показателями в контрольной группе.

Таким образом, для пациентов с бактериальными осложнениями высокое диагностическое значение имели увеличение количества лейкоцитов и нейтрофилов относительно значений в контрольной группе. Чувствительность ИРИ составила 81%, специфичность - 27%, что соответствует удовлетворительному диагностическому значению, и при проведении дифференциальной диагностики целесообразно учитывать. Указанные показатели составили диагностический комплекс для пациентов с бактериальными осложнениями.

3. Анализ диагностически значимых иммунологических показателей у пациентов с осложнениями вирусной природы

Проведен сравнительный анализ иммунологического мониторинга пациентов с вирусными осложнениями (2 гр.) в ранний период после ТП и пациентов контрольной группы, у которых не было осложнений в аналогичные сроки (табл. 6).

Анализ показал значительное снижение в периферической крови количества иммунокомпетентных клеток у пациентов 2 гр. в сравнении с контрольной группой. Отмечали лейко - и нейтропению, что характерно для пациентов с активной вирусной инфекцией.

Выявлено достоверно большее количество С08+лимфоцитов у пациентов с реактивацией вирусного гепатита В или С (РВГ) (р <0,05 ) в сравнении с пациентами контрольной группой и пациентами с вирусной инфекцией, вызванной вирусами семейства НегреБУМсЬе (ГВИ). ИРИ у пациентов с РВГ снижался до 1,0 и ниже (р <0,05 ) У пациентов с ГВИ отмечено снижение абсолютного содержания СБ8+ лимфоцитов в сравнении с контрольной группой

16

и с пациентами с РВГ (р <0,05 ), что доказывает высокую диагностическую

значимость этого показателя при проведении дифференциальной диагностики

вирусной инфекции, вызванной вирусами разных семейств.

Таблица 6. Результаты анализа иммунологических показателей пациентов с вирусными осложнениями

Показатели Контрольная группа Пациенты с вирусной инфекцией (2 гр.) Р

Ср.знач. (М) Медиана, 25 и 75%о Ср.знач. (М) Медиана 25 и 75%0

Лейкоциты (кл/мкл) 6384,2 5580,0 4990Д7580 3183,2 3190,0; 2333,0; 4005,0 0,0001

Нейтрофилы (кл/мкл) 5411,3 4976; 3870;5830 2463,2 2495,0; 1793,0;2908,0 0,0003

спНСТ-тест (%) 13,6 14,0; 10,0;19,0 13,9 16,5; 13,0;18,0 0,9598

ГВИ РВГ ГВИ РВГ

ИРИ (CD4/CD8) 2,1 2,0; 1,6; 2,5 2,2 0,7 2,2; 1,5; 2,5 0,7; 0,5; 0,9 0,9063 0,0001

CD8+ лимфоциты (кл/мкл) 114,6 111,0; 86,0; 137,0 69,4 228,2 61,0; 14,0; 118,0 302,0; 134,0; 420,0 0,0615 0,0245

ROC- анализ результатов, полученных при сравнении иммунологических показателей пациентов 2 и контрольной групп, показал, что высокое диагностическое значение имели количество лейкоцитов, нейтрофилов и CD8+ лимфоцитов, значение ИРИ (табл.7).

Таблица 7. Диагностическая значимость иммунологических показателей пациентов с вирусными осложнениями (ЯОС-анализ)

Показатели Лейкоциты Нейтрофилы CD8+ лимфоциты ИРИ

ГВИ РВГ ГВИ РВГ

AUC 0,94 0,97 0,77 0,77 0,5 0,99

Чувств ительность(%) 87 93 77 77 53 99

Специфичность (%) 78 85 67 67 22 92,3

При пороговом значенин <4388 кл/мкл <3693 кл/мкл <95кл/мкл> - <1,1

Комплекс диагностически значимых показателей позволил выявить на 2 сутки после ТП достоверные изменения у 66,7% пациентов с вирусной инфекцией герпетической группы (ГВИ) и у 71,4% пациентов с реактивацией

17

вирусного гепатита В или С (РВГ). В период формирования воспалительного процесса вирусной природы на 2-й неделе после ТП, диагностически значимые изменения указанных показателей наблюдались у 77,7% пациентов с ГВИ и у 85,7% с РВГ. В результате, диагностический комплекс для проведения дифференциальной диагностики вирусной инфекции разных семейств у пациентов после ТП состоял из следующих показателей: количество лейкоцитов, нейтрофилов и CD8+лимфоцитов, значение ИРИ. 4. Анализ диагностически значимых иммунологических показателей у пациентов с острым клеточным осложнением

Результаты иммунологического обследования пациентов с острым клеточным отторжением (3 гр.), установленным в первый месяц после ТП на основании биопсии печени (5-9 баллов по Banff), сравнивали с иммунологическими показателями пациентов контрольной группы на 14 сутки мониторинга (табл. 8).

Таблица 8. Результаты анализа иммунологических показателей пациентов с острым клеточным отторжением.

Показатели Контрольная группа Пациенты с острым клеточным отторжением (Згр.) Р

Ср.знач. (М) Медиана 25 и75%о Срлнач. (М) Медиана; 25 и75%о

Лейкоциты (кл/мкл) 6384,2 5580,0 4990,0;7580,0 7399,0 6005; 4520;9963 0,7533

Нейтрофилы (кл/мкл) 5411,3 4976; 3870; 5830 6320,2 4626; 3735;9375 0,9626

спНСТ-тест (%) 13,6 14,0; 10,0; 19,0 17,4 16,5; 13,0;18,0 0,1682

ИРИ (CD4/ CD8) 2,1 2,0; 1,6; 2,5 0,8 0,8; 0,6; 1,1 0,0001

CD8+ лимфоциты (кл/мкл) 114,6 111,0; 86,0; 137,0 323,8 302,0; 134,0;420,0 0,0027

Проведенный анализ выявил комплекс диагностически значимых иммунологических показателей, достоверно отличающихся у пациентов с острым отторжением в сравнении с пациентами контрольной группы. В ком-

плекс включены следующие показатели: абсолютное число СГ)8+ лимфоцитов и значение ИРИ.

Анализ комплекса иммунологических показателей в группе пациентов с отторжением трансплантата печени, уже на 2 сутки после операции выявил изменения указанных показателей у 75% пациентов. При развитии клеточного отторжения изменения диагностически информативных показателей определялись также у 75% пациентов этой группы.

По результатам ЛОС-анализа высокое диагностическое значение при сравнении пациентов с острым клеточным отторжением и пациентов контрольной группы имели ИРИ (АиС=0,98) и число С08+ лимфоцитов (АиС=0,78). Чувствительность и специфичность этих тестов представлена в таблице 9.

Таблица 9. Диагностическая значимость иммунологических показателей пациентов с острым клеточным отторжением (¡ЮС-анализ)

Показатели С1)8*лимфоциты ИРИ

лис 0,78 0,98

Чувствительность (%) 75 99

Специфичность (%) 85 93

При пороговом значении >185 кл/мкл <1,4

Проведенный иммунологический мониторинг позволил выявить закономерности изменения иммунологических показателей у пациентов сравниваемых групп и сформулировать диагностические критерии, которые легли в основу алгоритма проведения дифференциальной диагностики воспалительных процессов инфекционной и неинфекционной природы в ранние сроки после ТП.

Алгоритм дифференциальной диагностики воспалительных процессов различной этиологии в ранний период после трансплантации печени.

ВЫВОДЫ

1. Формирование посттрансплантационного иммунитета в первые 2 недели после трансплантации печени в условиях иммуносупрессивной терапии проявлялось в волнообразном двухэтапном изменении числа и активности иммунокомпетентных клеток. Достоверные изменения иммунологических показателей относительно референтного интервала зарегистрированы на 2, 5, 12 и 14 сутки после ТП.

2. У пациентов с неосложненным течением послеоперационного периода (контрольная группа) на 2 и 12 сутки после ТП достоверно увеличивалось количество нейтрофилов и активность нейтрофилов в спНСТ-тесте. В конце второй недели анализируемые показатели регистрировали в пределах референтного интервала, что соответствовало адекватному иммунному ответу на трансплантацию и проводимую иммуносупрессивную терапию.

3. В группе пациентов с бактериальными осложнениями со 2 суток после ТП и до завершения мониторинга отмечали достоверное увеличение лейкоцитов и нейтрофилов в сравнении с контрольной группой.

4.В группе пациентов с активацией вирусного гепатита В или С наблюдали лейкопению, нейтропению, увеличение количества CD8+ лимфоцитов, снижение ИРИ до 1,0 и ниже. У пациентов с инфекцией, вызванной вирусами семейства Herpesviridae отмечали лейкопению, нейтропению, ИРИ регистрировали в передах референтного интервала.

5. У пациентов с высоким риском острого клеточного отторжения со 2 суток и до завершения мониторинга лейкоциты и нейтрофилы регистрировали в пределах рефрерентных значений или выше, отмечали достоверное увеличение в сравнении с контрольной группой абсолютного количества CD8+ лимфоцитов, ИРИ снижался до 1,0 и ниже.

6. Для прогноза и дифференциальной диагностики воспалительных процессов различной природы наиболее информативны были следующие показатели: количество лейкоцитов, нейтрофилов, СВ8+лимфоцитов, величина ИРИ и их динамика в первые две недели после трансплантации печени.

7. На основании данных иммунологического мониторинга разработан и апробирован алгоритм, позволяющий в ранние сроки после трансплантации печени (на 2 сутки) прогнозировать развитие острого клеточного отторжения и инфекционных осложнений в 65-78% случаев. В более поздние сроки (7-15 сутки после операции) алгоритм помогает проводить дифференциальную диагностику между осложнениями бактериальной или вирусной природы в 78 и

86% случаев, соответственно, а также диагностировать острое клеточное отторжение трансплантата в 75% случаев.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1.Для оценки риска развития инфекционных осложнений или клеточного отторжения у пациентов после ТП и проведения дифференциальной диагностики осложнений различной природы рекомендуется на 2, 5, 12 и 14 сутки после операции провести иммунологический мониторинг, который включает следующие показатели: количество лейкоцитов, нейтрофилов, CD8+лимфоцитов, ИРИ.

2. Высокому риску развития клеточного отторжения уже на 2 сутки после ТП соответствует снижение ИРИ до 1,0 и ниже, увеличение количества CD8+ лимфоцитов выше 150 кл/мкл, при содержании лейкоцитов и нейтрофилов в пределах референтного интервала или выше. При выявлении подобных изменений необходимо повторить исследование на 3 и 4 сутки после операции. При сохранении иммунологических данных, указывающих на высокий риск клеточного отторжения, целесообразно усилить иммуносупрес-сивную нагрузку или изменить схему иммуносупрессии.

3. При выявлении у пациента лейкоцитоза (нейтрофилеза), увеличения ИРИ выше 1,0, снижения числа CD8+лимфоцитов до 150 кл/мкл и ниже, что характерно для иммунного ответа на бактериальную инфекцию, целесообразно проведение инструментальных методов обследования для выявления очага инфекции, проведения бактериологического исследования и своевременного включения в схему лечения антибактериальных препаратов.

4. Обнаружение у пациента при иммунологическом обследовании лейкопении (нейтропении), снижение ИРИ до 1,0 или ниже, увеличение числа CD8+ лимфоцитов больше 100 кл/мкл характерно для реактивации вирусов гепатита В или С. Пациенту необходимо проведение ПЦР или ИФА для уточнения степени виремии и активности процесса для назначения этиотроп-ной терапии.

5. Выявление лейкопении (нейтропении), снижение числа CD8+лимфоцитов ниже 100 кл/мкл типично для оппортунистической инфекции и требует проведения ПЦР для уточнения диагноза и назначения этиотропной терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Журавель C.B. Иммуносупрессия при трансплантации органов / C.B. Журавель, О.И. Андрейцева, В.П. Никулина, A.B. Чжао // Неотложная и специализированная хирургическая помощь: тезисы доклада II конгрессе Московских хирургов, 17-18 мая 2007 г.- М., 2007. - С. 124

2. Никулина В.П. Иммунологические аспекты использования эритроцитарной массы донора органа при трансплантации печени / В.П. Никулина, В.А. Гуляев, М.А. Годков, E.H. Кобзева // Актуальные вопросы трансплантации органов: материалы городской научно - практической конференции под редакцией M.11I. Хубу-тия- М.: Триада, 2008. - С.93-95.

3. Никулина В.П. Острая клеточная реакция отторжения при трансплантации трупной печени / В.П. Никулина, A.B. Чжао, М.А. Годков // Сборник тезисов Первой международной конференции по торако-абдоминальной хирургии, г. Москва, 5-6 июня 2008 г.- М., 2008. - С. 192.

4. Никулина В.П. Иммунологические исследования при трансплантации печени: роль в дифференциальной диагностике инфекционных осложнений и отторжения трансплантата / В.П. Никулина, М.А. Годков, В.Е. Сюткин, A.B. Чжао // Материалы 1-й конференции Межрегиональной общественной организации «Общество трансплантологов», г. Москва, 18 апр. 2009 г.-М., 2009.-С.13-14.

5. Никулина В.П. Клинико-лабораторные аспекты монокомпонентной иммуно-супрессии при трансплантации печени / В.П. Никулина, М.А. Годков, В.Е. Сюткин, A.B. Чжао / Здоровье столицы - 2009, тезисы доклада каталог участников выставки VIII Московской ассамблеи, 17-18 дек. 2009 г.- М.: ГЕОС, 2009.-С.49.

6. Хубутия М.Ш. Применение глутамина после трансплантации печени. М.Ш. Хубутия, C.B. Журавель, В.Е. Сюткин, О.И. Андрейцева, В.П. Никулина, М.А. Годков, A.B. Чжао // Вестник службы крови России. 2009. - № 1. - С. 31-35.

7. Журавель C.B. Клинико-лабораторные аспекты монокомпонентной иммуно-супрессии при трансплантации печени / C.B. Журавель, A.A. Рык, В.В. Киселев, В.П.Никулина, A.B. Чжао// Трансплантология.-2009. - № 2. - С. 25-31.

8. Хубутия М.Ш. Динамика прокальцитонина у пациента после сочетанной трансплантации органов / М.Ш. Хубутия, В.П. Никулина, A.B. Пинчук, М.А.Годков // Вестник трансплантологии и искусственных органов,- 2010. - Т. 12. - №1. - С.68-71.

9. Хубутия, М.Ш. Трансплантация печени: изменения биохимических показателей и параметров иммунной системы у пациентов с разной этиологией цирроза /

М.Ш. Хубутия, В.П. Никулина, М.А. Годков, С.Б. Матвеев, В.Е. Сюткин, A.B. Чжао// Анналы хирургии. - 2010. - № 2. - С. 46-51.

10. Андрейцева О.И. Влияние монокомпонентной иммуносупрессии в отдаленный период после трансплантации печени на клиническое состояние пациентов и функцию трансплантата / О.И. Андрейцева, В.Е. Сюткин, В.П. Никулина, М.А. Годков, A.B. Чжао. Материалы П-ой конференции Межрегиональной общественной организации «Общество трансплантологов», г. Москва, 24 апр. 2010 г. // Трансплантология.-2010. -№ 1.-С.95

11. Никулина В.П. Опыт лабораторного мониторинга пациентов после трансплантации печени / В.П. Никулина, М.А. Годков, C.B. Журавель, A.B. Чжао // Лаборатория. - 2010. -№2.- С.6.

12. Никулина В.П. Дифференциальная диагностика воспалительных процессов и острого кризиса отторжения после трансплантации печени с помощью иммунологических маркеров. / В.П. Никулина, М.А. Годков, О.И. Андрейцева, A.B. Чжао // Современные лабораторные технологии в диагностике неотложных состояний: материалы городского семинара,- М.: НИИ СП им. Н.В. Склифосовского, 2010.-(Труды института, Т.215).- С.29-31.

13. Никулина В.П. Иммунологические исследования при трансплантации печени: роль в дифференциальной диагностике инфекционного воспалительного процесса и острого отторжения / В.П. Никулина, М.А. Годков, О.И. Андрейцева, A.B. Чжао // Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофарма-кологии: Труды XI Международного конгресса, Москва, 5-8 июля 2011.г. // Российский аллергологический журнал,-№ 4, вып.1.- С.262-264.

14. Годков М.А. / Лабораторно - клинический мониторинг пересаженных органов. Трансплантация органов и тканей в многопрофильном научном центре / М.А. Годков, В.П. Никулина // под редакцией М.Ш. Хубутия. - М.: АирАтр, 2011. - Гл. 12. - С.329-346.

15. Хубутия М.Ш. Особенности формирования иммунного ответа на инфекцию, вызванную вирусами семейства Herpesviridae или вирусами гепатитов С и В, у пациентов после трансплантации печени / М.Ш. Хубутия, В.П. Никулина, О.И. Андрейцева, В.Е. Сюткин, М.А. Годков, А.В Чжао П Трансплантология,- 2012. - № 3. -С. 33-41.

16. Сюткин В.Е. Опыт применения Эверолимуса у больных, перенесших орто-топическую трансплантацию печени / В.Е. Сюткин, О.И. Андрейцева, А.О. Чугу-нов, В.П. Никулина // Трансплантология,- 2012. - № 1-2. - С.10-14.

17. Никулина В.П. Основные принципы современной иммуносупрессии при трансплантации печени / В.П. Никулина, М.А.Годков, О.И. Андрейцева, A.B. Чжао // Тезисы доклада на VI Всероссийском съезде трансплантологов, г. Москва 24-27 сентября 2012г. Вестник трансплантологии и искусственных органов,-2012,-Прил,- С.145-146.

18. Хубутия М.Ш. Применение эверолимуса у больных, перенесших ортотопи-ческую трансплантацию печени / М.Ш. Хубутия, В.Е. Сюткин, О.И Андрейцева,

24

С.В.Журавель, А.О.Чугунов, В.П. Никулина // Тезисы доклада на VI Всероссийском съезде трансплантологов, г. Москва 24-27 сентября 2012г. // Вестник трансплантологии и искусственных органов.-2012.- Прил.-С.148.

Список сокращений. AJIT- аланинаминотрансфераза

АПТВ - активированное парциальное тромбопластиновое время

ACT - аспартатаминотрансфераза

ГГТП - у-глутамилтранспептидаза

ИФА - иммуноферментный анализ

МКАТ - моноклональные антитела

MHO - международное нормализованное отношение

НСТинд,- индуцированный НСТ-тест

ПДФ - продукты деградации фибриногена

ПКТ - прокальцитонин

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РМП - реакция микропреципитации с кардиолипиновым антигеном спНСТ - тест - спонтанный тест с нитросиним тетразолием СРБ- С- реактивный белок

ФА - фагоцитарная активность нейтрофилов в латекс- тесте ЩФ - щелочная фосфатаза

Banff- -классификация, патологии аллотрансплантата, созданная в r.Banff (Канада) и принятая большинством центром по трансплантации CD - поверхностный лейкоцитарный антиген (clusters of differentiation) Chld-Pugh- оценка тяжести печёночной недостаточности согласно классификации Child в модификации Pugh в баллах CMV - цитомегаловирус EBV - вирус Эпштейн-Барра HbsAg-маркер вирусного гепатита В HCV- вирус гепатита С HBV - вирус гепатита В HSV - вирус герпеса Ig - иммуноглобулин NK- естественные киллерные клетки ТРНА - реакция агглютинации с трипанемным антигеном

Выражаю глубокое уважение и искреннюю благодарность своему научному руководителю, руководителю отдела лабораторной диагностики НИИ СП им. Н.В. Склифосовского, д.м.н. Михаилу Андреевичу Годкову. Благодарна за помощь и интересную совместную работу.

Выражаю искреннюю любовь и благодарность сотрудникам лаборатории клинической иммунологии и диагностики СПИД НИИ СП, принимающих творческое участие в совместной научной работе. Д.м.н. Булаве Галине Владимировне, к.б.н. Андросовой Марине Владимировне, Есениной H.A. Калашниковой Т.А., Селезневой Г.А., Баевой О.

Подписано в печать: 12.09.14

Объем: 1,0 п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 325 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинский проспект, д.2 (495) 978-66-63, www.reglet.ru