Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Иммунологические показатели доноров в оценке качества плазмы для получения препаратов иммуноглобулинов

На правах рукописи

РЕНЕВА ЛАРИСА ВИТАЛЬЕВНА

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ДОНОРОВ В ОЦЕНКЕ КАЧЕСТВА ПЛАЗМЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

005558321

2 - ЯНЗ ¿015

Пермь 2014

005558321

Работа выполнена в Филиале Федерального государственного унитарного предприятия «Микроген» Министерства Здравоохранения России Пермское НПО «Биомед», Пермь

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Волкова Лариса Владимировна Научный консультант:

доктор фармацевтических наук Орлова Екатерина Владимировна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, заместитель директора по лечебной работе ФБУН «Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения» Устинова Ольга Юрьевна кандидат медицинских наук, доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории экологической иммунологии ИЭГМ УрО РАН Шилов Юрий Иванович

Ведущая организация - Федеральное Государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации (127051, г. Москва, Петровский б-р, д. 8)

Защита состоится «27» февраля 2015 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д.13. Факс (342) 280 92 И

Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://vak.ed.gov.ru) и на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и на сайте ИЭГМ УрО РАН (http://www.iegm.ru).

Автореферат разослан «20» января 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Юлия Геннадьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Разработка новых иммунобиологических препаратов и обеспечение их безопасности является одним из основных направлений деятельности Всемирной организации здравоохранения (Roth W.K. et al, 2002; Geneva: WHO, 2009; The Marketing Research Bureau, 2008). В настоящее время вопросам иммунного донорства для производства специфических иммуноглобулинов уделяется недостаточно внимания (Зайцева Г.А., 1999; Русанов В.М., 2004; Тхай С.В. и соавт., 2012). Появлению у доноров плазмы скрытых нарушений иммунной системы (Зайцева Г.А. и соавт., 1996; Зайцева Г.А. и соавт., 2011; Ионова А.И., 1991; Исаева Н.В., 2000; Исаева Н.В., 2007), сдвигов в функционировании различных систем организма, нарушений в электрокардиограмме (Безусова Н.А., 1996), снижении тканевых запасов железа (Зайцева Г.А. и соавт., 2011; Карпова М.В., 2012) способствует ухудшение экологической обстановки и экономическая нестабильность.

В связи с тем, что оценка состояния иммунной системы доноров в процессе многократных донаций при использовании различных схем иммунизации является актуальной научной задачей, решение которой позволит обеспечить высокое качество донорской плазмы, предназначенной для последующего фракционирования с целью получения препаратов направленных иммуноглобулинов.

Цель работы — исследование иммунологических показателей доноров плазмы, используемой в производстве специфических иммуноглобулинов.

Задачи исследования

1. Изучить состояние поствакцинального иммунитета у активных доноров иммунной плазмы при многократных плазмаферезах.

2. Провести сравнительную оценку уровня антител к антигенам, использованных для вакцинации, и к посторонним вакцинным антигенам у доноров при иммунизации разными вакцинами.

3. Изучить иммунологические показатели безопасности и качества плазмы для получения специфических иммуноглобулинов.

Научная новизна исследования. Впервые проведен комплексный анализ состояния поствакцинального иммунитета доноров плазмы, информативности иммунологических показателей безопасности и качества плазмы для получения специфических иммуноглобулинов. Впервые определена эффективность используемых схем иммунизации при получении специфической плазмы для фракционирования. Показано, что при иммунизации доноров иммунный ответ развивается не только на антигенные детерминанты вводимой вакцины, но и увеличивается уровень антител к другим антигенам. Выявлен половой диморфизм иммунного ответа на столбнячный анатоксин и вакцину клещевого

энцефалита, проявляющийся в более выраженном и длительном повышении уровня антител у женщин в сравнении с мужчинами.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют представление об общефизиологических закономерностях развития поствакцинального иммунитета. В результате проведенных исследований определены наиболее эффективные схемы иммунизации доноров различными видами вакцин и выявлены группы доноров с выраженным иммунным ответом на вакцинацию. Изучена динамика изменения иммунологических показателей доноров плазмы для фракционирования. Разработана и внедрена оптимальная схема отбора доноров для проведения иммунизации с последующими крово- и плазмодачами, апробации донорской крови и отбраковки донорской плазмы ненадлежащего качества, направленная на обеспечение безопасности иммунной донорской плазмы, используемой для производства иммуноглобулинов. На основе обобщения полученных материалов разработаны основные принципы оценки иммунологических показателей доноров плазмы для решения вопроса необходимости и целесообразности проведения иммунизации при получении иммунной донорской плазмы. В производственный процесс получения донорской плазмы для фракционирования внедрен алгоритм действий, направленный на обеспечение качества донорской плазмы при заготовке, карантинном хранении, разработанный лично автором, решены вопросы отбраковки сырья ненадлежащего качества для фракционирования иммунной плазмы. Разработана и внедрена схема отбора доноров для проведения иммунизаций в подразделении филиала ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ в г. Пермь «Пермского НПО «Биомед», осуществляющего заготовку иммунной донорской плазмы.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Вакцинация доноров для получения иммунной донорской плазмы используемой при производстве специфических иммуноглобулинов должна проводиться с использованием стандартных схем иммунизаций, дающих в отличие от экстренных схем иммунизаций наиболее выраженный и длительный эффект. Существует половой диморфизм иммунного ответа на столбнячный анатоксин и вакцину клещевого энцефалита, проявляющийся в более выраженном и длительном повышении уровня антител у женщин в сравнении с мужчинами.

2. У доноров с низким уровнем антителопродукции целесообразно проведение новых иммунизаций другими видами вакцин. При иммунизации доноров иммунный ответ развивается не только на антигенные детерминанты вводимой вакцины, но и увеличивается уровень антител к другим антигенам.

3. Для обеспечения безопасности и качества донорской плазмы, используемой в производстве препаратов крови человека, необходим единый

алгоритм действий по решению вопроса о допуске доноров к крово- и плазмодаче, включающий апробацию крови с применением современных тест-систем, эпидемиологическое наблюдение за донорами в процессе карантинизации и отбраковке плазмы ненадлежащего качества.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертационной работы представлены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (6-7 октября 2010 г. - г. Киров); XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (12-16 апреля 2010 г. - г. Москва); Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2010. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (9-10 ноября 2010 г. - г. Москва); XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (11-15 апреля 2011 г. — г. Москва); XIII региональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Химия. Экология. Биотехнология-2011» (20-21 апреля 2011г. - г. Пермь); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (5-6 июля 2011 г. — г. Санкт Петербург); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (6-7 октября 2012 г. - г. Киров); X международной научно-практической конференции «Актуальные научные достижения» (27-30 сентября 2014 г. - г. Прага); X международной научно-практической конференции «Перспективы мировой науки» (30 июля-7 августа 2014 г. - г. Шеффилд).

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 5 статей в изданиях рекомендуемых ВАК РФ для публикации материалов диссертационных исследований.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 163 стр. машинописного текста, содержит 34 таблицы и 25 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, включающего 240 источника, из них 158 отечественных и 82 зарубежных.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора. Личный вклад автора состоит в планировании и организации проведения исследований. Разработке критериев отбора доноров на иммунизацию, в анализе статистической документации, медицинской документации (карт доноров). Автор принимал участие в проведении исследования фагоцитарной активности лейкоцитов. Обработка, анализ, интерпретации результатов серологических исследований выполнены лично автором.

Внедрение результатов работы в практику. Результаты исследований внедрены в работу донорского пункта Филиала ФГУП НПО «Микроген» Министерства Здравоохранения Российской Федерации в г. Пермь «Пермского НПО «Биомед» (614084, г. Пермь, ул. Братская, д. 177); используются при чтении лекций и на практических занятиях на кафедре химии и биотехнологии по направлению «Промышленная биотехнология и биоинженерия» дисциплина «Биотехнология лекарственных препаратов и GMP» ГОУ ВПО «Пермский национальный исследовательский политехнический университет» (614001, г. Пермь, Комсомольский пр., д. 29).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. Исследование проводили с 2006 по 2012 гг. на базе донорского пункта «Пермского НПО «Биомед». Объектом исследования явились доноры «Пермского НПО «Биомед»: первичные, активные доноры. Обследование доноров проводили в соответствии с нормативными документами (Приказ МЗ РФ № 364 от 14.09.2001). Обследовано 50194 донора из них 12542 первичных донора, 37552 активных донора, 36284 - доноры крови, 13910 - доноры плазмы. Исследовано 126999 донаций крови и 83463 донации плазмы. Лабораторное обследование доноров включало следующие виды исследований.

1. Общее клиническое исследование крови на автоматическом гематологическом анализаторе «Астра», оценка скорости оседания эритроцитов.

2. Определение групповой и резус принадлежности доноров с помощью стандартных эритроцитов человека для определения группы крови по системе ABO (КСПК, г. Пермь), цоликлонов для определения группы крови по системе ABO анти - А и анти - В (ООО «Медиклон», г. Москва). Резус принадлежность доноров определяли, используя универсальный реагент антирезус (Д) - супер цоликлон для экспресс-метода (ООО «Медиклон», г. Москва).

3. Определение маркеров гемотрансмиссивных инфекций и сифилиса: поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) - набор реагентов «ДС-ИФА-HBsAg» со степенью чувствительности и специфичности по HBsAg-0,1. С 2009 г. для определения HBsAg - со степенью чувствительности и специфичности по HBsAg-0,01, «flC-M®A-HBsAg0,01» (НПО «Диагностические системы», г. Н.-Новгород), для подтверждения наличия HBsAg - набор реагентов: «ИФA-HBsAg-пoдтвepждaющий тест» (НПО «Диагностичесие системы», г. Н.-Новгород), с 2009 г. с использованием набора реагентов «ИФЛ-HBsAg 0,01 - подтверждающий тест» (НПО «Диагностические системы», г. Н.-Новгород); антител к вирусу гепатита С -набор реагентов: «ИФА-АНТИ-HCV», для подтверждения наличия анти-ВГС -

набор реагентов «ДС-ИФА-АНТИ-НСУ-СПЕКТР-GM» (НПО «Диагностические системы», г. Н.-Новгород); антител к ВИЧ-1 и ВИЧ-2 с помощью набора реагентов, выявляющих одновременно антитела и антиген к ВИЧ, «ДС-ИФА-ВИЧ-АГ+АТ», «ДС-ИФА-ВИЧ-АГАТ-СКРИН», «ДС-ИФА-ВИЧ-АГАТ-УНИФ» (НПО «Диагностические системы», г. Н.-Новгород). С 2011 г. маркеры ВИЧ определяли тест-системами со степенью чувствительности и специфичности по антигену ВИЧ-1 (р24), чувствительностью по р24-5 пг/мл, (регламентированы к использованию тест системы с чувствительности к антигену ВИЧ-1 (р24) чувствительностью по р24-10 пг/мл), тест системы ИФА для идентификации суммарных антител к отдельным белкам ВИЧ-1 gp41env, gpl20env p31pol,ВИЧ-1 группы О gp41env, ВИЧ-2 gp36env и выявления антигена ВИЧ-1 (р24) чувствительностью по р24-5 пг/мл «ДС-ИФА-ВИЧ-АТ/АГ-СПЕКТР» (НПО «Диагностические системы», г. Н.-Новгород).

4. Определение маркеров гемотрансмиссивных инфекций в качественной полимеразной цепной реакции (ТТТТР) с использованием набора реагентов для одновременного выделения ДНК ВГВ, РНК ВГС, РНК ВИЧ из сыворотки (плазмы) крови для последующего анализа методом ПЦР с детекцией в реальном времени - набор реагентов «РеалБест ДельтаМаг ВГВ/ВГС/ВИЧ» (ЗАО «Вектор Бест», г. Новосибирск). Для оценки качественного и количественного определения ДНК ВГВ методом, основанным на амплификации фрагмента ДНК в ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в реальном времени использовали набор реагентов «РеалБест ВГВ ПЦР» (ЗАО «Вектор Бест», г. Новосибирск). Для выявления и количественного определения РНК ВГС методом обратной транскрипции вирусной РНК с последующей амплификацией фрагмента к ДНК в ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в реальном времени использовали набор реагентов «РеалБест ВГС ПЦР» (ЗАО «Вектор Бест», г. Новосибирск). Для проведения выявления и количественного определения РНК ВИЧ методом обратной транскрипции вирусной РНК (ОТ-ПЦР) с последующей амплификацией фрагмента к ДНК в ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов ПЦР в реальном времени использовали набор реагентов «РеалБест ВИЧ ПЦР», (ЗАО «Вектор Бест», г. Новосибирск). Подтверждение результатов, и постановку окончательного лабораторного анализа, на маркеры ВИЧ проводили в Краевом Центре СПИД методом иммунного блота «Genscreen ULTRA HIV Ag-Ab» («Bio-Rad Laboratories SAS», Франция).

5. Определение уровня специфических антител: к вирусу клещевого энцефалита в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с диагностикумом клещевого энцефалита сухим (ФГУП НПО «Микроген», г. Томск); к гепатиту В

с использованием тест-системы, «МикрАТ-HBs», (ФГУП НПО «Микроген», г.

H.-Новгород); к анатоксину столбняка с использованием набора реагентов для выявления антитоксических дифтерийных и столбнячных антител «ИФА анти ДС» (ФГУП НПО «Микроген», г. Пермь).

6. Биохимическое исследование крови с определением уровня общего белка у доноров плазмы биуретовым методом, с использованием реагентов для определения концентрации общего белка в сыворотке (плазме) крови «Общий белок - Ольвекс» ТУ 9398-006-44276594-2005 (ООО «Ольвекс-Диагностикум», г. С. Петербург). Определение белковых фракций иммуноглобулинов с использованием прибора для проведения электрофореза белков крови УЭФ-01-«АСТРА» и набора реагентов для определения белковых фракций сыворотки крови «КлиниТест-ЭФ» (РОО СПбОЕ, г. С. Петербург).

Допуск донора к донации крови/плазмы осуществляли на основании приказа МЗ РФ № 364. Доноры, в письменной форме, давали добровольное согласие на проведение процедуры крово-/плазмодачи и проведение иммунизации.

Для проведения иммунизации доноров использовали вакцины:

Вакцина клещевого энцефалита культуральная очищенная инактивированная сухая концентрированная «Энцевир» (ФГУП «ПИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН», г. Москва и ФГУП НПО «Микроген», г. Томск). Использовали две схемы иммунизации, плановую и экстренную. По экстренной схеме обозначаемой 0-1 мес., вакцинировали 450 доноров, с последующей ревакцинацией, через 1 год, а затем каждые 3 года. По плановой схеме обозначаемой 0-6 мес. было вакцинировано 5766 доноров, с последующей ревакцинацией аналогично экстренной схеме. Иммунный ответ оценивали по содержанию в плазме специфических антител к вирусу клещевого энцефалита в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) при каждой донации. Среди вакцинированных доноров выделили две группы: первая - доноры со слабым гуморальным ответом с титром АТ-ВКЭ ниже 1:10 и продолжительностью сохранения титров менее 60 дней, вторая - доноры с активным иммунным ответом с титром АТ-ВКЭ не ниже 1:20 и продолжительностью сохранения титра не менее 60 дней. При этом титр 1:10 считали низким, 1:20- средним, 1:40 и более - высоким.

Вакцина против гепатита В, рекомбинантная дрожжевая, суспензия для внутримышечного введения (ЗАО НПК «Комбиотех», г. Москва и «Engerix В-

I,0», Бельгия). Вакцинацию проводили в соответствии с инструкцией по применению вакцины. Использовались две схемы иммунизации, стандартную -по которой было иммунизировано 929 человек, схему вакцинации обозначали 0-1-6 мес. и экстренную, по которой было иммунизировано 30 человек, схему вакцинации обозначали 0-1-2-12 мес. Группу подлежащих бустер-

вакцинации составили 27 человек. Уровень антителопродукции контролировали методом ИФА при каждой явке донора на донацию.

Анатоксин столбнячный очищенный адсорбированный жидкий для доноров (АС-анатоксин для доноров) (ФГУП НПО «Микроген», г. Пермь). Вакцинацию проводили в соответствии с инструкцией по применению АС. Уровень антителопродукции к столбняку определяли методом ИФА при каждой донации.

Статистический анализ результатов проводили с использованием методов описательной статистики, одно- и двухфакторного дисперсионного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение состояния поствакцинального иммунитета у активных доноров иммунной плазмы при многократных плазмаферезах

Оценка активности специфического антителообразования у активных доноров плазмы иммунизированных вакциной против гепатита В

Установлено, что в группе лиц, вакцинированных по стандартной схеме, через 1 месяц после завершенного курса вакцинации уровень сероконверсии составил 98%. Среднегеометрическая концентрация АТ составила 5,6±0,3 МЕ/мл. Наибольший удельный вес (53%) составили лица с высокими (1,0-10,0 МЕ/мл) концентрациями АТ, очень высокими 34,6%.

В группе лиц, вакцинированных по экстренной схеме уровень сероконверсии составил 82,0%. В структуре вакцинированных доноров, по данной схеме, наибольший удельный вес приходился на долю лиц со средними (0,1-1,0 МЕ/мл) концентрациями поствакцинальных антител (62,3%), высокие (1,0-10,0 МЕ/мл) концентрации анти-НВз антител имели лишь 11,6%, а очень высокие (10,0 и более) 1,4% доноров, 27% имели низкий уровень антител (0,010,1 МЕ/мл), а 2,0% не дали ответ на проведенную вакцинацию. Сравнительная оценка динамики изменения уровней анти-НВБ АТ у доноров показала, статистически значимое (/><0,05) уменьшение доли лиц с высокими титрами АТ с течением времени, как с использованием стандартной, так экстренной схем (табл. 1).

Динамика сохранения высоких уровней АТ к вирусу гепатита В (1,ОМЕ/мл) у доноров (%) в зависимости от используемых схем __иммунизации_

Срок исследования Схема иммунизации

Стандартная Экстренная

3 месяца 68,0 62,0

6 месяцев 60,1 34,1

1 год 55,0 23,5

2 года 47,3 37,3

3 года 27,9 18,6

4,0 года 25,0 12,4

Показатели эффективности вакцинации у лиц, иммунизированных по стандартной схеме были статистически значимо выше, среднегеометрическое титра АТ при иммунизации по стандартной схеме 5,6±0,3 МЕ/мл, против 3,4±0,6 МЕ/мл (/><0,01), у иммунизированных по экстренной схеме. Это связано, по-видимому, с большим интервалом между второй и третьей вакцинациями, а также с медленным нарастанием концентраций АТ в ответ на введение рекомбинантного НВзА§. Проведенное исследование выявило ежегодное падение уровня антител к гепатиту В при использовании обеих схем вакцинации, но более выраженное у лиц вакцинированных по экстренной схеме (табл. 2).

Таблица 2

Динамика изменения уровня антителоиродукции к вирусу гепатита

В в зависимости от используемых схем иммунизации (МЕ/мл)

Срок исследования Схема иммунизации

Стандартная Экстренная

3 месяца 5,9±0,4 2,2±0,3

6 месяцев 3,8±1Д 1,2±0,4

1 год 1,8±0,4 0,6±0,1*

2 года 1,4±0,4 0,4±0,2**

3 года 0,6±0,1 0,2±0,1

4,0 года 0,1±1,1 0,1±0,1

Примечание. - р<0,01 по критерию Стьюдента. * - до проведения ревакцинации, ** - после проведения ревакцинации.

В результате исследований установлено, что через 4 года у 75,0% доноров вакцинированных по стандартной схеме и у 93,6% доноров, вакцинированных по экстренной схеме, уровень АТ снизился менее 1,0 МЕ/мл, плазма этих доноров не могла быть использована для производства препарата

иммуноглобулина против ВГВ.

Использование стандартной схемы вакцинации позволило получить более выраженный иммунный ответ на вакцинацию особенно у мужчин и женщин, имеющих первую группу крови в возрасте от 20 до 30 лет и у женщин имеющих четвертую группу крови в возрасте 40-50 лет. Мужчины, имеющие третью группу крови в возрасте 40-50 лет, показали наименьший по выраженности и продолжительности иммунный ответ. Через три года после проведенной вакцинации с использованием профилактической схемы, количество доноров, имеющих титры противогепатитных АТ в концентрации достаточной для использования их плазмы для производства специфического иммуноглобулина, уменьшилось более чем в 2 раза, а при использовании экстренной схемы более чем в 3 раза.

Оценка антителообразования, у активных доноров, иммунизированных столбнячным анатоксином для доноров

Установлено, что в группе доноров, иммунизированных анатоксином столбняка (АС) через 1 месяц после вакцинации, среднегеометрическая концентрация антител составила 4,90+0,04 МЕ/мл, уровень сероконверсии -74,49%, причем среди мужчин 57,84%, а среди женщин 91,13%. В общей структуре иммунизированных наибольший удельный вес (95,0%) составляли лица с высокими (5,0 МЕ/мл и более) концентрациями антител. При сравнении среднегеометрических концентраций АТ к АС у иммунизированных отмечено статистически значимое снижение концентраций поствакцинальных антител (¿><0,001) через 1 год после проведенной иммунизации. Изучение влияния пола и возраста иммунизированных доноров на выработку АТ к АС показало, что до иммунизации женщины имеют более низкий исходный фон титра АТ - 0,74±0,1 МЕ/мл, против 1,23±0,09 МЕ/мл у мужчин. При проведении двухфакторного дисперсионного анализа в объединенной выборке всех результатов после иммунизации выявлено статистически значимое влияние фактора «пол» (Д1,909)=12,124, />=0,00052; градации фактора: 0 - мужчины, 1 - женщины) и фактора «время после иммунизации» (7Г(6,909)=19.891, />=0,0000; градации фактора: 1-1 месяц, 2-3 месяца,3 - 6 месяцев, 4-12 месяцев, 5-18 месяцев, 6 -24 месяца, 7-36 месяцев после проведенной иммунизации), в то время как взаимодействие этих факторов статистически не значимо (табл. 3). Таким образом, женщины более активно отвечают на иммунизацию и у них наблюдается менее выраженное снижение титра АТ в течение времени.

Зависимость уровня антител у иммунизированных доноров от пола и

времени с начала иммунизации по данным двухфакторного __дисперсионного анализа_

Эффект Суммы квадратов отклонений от среднего или девиаты (SS) Число степеней свободы (df) Дисперсии (MS) F Р

Intercept 9438,748 1 9438,748 7031,695 0,000000

Пол 16,275 1 16,275 12,124 0,000521

Время 160,201 6 26,700 19,891 0,000000

Пол+Время 16,469 6 2,745 2,045 0,057369

Ошибка (остаточная вариация) 1220,164 909 1,342

Поскольку у женщин гуморальная составляющая иммунного ответа более выражена, чем у мужчин, что подтверждает существование такого феномена, как половой диморфизм иммунного ответа (Кеворков Н.Н. и соавт., 1993; Маянский А.Н., 2005; Druckmann R., 2001; Grossman C.J. et al., 1991; Grossman CJ. et al., 1994), нами проведена оценка влияния фазы менструального цикла, в которую были иммунизированы доноры-женщины, на выработку специфических AT. Полученные результаты показали, что у женщин в возрасте от 27 до 50 лет, наибольший иммунный ответ получен при иммунизации в фолликулярную фазу цикла, выраженный - в период овуляции и в раннюю лютеиновую фазы, характеризующиеся высокой продукцией эстрогенов, а наименьший - в менопаузе что согласуется с данными литературы (Кеворков Н.Н. и соавт., 1993; Chernyshov V.P. et al., 2001) (табл. 4).

Таблица 4

Зависимость иммунного ответа на вакцинацию от фазы _ менструального цикла_

Количество доноров (п=60) День менструального цикла Число (%) женщин с высоким титром AT (5МЕ/мл)

15 4-13 15 (100,0)

11 14-16 9(81,8)

10 17-23 7 (70,0)

9 24-28 3 (33,3)

15 Менопауза 4 (26,6)

Исследование влияния возраста иммунизированных доноров на выработку АТ показало, что значимых различий у мужчин и женщин одной возрастной группы не выявлено. Уровень сероконверсии для группы 20-40 лет составил - 70,21%, 41-50 лет - 65,15%, 51-60 лет - 62,96%, что свидетельствует о более выраженном иммунном ответе на иммунизацию у молодых доноров в возрасте до 40 лет (табл.5).

Таблица 5

Динамика противостолбнячных антител (МЕ/мл) у иммунизированных доноров в зависимости от возраста_

Срок исследования Возраст, лет

21-40(1) 41-50 (2) 51-60 (3)

Исходный фон 1,14+0,15 1,10±0,11 1,13+0,18

1 месяц 4,89+0,08 4,87+0,06 5,0+0,02

3 месяца 4,78+0,12 4,96+0,02 4,92+0,08

6 месяцев 4,64+0,15 4,62+0,11 4,54+0,19

1 год 4,27+0,19 3,99+0,16 3,73+0,28

1,5 года 4,17+0,21 3,67+0,19 3,27+0,34

2,0 года 3,53+0,26 3,53+0,20 3,59+0,36

2,5 года 3,04+0,41 3,40+0,22 3,20+0,50

3,0 года 2,64+0,51 3,12+0,27 2,96+0,38

Изучение динамики сохранения высоких уровней АТ показало ежегодное снижение в среднем в 1,17 раза, причем у лиц в возрасте 21-40 лет в первый год уровень АТ снижался медленнее, чем у лиц, более старших возрастных групп.

Исследование влияния групповой и резус принадлежности иммунизированных доноров на выработку АТ показало наибольший иммунный ответ на вакцинацию у женщин первой и третьей групп крови и мужчин первой и второй групп крови. Изучение динамики изменения титра АТ в зависимости от резус принадлежности доноров статистически значимых различий не выявило.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что женщины более активно отвечают на иммунизацию АС, чем мужчины, уровень сероконверсии составил 91,13% и 57,84% соответственно, что подтверждает наличие феномена полового диморфизма. Наибольший иммунный ответ получен среди женщин первой и третьей групп крови вакцинированных в фолликулярную фазу цикла, в возрасте от 20 до 40 лет и мужчин первой и второй групп крови в возрасте от 20 до 40 лет. Через 3 года только 23,53% ранее иммунизированных доноров сохранили высокий титр специфических антител.

Изучение активности спег/ифического антителообразования у активных доноров плазмы, иммунизированных против клещевого энцефалита Проведенный скрининг среди первичных доноров показал, что только 8,8% из них имеют титр антител к вирусу клещевого энцефалита (ВКЭ) в концентрации, необходимой для производства иммуноглобулина против клещевого энцефалита (1:20 и более в РТГА). В связи с этим, проведена оценка эффективности двух схем иммунизации против клещевого энцефалита.

Установлено, что в группе лиц, вакцинированных по экстренной схеме, через 1 месяц после завершенного курса вакцинации 63,8% донора имели титр AT 1:20 и выше в сравнении с иммунизацией по схеме стандартной, при которой активный иммунный ответ отмечали у 72,4% доноров. Длительность циркуляции AT была прямо пропорциональна величине титра. Продолжительность сохранения титра в случае выявления у доноров низких титров АТ-ВКЭ (1:10) - в среднем 8 недель, в случае средних титров (1:20) -1617 недель, высоких (1:40 и выше) титров -28-31 недель.

В результате ревакцинации активными антителопродуцентами оказались при первой схеме иммунизации 74,2% донора, при второй - 85,2%. Поскольку различия в иммунном ответе доноров, вакцинированных по схемам 1 и 2, не были статистически значимы (р>0,05), предпочтение отдали стандартной схеме вакцинации, которая позволила заготовить больше иммунной плазмы на 8,6%. Среди 66% вакцинированных женщин активно на вакцину КЭ ответили 78,2%, среди 34% мужчин - 54,5%.

Расчеты показали, что у женщин ответная реакция на вакцину КЭ выше, чем у мужчин (р<0,05), что подтверждает существование полового диморфизма высоты иммунного ответа (Кеворков H.H. и соавт., 1993; Маянский А.Н., 2005; Grossman С.J. et al., 1994).

Изучение выраженности иммунного ответа на иммунизацию в зависимости от возраста показало, что наибольший ответ получен у лиц в возрасте 20-40 лет. Влияние групповой и резус принадлежности иммунизированных доноров на выработку AT статистически не значимо (р> 0,05).

Таким образом, в результате проведенного нами исследования выявлена наиболее эффективная стандартная схема иммунизации вакциной КЭ. Наибольший эффект от иммунизации достигнут при вакцинации женщин молодого возраста от 20 до 40 лет.

Изучение состояния поствакцинального иммунитета у активных доноров иммунной плазмы при иммунизации разными вакцинами

Сравнительная оценка уровня антител к антигенам, использованных для вакцинации доноров Иммунизация доноров с целью производства направленных иммуноглобулинов с использованием различных схем вакцинаций вызывает достаточный по выраженности иммунный ответ. Период сохранения титров специфических антител у иммунизированных доноров, как правило, меньше, чем интервал между последующими иммунизациями и ревакцинациями, предусмотренными инструкциями по применению вакцин.

Проведенные нами исследования показали, что через 3 года 72,1% вакцинированных против гепатита В по стандартной схеме и 81,4%, вакцинированных по экстренной не имеют необходимого титра антител (более 1,0 МЕ/мл). Среди доноров, вакцинированных столбнячным анатоксином, 74,47% через 3 года также не имеют необходимого титра антител (5,0 МЕ/мл и более). Иммунизация таких лиц другими видами вакцин в интервалах между ревакцинациями, проводимыми в соответствии со схемами применения вакцин, приводила к увеличению антителопродукции не только к используемому антигену, но и увеличивала антителопродукцию в целом. При иммунизации доноров против ВГВ была выявлена слабая обратная линейная связь (г=-0,50) между увеличением антителопродукции к ВГВ и увеличением титров АТ к ВКЭ у ранее иммунизированных против КЭ доноров. Линейную связь между увеличением антителопродукции против ВГВ и увеличением титров АТ к столбнячному анатоксину у ранее иммунизированных доноров выявить не удалось (г=0,42, р>0,05 по критерию Стьюдента). При иммунизации доноров вакциной против КЭ линейную связь между увеличением антителопродукции к ВКЭ и увеличением титров АТ к столбнячному анатоксину и ВГВ у ранее иммунизированных доноров выявить не удалось (/=0,41; р>0,05) и (г=0,49; />>0,05) соответственно.

При иммунизации доноров АС, выявлена сильная степень линейной связи между увеличением антителопродукции к столбнячному анатоксину и ВКЭ (г= 0,73; /><0,01). При иммунизации доноров мужчин стафилококковым анатоксином выявлены: сильная степень линейной связи между увеличением антителопродукции к стафилококковому анатоксину и АС (г=0,89; /?<0,01). Данные по средним значениям уровня антител к этим антигенам представлены на рис. 1 и 2.

Ом«; lMet 2плес. Зллес 4iviec- 5ллеи бллкс Под 1 ^юда

Рис. 1. Изменение титров AT при иммунизации АС

3.5

0.5 О

Рис. 2. Изменение титров AT при иммунизации стафилококковым

анатоксином

Данный эффект объясняется использованием в вакцинных препаратах гидрооксида алюминия в качестве адъюванта для обеспечения более длительного процесса поступления антигенов (депонирующий эффект), что способствует продлению гуморального ответа (Derek Т. et al., 2007; Kathy D„ 1991; Medunitsyn N.V. et al., 2005; Sayers S. et al., 2012). Проведенные нами исследования показали что вакцина, содержащая в своем составе большую концентрацию гидрооксида алюминия в качестве адъюванта, стафилококковый анатоксин и столбнячный анатоксин, дает не только наиболее выраженный иммунный ответ на вводимую вакцину, но и увеличивает антителопродукцию в целом (табл. 6).

омес 1 мсс 2мес змее 4мес Змее бмес 1год 1,5годэ

AT к столбняку ДТкКЭ

AT к renaTrtiy в

Содержание гидрооксида алюминия в вакцинных препаратах

№ п/п Наименование вакцины Содержание алюминия гидрооксида Эффект

1. Анатоксин 0,9-1,3 мг/мл >АТ к АС

стафилококковый Анатоксин столбнячный до 1,1мг/мл (г=0,89) >АТ к ВКЭ

2. (/=0,73)

3. Вакцина гепатита В 0,5 мг/мл -

4. Вакцина клещевого энцефалита 0,3-0,5мг/доза

Иммунологические показатели безопасности и качества плазмы для получения специфических иммуноглобулинов

Иммунологические показатели и полимеразная цепная реакция у доноров

как критерии вирусной безопасности иммунной плазмы Инфекционная безопасность донорской плазмы является одним из основных показателей качества плазмы для фракционирования (Жибурт Е.Б. и соавт., 2010; Geneva: WHO, 2009;). Изучение серологических показателей крови доноров иммунной плазмы на наличие маркеров ГТИ в течение шести лет с применением современных высокочувствительных тест-систем для ИФА и метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) показало, что доля выявления маркеров ВГВ среди доноров снизилась в 1,8 раза, маркеров ВГС в 1,5, а маркеров ВИЧ в 1,7 раза (рис. 3).

%

0,6

о

2006г 2007Г 2008г 2009г 201Or 2011 г

Рис. 3. Динамика показателей скрининга маркеров ГТИ среди доноров

Использование с 2009 г. набора реагентов с детекцией по ИВзА§ 0,01, позволило уменьшить количество ложноположительных результатов исследований на маркеры ВГВ в 4,0 раза, а использование с 2010 г. набора реагентов с детекцией по АГ к ВИЧ 1 5 пг/мл., снизило количество ложноположительных результатов при определении маркеров ВИЧ в 6,0 раз (рис. 4).

%

0,7

2006Г 2007г 2008Г 2009г 2010г 2011г

Рис. 4. Динамика показателей ложноположительных результатов на маркеры ГТИ

Для исключения возможности донации крови и плазмы донором в период серонегативного окна при наличии отрицательных результатов серологического тестирования на маркеры ГТИ с использованием методов ИФА был введен метод исследования нуклеиновых кислот на наличие РНК ВГС, РНК ВИЧ, ДНК ВГВ. При исследовании 14901 образцов крови доноров методом ПЦР в 135 случаях было зарегистрировано нарастание флуоресцентного сигнала, свидетельствовавшего о наличие в образце крови вирусной НК. Дискриминаторное исследование этих образцов выявило в 97 образцах РНК ВГС; в 21 образце - ДНК ВГВ и в 17 образцах - РНК ВИЧ. Практически во всех случаях, положительные результаты, полученные в ПЦР, совпадали с положительными результатами, полученными в ИФА. Только при исследовании трех серонегативных в ИФА образцов донорской крови был получен положительный результат при исследовании, проведенном методом ПЦР. В двух образцах выявлена РНК ВГС. В одном образце выявлена РНК ВИЧ.

Сравнительный анализ частоты выявления маркеров ГТИ у доноров крови и плазмы показал, что среди активных доноров плазмы маркеры ВГВ выявляются в 4,5, ВГС в 5,0, а ВИЧ в 6,7 раз реже, чем у доноров крови.

Анализ полученных результатов позволяет заключить, что кровь и плазма активных доноров наиболее безопасна в отношении гемотрансмиссивных инфекций. Разработанный «Алгоритм действий по выбраковке донорской

крови и плазмы при заготовке и в процессе карантинизации», позволил сократить потери сырья при заготовке в 2,0, а в процессе карантинизации плазмы в 2,6 раза.

Показатели общего белка и белковых фракций доноров иммунной плазмы

Проведенные исследования показателей белкового обмена среди 2990 доноров в возрасте от 18 до 60 лет, среди которых 1404 первичные и 1586 активные доноры, том числе 1677 мужчин и 1313 женщин, в зависимости от таких факторов как: пол, возраст, частота донаций, объем плазмодач, социальный статус показали статистически значимые отличия уровня альбумина и суммы глобулинов у мужчин и женщин, как среди первичных, так и среди активных доноров плазмы. Среди первичных доноров мужчин уровень альбумина - 60,73±0,37%, у женщин -59,64±0,36%, сумма глобулинов - 39,27±0,37% и 40,36±0,36% соответственно, у активных доноров плазмы 60,60±0,38%, 58,88±0,43% среди мужчин и 39,40±0,38% 41,12±0,43% среди женщин и как следствие более высокий уровень коэффициента А/Г у доноров мужчин по сравнению с донорами женщинами. Проведенные исследования среди активных доноров иммунной плазмы имеющих в среднем 11,5 донаций плазмы в год с изъятием в среднем 6,7 литров плазмы ежегодно, показали, что у доноров-женщин наблюдалось увеличение суммы глобулинов за счет более высокого значения а2-глобулинов и у-глобулинов по сравнению с мужчинами (соответственно 6,51±0,11 г/л и 12,38±0,31 г/л, против 6,21±0,09 г/л и 11,78±0,09, /?<0,05). Обнаружены взаимосвязи ряда показателей от социального статуса доноров. Так, у доноров мужчин-безработных отмечался низкий уровень глобулинов (38,67±3,18%) в сравнении с женщинами-служащими (41,78±0,61%; р<0,05).

Установлено, что такие характеристики как содержание альбумина, суммы глобулинов, в частности В-глобулинов, являются зависимыми от возраста, с возрастом эти показатели увеличивались, но не выходили за границы возрастных норм. Частота и объем плазмодач, хотя и оказывают влияние на показатели белкового состава сыворотки крови у активных доноров плазмы по сравнению с первичными донорами в отношении уменьшения уровня общего белка (соответственно 73,14±0,37 г/л и 75,10±0,42 г/л) и повышения уровня В-глобулинов (соответственно 12,07±0,13% и 11,37±0,11%), они не приводят к сдвигу анализируемых параметров за границы установленных возрастных норм.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что длительность антителопродукции у вакцинированных доноров зависит от используемых схем иммунизации; наиболее выраженный и длительный иммунный ответ достигается при использовании

профилактических схем иммунизации. Выявлен половой диморфизм иммунного ответа на столбнячный анатоксин и вакцину клещевого энцефалита, проявляющийся в более выраженном и длительном повышении уровня антител у женщин в сравнении с мужчинами.

2. Показано, что при иммунизации доноров иммунный ответ развивается не только на антигенные детерминанты вводимой вакцины, но и увеличивается уровень антител к другим антигенам. Выявлена положительная линейная корреляция между увеличением антителопродукции к столбнячному анатоксину и вирусу клещевого энцефалита (г=0,73), между увеличением антителопродукции к стафилококковому токсину и столбнячному анатоксину (>=0,89) у ранее иммунизированных доноров.

3. Для обеспечения качества и безопасности донорской плазмы, используемой для производства препаратов крови человека, необходим единый алгоритм действий по решению вопроса о допуске доноров к донации, включающий апробацию крови, эпидемиологическое наблюдение за донорами в процессе карантинизации и отбраковке плазмы ненадлежащего качества. Изменения показателей концентрации белковых фракций плазмы крови, у активных доноров иммунной плазмы носят транзиторный характер и не могут быть использованы в качестве критериев качества плазмы для получения специфических иммуноглобулинов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Вакцинация доноров для получения иммунной донорской плазмы используемой при производстве специфических иммуноглобулинов должна проводиться с использованием профилактических схем иммунизаций, дающих наиболее выраженный и длительный эффект, в отличие от экстренных схем иммунизаций.

2. Целесообразно у доноров с низким уровнем антителопродукции проведение новых иммунизаций в интервалах между ревакцинациями, проводимыми в соответствии со схемами применения вакцин, другими видами вакцин. Поскольку выраженный иммунный ответ возникает не только на вводимую вакцину, но и в целом усиливается антигелопродукция, а именно: выявлены: сильные степени линейной связи между увеличением антителопродукции к столбнячному анотоксину и вирусу клещевого энцефалита (г=0,73), между увеличением антителопродукции к стафилококковому токсину и столбнячному анотоксину (/^0,89).

3. Целесообразно использовать при исследовании на маркеры гемотрансмиссивных инфекций современные тест системы, обладающие высокой степенью чувствительности и специфичности, так тест системы с детекцией по HBsAg 0,01, позволили снизить количество ложноположительных

результатов в 1,7 раза. Использование «Алгоритма действий по выбраковке донорской крови и плазмы при заготовке и в процессе карантинизации» позволяет предотвратить попадание в производство плазмы ненадлежащего качества, и в то же время, сохранить донорские кадры.

4. Рекомендуется проводить мониторинг донорских кадров с использованием такого традиционного инструмента как опрос и анкетирование, для выявления факторов влияющих на донорскую активность с целью привлечения наиболее социально значимых групп населения в активное донорство.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК Минобрнауки РФ

1. Ренева, Л.В. Внедрение в практику работы донорского пункта Пермского НПО «Биомед» аппарата для получения донорской плазмы, используемой в производстве иммуноглобулинов / JI.B. Ренева, JI.B. Волкова, Е.В. Орлова // Пермский медицинский журнал. - 2010. - № 27 (3). - С. 57-61.

2. Ренева, JI.B. Динамика посвакцинального иммунитета к клещевому энцефалиту у активных доноров плазмы / JI.B. Ренева, Л.В. Волкова, В.А. Черешнев // Вестн. Уральской медицинской академической науки. - 2011. -№4/1 (38).-С. 112-113.

3. Ренева, Л.В. Обеспечение вирусной безопасности донорской плазмы, используемой в производстве препаратов крови / Л.В. Ренева, Л.В Волкова, A.B. Казьянин // Вестн. службы крови России. - 2011. - № 4. - С. 19-23.

4. Ренева, Л.В. Мониторинг донорских кадров - основной способ изучения социального портрета доноров / Л.В. Ренева, Л.В. Волкова, A.B. Казьянин // Вестн. службы крови России. - 2012. - № 3. - С. 19-23.

5. Ренева, Л.В. Посвакцинальный иммунитета к гепатиту В у доноров плазмы / Л.В. Ренева, Л.В. Волкова, A.B. Казьянин // Вестн. Уральской медицинской академической науки. - 2013. - № 1 (43). - С.73-76.

Публикации в других журналах и сборниках

1. Опыт внедрения метода карантинизации в технологию производства препаратов крови / Л.В. Ренева, A.B. Казьянин, Л.В. Волкова, Е.В. Орлова // Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины: тез. докл. Всероссийской науч.-практ. конф. с международным участием, посвященной 50-летию ФГУП «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови ФМБА России». - Киров, 6-7 октября 2010 г. - Киров: Изд-во «Старая Вятка», 2010. - С. 125-126.

2. Ренева, Л.В. Вопросы безопасности донорской плазмы, используемой в производстве иммуноглобулинов / Л.В. Ренева, Л.В. Волкова // Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: тез. докл. Всероссийской науч.-практ.

конф. «Вакцинология 2010». - Москва, 9-10 ноября 2010 г. - М:, 2010. - С. 92.

3. Ренева, JI.B. Опыт освоения метода автоматического афереза с целью получения сырья для производства иммуноглобулинов человека / JI.B. Ренева, JI.B. Волкова, Е.В. Орлова // XVII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, 12-16 апреля 2010: сб. материалов. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2010. - С.710.

4. Ренева, JI.B. Социология и мотивация доноров крови / JI.B. Ренева, JI.B. Волкова, Е.В. Орлова // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии: тез. докл. Всероссийской науч.-практ. конф., Санкт Петербург, 5-6 июля 2011. - С. 98.

5. Ренева, Л.В. Оценка донорского потенциала при производстве препаратов крови человека / Л.В. Ренева, Л.В. Волкова И XVIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство», Москва, 11-15 апреля 2011: сб. материалов. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2011. - С. 630.

6. Ренева, Л.В. Эффективность иммуноферментного метода при отборе плазмы, используемой в производстве иммуноглобулинов направленного действия / Л.В. Ренева, Л.В. Волкова, М.В. Буркова // Химия и экология: тез. докл. Х1П Краевой науч.-практ. конф., Пермь, 20-21 апреля 2011 г. - Пермь, 2011.-С. 110-112.

7. Унификация методов контроля вирусной безопасности плазмы доноров, используемой в технологии производства специфических иммуноглобулинов / Л.В. Ренева, JLB. Волкова, Е.В. Орлова, A.B. Казьянин // Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины: тез. докл. Всероссийской науч.-практ. конф., Киров, 6-7 октября 2012 г. - Киров, 2012. - С. 125-126.

8. Ренева, Л.В. Оценка антителообразования у активных доноров иммунизированных столбнячным анатоксином / Л.В. Ренева, Л.В. Волкова // Актуальные научные достижения: тез. докл. X Международной науч.-практ. конф., Прага, 27-30 сентября 2014 г. - Прага, 2014. - С. 60-65.

9. Ренева, Л.В. Оценка антителообразования у активных доноров плазмы для фракционирования иммунизированных вакциной против гепатита В / Л.В. Ренева, Л.В. Волкова // Перспективы мировой науки: тез. докл. X Международной науч.-практ. конф., Шеффилд, 30 июля-7 августа 2014 г. -Шеффилд, 2014. - С. 3-10.

Список основных сокращений:

АГ — антиген

АС — анатоксин столбнячный AT — антитела

РЕНЕВА Лариса Витальевна

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ДОНОРОВ В ОЦЕНКЕ КАЧЕСТВА ПЛАЗМЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

АВТОРЕФЕРАТ

Подисано в печать 28.12.2014. Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 1356/2014.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии издательства Пермского национального исследовательского политехнического университета. Адрес 614990, г. Пермь, Комсомольский пр., 29, к. 113. Тел. (342) 219-80-33.