Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Критерии прогнозирования иммунного ответа доноров на вакцину клещевого энцефалита

На правах рукописи

Вальцева Людмила Николаевна

Критерии прогнозирования иммунного ответа доноров на вакцину клещевого энцефалита

14.00.29 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Сан^т -Петербург 2006

УДК 612.017.1:615.38-07]:615.371:616.988.25-002.954.2

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук профессор Зайцева Галина Алексеевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук профессор Бубнова Людмила Николаевна

доктор биологических наук профессор Сесь Татьяна Павловна

Ведущее учреждение:

Государственное учреждение Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук

1Р </300

Защита состоится « I (л » ^ _2006 г. в ' ^

на заседании диссертационного совета Д 208.074.01 в ФГУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (193024, г. Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

¡Я 0 8

Автореферат разослан « 1 »_^ ^_2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Т.В. Глазанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Согласно рекомендациям ВОЗ (1982), одной из важнейших областей применения иммуноглобулинов является профилактика и лечение вирусных инфекций, резистентных к химиопрепаратам. К числу таких инфекций относится клещевой энцефалит (tick-borne encephalitis) (КЭ) - острая нейровирусная инфекция, характеризующаяся поражением серого вещества головного и спинного мозга. Заболевание отличается тяжестью и длительностью течения, высокой частотой (до 30-46%) необратимых остаточных явлений (Иерусалимский А.П., 2001; Haglund М., 2002, 2003; Herzig R., 2002). В отдельных районах Дальнего Востока летальность достигает 40% (Леонова Г.Н. и соавт., 1996, 2005). Вызывает особую озабоченность; что за последние 20 лет заболеваемость КЭ в России увеличилась в 7-9 раз, и в настоящее время эпидемиологическая ситуация по КЭ характеризуется как сложная (Онищенко Г.Г., 2003; Злобин В.И., 2004, 2005).

Основным средством специфической профилактики и лечения КЭ является донорский иммуноглобулин. Однако потребности здравоохранения в этом препарате удовлетворены далеко не полностью (Воробьева М.С., 2003; Лашкевич В.А. 2003; Русанов В.М., Левин И., 2004). Производство иммуноглобулинов против КЭ затруднено тем, что при использовании серологического скрининга плазмы невакцинированных доноров не удается заготовить необходимый объем иммунного сырья. Среди доноров Кировской области относительное количество лиц с содержанием антител к вирусу КЭ в плазме не менее 1:10 составляет в среднем 7,6% (Мальцева О.В., 2002). Кроме того, причиной дефицита и высокой стоимости аллогенных иммунных препаратов крови является ограниченность кадров доноров, их большой отсев в процессе обследования и иммунизации (Верета Л.А. и соавт., 1987; Смирнова А.И., 1990).

Существующая система комплектования групп иммунных доноров не предусматривает учет генетически обусловленных особенностей иммунного ответа индивида на конкретную вакцину. При этом значительная часть вакцинированных не отвечает активной антителопродукцией на введение антигена. Плазма этих доноров не может быть использована для производства иммуноглобулинов, а антигенные нагрузки на организм донора оказываются неоправданными. Поэтому представляется важным привлекать к вакцинации лице предположительно активной выработкой антител.

На сегодняшний день получены убедительные свидетельства того, что активность иммунного ответа в существенной мере определяется антигенной характеристикой тканей организма (Серова Л.Д., Шабалин В.Н., 1988, Хаитов P.M., Алексеев Л.П., 2003, Железникова Г.Ф. 2005). Для ряда вакцин показана ассоциация иммунного ответа с антигенами лейкоцитов и эритроцитов (Медуницын Н.В., 2004). В частности, разработан способ определения потенциальной активности антителопродукции индивида на стафилококковый и столбнячный анатоксины, в основу которого положена идентификация HLA-фенотипа у вакцинированных (Зайцева Г.А., 1990).

Исходя из сказанного, можно полагать, что перспективы иммунного донорства во многом связаны с решением проблемы целенаправленного отбора лиц с предположительно активной выработкой специфических антител, т.е. изучение критериев определения потенциального иммунного ответа доноров на вакцины весьма актуально.

Цель исследования - разработка критериев прогнозирования активности антителопродукции у доноров, иммунизированных вакциной клещевого энцефалита.

Задачи исследования:

1. Оценить иммунный ответ доноров на «Вакцину клещевого энцефалита культуральную очищенную концентрированную инактивированную сухую» производства Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН (г. Москва) по титру специфических антител в реакции торможения гемагглютинации и по длительности сохранения титра. Сравнить активность антителопродукции у доноров в зависимости от схемы вакцинации.

2. Сопоставить титры специфических антител в образцах иммунной плазмы доноров при исследовании в реакции торможения гемагглютинации и иммуноферментном анализе.

3. Изучить характер распределения антигенов систем HLA, ABO, Резус у вакцинированных с разной активностью антителопродукции; исследовать выраженность иммунного ответа доноров в зависимости от пола и возраста.

4. Разработать функциональную модель для прогнозирования активности гуморального иммунного ответа индивида на вакцину КЭ.

5. Апробировать функциональную модель при вакцинации доноров станции переливания крови ФГУ «КНИИГиПК Росздрава» и ГУЗ «Свердловская ОСПК».

4

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Интенсивность выработки специфических антител у лиц, вакцинированных против КЭ, ассоциирована с лейкоцитарными антигенами. Существует положительная и отрицательная ассоциация активности продуцирования специфических антител к вирусу КЭ с HLA-фенотипом. Комплектование групп иммунных доноров целесообразно осуществлять с учетом выявленных ассоциаций.

2. Активность гуморального иммунного ответа индивида на вакцину КЭ зависит от возраста и пола вакцинированного. Функциональная модель, построенная на основе количественного учета комплекса присущих индивиду признаков, в числе которых пол, возраст, антигены систем HLA, ABO, Резус, позволяет повысить точность прогнозирования выраженности иммунного ответа индивида на вакцину КЭ.

Научная новизна. Впервые показана возможность прогнозирования иммунного ответа индивида на вакцину клещевого энцефалита. Выявлены факторы, влияющие на активность антителопродукции у доноров при вакцинации. Установлена связь интенсивности выработки специфических антител с HLA-фенотипом индивида. Разработана функциональная модель, позволяющая прогнозировать иммунный ответ на вакцину КЭ путем учета комплекса присущих индивиду признаков. Подана заявка на предполагаемое изобретение (уведомление о положительном результате формальной экспертизы от 04.04.2005 г., МКИ G01 №33/50).

Теоретическая и практическая значимость. Выявленные ассоциации иммуногенетических признаков с активностью антителообразования при вакцинации свидетельствуют о несомненной роли тканевых антигенов в генетической детерминации выраженности иммунного ответа. Представляется практически важным привлекать к иммунизации с целью производства специфических препаратов потенциально активных антителопродуцентов, тем самым создаются условия для рационального распределения ограниченных донорских ресурсов. Отказ от иммунизации ареактивных индивидов позволяет избежать неоправданных антигенных нагрузок на организм донора. Рекомендуемый способ прогнозирования иммунного ответа доноров на вакцину КЭ обеспечивает достаточную для практических нужд точность прогноза. Его применение позволяет повысить процент иммуноактивных лиц среди вакцинированных до 80±3,02%, что способствует увеличению объемов заготовки плазмы специфической направленности. Модуль для прогнозирования иммунного ответа,

5

разработанный на Delphi, позволяет использовать полученные в результате исследования данные в работе учреждений службы крови, занимающихся направленной иммунизацией доноров.

Внедрение результатов исследования в практику.

Способ прогнозирования иммунного ответа доноров на вакцину КЭ используется при отборе доноров для иммунизации в отделе комплектования доноров СПК института и ГУЗ «Свердловская ОСПК», что позволило повысить эффективность вакцинации и увеличить титр специфических антител в иммуноглобулинах против клещевого энцефалита.

Апробация работы. Основные положения и результаты работы доложены на научно-практической конференции «Клиника, диагностика, профилактика, лечение клещевого энцефалита» (Киров, 1999), на итоговых научных конференциях Кировского НИИ гематологии и переливания крови (2000, 2002), на заседании областного общества гематологов и трансфузиологов (2001, 2005), на научно-практической конференции "Трансфузиология - проблемы перехода к компонентному донорству" (ГНЦ РАМН, Москва, 2002).

Личное участие автора в получении результатов. Автором изучена в динамике активность иммунного ответа доноров на вакцину клещевого энцефалита. В образцах плазмы крови 262 вакцинированных определены титры специфических антител методом РТГА. В 138 образцах иммунной плазмы доноров установлены титры иммуноглобулинов класса G к вирусу КЭ методом ИФА. Выявлены HLA-антигены, ассоциирующиеся с разной активностью антителопродукции. Разработана и апробирована функциональная модель для прогнозирования иммунного ответа индивида на вакцину КЭ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 2 в центральной печати.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 таблицами и 9 рисунками. Работа построена по традиционному плану и состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием объектов и методов, двух глав с изложением результатов исследования, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Библиография включает 187 источников, из них 111 отечественных и 76 зарубежных.

Диссертация выполнена в ФГУ «Кировский НИИ гематологии и переливания крови Федерального агентства по здравоохранению и 6

социальному развитию» (директор — проф. С.Л. Шарыгин) в лаборатории препаратов крови и кровезаменителей (руководитель - к.б.н. A.B. Дробкова), в лаборатории иммуногематологии (руководитель - проф. Г.А. Зайцева), на станции переливания крови института (главный врач - В.К. Куноф) в отделе комплектования доноров (заведующая - O.A. Вершинина), в клинической лаборатории (заведующая - М.В. Карпова). Фрагмент диссертации выполнен совместно с сотрудниками ГУЗ «Свердловская областная станция переливания крови» (главный врач - А.Ф. Соловьев).

Выражаю глубокую благодарность научному руководителю д.м.н. профессору Г.А. Зайцевой, ученому секретарю института к.м.н. доценту М.Е. Ковтуновой за помощь в подготовке диссертации.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объектом исследования являлись доноры, вакцинированные против КЭ с целью заготовки иммунной плазмы для производства специфических иммуноглобулинов. Группу наблюдавшихся формировали методом случайной выборки по мере согласия доноров на иммунизацию. Отбор доноров для иммунизации и контроль состояния их здоровья в процессе вакцинации осуществляли в соответствии с Приказом МЗ РФ №364 от 14.09.2001г. «Об утверждении порядка медицинского обследования донора крови и ее компонентов». Кровь/плазму сдавали 334 донора станции переливания крови института, 216 доноров - ГУЗ «Свердловская ОСПК». Возраст доноров варьировал от 20 до 54 лет. Учитывая возрастной интервал, выделили три группы доноров: I — от 20 до 29 лет, II — от 30 до 39 лет, III — 40 лет и старше (табл. 1).

Иммунизацию проводили «Вакциной клещевого энцефалита культуральной очищенной инактивированной сухой концентрированной» (в дальнейшем вакцина КЭ) производства Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН согласно прилагаемой к ней инструкции. Вакцину КЭ вводили подкожно, в подлопаточную область по одной из двух схем: двукратно в дозе 0,5 мл с интервалом 5-7 мес. (схема 1) и трехкратно по схеме 0,5 - 1,0 - 1,0 мл с интервалом 3-5 недель (схема 2). Ревакцинацию проводили однократно в дозе 0,5 мл через 1 год после завершения первичного курса вакцинации.

На СПК института по схеме 1 вакцинировали 51 донора, среди них 33 женщины и 18 мужчин, доноры I возрастной группы - 21 человек,

II - 16 человек, III - 14 человек. По схеме 2 вакцинировали 283 доноров. Среди вакцинированных было 176 женщин и 107 мужчин, доноры I возрастной группы - 86 человек, II - 145 человек, III - 52 человека. Ревакцинировали 152 человек, повторно ревакцинировали 65 человек. Доноров ГУЗ «Свердловская ОСПК» вакцинировали по схеме 2.

Таблица 1 — Общая характеристика наблюдавшихся лиц

Группы наблюдавшихся Использованная вакцина Кол-во наблюдавшихся Мужчины Женщины Возрастные группы

I II III

Доноры СПК института (вакцинация) Вакцина клещевого энцефалита культуральная очищенная концентрированная инактивиро-ванная сухая ФГУП «ПИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН» (г. Москва) 334 • 125 209 107 161 66

Доноры ГУЗ «Свердловская ОСПК» (вакцинация) 216 152 64 62 81 73

Доноры СПК института (ревакцинация I) 152 56 96 51 81 20

Доноры СПК института (ревакцинация II) 65 23 42 22 33 10

Больные с диагнозом КЭ - 11 5 6 2 2 7

Еще одну группу обследованных составили 11 человек, перенесшие в результате контактов с клещами заболевание с первичным диагнозом КЭ и состоявшие на учете в эпидемиологическом отделе областного центра Госсанэпиднадзора (ЦГСЭН). Возможность работы с картами больных КЭ была любезно предоставлена в эпидемиологическом отделе ЦГСЭН (заведующая - Л.В. Опарина).

Иммунный ответ индивида на вакцину клещевого энцефалита оценивали через 2 недели после окончания курса вакцинации по содержанию в плазме специфических антител. Уровень антител к вирусу клещевого энцефалита (АТ-ВКЭ) определяли методом РТГА с диагностикумом клещевого энцефалита сухим производства НПО «Вирион» (г. Томск) 8

в соответствии с инструкцией по применению, утв. МЗ СССР 19.04.1990 г. Коммерческий иммуноглобулин человека против КЭ производят из донорской плазмы с титром специфических антител не ниже 1:10. Активность специфического гуморального иммунитета на вакцину КЭ у 550 доноров изучали в динамике на протяжении периода сохранения минимально допустимого титра антител. В 178 образцах плазмы, полученных от вакцинированных доноров, активность антител определяли методом ИФА с использованием тест-системы «ВектоВКЭ-1§-стрип» согласно инструкции по применению. Для производства иммуноглобулинов титр специфических антител в плазме доноров должен быть не ниже 1:800.

У 236 доноров СПК института и 139 доноров ГУЗ «Свердловская ОСПК», иммунизированных вакциной КЭ, а также у 11 пациентов городской инфекционной больницы (ГИБ) определяли группу крови (ABO), резус-принадлежность, HLA-фенотип (локусы А и В). Установление группы крови ABO и резус-принадлежности проводили в соответствии с инструкциями, утвержденными приказом МЗ РФ №02 от 09.01.1998 г. HLA-фенотип определяли в лаборатории иммуногематологии института (руководитель -д.м.н., профессор Г.А. Зайцева) и в иммунологической лаборатории ГУЗ «Свердловская ОСПК» (заведующая - В.М. Минина). HLA-антигены исследовали в стандартном лимфоцитотоксическом тесте (Terasaki et al., 1970) с набором типирующих сывороток Российского НИИ гематологии и трансфузиологии (производство ЗАО Межрегиональный центр иммуногенетики и гистотипирующих сывороток «Гисанс»). Кроме того, у 40 доноров СПК института идентифицировали аллели локусов DRB1 и DQB1 системы HLA методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Оценка результатов исследования основывалась на сравнительном анализе частоты встречаемости тканевых антигенов и их сочетаний в группах доноров с активным и слабым иммунным ответом и в рандомизированной группе сравнения (795 интактных доноров). Расчет популяционно-генетических параметров производили с помощью программы «Антиген», разработанной Зайцевой Г.А. с соавторами. Существенность различий в характере распределения антигенов в сравниваемых группах определяли с помощью критерия х2 и ПРИ вычислении ошибки относительной величины. Учитывая многоаллельность системы HLA, проводили коррекцию уровня значимости р на число тестированных антигенов (Певницкий Л.А., 1988). Степень выявленных ассоциаций оценивали по критерию относительного риска (RR) и посредством вычисления этиологической фракции (EF).

Перейти от измерения отдельных параметров к оценке функционального состояния организма в целом позволило применение метода медицинской статусметрии (Разоренов Г.И., Поддубский Г.А., 1985). Составными частями метода являются: оценка информативности использованных признаков, минимизация их числа за счет исключения признаков с пренебрежительно малой информативностью, построение функциональной модели и выведение решающего правила для классификации объектов по альтернативному состоянию. Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета прикладных программ STATGRAPHICS (STSC Inc, США): Statgraphics Plus for windows 2.1, Copyright 1994 -1996 by Statistical Graphics Corp. Вероятность верной и ошибочной классификации оценивали методом дискриминантного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Активность гуморального иммунитета у вакцинированных.

С целью обеспечения сырьевой базы производства специфических иммуноглобулинов в 1996 году на СПК института внедрили метод иммунизации доноров вакциной КЭ. У вакцинированных против КЭ оценивали уровень специфических антител и продолжительность сохранения необходимого для производства иммуноглобулинов титра. В зависимости от выраженности иммунного ответа выделили две группы доноров: первая -доноры со слабым гуморальным ответом с титром АТ-ВКЭ ниже 1:10 и продолжительностью сохранения титров менее 60 дней, вторая - доноры с активным иммунным ответом с титром АТ-ВКЭ не ниже 1:10 и продолжительностью сохранения титра не менее 60 дней. При этом титр 1:10 считали низким, 1:20 - средним, 1:40 и более — высоким.

Исследовали эффективность двух схем вакцинации (табл. 2). Учитывали выраженность иммунного ответа как после вакцинации, так и при ревакцинации.

На вакцинацию по схеме 1 активной выработкой антител ответили 32 донора (62,7 %), иммунизация по схеме 2 вызвала активный иммунный ответ у 193 доноров (68,2%). Длительность циркуляции антител была прямо пропорциональна величине титра. Продолжительность сохранения протективного титра у доноров с низким титром АТ-ВКЭ составила в среднем 8 нед., со средним титром — 16-17 нед., с высоким титром -21-25 нед. 10

Таблица 2 - Иммунный ответ доноров на вакцину КЭ (по титрам специфических антител в РТГА)

Схема иммунизации Первичная иммунизация Ревакцинация I Ревакцинация II

Кол-во доноров Активный ответ Кол-во доноров Активный ответ Кол-во доноров Активный ответ

абс. % абс. % абс. %

1 51 32 62,7 31 23 74,2 11 9 81,8

2 283 193 68,2 121 85 70,2 54 46 85,2

В результате ревакцинации активными антителопродуцентами оказались при двукратной иммунизации 23 донора (74,2 %), при трехкратной иммунизации — 85 доноров (70,2%). Положительный иммунный ответ на повторную ревакцинацию наблюдали у 9 доноров (81,8%) и у 46 доноров (85,1%) соответственно при иммунизации по схеме 1 и схеме 2.

Различия в иммунном ответе доноров, вакцинированных по схемам 1 и 2, не были статистически значимы как в случае первичной иммунизации (х2 =0,36, р>0,05), так и при ревакцинации I и II (х2 =0,04, р>0,05; Х2=0,03, р>0,05 соответственно). Предпочтение отдали трехкратной вакцинации, которая позволяет в более короткие сроки заготовить иммунную плазму.

2. Сравнительное исследование титров антител к вирусу клещевого энцефалита у вакцинированных доноров методом РТГА и ИФА. Высокий процент доноров с отсутствием необходимого титра специфических антител может быть обусловлен низкой чувствительностью метода РТГА, который используют при отборе иммунной плазмы согласно утвержденной документации. В настоящее время одним из альтернативных диагностических тестов стал твердофазный иммуноферментный анализ.

С целью изучения преимуществ этого метода провели параллельное титрование 178 образцов плазмы крови вакцинированных доноров двумя указанными способами. Титры антител к ВКЭ ниже 1:10 в РТГА и не выше 1:400 в ИФА расценивали как низкую специфическую активность плазмы, титры АТ-ВКЭ >1:10 в РТГА и >1:400 в ИФА считали выраженной специфической активностью. Как следует из табл. 3, специфическая активность охарактеризована как низкая в 53 образцах плазмы (29,8%) по результатам РТГА, и в 44 образцах плазмы (24,7 %) в ИФА.

Таблица 3 - Специфическая активность плазмы доноров при

исследовании методами РТГА и ИФА

Специфическая активность РТГА ИФА

Титр антител Кол-во проб Титр антител Кол-во проб

абс. % абс. %

Низкая ниже 1:10 53 29,8 не выше 1:400 44 24,7

Выраженная 1:10-1:320 125 70,2 1:800-1:25600 134 75,3

Сравнительный анализ показал, что во всех образцах плазмы с титром антител 1:40... 1:320 в РТГА (24 пробы), методом ИФА выявлены титры 1§С 1:1600... 1:25600, т.е. также констатирована выраженная специфическая активность плазмы крови доноров. Образцам с титром 1:20 (45 проб) в РТГА соответствовали титры 1:800... 1:6400 (44 пробы) и 1:400 (1 проба) в ИФА. В образцах с титром 1:10 (56 проб) установили титры 1:800... 1:3200 (47 проб) и 1:400 (9 проб).

В образцах плазмы с низкой специфической активностью в РТГА (31 проба) выявили разную степень агглютинации. В 22 образцах плазмы с неполной агглютинацией (+2) методом ИФА установили титры 1:400...1:800. Вместе с тем среди образцов плазмы с неполной агглютинацией (+3) или с полной агглютинацией (+4) (31 проба) иммуноферментным методом определили титр специфических антител 1:400... 1:800 в 16 пробах (51,6%), титр 1:200 - в 10 пробах (32,2%), титр 1:100 -в 2 пробах (6,5%), титр антител менее 1:100 - в 3 пробах (9,7%).

Таким образом, при использовании ИФА удалось выявить больший процент образцов с выраженной специфической активностью плазмы, чем в РТГА (75,3% и 70,2% соответственно). Учитывая ббльшую информативность иммуноферментного анализа, сделали вывод, что тактика лабораторного исследования плазмы доноров с целью заготовки сырья для производства иммуноглобулинов против КЭ должна быть основана преимущественно на использовании ИФА. Вместе с тем, сравнение результатов титрования плазмы двумя методами показало, что высокий процент доноров с отсутствием достаточного для производства иммуноглобулинов титра специфических антител, по-видимому, связан не только с чувствительностью метода исследования, а в большей степени с индивидуальными особенностями организма.

3. Факторы, влияющие на активность иммунного ответа у доноров при вакцинации. Многолетняя практика иммунизации свидетельствует, что определенная часть привитых лиц не отвечает активной антителопродукцией на введение антигена. Действительно, при иммунизации 334 доноров СПК института вакциной КЭ у 109 человек (32,6%) установили слабый иммунный ответ. В результате иммунизации 216 доноров ГУЗ «Свердловская ОСПК» слабой антителопродукцией ответили 97 (44,9%) доноров. Плазма этих доноров не может быть использована для производства иммуноглобулинов против КЭ. Привлекать этих доноров к намеренной вакцинации нецелесообразно.

В настоящее время получены убедительные свидетельства того, что активность иммунного ответа на антиген/вакцину обусловлена генетически и в существенной мере определяется антигенным составом тканей организма. Научно обоснована и практически доказана возможность прогнозирования иммунного ответа на антиген.

У 334 доноров, вакцинированных против КЭ, проанализировали зависимость активности гуморального иммунитета от пола, возраста, групповой (ABO), резус-принадлежности

Распределение доноров по возрасту среди вакцинированных с активным и слабым иммунным ответом показано в табл. 4.

Таблица 4—Активность иммунного ответа у вакцинированных доноров разных возрастных групп

Возрастные группы Доноры с активным иммунным ответом (п=225) Доноры со слабым иммунным ответом (п=109) х2 Р

абс. % абс. %

I 78 72,9 29 27,1 1,83 >0,05

II 113 70,2 48 29,8 0,89 >0,05

III 34 51,5 32 48,5 8,52 0,0035

В выделенных группах процент активно ответивших на вакцину КЭ составил 72,9% (78 человек), 70,2% (113 человек), 51,5% (34 человека) соответственно в первой, второй и третьей группах. Доля доноров со слабым иммунным ответом составила 27,1% (29 человек), 29,8% (48 человек) и 48,5% (32 человека) соответственно. Доноры III возрастной группы достоверно

чаще отвечали на вакцину КЭ слабой выработкой специфических антител по сравнению с донорами других возрастных групп.

Среди 209 вакцинированных женщин активной выработкой антител ответили 157 (75,1%), среди 125 мужчин - 68 (54,5%) (табл. 5), т.е. у женщин достоверно чаще наблюдали активный гуморальный ответ.

Таблица 5 — Активность иммунного ответа в зависимости от пола вакцинированных

Пол Доноры с активным иммунным ответом (п=225) Доноры со слабым иммунным ответом (п=109) х2 Р

абс. % абс. . %

Женский 157 75,1 52 24,9 14,3 0,00015

Мужской 68 54,5 57 45,6

Среди вакцинированных с разной активностью иммунного ответа исследовали характер распределения антигенов системы (ABO) и антигена D системы Резус. Результаты исследования отражены в табл. 6.

Таблица 6 - Распределение эритроцитарных антигенов в группах доноров с разной активностью иммунного ответа

Доноры с активным Доноры со слабым

Антигены иммунным ответом (п=225) иммунным ответом (п=109) х2 Р

абс. % абс. %

0 84 70,6 35 29,4 0,6 >0,05

А 81 70,4 34 29,6 0,5 >0,05

В 46 60,5 30 39,5 1,7 >0,05

АВ 14 58,3 10 41,7 1,0 >0,05

Rh(D)+ 189 66,1 97 33,9 1,1 >0,05

Rh(D)- 36 75,0 12 25,0

Произведенные расчеты не позволили установить ассоциацию активности иммунного ответа с наличием эритроцитарных антигенов.

Таким образом, при изучении иммунного ответа доноров на вакцину КЭ выявили признаки (возраст и пол индивида), достоверно ассоциирующиеся с разной активностью иммунного ответа. Наибольший эффект иммунизации может быть достигнут при вакцинации женщин

молодого возраста. Однако учет лишь этих параметров недостаточен для эффективного отбора доноров при вакцинации.

Для разработки критериев прогнозирования иммунного ответа индивида на вакцину КЭ у 200 вакцинированных сопоставили активность антителопродукции с HLA-фенотипом. Группа доноров с активной антителопродукцией включала 110 человек, со слабо выраженным иммунным ответом — 90 человек. В результате исследования выявили положительную и отрицательную ассоциацию активности продуцирования специфических антител к вирусу КЭ с HLA-антигенами. Полученные данные убедительно свидетельствуют, что активный иммунный ответ доноров на вакцину КЭ ассоциирован с антигенами A3 (х2= 14,08; р=0,00018, рс< 0,05), В7 (х2=5,41; р=0,02014), В14 (х2=7,70; р-0,00560) и сочетаниями антигенов АЗ-В7, АЗ-В15; слабый иммунный ответ - с антигенами А19 (х2=5,09; р=0,0253), В13

(Х2=19,17; р=0,00001, рс< 0,05), В40 (х2=7,71; р=0,00580) и сочетаниями антигенов В13-В27 (х2=4,20; р=0,04042), А2-В13, А9-В13, А9-В40, А11-В15,

Частота встречаемости названных антигенов и сочетаний у доноров с разным иммунным ответом и в группе сравнения показана на рис. 1 и 2.

А19-В13.

%

45 40 35 30 25 20 15 10

50

□ группа сранения

■ активный иммунный ответ

□ слабый иммунный ответ

5-'" 0-ii

HLA-A3 HLA-B7 HLA-B14 HLA-A19 HLA-B13 HLA-B40

Рис.1— Частота встречаемости антигенов, с которыми ассоциируется иммунный ответ на вакцинацию

%

□ группа сранения

10 8

■ активный иммунный ответ

п

—fi-T-TL

□слабый иммунный ответ

АЗ-В7 АЗ-В15 В13-В27 А2-В13 А9-В13 А9-В40 А1Э-В13

Рис. 2 — Частота встречаемости сочетаний антигенов, с которыми ассоциируется иммунный ответ на вакцинацию

О силе ассоциации между активностью выработки специфических антител и наличием антигена судили по критерию относительного риска (RR) и этиологической фракции (EF). Величина EF показывает, что активный иммунный ответ у 15-19% доноров ассоциирован с антигенами HLA - A3, В7, а слабый ответ у 19% доноров связан с HLA - В13. Показатель RR позволил отметить, что в случае присутствия в фенотипе донора антигенов и сочетаний антигенов, с которыми ассоциируется выраженный иммунный ответ, вероятность активной антителопродукции увеличивается в 1,7-2,4 раза. При наличии в фенотипе донора антигенов и сочетаний антигенов, ассоциирующихся со слабым иммунным ответом, частота встречаемости лиц, отвечающих низкими титрами на вакцину КЭ, увеличивается в 1,6 - 6,6 раза.

Проанализировав характер иммунного ответа 122 доноров на ревакцинацию в зависимости от HLA-фенотипа, установили, что активный вторичный иммунный ответ ассоциирован с антигеном HLA-B14 (%2 =7,36, р=0,00660, RR=2,93, EF=0,08), слабо выраженный вторичный иммунный ответ обусловлен присутствием в фенотипе донора антигена HLA-B16 (X2 =12,35, р=0,00050, RR =4,19, EF =0,16) и сочетания антигенов А9-В13 (RR= 8,84, EF=0,05).

Таким образом, сделан вывод, что при комплектовании групп иммунных доноров целесообразно учитывать выявленные ассоциации.

Из данных литературы известна связь генов локусов DR и DQ системы HLA с активностью антителообразования при инфицировании различными антигенами. У 40 вакцинированных доноров определяли аллели генов локусов DRB1 и DQB1 и исследовали активность выработки специфических антител. Активно на вакцинацию ответили 19 человек (титр АТ-ВКЭ >1:10), слабый иммунный ответ зарегистрировали у 21 донора (титр АТ-ВКЭ <1:10). Отметили различие в частоте встречаемости специфичностей HLA-DRB1 *07, HLA-DRB1*10, HLA-DRB 1*12, HLA-DRB 1*17, HLA-DQB 1*0201, HLA-DQB1*0302, HLA-DQB1*301,*501 в группах доноров с разным иммунным ответом. Однако ввиду небольшой выборки обследованных не удалось четко констатировать ассоциацию активности иммунного ответа с наличием аллелей генов локусов DRB1 и DQB1. Сложность и высокая стоимость определения аллелей генов HLA класса II ограничивает возможность их использования в качестве маркеров прогнозирования иммунного ответа, хотя представляется нелишним продолжить эти исследования.

4. Выявление потенциально активных антителопродуцентов на основе учета комплекса присущих организму признаков. Чтобы повысить точность прогнозирования выраженности иммунного ответа, разработана функциональная модель на основе количественного учета комплекса присущих индивиду признаков.

В результате многочисленных сопоставлений показателей, свойственных донорам с разным иммунным ответом на вакцину КЭ, выделили 21 информативный признак: HLA-антигены AI, А2, A3, А9, А10, All, А19, А28, В7, В12, BI3, В14, В21, В27, В40, группы крови В, AB, отрицательный резус-фактор, возраст в интервале 20-29 лет ( W1), возраст в интервале 30-39 лет (W2), мужской пол (М). Перечисленные показатели вошли в качестве переменных в функциональную модель, связывающую значение дискриминантной функции (Z) - интегральный показатель активности антителопродукции - с набором информативных признаков.

Способ определения потенциального иммунного ответа на вакцину клещевого энцефалита осуществляется следующим образом. У донора определяют HLA-фенотип в стандартном микролимфоцитотоксическом тесте по набору типирующих сывороток, группу крови, резус-принадлежность, учитывают возраст и пол.

По формуле вычисляют интегральный показатель активности антителопродукции.

Z = — 0,8074 + 0,2608 х AI + 0,1993 х А2 + 1,3890 х A3 + 0,2842 х А9+ +0,7759 х хАЮ - 0,3302 х AI 1 - 0,2933 х А19 + 1,802 х А28 + 0,3659 х В7 + +0,5806 х В12 - 1,514 х В13+ 1,6456 х В14 + 1,8221 х В21 + 0,2853 х В27 -- 1,7906 х В40 - 1,1993 х В(Ш) - 1,5116 х AB(VI) - 0,3640 х М + 0,7729 х d + + 0,5610 х W1 + 0,5286 х W2

Признаки принимают значение 1, если они имеются у тестируемого лица, и 0 - если отсутствуют.

Величина — 0,8074 служит вводным коэффициентом. По разработанному правилу прогнозируют иммунный ответ донора: eomZ-> 0,220, прогнозируется активный иммунный ответ, если Z < - 0,210, прогнозируется слабый иммунный ответ, если — 0,210 < Z < 0,220 , решение неопределенное. Лиц с предположительно активным иммунным ответом рекомендуется включать в группу для иммунизации вакциной КЭ.

Способ определения потенциального иммунного ответа индивида на вакцину клещевого энцефалита апробирован у 36 типированных иммунных доноров СПК института и у 139 доноров ГУЗ «Свердловская ОСПК». В группе доноров института правильный прогноз иммунного ответа констатировали у 31 человека (86,1±5,8%), среди доноров ГУЗ «Свердловская ОСПК» прогноз осуществлен правильно у 109 человек (78,4±3,5%). У больных с диагнозом клещевой энцефалит прогноз иммунного ответа был корректен в 9 случаях из 11 (81,8 %). По-видимому, целесообразно использовать предложенный способ прогнозирования выраженности иммунного ответа не только для вакцинированных доноров, но и для инфицированных вирусом клещевого энцефалита.

Таким образом, разработан способ прогнозирования иммунного ответа индивида на вакцину клещевого энцефалита для отбора активных продуцентов специфических антител, заключающийся в построении функциональной модели и вычислении интегрального показателя активности антителопродукции по набору информативных признаков.

выводы

1. Разработаны критерии прогнозирования активности антителопродукции у лиц, иммунизированных вакциной клещевого энцефалита. Значимым для прогнозирования иммунного ответа оказалось наличие в фенотипе антигенов системы HLA - АЗ, В7, В13, В14 и комбинаций антигенов А2-В13, АЗ-В7, А9-В13, А19-В13. Активность гуморального иммунного ответа индивида на вакцину клещевого энцефалита зависит также от возраста и пола.

2. Предложена функциональная модель для отбора потенциально активных антителопродуцентов при иммунизации вакциной клещевого энцефалита, основанная на количественном учете комплекса присущих индивиду признаков, в числе которых пол, возраст, антигены систем HLA, ABO, Резус.

3. Вакцинация доноров против клещевого энцефалита является необходимым условием для обеспечения сырьевой базы производства специфических иммуноглобулинов. При этом количество серопозитивных доноров достигает 67,4%, что значительно превышает результаты серологического скрининга плазмы невакцинированных доноров на наличие антител к вирусу (7,6%).

4. Применение рекомендуемых инструкцией схем вакцинации не выявило статистически значимых различий в гуморальном иммунном ответе доноров. Для иммунизации с целью производства иммуноглобулинов предпочтительнее использовать трехкратную схему вакцинации, поскольку она позволяет в более короткие сроки получить требуемый уровень антител в плазме доноров.

5. Тактика лабораторного исследования плазмы доноров для производства иммуноглобулинов против клещевого энцефалита должна основываться преимущественно на использовании ИФА, позволяющего выявить на 5% больше образцов с необходимым для производства иммуноглобулинов титром антител.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработанная модель прогнозирования иммунного ответа доноров на вакцину КЭ рекомендуется для практического использования в учреждениях службы крови, осуществляющих иммунизацию с целью получения плазмы и иммуноглобулинов специфической направленности.

Комплектование групп доноров для иммунизации вакциной КЭ целесообразно осуществлять с учетом выявленных ассоциаций.

2. Для вакцинации доноров с целью заготовки иммунной плазмы рекомендуется применять «Вакцину клещевого энцефалита культуральную очищенную концентрированную инактивированную сухую» производства Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН (г. Москва) по трехкратной схеме иммунизации, поскольку она позволяет через 3-5 недель получить требуемый уровень антител в плазме доноров. Двукратная схема иммунизации обеспечивает необходимый эффект лишь через 5-7 месяцев.

3. Для выявления уровня специфических антител в плазме доноров целесообразно использовать ИФА, как более специфичный, чувствительный и информативный метод по сравнению с РТГА.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Вальцева JI.H. Сравнительная оценка эффективности вакцин клещевого энцефалита / JI.H. Вальцева, O.A. Вершинина., О.В. Мальцева, A.B. Лазыкина, С.Л. Шарыгин // Вопросы трансфузионной и клинической медицины: Материалы 6-й науч. конф. молодых ученых. - Киров, 1999. -С.23.

2. Вальцева Л.Н. О возможности прогнозирования характера иммунного ответа у доноров, иммунизированных вакциной клещевого энцефалита / Л.Н. Вальцева, Г.А. Зайцева, O.A. Вершинина, Е.Е. Старостина, С.Л. Шарыгин, В.А. Заречнев // Актуальные проблемы трансфузионной медицины: Материалы науч. - практич. конф. - Киров, 2000. —С.21.

3. Вальцева Л.Н. О возможности прогнозирования иммунологической реактивности доноров на вакцину против клещевого энцефалита / Л.Н. Вальцева, Г.А. Зайцева, O.A. Вершинина, В.А. Заречнев, С.Л. Шарыгин // Материалы науч. сессии Пермской государственной медицинской академии. - Пермь, 2001 г. - С.53.

4. Вальцева Л.Н. Изучение взаимосвязи между HLA-антигенами и характером иммунного ответа на вакцину против клещевого энцефалита / Л.Н. Вальцева, Г.А. Зайцева, М.В. Карпова, O.A. Вершинина, В.А. Заречнев // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии: Материалы науч,-практич. конф. - СПб, 2002 г. - С.245.

5. Вальцева Л.Н. Особенности распределения эритроцитарных и HLA-антигенов у доноров с разной активностью иммунного ответа на вакцину 20

против клещевого энцефалита / JI.H. Вальцева, Г.А. Зайцева, O.A. Вершинина, М.В. Карпова, В.А. Заречнев // Современные проблемы гематологии и трансфузиологии: Материалы науч.-практич. конф. - Киров, 2002.-С. 21-22.

6. Вальцева JI.H. Определение потенциального иммунного ответа доноров на вакцину клещевого энцефалита / Л.Н. Вальцева, Г.А. Зайцева, O.A. Вершинина, М.В. Карпова. // Проблемы гематологии и переливания крови: Материалы науч.-практич. конф. «Трансфузиология - проблемы перехода к компонентному донорству». - 2003. -№ 1. - С.39.

7. Вальцева Л.Н. Исследование серологической активности плазмы доноров, иммунизированных вакциной клещевого энцефалита / Л.Н. Вальцева, М.В. Карпова // Пробл. гематологии и переливания крови: Материалы науч.-практич. конф. «Трансфузиология — проблемы перехода к компонентному донорству». - 2003. -№ 1. - С.39..

8. Вальцева Л.Н. Особенности распределения HLA-антигенов у доноров с разной активностью иммунного ответа на вакцину клещевого энцефалита / Л.Н. Вальцева, Г.А. Зайцева, O.A. Вершинина, М.В. Карпова // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии: Материалы науч. практич. конф. - СПб, 2004 г. - С. 139.

9. Вальцева. Л.Н. Особенности иммунного ответа на вакцину клещевого энцефалита в зависимости от HLA-фенотипа донора / Л.Н. Вальцева, Г.А. Зайцева, О.И. Матрохина, М.В. Карпова, В.А. Заречнев // Вакцинология: Тез. I Всерос. конф. по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций». - М., 2004. - С. 12.

10. Карпова М.В. Сравнительное изучение методов выявления специфических антител к вирусу клещевого энцефалита в плазме крови доноров / М.В. Карпова Л.Н. Вальцева // Вестник молодых ученых: Материалы Всерос. конф. «Физиология и медицина». - СПб, 2005. -С.50.

11. Вальцева Л.Н. Разработка критериев прогнозирования иммунного ответа доноров на вакцину клещевого энцефалита / Л.Н. Вальцева, Г.А. Зайцева, М.В. Карпова, O.A. Вершинина // Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины. - Киров, 2005. -С. 37-40.

12. Вальцева Л.Н. Разработка способа прогнозирования иммунного ответа доноров на вакцину клещевого энцефалита / Л.Н. Вальцева, Г.А. Зайцева, М.В. Карпова, O.A. Вершинина // Пермский медицинский журнал. — 2006. - № 4. В печати.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АТ-ВКЭ - антитела к вирусу клещевого энцефалита

ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения

ГИБ - городская инфекционная больница

ГНЦ - Гематологический научный центр

ГУЗ - Государственное учреждение здравоохранения

ИФА — иммуноферментный анализ

КЭ - клещевой энцефалит

МЗ — Министерство Здравоохранения

ОСПК — областная станция переливания крови

ПИПВЭ - производство института полиомиелита и вирусных энцефалитов

РАМН - Российская академия медицинских наук

РТГА — реакция торможения гемагглютинации

РФ — Российская Федерация

СПК — станция переливания крови

ЦГСЭН - Центр Госсанэпиднадзора

HLA — человеческий лейкоцитарный антиген (human leucocyte antigen)

Актуальность проблемы.

Согласно рекомендациям ВОЗ (1982) одной из важнейших областей применения иммуноглобулинов является профилактика и лечение вирусных инфекций, резистентных к химиопрепаратам [74].

Актуальность проблемы профилактики и терапии КЭ определяется высоким уровнем заболеваемости, тяжелыми последствиями болезни и высокой летальностью (до 40%) [19, 50, 82, 110, 138]. Заболевание широко распространено на территории 27 стран, от Франции до Японии [23, 62, 142, 144, 171, 177, 179, 181]. В странах Европы ежегодно регистрируют до 3 тыс. случаев КЭ, при этом отмечают высокий уровень заболеваемости детей и подростков (до 70%) [130, 132, 168, 178]. В России во второй половине XX века ареал КЭ расширился, сложились благоприятные условия для повышения эпидемиологического потенциала природных очагов инфекции. Если до 1984 года показатель заболеваемости составлял 1,5-2,5 случая на 100 тыс. населения, то в последующий период он принимал значения от 3,5 до 7 случаев на 100 тыс. населения, что соответствует 5-10 тыс. случаев заболеваний КЭ в год [35, 36, 37, 62, 81]. Треть заболевших составляют дети [19, 20, 49, 62, 86]. Практически повсеместное распространение природных очагов КЭ на территории нашей страны указывает на необходимость создания эффективных мер профилактики и терапии этого заболевания [19,20, 73, 82, 85].

Практическое здравоохранение располагает двумя отечественными и тремя зарубежными вакцинами против КЭ, зарегистрированными в Федеральном агентстве по здравоохранению и социальному развитию [10,13,15,100]. Вместе с тем, ежегодно проводимая вакцинация охватывает лишь 2-3 млн. человек, что составляет около 2% населения РФ. По этой причине снижения общей заболеваемости КЭ не происходит [10, 48, 62, 73, 85]. Следовательно, необходимы препараты, которые могут обеспечить надежную защиту населения от клещевого энцефалита [15,19, 75,76].

На сегодняшний день основным средством терапии КЭ является донорский иммуноглобулин, содержащий антитела к вирусу клещевого энцефалита (ВКЭ) и предназначенный для внутримышечного или внутривенного введения [48, 61, 75, 76, 86, 99, 110]. Иммуноглобулин с высокими титрами специфических антител (более 1:320) используют для экстренной профилактики КЭ. Своевременное применение специфических иммуноглобулинов позволяет снизить заболеваемость КЭ более, чем в 5 раз, а в случае заболевания избежать осложнений и летальности [65, 87, 110]. Однако потребности здравоохранения в этих препаратах удовлетворены далеко не полностью [10, 45, 62, 99, 110, 132, 133]. Производство иммуноглобулинов против КЭ затруднено тем, что при использовании серологического скрининга плазмы невакцинированных доноров не удается заготовить необходимый объем иммунного сырья. Кроме того, причиной дефицита и высокой стоимости аллогенных иммунных препаратов крови является ограниченность кадров доноров, их большой отсев в процессе обследования и иммунизации [9, 66,93 17, 64, 66,93, 94^5].

Существующая система комплектования групп иммунных доноров не предусматривает учет генетически обусловленных особенностей иммунного'' ответа индивида на конкретную вакцину. При этом вакцинации подвергается значительная часть ареактивных в отношении продукции специфических? антител лиц. Плазма этих доноров не может быть использована для производства иммуноглобулинов, а антигенные нагрузки на организм донора оказываются неоправданными.

Заготовить необходимые объемы плазмы крови для производства иммуноглобулинов, повысить специфическую активность препаратов и одновременно рационально использовать донорский контингент позволяет новый подход к комплектованию групп иммунных доноров, а именно -целенаправленный отбор доноров, у которых предполагается активная выработка специфических антител [17, 55].

Иммунный ответ на вакцину трудно прогнозировать, однако это возможно. Необходимый эффект при вакцинации, по-видимому, в существенной мере определяется антигенным составом тканей организма [16, 17, 55, 64, 107]. Для ряда вакцин показана ассоциация иммунного ответа с антигенами лейкоцитов и эритроцитов [17, 55, 89]. В частности, разработан способ определения потенциальной активности антителопродукции индивида на стафилококковый и столбнячный анатоксины, в основу которого положена идентификация HLA-фенотипа у вакцинированных [17]. Исходя из сказанного, можно полагать, что перспективы иммунного донорства во многом связаны с решением проблемы целенаправленного отбора лиц с предположительно активной выработкой специфических антител, т.е. изучение критериев определения потенциального иммунного ответа доноров на вакцины весьма актуально.

Цель исследования - разработка критериев прогнозирования активности антителопродукции у доноров, иммунизированных вакциной клещевого энцефалита.

Задачи исследования:

1. Оценить иммунный ответ доноров на «Вакцину клещевого энцефалита ■ культуральную очищенную концентрированную инактивированную сухую» производства Института полиомиелита и вирусных энцефалитов, им. М.П. Чумакова РАМН (г. Москва) по титру специфических антител в реакции торможения гемагглютинации и по длительности сохранения титра. Сравнить активность антителопродукции у доноров в зависимости от схемы вакцинации.

2. Сопоставить титры специфических антител в образцах иммунной плазмы доноров при исследовании в реакции торможения гемагглютинации и иммуноферментном анализе.

3. Изучить характер распределения антигенов систем HLA, АВО, Резус у вакцинированных с разной активностью антителопродукци; исследовать выраженность иммунного ответа доноров в зависимости от пола и возраста.

4. Разработать функциональную модель для прогнозирования активности гуморального иммунного ответа индивида на вакцину КЭ.

5. Апробировать функциональную модель при вакцинации доноров на станции переливания крови ФГУ «КНИИГиПК Росздрава» и ГУЗ «Свердловская ОСПК».

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Интенсивность выработки специфических антител у лиц, вакцинированных против КЭ, ассоциирована с лейкоцитарными антигенами. Существует положительная и отрицательная ассоциация активности продуцирования специфических антител к вирусу КЭ с HLA-фенотипом. Комплектование групп иммунных доноров целесообразно осуществлять с учетом выявленных ассоциаций.

2. Активность гуморального иммунного ответа индивида на вакцину КЭ зависит от возраста и пола вакцинированного. Функциональная модель, построенная на основе количественного учета комплекса присущих индивиду признаков, в числе которых пол, возраст, антигены системы HLA, АВО, Резус, позволяет повысить точность прогнозирования выраженности иммунного ответа индивида на вакцину КЭ.

Научная новизна.

Впервые показана возможность прогнозирования иммунного ответа индивида на вакцину клещевого энцефалита. Выявлены факторы, влияющие на активность антителопродукции у доноров при вакцинации. Установлена связь интенсивности выработки специфических антител с HLA-фенотипом индивида. Разработана функциональная модель, позволяющая прогнозировать иммунный ответ на вакцину КЭ путем учета комплекса присущих организму признаков. Подана заявка на предполагаемое изобретение (уведомление о положительном результате формальной экспертизы от 4.04.2005 г., МКИ G01 №33/50).

Практическая значимость.

Представляется практически важным привлекать к иммунизации с целью производства специфических препаратов потенциально активных антителопродуцентов, тем самым создаются условия для рационального распределения ограниченных донорских ресурсов. Отказ от иммунизации ареактивных индивидов позволяет избежать неоправданных антигенных нагрузок на организм донора. Рекомендуемый способ прогнозирования иммунного ответа доноров на вакцину КЭ обеспечивает достаточную для практических нужд точность прогноза. Его применение позволяет повысить процент иммуноактивных лиц среди вакцинированных с 67,4±6,6% до 80±3,02%, что способствует увеличению объемов заготовки плазмы специфической направленности. Модуль для прогнозирования иммунного ответа, разработанный на Delphi (Приложение), позволяет использовать полученные в результате исследования данные в работе учреждений службы крови, занимающихся направленной иммунизацией доноров. Способ прогнозирования иммунного ответа доноров на вакцину КЭ используется при отборе доноров для иммунизации в отделе комплектования доноров СПК института и ГУЗ «Свердловская ОСПК», что позволило повысить эффективность вакцинации и увеличить титр специфических антител в иммуноглобулинах против клещевого энцефалита.

Апробация работы.

Основные положения и результаты работы доложены на научно-практической конференции «Клиника, диагностика, профилактика, лечение клещевого энцефалита» (Киров, 1999 г.), итоговых научных конференциях Кировского НИИ гематологии и переливания крови (2000 г., 2002 г.), заседании^ областного общества гематологов и трансфузиологов (2001 г., 2005 г.), научно-практической конференции "Трансфузиология - проблемы перехода к компонентному донорству" (ГНЦ РАМН, Москва, 2002 г.). По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 2 в центральной печати.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием объектов и методов, двух глав с изложением результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Библиография включает 187 источников, из них 111 отечественных и 76 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 9 рисунками и 19 таблицами.

выводы

1. Разработаны критерии прогнозирования активности антителопродукции у лиц, иммунизированных вакциной клещевого энцефалита. Значимым для прогнозирования иммунного ответа оказалось наличие в фенотипе антигенов системы HLA A3, В7, В13, В14 и комбинаций А2-В13, АЗ-В7, А9-В13, А19-В13. Активность гуморального иммунного ответа индивида на вакцину КЭ зависит от возраста и пола.

2. Предложена функциональная модель для отбора потенциально активных антителопродуцентов при иммунизации вакциной КЭ, основанная на количественном учете комплекса присущих индивиду признаков, в числе которых пол, возраст, антигены системы HLA, АВО, Резус.

3. Вакцинация доноров против клещевого энцефалита является необходимым условием для обеспечения сырьевой базы производства специфических иммуноглобулинов. При этом количество серопозитивных доноров достигает 67,4%, что значительно превышает результаты серологического скрининга' плазмы невакцинированных доноров на наличие антител к вирусу (7,6%).

4. Применение рекомендуемых инструкцией схем вакцинации не выявило статистически значимых различий в гуморальном иммунном ответе доноров. Для иммунизации с целью производства иммуноглобулинов предпочтительнее использовать трехкратную схему вакцинации, поскольку она позволяет в более короткие сроки получить требуемый уровень антител в плазме доноров.

5. Тактика лабораторного исследования плазмы доноров для производства и иммуноглобулинов против КЭ должна основываться преимущественно на использовании ИФА, позволяющего выявить на 5% больше образцов с необходимым для производства иммуноглобулинов титром антител.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одной из опасных нейровирусных инфекций, широко распространенных на территории нашей страны, является клещевой энцефалит, отличающийся тяжестью и длительностью течения, грубыми остаточными явлениями после перенесенного заболевания, высоким процентом летальных исходов (более 40% в районе Дальнего Востока) [10,23,108,133 ].

Основным средством профилактики и терапии этой инфекции является донорский специфический иммуноглобулин [46, 48, 61, 65, 76, 86, 87, 110, 111]. Введение иммуноглобулина позволяет создать в крови оптимальную концентрацию антител к ВКЭ, что необходимо для нейтрализации возбудителя. Однако потребности здравоохранения в этом препарате удовлетворяются далеко не полностью.

Производство иммуноглобулинов против КЭ затруднено тем, что при использовании серологического скрининга плазмы невакцинированных доноров не удается заготовить необходимый объем иммунного сырья. Кроме того, причиной дефицита аллогенных иммунных специфических препаратов крови является ограниченность кадров иммунных доноров, их большой отсев в процессе обследования и иммунизации. Известно, что далеко не каждый донор отвечает на вакцинацию выработкой антител в титре, достаточном для производства иммуноглобулинов. Поэтому представляется практически важным привлекать к иммунизации лиц с предположительно активной выработкой антител. Такой подход к комплектованию групп иммунных доноров позволяет рационально использовать донорский контингент, заготовить необходимые объемы иммунной плазмы и избежать неоправданных антигенных нагрузок на организм доноров.

В настоящее время доказано, что активность иммунного ответа обусловлена генетически, и в значительной мере определяется антигенным составом тканей организма [16, 55, 89, 103, 105, 107]. Для ряда вакцин разработаны критерии прогнозирования индивидуальной активности гуморального иммунного ответа [17, 55, 89].

Целью настоящего исследования явилась разработка критериев прогнозирования активности антителопродукции у доноров, иммунизированных вакциной клещевого энцефалита.

Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:

1. Оценить иммунный ответ доноров на «Вакцину клещевого энцефалита культуральную очищенную концентрированную инактивированную сухую» производства Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН (г. Москва) по титру специфических антител в реакции торможения гемагглютинации и по длительности сохранения титра. Сравнить активность антителопродукции у доноров в зависимости от схемы вакцинации.

2. Сопоставить титры специфических антител в образцах иммунной плазмы доноров при исследовании в реакции торможения гемагглютинации и иммуноферментном анализе.

3. Изучить характер распределения антигенов систем HLA, АВО, Резус у вакцинированных с разной активностью антителопродукци; исследовать выраженность иммунного ответа доноров в зависимости от пола и возраста.

4. Разработать функциональную модель для прогнозирования активности гуморального иммунного ответа индивида на вакцину КЭ.

5. Апробировать функциональную модель при вакцинации доноров на станции переливания крови ФГУ «КНИИГиПК Росздрава» и ГУЗ «Свердловская ОСПК».

Важнейшей характеристикой препаратов иммуноглобулина против вируса КЭ является содержание в них специфических антител, которое определяет эффективность препарата как лечебного средства и зависит от наличия соответствующих антител в исходном сырье - плазме крови доноров [55, 64, 99, 110, 111]. Традиционным методом заготовки сырья для получения специфических иммуноглобулинов является использование серологического скрининга донорской плазмы на наличие естественных антител к возбудителю. Скрининг 1160 образцов плазмы доноров из различных районов Кировской области, проведенный в 1996-1998 гг., показал, что количество лиц с содержанием антител к ВКЭ в плазме не менее 1:10 составляет в среднем 7,6% [54]. В результате исследования сделан вывод, что при использовании серологического скрининга плазмы невакцинированных доноров не удается заготовить необходимый для производства иммуноглобулина объем иммунного сырья.

В связи с вышесказанным уже в 1996 году на СПК института внедрили метод иммунизации доноров вакциной КЭ с целью обеспечения сырьевой базы производства. Для иммунизации использовали «Вакцину клещевого энцефалита культуральную очищенную инактивированную сухую концентрированную производства ФГУП «ПИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН». Инструкция по применению вакцины предусматривает использование двух схем иммунизации (двукратная и трехкратная) и ревакцинацию через 1 год после завершения первичного курса вакцинации. Вакцинировали 51 донора по схеме 1 и 283 , доноров по схеме 2.

Иммунный ответ индивида на вакцину клещевого энцефалита оценивали по содержанию в плазме специфических антител методом РТГА с диагностикумом клещевого энцефалита сухим производства НПО «Вирион» (г. Томск). Активность специфического гуморального иммунитета исследовали в динамике на протяжении периода сохранения необходимого для производства препарата титра антител. Среди вакцинированных доноров выделили две группы: первая - доноры со слабым гуморальным ответом с титром АТ-ВКЭ ниже 1:10 и продолжительностью сохранения титров менее 60 дней, вторая -доноры с активным иммунным ответом с титром АТ-ВКЭ не ниже 1:10 и продолжительностью сохранения титра не менее 60 дней. При этом титр 1:10 считали низким, 1:20- средним, 1:40 и более - высоким.

Провели сравнение эффективности схем иммунизации. На вакцинацию по схеме 1 активной выработкой антител ответили 32 (62,7 %) донора, иммунизация по схеме 2 вызвала активный иммунный ответ у 193 (68,2%) доноров. Длительность циркуляции антител была прямо пропорциональна величине титра. Продолжительность сохранения титра в случае выявления у доноров низких титров АТ-ВКЭ - в среднем 8 нед., в случае средних титров -16-17 нед., высоких титров -21-25 нед.

В результате ревакцинации активными антителопродуцентами оказались при двукратной иммунизации 23 (74,2 %) донора, после трехкратной иммунизации - 85 (70,2%) доноров. Положительный иммунный ответ на повторную ревакцинацию наблюдали у 9 (81,8%) доноров и у 46 (85,1%) доноров соответственно для иммунизации по схеме 1 и схеме 2. Различия в иммунном ответе доноров, вакцинированных по схемам 1 и 2, не были статистически значимы, как в случае первичной иммунизации (%2 =0,36, р>0,05), так и при ревакцинации I и II (%2 =0,04, р>0,05; %2 =0,03, р>0,05 соответственно). Предпочтение отдали трехкратной вакцинации, которая позволяет в более короткие сроки заготовить иммунную плазму.

Многолетняя практика иммунизации свидетельствует, что определенная часть привитых лиц не отвечает активной антителопродукцией на введение антигена. Действительно, при иммунизации 334 доноров СПК института вакциной КЭ у 109 человек (32,6%) отметили слабый иммунныйответ. В результате иммунизации 216 доноров ГУЗ «Свердловская ОСПК» активной выработкой антител ответили 119 (55,1%) доноров, слабой антителопродукцией - 97 (44,9%) доноров.

Таким образом, опыт иммунизации доноров показал, что более, чем у 30% вакцинированных титр антител к вирусу КЭ не достигает 1:10 в РТГА. Плазма этих доноров не может быть использована для производства иммуноглобулинов против КЭ. Привлекать этих доноров к намеренной вакцинации нецелесообразно.

Одной из причин высокого процента доноров с отсутствием протективного титра специфических антител может быть низкая чувствительность метода исследования. При отборе иммунной плазмы для производства иммуноглобулинов против КЭ используют метод РТГА согласно утвержденной документации. В настоящее время одним из альтернативных диагностических тестов стал твердофазный иммуноферментный анализ. С целью изучения преимуществ применения метода твердофазного ИФА для выявления уровня серологической активности донорской плазмы, исследовали 178 образцов сыворотки крови в параллельных опытах методом РТГА с диагностикумом КЭ производства НПО «Вирион» (г. Томск) и методом ИФА с использованием тест-системы «ВектоВКЭ-^-стрип».

Титры антител к ВКЭ менее 1:10 в РТГА и не более 1:400 в ИФА расценивали как низкую специфическую активность плазмы, титры АТ-ВКЭ 1:10 и выше в РТГА и выше 1:400 в ИФА считали выраженной специфической активностью. Специфическая активность охарактеризована как низкая в 53 образцах плазмы (29,8%) по результатам РТГА, и в 44 образцах плазмы (24,7 %) в ИФА.

Методом РТГА выраженная специфическая активность плазмы выявлена в 70,2% образцов (125 проб). Титр АТ-ВКЭ 1:10 выявили в 56 образцах (31,5 % ), титр 1:20 — в 45 образцах (25,3 %), с титром 1:40 - 9 % (16 проб), с титром 1:80 - 1,7 % (3 пробы), с титром 1:160 - 2,3 % (4 пробы), с титром 1:320 - 0,6% (1 проба). Специфическая активность охарактеризована как низкая в 53 образцах плазмы (29,8%).

Использование метода ИФА позволило отнести к группе с выраженной спецической активностью 75,3% образцов (134 пробы): ): титр 1:800 зарегистрировали в 47 образцах (26,4 %), титр 1:1600 - в 42 образцах (23,6 %), титр 1:3200 - в 27 образцах (15,2 %), титр 1:6400 - в 9 образцах (5,0 %), титр 1:12800 - в 3,4 % (6 проб), титр 1:25600 - в 1,7% (3 пробы). Низкую специфическую активность выявили в 15 образцах (8,40%) с титром антител менее 1:400 и в 29 образцах (16,30%) с титром 1:400.

Таким образом, показана более высокая чувствительность и специфичность ИФА при выявлении АТ-ВКЭ по сравнению с РТГА. Учитывая большую информативность метода ИФА, сделали вывод, что тактика лабораторного исследования плазмы доноров с целью заготовки сырья для производства иммуноглобулинов против КЭ должна быть основана преимущественно на использовании ИФА. Вместе с тем, сравнение результатов титрования плазмы двумя методами показало, что высокий процент доноров с отсутствием протективного титра специфических антител, по-видимому, связан не только с чувствительностью метода исследования, а в большей степени с индивидуальными особенностями организма.

На сегодняшний день получены убедительные свидетельства того, что активность гуморального иммунного ответа обусловлена генетически. Для многих вакцин показана ассоциация активности иммунного ответа с биологическими параметрами, в том числе и с тканевыми антигенами, в частности с антигенами лейкоцитов и эритроцитов. Таким образом, научно обоснована и практически доказана возможность прогнозирования иммунного ответа на антиген.

У 334 доноров, иммунизированных вакциной КЭ, проанализировали зависимость активности гуморального иммунитета от пола, возраста, групповой (АВО), резус-принадлежности. Доноры были разделены на три возрастные группы: I - от 20 до 29 лет (107 человек), II - от 30 до-39 лет (161 человек), III -40 лет и старше (66 человек).

В выделенных группах процент активно ответивших на вакцину КЭ доноров составил 72,9% (78 человек), 70,2% (113 человек), 51,5% (34 человека) соответственно в первой, второй и третьей группах. Доля доноров со слабым иммунным ответом составила 27,1% (29 человек), 29,8% (48 человек) и 48,5% (32 человека) соответственно. Доноры III группы достоверно чаще отвечали на ВКЭ слабой выработкой специфических антител.

Среди 209 вакцинированных женщин активно на вакцину КЭ ответили 157 (75,1%), среди 125 мужчин - 68 (54,5%). Расчеты показали, что женщины достоверно чаще отвечали активно на вакцину КЭ.

Среди вакцинированных с разной активностью иммунного ответа рассчитали частоту встречаемости групп крови (АВО) и антигена D системы Резус. Произведенные расчеты не позволили установить ассоциацию активности иммунного ответа с наличием эритроцитарных антигенов

Таким образом, при изучении иммунного ответа доноров на вакцину КЭ удалось выявить признаки (возраст и пол индивида), ассоциирующиеся с разной активностью иммунного ответа. Наибольший эффект иммунизации может быть достигнут при вакцинации женщин молодого возраста. Однако учет лишь этих параметров недостаточен для эффективного отбора доноров для намеренной вакцинации.

Для разработки критериев прогнозирования иммунного ответа индивида на вакцину КЭ у 200 вакцинированных сопоставили активность антителопродукции с HLA-фенотипом. Группа доноров с активной антителопродукцией включала 110 человек, со слабо выраженным иммунным ответом - 90 человек. В результате исследования выявили положительную и отрицательную ассоциацию активности продуцирования специфических антител к вирусу КЭ с HLA-антигенами. Статистическую значимость различий полученных результатов оценивали, используя критерий %2, уровень значимости а=0,05 (р<0,05) при df=l. Полученные данные убедительно свидетельствуют, что активный иммунный ответ доноров на вакцину КЭ ассоциирован с антигенами A3 (х2= 14,08; р=0,00018), В7 (х-5,41; р=0,02014), В14 (х2=7,70; р=0,00560) и сочетаниями антигенов АЗ-В7, АЗ-В15; слабый иммунный ответ - с антигенами А19 (х2=5,09; р=0,0253), В13 (х2=19,17; р=0,00001), В40 (х2=7,71; р=0,00580) и сочетаниями антигенов В13-В27 (х2=4,20; р=0,04042), А2-В13, А9-В13, А9-В40; А11-В15, А19-В13.

Чтобы оценить силу ассоциативной связи между способностью индивида к специфической антителопродукции и HLA-фенотипом, сопоставили частоту встречаемости HLA- антигенов в группах доноров с активной и слабой антителопродукцией с таковой в группе сравнения (795 интактных доноров). Определили показатель относительного риска (RR) и величину этиологической фракции (EF). Величина EF показывает, что активный иммунный ответ у 15-19% доноров ассоциирован с антигенами HLA - A3, В7, а слабый ответ у 19% доноров связан с HLA - В13. Показатель RR позволил отметить, что в случае присутствия в фенотипе донора антигенов и сочетаний антигенов, с которыми ассоциируется выраженный иммунный ответ, вероятность активной антителопродукции увеличивается в 1,7-2,4 раза. При наличии в фенотипе донора антигенов и сочетаний антигенов, с которыми ассоциируется слабый иммунный ответ, доля лиц, отвечающих низкими титрами на вакцину КЭ, увеличивается в 1,6 - 6,6 раза.

Проанализировав характер иммунного ответа 122 доноров на ревакцинацию в зависимости от HLA-фенотипа, установили, что активный вторичный иммунный ответ ассоциирован с антигеном HLA-B14 (% =7,36, р= 0,00660, RR=2,93, EF=0,08), слабо выраженный вторичный иммунный ответ обусловлен присутствием в фенотипе донора антигена

HLA-B16 х2 =12,35, р=0,00050, RR =4,19; EF=0,16) и сочетания антигенов А9-В13 (RR= 8,84; EF=0,05).

Исходя из вышеизложенного, разработали способ прогнозирования иммунного ответа донора на вакцину КЭ по наличию в фенотипе указанных антигенов. Для этого у донора берут 3-5 мл дефибринированной или гепаринизированной крови и выделяют из нее лимфоциты путем центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина. Определяют антигенный состав лимфоцитов в стандартном микролимфоцитотоксическом тесте по коллекции типирующих сывороток. При выявлении у донора антигенов^ В13, В16 или комбинации антигенов В13-В27, А2-В13, А9-В13, А9-В40, А11-В15, А19-В13 рекомендуется отклонять его от иммунизации, т.к. у носителей ? указанных антигенов зарегистрирован слабый первичный и вторичный иммунный ответ на вакцину КЭ. Лица, имеющие в фенотипе антигены A3, В7, В14 или сочетания антигенов АЗ-В7, АЗ-В15, отвечают более активной выработкой антител к вирусу КЭ, и поэтому при комплектовании групп иммунных доноров целесообразно привлекать этих лиц к иммунизации. Предложенный способ считали предварительным.

Из данных литературы известна связь генов локусов DR и DQ системы HLA с активностью антителообразования при инфицировании различными агентами. У 40 вакцинированных доноров определяли аллели генов локусов DR и DQ и исследовали активность выработки специфических антител. Активно на вакцинацию ответили 19 человек (титр АТ-ВКЭ >1:10), слабый иммунный ответ зарегистрировали у 21 донора (титр АТ-ВКЭ <1:10). Отметили различие в частоте встречаемости специфичностей HLA- DRB1*07, HLA-DRB1*10, HLA-DRB1*12, HLA-DRB1*17, HLA-DQB 1*0201, HLA-DQB 1*0302, HLA-DQB1*301,*501 в группах доноров с разным иммунным ответом. Однако ввиду небольшой выборки обследованных, не удается констатировать ассоциацию активности иммунного ответа с наличием аллелей генов локусов DR и DQ. Сложность и высокая стоимость определения аллелей генов HLA класса II ограничивает возможность их использования в качестве маркеров прогнозирования иммунного ответа.

Чтобы повысить точность прогнозирования выраженности иммунного ответа, разработана функциональная модель на основе количественного учета комплекса присущих индивиду признаков. В результате многочисленных сопоставлений показателей, свойственных донорам с разным иммунным ответом на вакцину, выделили 21 информативный показатель: HLA-антигены Al, А2, A3, А9, А10, Al 1, А19, А28, В7, В12, BI3, В14, В21, В27, В40, группы крови В, АВ, отрицательный резус-фактор, возраст в интервале 20-29 лет ( W1), возраст в интервале 30-39 лет (W2), мужской пол (М). Перечисленные показатели вошли в качестве переменных в функциональную модель, связывающую значение дискриминантной функции (Z) - интегральный показатель активности антителопродукции - с набором информативных признаков.

Способ определения потенциальной индивидуальной иммунореактивности осуществляется следующим образом. У донора определяют HLA-фенотип в стандартном микролимфоцитотоксическом тесте по набору типирующих сывороток, группу крови, резус-принадлежность, учитывают возраст и пол.

По формуле вычисляют интегральный показатель активности антителопродукции.

Z = - 0,8074 + 0,2608 х А1 + 0,1993 х А2 + 1,3890 х A3 + 0,2842 х А9 + 0,7759 х А10 - 0,3302 х Al 1 - 0,2933 х А19 + 1,802 х А28 + 0,3659 х В7 + 0,5806х хВ12- 1,514х В13+ 1,6456хВ14+ 1,8221 хВ21 +0,2853 хВ27- 1,7906 хВ40-- 1,1993 х В - 1,5116 х АВ - 0,3640 х М + 0,7729 х d + 0,5610 х W1 + 0,5286 х xW2

Признаки принимают значение 1, если они имеются у тестируемого лица, и 0 - если отсутствуют. Величина - 0,8074 служит вводным коэффициентом.

По разработанному правилу прогнозируют иммунный ответ донора: если Z > 0,220, прогнозируется активный иммунный ответ, если Z < - 0,210, прогнозируется слабый иммунный ответ, если - 0,210 < Z< 0,220 , решение неопределенное. Лиц с предположительно активным иммунным ответом рекомендуется включать в группу для иммунизации вакциной КЭ. При применении решающего правила уровень доверительной вероятности составляет 80%. Способ определения потенциальной иммунореактивности индивида на вакцину КЭ апробирован у 36 типированных иммунных доноров СПК института и у 139 доноров ГУЗ «Свердловская ОСПК» (г. Первоуральск).

В группе доноров института правильный прогноз иммунного ответа констатировали у 31 человека (86,1%) и неверный - у 5 человек (13,9%). Среди доноров ГУЗ «Свердловская ОСПК» прогноз осуществлен правильно у 109 человек (78,4%) и неверно - у 30 человек (21,6%). В целом правильно прогнозировали активность иммунного ответа у 80% доноров. У больных с диагнозом КЭ прогноз иммунореактивности был корректен в 9 случаях из И (81,8 %). По-видимому, целесообразно использовать предложенный способ прогнозирования иммунного ответа на основе учета комплекса присущих организму признаков не только для вакцинированных доноров, но и для инфицированных вирусом КЭ. Разработанная модель прогнозирования иммунного ответа доноров на вакцину КЭ может быть рекомендована для практического использования в учреждениях службы крови, осуществляющих вакцинацию доноров с целью получения плазмы или препаратов специфической направленности.