Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунологические особенности больных с новообразованиями органов пищеварительного тракта, выявленными миниинвазивными хирургическими методами

На правахрукописи

Рудаков Дмитрий Михайлович

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ БОЛЬНЫХ С НОВООБРАЗОВАНИЯМИ ОРГАНОВ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОГО ТРАКТА, ВЫЯВЛЕННЫМИ МИНИИНВАЗИВНЫМИ ХИРУРГИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ

14.00.36 - аллергология и иммунология 14.00.27 - хирургия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена на кафедре хирургических болезней и новых технологий с курсом стационар замещающих технологий Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Башкирского государственного медицинского университета Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию и на базе Республиканской детской клинической больницы Министерства здравоохранения Республики Башкортостан.

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

профессор Хайруллина Раиса Масгутовна

доктор медицинских наук,

профессор Галимов Олег Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Ярилин Александр Александрович

доктор медицинских наук,

профессор Алсынбаев Махамат Махаматуллович

Ведущая организация: Институт экспериментальной медицины Российской Академии Медицинских наук (г. Санкт - Петербург).

Защита диссертации состоится « 30 » июня 2005 г. в / " час. на заседании Диссертационного совета КМ 002. 124. 01 при Президиуме Академии наук Республики Башкортостан по адресу: 450014, г.Уфа, ул.Новороссийска, 105.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Уфимского филиала Федерального государственного унитарного предприятия «Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам «Микроген» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации «Иммунопрепарат» по адресу: 450014, г.Уфа, ул. Новороссийская, 105.

Автореферат разослан «_28_»_мая_2005 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Иммунная система играет ключевую роль в патогенезе развития и течения опухолей. С одной стороны, различные нарушения иммунологического противоопухолевого надзора увеличивают частоту появления новообразований; с другой — особенности иммунного статуса, предшествующие образованию опухоли, оказывают влияние на характер течения и развитие осложнений. Известно также, что растущие опухоли вырабатывают вещества, способные влиять на состояние иммунной системы. (Н.М. Бережная, В.Ф. Чехун, 2000г.). Таким образом, существуют многогранные взаимоотношения между опухолью и иммунной системой хозяина (А.Ю. Барышников, 2003г.).

В структуре онкологической заболеваемости населения большинства стран мира более половины приходится на долю новообразований органов пищеварения, причем в каждой стране имеются особенности соотношения частоты отдельных форм таких опухолей (Д.Г. Заридзе, 2000г.). В России среди первых пяти причин смерти от злокачественных новообразований после рака легкого и молочной железы, наиболее частыми формами являются рак желудка и кишечника (В.И. Чиссов, 2000г., М.И. Давыдова, 2003г.; Н.Н. Трапезников, Е.М. Аксель, 2001г.). По данным ВОЗ, число больных новообразованиями органов пищеварительного тракта непрерывно увеличивается. В последние десятилетия, в связи с внедрением эндоскопической техники и развитием миниин-вазивной хирургии, удалось значительно повысить выявляемость этой патологии в ранние сроки заболевания. Благодаря использованию эндоскопических манипуляций, стала возможной постановка клинико-морфологического диагноза уже при первом обращении больного за медицинской помощью. Важная особенность, сопровождающая эндоскопические биопсии - это небольшой объем материала, ограниченный размер которого сужает представление исследователя о степени дифференцировки, пролиферативной активности и инвазивных свойствах опухоли. Указанные обстоятельства становятся объективными факторами клинико-морфологической недооценки агрессивности новообразования. Улуч-

шению диагностики способствует внедрение передовых технологических приемов исследования, в частности, таких, как проточная цитометрия. Проточная цитофлуориметрия биопсийного материала, позволяет сочетать эндоскопическое и классическое патоморфологическое обследование с параллельным анализом цитометрических параметров клеток обнаруженной опухоли и клини-ко-лабораторными иммунологическими обследованиями.

Цель исследования: выявить особенности иммунного статуса у больных с новообразованиями пищеварительного тракта в зависимости от степени диффе-ренцировки и интенсивности пролиферации клеток из материала биопсий, полученных с использованием миниинвазивных хирургических методов.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ параметров иммунного статуса больных с новообразованиями пищеварительного тракта различной локализации в зависимости от степени гистологической дифференцировки, пролиферативной активности клеток и плоидности опухолей.

2. Определить показания к проведению проточной цитометрии биопсийного материала, полученного при эндоскопическом исследовании больного; оценить результаты применения проточной цитометрии с параллельным ДНК-анализом материала биопсий на раннем этапе диагностики.

3. Оценить значение миниинвазивных хирургических методов в ранней диагностике заболеваний органов пищеварительного тракта методом проточной цитометрии.

4. На основе сопоставления данных иммунологического и патоморфологи-ческого исследований с показателями проточной цитометрии биопсийного материала выявить параллели уровней катаплазии опухолей и изменений иммунного статуса пациентов.

Научная новизна. Впервые выявлены изменения иммунологического статуса больных новообразованиями пищеварительного тракта, коррелирующие с определенными значениями уровней катаплазии и степеней дифференцировки опухоли. Впервые обоснована целесообразность включения иммунологическо-

го исследования как составляющего оценки общего состояния пациентов, учитывая выявленные особенности измененного иммунного статуса больных. Впервые показана целесообразность внедрения проточной цитометрии с параллельным ДНК-анализом материала биопсий, полученных с использованием ми-ниинвазивных хирургических методов. Определены показания к проведению проточной цитометрии биопсийного материала, взятого при эндоскопическом исследовании больного.

Практическая значимость. Полученные в работе данные свидетельствуют о необходимости комплексного патоморфологического и цитометрического исследования биоптатов новообразований пищеварительного тракта с клинико-иммунологическим обследованием пациентов. Установленные изменения отдельных звеньев системы иммунитета могут служить дополнительными критериями оценки общего состояния больных с новообразованиями ПТ. Разработаны показания для проведения цитометрического исследования на проточном цитофлуориметре с параллельным ДНК-анализом биоптатов, полученных при эндоскопическом исследовании больных, которые способствуют улучшению онкологической диагностики на раннем этапе.

Положения, выносимые на защиту

1. Выявлена зависимость характер и выраженности иммунологических нарушений у больных с новообразованиями органов пищеварительного тракта от уровня катаплазии и степени дифференцировки злокачественных опухолей.

2. Пролиферативная активность различных по степени гистологической дифференцировки новообразований характеризуется типичными изменениями параметров клеточного цикла. Количество и кратность содержания ДНК в клетках (плоидность) исследованных опухолей отражает уровень катаплазии новообразований.

3. Высокоинформативным для цитометрического исследования является материал рутинных биопсий органов пищеварительного тракта, полученный в процессе первичного эндоскопического обследования. Данные ДНК-цитометрии клеток биопсийного материала опухоли и иммунологического ис-

следования больных взаимообогащают диагностический арсенал клинической хирургии.

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты исследования внедрены в работу городской клинической больницы (ГКБ) № 18, Централизованного патанатомического отделения (ЦПАО) ГКБ № 13, Центра иммуно-аллергологии РДКБ, г.Уфа.

Апробация работы. Материалы проведенных исследований представлены на VI11, IX Всероссийских научных форумах с международным участием «Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии» (СПб, 2005), IX итоговой научно-практической конференции с международным участием «Молодежь и медицинская наука в XXI веке» (Киров, 2005). Диссертация апробирована на межкафедральном заседании БГМУ (протокол № 1 от 01.04.2005г.), на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.124.01 при Президиуме Академии наук Республики Башкортостан (протокол № 33 от 26.05.2005г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе научных статей и методических рекомендаций. Оформлено 1 рационализаторское предложение.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах

машинописного текста, иллюстрирована_рисунками,_таблицами; состоит

из введения, 5 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций. Список литературы содержит 244 источника, из них 89 отечественных и 155 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Работа проведена на базе Центра им-муноаллергологии РДКБ, ЦПАО ГКБ №13, эндоскопического и хирургического отделений ГКБ № 18, № 8 и № 6, на кафедре хирургических болезней и новых технологий с курсом стационар замещающих технологий БГМУ.

Клиническому анализу были подвергнуты истории болезни 46333 больных, которым за период 2003-04 гг. произведены внутрипросветные эндоскопиче-

ские исследования на органах пищеварительного тракта. Верификация диагноза проведена на основании морфологических методов исследования. Рак пищевода выявлен у 47 больных; рак желудка у 326 обследованных. 1896 случая с полипами толстого кишечника составили более 26% от проведенных колоноско-пий; у 496 пациентов обнаружен рак толстого кишечника. Программа исследования включала несколько этапов. На первом этапе для патоморфологической идентификации был использован материал текущих биопсий. Основную группу составили 210 больных с впервые выявленным эндоскопически и гистологически установленным диагнозом новообразования. Первую рабочую группу составили больные с раком пищевода различной степени дифференцировки; во вторую включены больные с железистыми и недифференцированными раками желудка. Третья группа состояла из случаев аденокарциномы толстого кишечника. В каждой группе выделены подгруппы согласно уровню тканевой диффе-ренцировки опухоли. Для выявления цитометрических особенностей обнаруженных опухолей нами отобраны кусочки биоптатов, объем которых содержал не менее 90% опухолевой ткани. Группа сопоставления (далее - «контроль») объединяла пациентов с доброкачественными новообразованиями и хроническими воспалительными заболеваниями пищеварительного тракта.

Биоптаты слизистой оболочки фиксировали в 10% нейтральном формалине с последующей стандартной проводкой и заливкой кусочков тканей в парафин. Полученные на микротоме парафиновые срезы (3-5 мкм) окрашивали гематоксилином и эозином, по стандартной методике. После проведения светооптиче-ского исследования материал готовили для анализа на проточном цитофлуори-метре FASCalibur (Becton Dickinson, США), при этом толстые срезы (около 3040 мкм) с парафиновых блоков подвергали депарафинизации по методике: ксилол - этанол - дистиллированная вода по Camplejonh и соавт. (1985 г.), D.W. Hedley и соавт. (1983 г.).

Таблица 1 Объем и методы исследования

Ме-теды иееледоаашм Рабойая грущш Контрольная группа №гЗ<? ' Всего

Световая микроскопия, патомор-фологическое исследование 210 30 240

Проточная цитометрия и ДНК-анализ клеток биоптата 210 30 240

Иммунофенотипирование (СОЗ+, С04+, СБ8+, СШ6+, СБ 19+) 210 30 240

Иммуноглобулины крови (1ёА, 1йМ, 1йО, ЦИК, ФАГ, С*Н50 210 30 240

Люминолзависимая хемилюми-несценция крови 210 30 240

В каждом образце анализировалось не менее 30000 клеток. Полученные результаты подвергались первичной обработке с помощью программы ModiFit на совмещенным с прибором персональном компьютере (ПК)

Клеточное звено системы иммунитета изучалось на проточном лазерном ци-тофлуориметре FASCahbur (Becton Dickinson, США), методом проточной лазерной цитометрии с использованием моноклональных антител и определением относительного содержания основных субпопуляций иммунокомпетентных клеток и т н. маркеров активации

(CD25+, CD69+; HLA-DR).

Количественное определения иммуноглобулинов классов М, G, А, - проводилось методом радиальной иммунодиффузии в геле (по Манчини с соавт, 1963 г.) с обработкой данных программой «Иммуноглобулин», в режиме SC-4 Комплементарная активность сыворотки крови оценивалась по 50% гемолизу в гемолитических единицах С*Н50 (Меньшикова В В , 1987г) Количество циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) определяли при помощи метода, основанного на селективной преципитации комплексов антиген-антитело в 4% полиэтилен-гликоле с последующим фотометрическим определением плотности преципитата Фагоцитарная активность гранулоцитов (ФАГ) оценивалась по способности поглощать инертные частицы меламиноформальдегидных час-

тиц латекса, размером 1,5-2 мкл производства ВНИИ биологического приборостроения (Москва). Способность к выработке активных форм кислорода характеризовалась по данным спонтанной люминолзависимой хемилюминесценции цельной крови.

Результаты исследования обработаны на ПК с помощью методов вариационной статистики с определением средней арифметической (М), стандартного отклонения (m); коэффициента достоверности различий Стьюдента (t), с использованием стандартных программ в операционной среде 2000ХР с пакетом Microsoft® Office (MS Word 6,0, Excel 4.0).

Результаты и их обсуждение По результатам исследования были выявлены следующие особенности иммунореактивности в зависимости от локализации и степени дифференциров-ки новообразований. При изучении анализа иммунологических параметров крови больных раком пищевода (табл. 2) отмечено умеренное снижение абсолютного и относительного содержания лимфоцитов, которое сопровождалось уменьшением числа клеток, экспрессирующих маркер CD3+; причем в подгруппе низкодифференцированного рака пищевода данный показатель был ниже, чем в подгруппах высоко- и умереннодифференцированных раков. Количество клеток, экспрессирующих маркер CD 19+, недостоверно превышало контроль во всех подгруппах. Содержание иммуноглобулинов внутри группы раков пищевода достоверно не превышало контрольных данных. В подгруппах высоко- и умереннодифференцированных раков количество клеток с экспрессией CD4+ достоверно не отличалось от контроля; в подгруппе низкодифферен-цированного рака пищевода относительное содержание хелперной субпопуляции было достоверно ниже контроля и составило 83.6% от контроля. Показатели CD8+ субпопуляции внутри группы находились в рамках контрольных значений. Содержание естественных киллерных клеток в подгруппах умеренно и низкодифференцированного раков достоверно превышало значения контроля, причем больше всего клеток с маркером CD16+/CD56+ было в подгруппе низко-дифференцированных опухолей.

Таблица 2. Иммунологические показатели больных плоскоклеточным раком пищевода (подгруппы: 1-я - высоко-, 2-я - умеренно-, 3-я - низкодиффе-

ренцированый плоскоклеточный рак).

показатели Клинико-морфологические подгруппы

1-я 2-я 3-я контрольО

лейкоциты, 109/л 4.82±1,61 5.02+1,72 4.62+1,13 6.06+0.82

лимфоциты, (%) 34.20±1,91 33.84+2,13 31.22+2,82 ЗЗ.О1+1.61

CD3+, (%) 56,15±1,41 54,03+1,62 51,30+2,27 57.52+4.14

CD19+, (%) 14,83+2,31 15,02+2,41 14,12+3,01 12.10+2.79

CD4+, (%) 28,34±2,44 27,28+2,53 24,17+2,18* 29.78+3.23

CD8+, (%) 30,21+3,60 29,08+4,11 27,11+4,15 28.80+3.31

CD4+/CD8+ 0.93+0,21 0.91+0,27 0.88+0,17* 1.15+0,07

CD16+/CD56+,(%) 18.58+2,13 20.71+1,67* 21.41 + 1,49** 16.12+3.33

СД8+/СД16+ 1.62+0,32 1.40+0,П* 1.26+0,22** 1.79+0,28

Светосумма (у.е.) 7.53+2,20* 7.94+2,07** 9.64+3,14** 4.49+0,82

Наклон (у.е./мин) 0,27+0,04** 0.44+0,14** 0.23+0,02* 0.18+0,03

Ig А, г/л 4.02+0,84 3.77+1,22 2.67+1,15 3.64+1,41

Ig M, г/л 2.12+0,53 2.32+0,68 1.81+0,50 1.66+0,47

Ig G, г/л 1 12.40+4,13 12.81+2,91 11.93+3,33 9.32+3,15

ЦИК, у.е. 86,61+7,14** 118,31+9,11** 133,22+8,18** 52,16+5,74

ФАГ, (%) 31,27+3,17 33,25+2,88 27,18+3,77* 36,09+4,12

с*н 1:32 1:32 1:32 1:32

СД25+5,(%) 8.86+0,70* 7.9+0,93 6.52+2,02 6.79+1,21

HLA-DR, (%) 16.39+0,28* 15.95+0,65 17.36+1,23* 15.61+0,47

Примечание: достоверность отличия значений показателей от контроль-

ной группы: * - р<0,05; р<0,01.

Изучая экспрессию активационных маркеров на лимфоцитах крови больных раком пищевода, мы обнаружили в подгруппе высокодифференцированно-го рака пищевода более высокие уровень CD25+, достоверно превышавший контрольные значения и содержание в подгруппе умеренно и низкодифферен-цированных раков. Содержание ЦИК в группе достоверно превышало контрольные данные. Выявлена отчетливая тенденция к увеличению ЦИК по мере снижения степени дифференцировки опухоли. Показатели светосуммы и наклона при исследовании хемилюминесценции крови были выше контрольных во всех подгруппах.

1% А, г/л

Рис. 1. Иммунный профиль больных плоскоклеточным раком пищевода: 1 - высоко-, 2 - умеренно-, 3 - низкодифференцированный; 4 - контроль. Показатели СО, НЬЛ-ЭЯ, ФАГ - в %; ЦИК - в у.е.

Как видно из сводной диаграммы (рис. 1), существенной разницы содержания иммунологических параметров при сравнении внутри группы плоскоклеточных раков пищевода не наблюдалось, обнаруженные нами отличия между подгруппами носили неоднородный характер, и по ряду показателей сводились к тенденции. Возможно, это было связано с рядом свойств, определяющих клинические и, отчасти, иммунологические особенности в данной нозологической группе. Прежде всего, это раки так называемой старшей возрастной группы у пациентов со сниженной активностью метаболических процессов и подавлением общей резистентности организма. Возможно, этим объясняется как поздняя первичная диагностика данных опухолей в результате отсутствия выраженной клиники и жалоб, так и глубокое прорастание ими мягких тканей к моменту первичного обследования.

Вторая группа наблюдения включала больных железистым и недифференцированным раками желудка. В зависимости от степени тканевой зрелости опухоли, данная группа была разделена на пять подгрупп. При сравнительном изучении параметров, характеризующих иммунный статус этих пациентов, на-

ми получены следующие результаты (табл. 3): абсолютное и относительное количество лимфоцитов и лейкоцитов в периферической крови больных раками желудка значимо не отличалось от контрольных показателей. Относительное и абсолютное содержание В-лимфоцитов (CD19+) достоверно превышало контрольные данные в подгруппах с аденокарциномами. Сравнение количественных характеристик относительного содержания CD4+ субпопуляции в подгруппах существенной разницы не выявило. Показатель CD8+ фракции умеренно превышал контрольные значения во всех подгруппах Показатели содержания натуральных киллеров превышали контроль в подгруппах с недифференцированными раками. У пациентов с высоко и умереннодифференцированными аденокарциномами желудка выявлено усиление экспрессии маркера CD69+ по сравнению с контролем.

В периферической крови обследованных пациентов с колоректальными аденокарциномами содержание лейкоцитов и лимфоцитов достоверно не отличалось от контроля (табл. 4). Относительное и абсолютное содержание В-лимфоцитов достоверно превышало контрольные величины. Количество Т-хелперов имело тенденцию к снижению. Показатели CD8+ превышали контроль во всех подгруппах.

Количество Т-цитотоксических клеток было достоверно выше в подгруппе высокодифференцированных аденокарцином. Количество натуральных киллеров достоверно превышало контроль в подгруппах умеренно и низкодиффе-ренцированных раков кишечника; больше всего их оказалось в подгруппе низ-кодифференцированной аденокарциномы.

Таблица 3. Иммунологические показатели больных раком желудка (подгруппы: 1-я — высоко-, 2-я — умеренно-, 3-я - низкодифференцированый железистый рак; 4 и 5-я — перстневидноклеточный и аденогенный недифференцированные

раки).

показатели Клинико-морфологические группы

1-я 2-я 3-я 4-я 5-я контроль

лимфоциты, (%) 36,15±0,55 29,88±0,74 31,80±0,77 31,44±1,41 30,23±1,64 33,01±0,61

лейкоциты, (10ук/л) 5.61±1,11 5,46±0,87 5.10±1.44 4.52±0,65* 4.32±0,59* 6.06±0.82

СЭЗ+,(%) 64.33±2,31** 61.79±2,13* 62.54±3,14 60.63±3,52 61.3±4,31 57.52±4,14

С08+/С016+ 1.42±0,19 1.43±0,23 1.49±0,30 1.72±0,19 1.70±0,34 1.79±0,28

СШ9\ (%) 20.91±5,25* 21.36±3,56** 21.23±3,77** 19.74±4,89 22.08±5,12 12.11±2,79

С04+, (%) 26.81±2,00 25.53±1,01** 25.82*2,41 26.11±2,47 25,27±2,15 29.78±3.23

С08+, (%) 30.80±2,17 31.58±2,50 32.09±1,83* 34.14±3,62** 31.95±2,77 25.80tt4.31

СШ6+/С056*, (%) 12,70±2,23 12,41 ±2,04 11,41±1,32* 19.59±2,08 21,84±2,34** 16.12±3.33

Светосумма, (у.е.) 9.52±2,47** 16,23±2,8** 14,05±3,11** 11,84±4,17* 14,96±4,07** 4,49±0,82

Наклон, (у.еУмин) 1,16±0,23** 0,73±0,31** 1,13±0,27 1ДЗ±0,19 0,8±0,17 0,18±0,03

1ё А, (г/л) 5,88±1,54 2.75±0,47 3,12±0,87 2,43±0,34 2.73±0,65 3,64±1,41

18М,(г/л) 1,58±0,68 1,93±0,27 1,26±0,54 1,06±0,42 1.41 ±0,62 1,66±0,47

18 О, (г/л) 12,20±2,92 10,86±2,77 9,27±2,79 10,24±3,21 9,84±2,61 9,32±3,15

ЦИК, у.е. 98,13±8,89** 112,44±11,61** 146,12±11,82** 161,27±14,74** 152,24± 14,40 52,16±5,74

ФАГ, (%) 32,31±3,17 29,18±2,51 27,04±0,87* 28,24±1,69 26,11±1,84** 36,09±4,12

С*Н5о 1:16 1:16 1:16 1:32 1:16 1:32

С025+, (%) 9,12±0,77* 9,16±1,35* 8,98±1,11* 5.63±1,26 5.71±0,82 6.79±1,21

СЭ69+, (%) 9.54±1,34 10.38±1,27** 8.72±2,33 9.29±2,68 8.94±2,63 7.54±1,37

Ш-А-ОЯ, (%) 14.64±2,12 15.88±2,38 12.71±3,11 11.90±2,84 10.77±2,18 15,61±0,47

Примечание: достоверность отличия значений показателей от контрольной группы: * - р<0,05; ** - р<0,01.

Соотношение CD8+/CD16+,CD56+ имело тенденцию к снижению по мере уменьшения степени дифференцировки опухолей. Содержание иммуноглобулинов основных классов во всех подгруппах не отличалось от контрольных величин.

Таблица 4. Иммунологические показатели больных колоректальным раком (подгруппы: 1-я - высоко-, 2-я - умеренно-, 3-я - низкодифференцированый

железистый рак).

показатели Клинико-морфолощческш «рущш

? г 2-4' ' -

лейкоциты, (10ч/л) 5.7Ш.41 5.89±1.28 5.63±1.48 6 06±0.82

лимфоциты, (%) 34.7±1.63 33.9±1.82 34.1±1.33 33 0Ш.61

1CD3+, (%) 64.18±2,47** 62.17±2,16 58.70±3,02 57.52±4.14

CD19+, (%) 21.05±3.91** 19 96±1.76** 20.62±2.78** 12.10±2.79

CD4+, (%) 29.21±2,93 27.63±3,13 26.10±2,18 29.78±3.23

CD8+, (%) 35.43±3,28** 34.89±4,11* 31.92±4,26 28.80±3.31

CD4+/CD8+ 0,82±0,21** 0,79±0,28* 0,81±0,18** 1.15±0,07

CD16+/CD56+, (%) 21.49±3.81 23.63±4 01** 25.94±2 82** 16.12±3.31

CD8+/CD16+ 1.66±0,21 1.48±0,25 1.34±0,15** 1.79±0,28

Светосумма, (y.e.) 10,48±2,17** 14,67±2,89** 13,37±3,24** 4.49±0,82

Наклон, (у.е./мин) 0,71±0,09** 1.03±0,15** 2,07±0,17** 0.18±0,03

Ig А, (г/л) 3,74±1,43 2,49±0,75 2,67±0,91 3.94±1,41

Ig M, (г/л) 1,37±0,41 1,78±0,63 1,45±0,48 1.66±0,47

Ig G, (г/л) 14,29±2,01* 12,6±3,62 13,8±3,80 9 32±3,15

ЦИК, (y.e.) 102,80±9,87 132,63±11,71 157,12±16,03 52,16±5,74

ФАГ,{%) - 34.24±3,82 32.87±2,12 29.0±2,84** 36,09±4,12

с*н50. . 1:32 1:16 1:16 1:32

CD25+, (%) 17,72±4,16** 15,41±4,72** 4.95±0,72* 6.79±1,21

CD69+, (%) 18.12±6,33** 17.33±7,16** 14.1±3,90** 7.54±1,31

HLA-DR, (%) 19.15±4,37 17.80±3,85 18.4±6,06 15 60±0,47

Примечание: достоверность отличия значений показателей от контроль-

ной группы: * - р<0,05; ** - р<0,01.

Экспрессия маркеров ранней активации на Т-лимфоцитах превышала контрольные величины во всех подгруппах, за исключением экспрессии CD25+B подгруппе низкодифференцированной аденокарциномы.

Согласно Международной классификация опухолей (ВОЗ, 1993г.), меньшему уровню катаплазии рака желудка соответствует высокодифференциро-ванная аденокарцинома, большему - низкодифференцированная, а недиффе-

ренцированный рак - крайне выраженной степени. Анализ полученных нами при цитометрическом исследовании данных свидетельствует о наличии достоверной связи между относительным количеством (%) анеуплоидных клеток в опухоли и ее пролиферативной активностью.

Сравнение показателей клеточного цикла в подгруппах с относительно зрелыми раками пищевода выявило, что различие показателей пролиферативной активности опухолей наиболее достоверны по признаку плоидности (табл. 5). Гистологический уровень дифференцировки имеет значение для низкодиф-ференцированных опухолей.

Таблица 5. Распределение клеток по фазам клеточного цикла при диплоидном и анеуплоидном типах рака пищевода.

.» ■ ччи >■«». " "< .......... ТМ^ ъ ■ . >. £ , , Фазы клеточного писца Индекс пролйферации : '> (8+02+М) (%) : к

. ООА1 (%) ог+ыт

Диплоидные 81,2±1,8 4,22±0,5 14 6±1,4 18.8±0,7

Анеуплоидные 72,6±3,8* 11,3±1,2* 16,1 ±2,7* 27,4± 1,95*

Примечание: * - по сравнению со средними величинами при диплоидном типе опухоли достоверно (р<0,05).

Сравнение показателей клеточного цикла в подгруппах раков желудка (табл. 6) не выявило достоверной разницы между подгруппами высоко и умеренно-дифференцированных аденокарцином, не отмечено значимых отличий и между подгруппами недифференцированных раков. Однако показатели пролиферативной активности опухолей этих подгрупп значительно отличались от подгруппы низкодифференцированных аденокарцином.

Таблица 6. Показатели цитометрического исследования и ДНК-анализа клеток рака и неопухолевых поражений слизистой желудка (контроль)

показатели „ л * 4 *' .^ЛИНИКО-МОрфбДОЙ! веские ггодгрунпы „

' , 1-я .* •; 2-я - 3-я ' ,-4-я' " » 5-я контроль

Частота ане-уплоидии% 60.5 57 9 100 100 100 0

Б1 1.19±0 06 1.14±0.03 2.54±0.11 1.42±0.07 1.34±0.11 1

Р1 19,89±3,75 17.7±2.70 24,72±6,12 22,7±2.20 22,4±4.10 15,24±7,75

Примечание: DI - индекс ДНК; PI - пролиферативный индекс.

При этом очевидно выраженное отличие цитометрических свойств дифференцированных и недифференцированных опухолей. Исследование структуры ДНК-гистограмм (рис. 2) показало, что на указанные выше особенности большое влияние оказал феномен поликлональности и клеточной гетерогенности новообразований. Использование свойства плоидности в качестве критерия для сравнения цитометрических параметров раков желудка, выявило значительное усиление пролиферативной активности анеуплоидных образований.

Debns Aggregates DipG1 Dtp G2 An) 01 An1 GZ An! S

Рис. 2. Гистограмма, типичная для недифференцированного перстневид-ноклеточного рака желудка.

Сопоставление показателей клеточного цикла и пролиферативной активности в ряду колоректальных раков (табл. 7) выявило убедительные различия в значениях между подгруппами относительно зрелых и низкодифференцирован-ных аденокарцином. При общем значительном превышении контрольных значений пролиферативного потенциала во всех подгруппах аденокарцином толстого кишечника, наиболее рельефно интенсивность опухолевой пролиферации была выражена в анеуплоидных бластомах.

Таблица 7. Показатели цитометрического исследования и ДНК-анализа клеток железистого колотерального рака и неопухолевых поражений слизистой толстого кишечника (контроль).

показатели Клинико-морфологические подгруппы

1-я 2-я- 3-я контроль

частота анеуплоидии,% 47,1 75 100 0

DI 1,52±0,16 1,43+0,11 1,74+0,04 1

PI 17,90+3,43 22,41+2,23 26,04+5,91 9,60+1,64

Примечание: DI - индекс ДНК; PI - пролиферативный индекс.

Выявленный приоритет свойства плоидности в ряду цитоморфологиче-ских характеристик новообразования убедил нас в том, что для определения зависимости иммунореактивности от степени злокачественности опухоли, необходимо провести сравнительный анализ иммунологических параметров в группах с анеушюидным и диплоидным содержаниями ДНК, результаты которого представлены далее.

250

Рис. 3. Иммунный профиль больных с 1 - диплоидным и 2 - анеуплоид-ным типами рака пищевода; 3 - контроль. Показатели СО, НЬЛ-ЭЛ, ФАГ - в %; ЦИК - в у.е.

При раках пищевода (рис. 3) содержание лейкоцитов и лимфоцитов в обеих подгруппах плоидности было ниже контрольных данных. По данным

комплексного обследования, мы сделали общий вывод, что у больных раком пищевода в подгруппе с анеуплоидным набором ДНК угнетено Т-клеточное звено иммунного ответа (по относительному содержанию CD4+, CD25+, CDS*), в то время как гуморальная активность несколько стимулирована (показатели CD19+,IgM,IgG,UHK).

Таблица 8. Иммунологические показатели больных диплоидным и анеуп-

лоидным типами рака желудка.

Показатели Типы

диплоидный анеуплоидный контроль

лейкоциты, (109/л) 5,22+1,47 4,27+1,73 6.06+0.82

лимфоциты, (%) 34.12±0,74 32,2+0,92 33,01+0,61

CD3+, (%) 60.75+2,14 63.78+2,08 57.52+4,14

CD8+/CD16+ 1.70+0,34 1.36+0,17* 1.79+0,28

CD47CD8+ 0,93+0,35 0,83+0,17 1,15+0,07

CD19+,(%) 16.27+3,41 21.19+6,16** 12.11+2,79

CD4+, (%) 28,42+3,16 26,65+2,52 29.78+3.23

CD8+, (%) 30.46+2,78 32.11+3,21 28.80+3.31

CD16+/CD56+, (%) 18.87+2,09 23.53+3,49** 16.12+3.33

Светосумма, (у.е.) 4.80+1,67 9.27+2,53** 4,49+0,82

Наклон, (у.е./мин) 0.32+0,H 1,32+0,29** 0,18+0,03

lgA, (г/л) 4.51+0,37 2.68+0,65 3,64+1,41

^М,(г/л) 1.83+0,67 1.03+0,31 1,66+0,47

IgG,(r/fl) 12.16+3,17 19.47+2,77** 9,32+3,15

ЦИК,(у.е.) 114,00+12,59** 152,43+16,21** 52,16+5,74

CD25+, (%) 9,32+0,76 7,44+1,61 6.79+1,21

HLA-DR, (%) 16.32+3,84 15.89+2,63 15.61+0,47

CD69+, (%) 14.71+2,79** 12.17+3,09* 7.54+1,37

Примечание: достоверность отличия значений показателей от контроль-

ной группы: * - р<0,05; ** - р<0,01.

Кроме того, значимо отличается в подгруппах с диплоидным и анеуплоидным наборами ДНК содержание натуральных киллеров: в подгруппе с анеу-плоидией оно достоверно выше, чем в контроле и в подгруппе с диплоидией. Соотношение СВ8+/СБ16+,СБ56+ выше нормы в первой подгруппе и гораздо ниже контрольных данных - во второй. Содержание СБ25+, являющееся маркером ранней активации Т-клеток, выше в подгруппе больных раком пищевода с

диплоидным содержанием хромосом. Кроме того, в подгруппе с анеуплоидным составом нами выявлена значимая обратная зависимость между содержанием СБ25+ и индексом ДНК (Б1).

Сравнительный анализ экспрессии клеточных маркеров на лимфоцитах крови больных раком желудка (табл. 8) продемонстрировал достоверное увеличение В-лимфоцитов и натуральных киллеров в группе с анеуплоидным содержанием ДНК. В группе с диплоидным содержанием хромосом аналогичные показатели также имели тенденцию к превышению, достоверно не отличаясь от контроля. Кроме того, значительные различия в подгруппах с анеу- и диплои-дией обнаружены в показателях, характеризующих гуморальный ответ и неспецифическую резистентность организма. Так, значения светосуммы и наклона кривой хемилюминесценции крови больных с анеуплоидией, достоверно превышали контроль и характеристики подгруппы с диплоидным набором ДНК.

С 04+ С08+ С04+1С08+ С016+ С025+ Н1_А-0Я

«диплоидный ' анеуплоидный «контроль

Рис. 5. Иммунный профиль больных с диплоидным и анеуплоидным типами рака кишечника. Показатели СБ, НЬА-ОИ. - %.

Возможно, это связано с тем, что в группу с анеуплоидией вошли преимущественно, и прежде всего, низко- и недифференцированные раки желудка, склонные к ранней изъязвляемости, и высокие показатели наклона и светосум-мы свидетельствовали о наличии тканевой деструкции. Содержание иммуноглобулинов в обеих подгруппах плоидности достоверно не отличалось от кон-

трольного, но в подгруппе с диплоидией содержание 1&А. имело тенденцию к превышению контроля, а в подгруппе с анеуплоидным набором достоверно превышал норму титр ^в. Содержание ЦИК достоверно было выше контрольного. Количество выявленных фенотипически детерминированных маркеров активации, использованных нами, незначительно превышали контрольные значения, несколько более - при диплоидном типе рака желудка.

В подгруппе больных колоректальным раком (рис. 5) с диплоидным набором хромосом достоверно выше относительное содержание как CD4+, так и CD8+ субпопуляций, чем в подгруппе с анеуплоидией, причем их соотношение не отличается в обеих подгруппах. Количество натуральных киллеров оказалось достоверно выше в анеуплоидной подгруппе, как по сравнению с диплоидной подгруппой, так и с группой контроля. Мы объяснили данный факт тем, что, во-первых, анеуплоидные раки обладают более активным инфильтратив-ным ростом, инвазируя в сосуды лимфодренажа, и единичные мутировавшие клетки, попадая в кровоток, становятся объектом цитолиза QZJ16+/CD56+. Кроме того, аденокарциномы толстой кишки часто развиваются из малигнизиро-ванных железистых полипов, морфологические структуры которых способны какое-то время сдерживать инвазивный рост в пределах новообразования. Что касается фенотипической экспрессии маркеров активации (CD25+, CD69+, НЬА^Я), она была достоверно выше на клетках диплоидной подгруппы, по сравнению с контролем и группой с анеуплоидным содержанием хромосом. Титр иммуноглобулинов классов А и М было выше в подгруппе с диплоидией по сравнению с анеуплоидной, в то время как в последней содержание ЦИК значительно превышало аналогичный показатель в подгруппе с диплоидным набором ДНК.

Таким образом, сравнительный анализ иммунологических параметров пациентов с новообразований пищевода выявил достоверное увеличение маркеров CD25+, БЬА^Я в ряду высокодифференцированного рака, увеличение КК клеток в случаях с умереннодифференцированными и снижение хелперной субпопуляции (CD4+) и фагоцитарной активности микрофагов наряду с увели-

чением КК и БЬА^Я - в подгруппе с низкодифференцированными бластома-ми. Анализ аналогичных показателей у больных раком желудка обнаружил достоверное увеличение CD 19+, CD25+, CD3+ у больных с высокодифферен-цированным раком; помимо этого, в подгруппе с умереннодифференцирован-ными аденокарциномами выявлено снижение содержания CD4+. Низкодиффе-ренцированные аденокарциномы характеризовались увеличением содержания CD25+, CD8+, CD 19+. У больных с недифференцированным раком было снижено содержание лейкоцитов, ФАГ; увеличено количество КК. Иммунный статус при колоректальных аденокарциномах независимо от степени тканевой зрелости характеризовался увеличением CD69+, CD 19+, КК , снижением ФАГ; содержание CD25+ превышало данные контроля в случаях с высоко и умерен-нодифференцированными раками, и было ниже контрольных данных в подгруппе с низкодифференцированными. Общим для всех раков пищеварительного тракта было достоверное увеличение показателей спонтанной хемилюми-несценции крови и ЦИК.

Проведенное в соответствие с поставленной целью комплексное исследование иммунного статуса у больных с выявленными новообразованиями обнаружило наличие таких его особенностей, анализ которых позволил установить зависимость между уровнем катаплазии опухоли и глубиной изменения иммунологических показателей. Сравнение показателей клеточного цикла в подгруппах с различной степенью дифференцировки раков органов пищеварительного тракта выявило, что различие показателей пролиферативной активности опухолей наиболее достоверны по признаку плоидности.

ВЫВОДЫ

1. Сравнительный анализ иммунологических параметров в зависимости от степени дифференцировки опухоли в случае с новообразованиями пищеварительного тракта выявил меньше особенностей, и они были менее выраженными, чем при сравнении аналогичных показателей в ряду опухолей с диплоидным и анеуплоидным набором хромосом, независимо от степени их дифферен-цировки.

2. В результате применения проточной цитометрии материала первичных эндоскопических биопсий новообразований органов ПТ выявлены различные уровни пролиферативной активности опухолей, одинаковых по степени гистологической дифференцировки. Достоверно эти различия проявились у высоко и умереннодифференцированных злокачественных новообразований ПТ при сравнении диплоидного и анеуплоидного типов опухолей, чем обоснована необходимость дополнительного исследования методом проточной цитометрии биоптатов высоко- и умереннодифференцированных новообразований органов ПТ.

3. Эндоскопическое исследование позволяет использовать возможности проточной цитометрии на самом начальном этапе хирургической диагностики новообразований ПТ, данные которого определяют уровень их пролиферативной активности.

4. Комплексное исследование иммунного статуса у больных с впервые выявленными новообразованиями ПТ выявило наличие его особенностей у пациентов с недифференцированными раками и низкодифференцированными аде-нокарциномами желудка и кишечника, анализ которых позволил установить зависимость между уровнем катаплазии опухоли и глубиной изменения иммунологических показателей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Больным с впервые выявленными новообразованиями органов ПТ целесообразно проводить клиническое и лабораторное иммунологическое обследование, результаты которого могут использоваться как для диагностики изменений иммунного статуса на момент исследования, так и для оценки общего состояния больных.

2. Показаниями для проведения цитометрического исследования биоптатов должны быть следующие результаты патоморфологического исследования: плоскоклеточный рак пищевода высокой степени зрелости, высоко- и умерен-нодифференцированные аденокарциномы желудка, высоко и умереннодиффе-ренцированные аденокарциномы толстого кишечника.

3. Комплекс диагностических мероприятий у больных с впервые выявленными при эндоскопическом исследовании новообразованиями пищеварительного тракта, может быть дополнен цитометрическим исследованием биопсий-ного материала. Крупные патоморфологические отделения рекомендуется оснастить оборудованием для подготовки материала с парафиновых блоков к исследованию на проточном цитофлуориметре.

4. Цитометрическое исследование биоптатов опухолей органов пищеварительного тракта должно стать методом выбора в определении степени катапла-зии и уровня пролиферативной активности новообразований. Параметры изученного клеточного цикла и содержание ДНК в клетках опухоли могут служить дополнительными объективными критериями диагностики злокачественных новообразований пищеварительного тракта.

Список опубликованных работ

1. Люминол-зависимая хемилюминесценция крови в диагностике грибковой патологии легких.у детей: Методические рекомендации. Уфа, 2002. - 31 с. (Соавт: Хайруллина P.M., Коценко Т.М Медведев ЮА,Фархутдинов P.P., Пролыгина Д.Д., Кальметьева Л.Р., Рыбаков И.Д.).

2. Особенности иммунного реагирования в группах больных с высо-кодифференцированным и недифференцированным раком желудка (статья). Медицинская иммунология, том 6(№3-5). VIII Всероссийская научная конференция с международным участием « Дни иммунологии в Санкт- Петербурге»: Материалы конф. -СПб., 2004. - С. 364-365, (Соавт: Коценко Т.М. Хайруллина Р.М.).

3. Особенности гистологического строения лимфатических узлов че-люстно-лицевой области у детей младшей возрастной группы (статья). Материалы Всероссийского симпозиума «Актуальные проблемы стоматологии» Всероссийского конгресса «Современные методы профилактики и лечения заболеваний парадонта», V Международной специализированной выставки «Стоматология Урала 2004», Уфа, 2004. - С. 54-55, (Соавт: Чуйкин СВ. Бикму-хаметов А.Р.).

4. Хемилюминесценция крови больных железистым раком органов ЖКТ, выявленном впервые при эндоскопическом исследовании. (Статья). Медицинская иммунология, том 7 (в печати). IX Всероссийская научная конференция с международным участием « Дни иммунологии в Санкт- Петербурге»: Материалы конф.-СПб., 2005. (Соавт. Хайруллина P.M., Коценко Т.М., Чувили-на Е.В., Хисамова Н.Ф.).

5. Иммунологические нарушения у больных с хроническими нагнои-тельными бронхолегочными заболеваниями. (Глава монографии). Монография «Проблемы пульмонологии детского возраста», под.ред.проф.Э.Н.Ах-мадеевой., «Гилем», Уфа, 2005г. С. 162-168. (Соавт: Коценко Т.М.).

6. Варианты активации адоптивного иммунного ответа в группах с заболеваниями пищеварительного тракта. (Тез.докл.). Вятский медицинский вестник, - 2005г. - №1. Сб.работ Материалы Междунар.конф. «Молодежь и медицинская наука в XI1 веке». Киров, 2005г.— С.20. (Соавт: Хайруллина P.M.).

7. Рационализаторское предложение № 1928 от 20.05.98г. «Способ оценки иммунного статуса больных», принято к внедрению Башкирским государственным медицинским университетом и Республиканской детской клинической больницей МЗ РБ.

8. Состояние кислород-зависимой микробоцидности у больных раком органов ЖКТ, выявленным впервые при эндоскопическом исследовании. (Статья). Вятский медицинский вестник, - 2005г. - №1. Сб.работ Материалы Междунар.конф. «Молодежь и медицинская наука в XII веке». Киров, 2005г. -С. 14-15. (Соавт: Хайруллина Р.М. Галимов О.В.).

Рудаков Дмитрий Михайлович

Иммунологические особенности больных с новообразованиями органов пищеварительного тракта, выявленными миниинвазивными хирургическими методами

14.00.36 - аллергология и иммунология 14.00.27-хирургия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Лицензия № 0177 от 10.06.96 г. Подписано в печать 26.05.2005 г. Отпечатано на ризографе. Формат 60x84 'Аб. Усл.-печ. л. 1,5. Уч.-изд. л. 1,7 Тираж 100 экз. Заказ № 300.

450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3, Башкирский государственный медицинский университет

¡.M.*

И (Л Я Л-.РГ I

"ЯйАЙЙ

1Ж

Актуальность проблемы.

Новообразования пищевода, желудка и кишечника по частоте встречаемости занимают ведущие места в структуре общей гастроэнтерологии и частной хирургии органов ЖКТ (В.Т.Ивашкин, 2000). По данным ВОЗ, число больных новообразованиями органов ПТ непрерывно увеличивается [D. Parkin et al., 1999]. В последние десятилетия, в связи с внедрением эндоскопической техники и развитием миниинвазивной хирургии, - удалось значительно повысить выявляемость этой патологии в ранние сроки заболевания. Использование эндоскопических манипуляций, сделало возможным постановку клинико-морфологического диагноза уже при первом обращении больного за медицинской помощью [JI.H. Иншаков и соавт, 1996].

Большое значение в патогенезе развития и течении опухолей имеет состояние иммунной системы. С одной стороны, различные нарушения иммунологического противоопухолевого надзора увеличивают частоту появления новообразований; с другой - особенности иммунного статуса, предшествующие образованию опухоли оказывают влияние на характер течения и развитие осложнений. Известно также, что растущие опухоли вырабатывают вещества, способные влиять на состояние иммунной системы (Н.М. Бережная, В.Ф. Чехун, 2000). Таким образом, существуют многогранные взаимоотношения между опухолью и иммунной системой хозяина (А.Ю. Барышников, 2003).

Особенность локализации новообразований пищеварительного тракта, обуславливает довольно раннее развитие такого осложнения, как изъязвление, клинические проявления которого часто служат причиной нарушения самочувствия и первого визита к врачу. Вместе с тем, местный деструктивный язвенный процесс способен значительно снижать возможности патоморфологической диагностики эндоскопически обнаруженного новообразования и его важнейших свойств, обуславливая необходимость повторных и дополнительных исследований. Другая важная особенность, сопровождающая эндоскопические биопсии, - это небольшой объем материала, ограниченный размер которого сужает возможности исследователя судить о степени дифференцировки, пролиферативной активности и характере роста опухоли. Рациональное использование современных методов противоопухолевого лечения предъявляет все возрастающие требования к прижизненной диагностике новообразований, включающие детальные подробности свойств опухоли, в т.ч. - особенности пролиферативной активности опухолевых клеток [J.P. Kim et al., 1998].

Известно, что патологические изменения процессов клеточного цикла деления могут значительно опережать внешние проявления катаплазии, видимые в световой микроскоп. Кроме того, ставшие классическими, критерии оценки степени дифференцировки новообразований, могут быть представлены неравномерно в объеме растущего опухолевого узла. Следовательно, указанные обстоятельства становятся объективными факторами клинико-морфологической недооценки злокачественности новообразования. Расширение возможностей световой микроскопии, как классического метода морфологической диагностики, возможно с помощью дополнения его передовыми технологическими приемами исследования, например таким как, проточная цитометрия. Проточная цитофлуориметрия биопсийного материала парафинового блока, использованного для приготовления гистологических препаратов, позволяет сочетать классическое патоморфологическое исследование с параллельным анализом морфометрических, ДНК-цитометрических параметров клеток опухоли. Такое взаимообогащающее использование методов, способно значительно расширить представления врача-исследователя о природе, свойствах и прогнозе новообразования, объективизировать представления о степени катаплазии и дифференцировки злокачественных новоообразований, дать клиницистам онкологам дополнительные критерии для выбора эффективных способов лечения больных. Однако в литератрурных источниках недостаточно освещены вопросы рационального сочетания современных методов исследования эндоскопических биопсий, с подробным иммунологическим обследованием, что не позволяет составить достаточно полное представление о характере взаимодействия защитных противобластомных механизмов, определить риск развития осложнений, выбор методов возможной иммунокоррекции до и после противоопухолевого лечения.

Цель исследования: выявить особенности иммунного статуса у больных с новообразованиями пищеварительного тракта в зависимости от степени дифференцировки и интенсивности пролиферации клеток опухолей из материала биопсий, полученных с использованием миниинвазивных хирургических методов.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ параметров иммунного статуса больных с новообразованиями пищеварительного тракта различной локализации в зависимости от степени гистологической дифференцировки, пролиферативной активности клеток и плоидности опухолей.

2. Определить показания к проведению проточной цитометрии биопсийного материала, полученного при эндоскопическом исследовании больного; оценить результаты применения проточной цитометрии с параллельным ДНК-анализом материала биопсий на раннем этапе диагностики.

3. Оценить значение миниинвазивных хирургических методов в ранней диагностике заболеваний органов пищеварительного тракта методом проточной цитометрии.

4. На основе сопоставления данных иммунологического и патоморфологического исследований с показателями проточной цитометрии биопсийного материала выявить параллели уровней катаплазии опухолей и изменений иммунного статуса пациентов.

Научная новизна.

Впервые проведено комплексное патоморфологическое, цитометрическое исследование материала эндоскопических биопсий больных новообразованиями пищеварительного тракта, определение пролиферативной активности и ДНК-анализ опухолевых клеток на проточном цитофлуорометре, в сочетании с клинико-лабораторным иммунологическим обследованием пациентов.

В результате комплексного патоморфологического и клинико-лабораторного исследования выявлены изменения иммунологического статуса больных новообразованиями пищеварительного тракта, коррелирующие с определенными значениями уровней катаплазии и степеней дифференцировки опухоли. Показана целесообразность внедрения проточной цитометрии с параллельным ДНК-анализом материала биопсий, полученного с использованием миниинвазивных хирургических методов. Определены показания к проведению проточной цитометрии биопсийного материала, полученного при эндоскопическом исследовании больного.

Обоснована целесообразность включения в комплекс обследования пациентов с новообразованиями пищеварительного тракта подробного иммунологического исследования, - как составляющего оценки общего состояния пациентов, учитывая выявленные особенности измененного иммунного статуса больных.

Практическая значимость.

Полученные в работе данные свидетельствуют о необходимости комплексного патоморфологического и цитометрического исследования биоптатов новообразований пищеварительного тракта с клинико-иммунологическим обследованием пациентов. Установлены изменения отдельных звеньев системы иммунитета, которые могут служить дополнительными критериями оценки общего состояния больных с новообразованиями ПТ. Разработаны показания для проведения цитометрического исследования на проточном цитофлуорометре с параллельным ДНК-анализом биоптатов, полученных при эндоскопическом исследовании больных, которые способствуют улучшению онкологической диагностики на раннем этапе.

Положения, выносимые на защиту.

1. Выявлена зависимость характера и выраженности иммунологических нарушений у больных с новообразованиями органов пищеварительного тракта от уровня катаплазии и степени дифференцировки злокачественных опухолей.

2. Пролиферативная активность различных по степени гистологической дифференцировки новообразований характеризуется типичными изменениями параметров клеточного цикла. Количество и кратность содержания ДНК в клетках (плоидность) исследованных опухолей отражает уровень катаплазии новообразований.

3. Высокоинформативным для цитометрического исследования является материал рутинных биопсий органов пищеварительного тракта, полученный в процессе первичного эндоскопического обследования. Данные ДНК-цитометрии клеток биопсийного материала опухоли и иммунологического исследования больных взаимообогащают диагностический арсенал клинической хирургии.

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты проведенного исследования используются в практической совместной работе эндоскопического отделения и отделения общей хирургии ГКБ № 18, ЦПАО

ГКБ № 13, Республиканского Центра иммуноаллергологии Республиканской детской клинической больницы (г.Уфа).

Апробация работы. Материалы проведенных исследований представлены на VI11, IX Всероссийских научных форумах с международным участием «Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии» (СПб, 2005), IX итоговой научно-практической конференции с международным участием «Молодежь и медицинская наука в XXI веке» (Киров, 2005). Диссертация апробирована на межкафедральном заседании БГМУ (протокол № 1 от 01.04.2005г.), на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.124.01 при Президиуме Академии наук Республики Башкортостан (протокол № 33 от 26.05.2005г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе научных статей и методических рекомендаций. Оформлено 1 рационализаторское предложение.

Объем и структура диссертации.

Содержание работы изложено на 156 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав изложения собственных наблюдений, главы, посвященной обсуждению результатов собственного исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций и обзора цитированной литературы, приложения. Работа иллюстрированы 31 рисунком, 23 таблицами. Список литературы содержит 244 источников, из них 89 отечественных и 155 иностранных.

ВЫВОДЫ.

1. На основании сравнительного анализа иммунного статуса больных с новообразованиями пищеварительного тракта установлено, что изменения иммунологических показателей в большей степени зависели от ДНК-плоидности, чем от локализации и гистологической дифференцировки опухолей.

2. В результате применения проточной цитометрии материала первичных эндоскопических биопсий новообразований органов пищеварительного тракта выявлены различные уровни пролиферативной активности опухолей, одинаковых по степени гистологической дифференцировки. Достоверно эти различия проявились у высоко и умереннодифференцированных злокачественных новообразований при сравнении диплоидного и анеуплоидного типов опухолей, чем обоснована необходимость дополнительного исследования методом проточной цитометрии биоптатов высоко- и умереннодифференцированных новообразований органов пищеварительного тракта.

3. Эндоскопическое исследование позволяет использовать возможности проточной цитометрии на самом начальном этапе хирургической диагностики новообразований пищеварительного тракта, данные которого определяют уровень их пролиферативной активности.

4. Комплексное исследование иммунного статуса у больных с впервые выявленными новообразованиями пищеварительного тракта выявило наличие его особенностей у пациентов с недифференцированными раками и низкодифференцированными аденокарциномами желудка и кишечника, анализ которых позволил установить зависимость между уровнем катаплазии опухоли и глубиной изменения иммунологических показателей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Больным с впервые выявленными новообразованиями органов ПТ целесообразно проводить клиническое и лабораторное иммунологическое обследование, результаты которого могут использоваться как для диагностики изменений иммунного статуса на момент исследования, так и для оценки общего состояния больных.

2. Показаниями для проведения цитометрического исследования биоптатов должны быть следующие результаты патоморфологического исследования: плоскоклеточный рак пищевода высокой степени зрелости, высоко- и умереннодифференцированные аденокарциномы желудка, высоко и умереннодифференцированные аденокарциномы толстого кишечника.

3. Комплекс диагностических мероприятий у больных с впервые выявленными при эндоскопическом исследовании новообразованиями пищеварительного тракта, может быть дополнен цитометрическим исследованием биопсийного материала. Крупные патоморфологические отделения рекомендуется оснастить оборудованием для подготовки материала с парафиновых блоков к исследованию на проточном цитофлуориметре.

4. Цитометрическое исследование биоптатов опухолей органов пищеварительного тракта должно стать методом выбора в определении степени катаплазии и уровня пролиферативной активности новообразований. Параметры изученного клеточного цикла и содержание ДНК в клетках опухоли могут служить дополнительными объективными критериями диагностики злокачественных новообразований пищеварительного тракта.