Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунологические и биохимические аспекты сорбционных методов терапии демиелинизирующих заболеваний

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ УКРАИНСКОЙ ССР

КИЕВСКИЙ ОРДЕНА. ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ ИМ.АКАДЕМИКА А.А.БОГОМОЛЬЦА

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СОРБЦИОННЫХ МЕТОДОВ ТЕРАПИИ ДЕМИЕЛИНИЗИРУЩИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

Турина Наталия Михайловна

Киев- 1990

Работа выполнена в секторе искусственных органов и медицинсш биотехнологии Института проблем онкологии им. Р.Е.Кавецкого АН УСС

Научный руководитель - кандидат медицинских наук,

старший научный сотрудник В.М.Юдин

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

профессор Я.В.Велик

- доктор медицинских наук, профессор Г.Н.Дранник

Ведущее учреждение - Институт экспериментальной медицины АМН СССР

Защита состоится " " (ал^Л.лал._199-/ г. в 13 часов

30 минут на заседании специализирс/ванного совета Д 088.13.06 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Киевском ордена Трудового Красного Знамени медицинском институте им.акад. А.А.Богомольца по адресу: 252057, Киев-57, проспект Поее-ды, 34 (санитарно-гигиенический корпус, аудитория 2).

Отзывы на автореферат высылать по адресу: 252057, Киев-57, проспект Победа, 34. КМИ, санитарно-гигиенический корпус.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Киевского медицинского института (Киев-57, ул.Зоологическая, I).

Автореферат разослан ^ь-о^лЯО-_ 1Э9-/ г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

В.Г.Бордонос

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТИ

Актуальность проблем». Рассеянный склероз (PC) занимает одно из первых мест в ряду демиелшшзирукщих заболеваний центральной нервной системы человека по частоте заболеваемости (Hallpike J. et al.,1983). Согласно аутоиммунной концепции патогенеза PC, основой процесса демиелшшзации являются иммунологически обусловленные деструктивные изменения миелиновой оболочки нервных волокон (Raine е., Traugott и.,1984; Hofman P. et al.,1986), которые связаны с нарушением проницаемости гематоэнцефалического барьера (Chou С*, et al., 1983; Forsberg P. et al.,1984) и выходом в циркуляцию энцефалито-генных субстанций, в частности, основного бежа миелина (ОБМ) и продуктов его деградации (Hashim G.,1985). Сенсибилизация организма этими субстанциями характеризуется появлением клонов аутореактивных лимфоцитов и специфических аутоантител (Groome M.,1980; Paterson P. et al.,1981; Ryberg В.,1982; Bellamy A. et al.,1986; Garoiamerino A. et al.,1986).

Известно, что аналогичные аутоиммунные изменения, а именно, появление в сыворотке крови антител к ОБМ, сопровождают развитие экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ), который является лабораторной моделью PC (Akiyama К. et al.,I98I; Irle H. et al.,1981; Carnbi F.,Lees M.,1984). На этой модели показана возможность достижения положительного терапевтического эффекта при введении высоких доз ОБМ или энцефалитогенного пептида животным с индуцированным ЭАЭ (Терлецкая Я.Т. и др.,1976; Житнухин Ю.Л. и др.,1978; Driscoll В. et al.,1974,1975; Bitar D.,Whitaore С.,1988; Kennedy M. et al.,1988; Clayton J. et al.,1989). Полагают, что этот эффект реализуется за счет специфического связывания антител к ОБМ (Swanborg H., 1973) или же за счет элиминации антигенспецифических клонов Т-лимфоцитов (Driscoll в. et al.,1975). Важно отметить, что есть отдельные сообщения об аналогичном использовании гетерологичного ОБМ для лечения PC у человека (WakBman В.,1983; Weiss W.,DambroBia У.,1983).

До недавнего времени основным методом лечения PC было использование препаратов, обладающих неспецифическим супрессорным воздействием на иммунную систему организма. Однако длительное применение им-мунодепрессантов может приводить к необратимым нарушениям клеточного иммунитета у больных, способствовать дальнейшему прогрессировашш PC и проявлению многочисленных осложнений, прежде всего, стероидной за-

висимости (Хондкариан O.A. и др.,1987; Ярош A.A. и др.,1990). Изве! но также, что характерные для демиелинизирущей патологии иммуноло; ческие и оиахимические изменения, как правило, сопровождаются избы точшм накоплением в крови продуктов метаболизма, в частности, Сол ков, которые могут угнетающе действовать на некоторые функции клет ного иммунитета, способствуя развитию аутоиммунного поражения нерв ной ткани на фоне эндогенной интоксикации организма (Галактионов С и др.,1983; Niese о. et al.,1986). Очевидно, что рациональная тера пия подобных патологических состояний должна решать две основные з дачи: достижение направленного иммунокорригирущего эффекта с цель элиминации или существенного тормошения аутоиммунных реакций как основного патогенетического звена, а также детоксицирущего воздей ствия.

Рядом авторов отмечен иммунокорригирувдий эффект эфферентных тодов терапии наряду с их выраженным детоксицирующим воздействием организм, что обусловило успех применения для лечения демиелинизир щих заболеваний человека, в частности PC, плазмафереза (Неретин В. И др.,1988; Dau Р. et al.,1980; Haaser S.et al.,1983; Weiner H.,19 Hosokawa S.,Oyamaguchl A.,1989), лимфоцитафереза (Medaer R. et al. 1984), а также сорбции на аффинных иммуносорбентах типа IM-P с иммобилизованным фенилалашшом (Nagasato К. et al.,1988; Palm М. et al.,1988; Schmitt E. et al.,1989).

Среди эфферентных методов терапии необходимыми свойствами для осуществления данной задачи может обладать и гемоперфузия через at тивировашше углеродные гемосорбенты. В пользу этого свидетельству ет то, что неселективная гемоперфузия нашла широкое применение в i рапии ряда иммунозависммых заболеваний (Молоденков М.Н. и др.,197; Дмитриев A.A. и др.,1982; Лопухин Ю.М. и др.,1982; Чучалин А.Г. и др. ,1982.- Грандо С.А. .Дранник Г.Н. ,1990; Nykolaev N. et al.,1985). Синтетические активированные угли медицинского назначения явились также перспективными матрицами и для создания специфических адсорбентов. На их основе разработаны сорбционные материалы с иммобилизованным комплексом протеолитических ферментов (EretBkaya Е.,1987 иммуносорбент для лечения бронхиальной астмы (Чучалин А.Г.,1984) ] ДНК-содеркащие гемоиммуносорбенты для лечения лучевых поражений и ряда иммунозависимых патологий (Снэккова Е.А.,1988).

Очевидно, что попытки сочетания специфического удаления анти к ОБМ с неспецифической элиминацией из организма токсичных продук

метаболизма, избыточное накопление которых ведет к эндогенной интоксикации, актуальны в плане разработки новых подходов и средств лечения РС.

Целью настоящего исследования явилось изучение возможностей применения сорбционных методов, основанных на использовании активированных углей, в терапии демиелинизирующих заболеваний.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи :

1. Изучить иммунологические и биохимические изменения, происходящие в организме экспериментальных животных в динамике развития ЭАЭ.

2. Оценить эффективность гемосорбционной терапии с использованием неспецифических углеродных адсорбентов при ЭАЭ у морских свинок.

3. Получить специфические иммуносорбенты на основе углеродных матриц, предназначенные для удаления антител к ОБМ из крови экспериментальных животных.

4. Проанализировать специфические и неспецифические поглотительные свойства полученных иммуносорбентов и оценить их терапевтическую эффективность при ЭАЭ у морских свинок.

5. Оценить эффективность применения гемо- и энтеросорбции при лечении больных РС по иммунологическим и биохимическим критериям.

Научная новизна исследования. Впервые показана возможность достижения положительного терапевтического эффекта у морских свинок с индуцированным ЭАЭ посредством сорбционных методов. Наиболее перспективным является метод гемоиммуносорбции с использованием специфических адсорбентов на основе различных углеродных матриц с иммобилизованным ОБМ. С помощью комплекса иммунологических и биохимических критериев показано, что реализация положительного эффекта гемосорб-ции при ЭАЭ достигается благодаря сочетанию специфических и неспецифических поглотительных свойств использованных иммуносорбентов. Тем самым показана принципиальная возможность разработки специфического адсорбента для лечения больных РС. Эффективность неспецифических сорбционных методов положительно верифицирована в клинике при лече-шш больных РС: показано, что применение гемо- и энтеросорбции приводит к нормализации хелпер-супрессорного соотношения Т-лимфоцитов и содержания В-лимфоцитов крови, липидного обмена, содержания компонентов средней молекулярной массы плазмы крови и связывающей способности альбумина.

Научно-практическая значимость работы. Предложенные на основании экспериментальных данных, схемы гемо-, энтеросорОции и их сочетанного применения используются в неврологических отделениях I ЛШ им.акад. И.П.Павлова и ЦКБ АН СССР (г.Москва) для лечения больных РС в стадии обострения заболевания. Сорбциошше средства терапии способствуют иммунокоррекции и восстановлению детоксикаци-ошюго иотешдеала организма, вследствие чего достигается устойчивая ремиссия длительностью год и более у 65% больных.

Апробация работы. Основные результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на отчетных научных конференциях Института проблем онкологии им. Р.Е.Кавецкого АН УССР (Киев,1987, 1988); на 7-м Международном симпозиуме по гемоперфузии (Киев,1986); на Международном симпозиуме по гемоперфузии, адсорбентам и иммобилизованным реактантам (Росток,1988); на Международной конференции "СагЬопе-90" (Париж,1.990); на заседании экспертного совета по апробациям докторских и кандидатских диссертаций при Киевском медицинском институте им.акад. А.А.Богомольца МЗ УССР (Киев,1990).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ и получено положительное решение Госкомитета СССР по делам изо бротений и открытий от 22 февраля 1990 г. по заявке № 4627108/30-14 от 23 ноября 1988 Г.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Иммунологические нарушения, наблюдаемые при развитии аутоиммунных демиелшшзируклцих заболеваний у экспериментальных животных и человека ОАЭ и РС), реализуются на фоне ряда метаболических изменений в организме, свидетельствующих о прогрессирующей эндогенной интоксикации.

2. Иммуьосорбенты на основе синтетических углеродных матриц с иммобилизованным ОБМ проявляют как специфические, так и неспецифические поглотительные свойства, то есть являются комбинированными адсорбентами.

3. Предложенные сорбциошше методы детоксикации (гемо-, энтеросорб-ция и их сочетание) с использованием отечественных активированных углей расширяют возможности эфферентной терапии домиелинизи-ругсцих заболеваний человека.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав обзора литературы, пяти глав собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, вклю-

ающего 241 наименование (83 отечественных и 158 зарубежных). Ра-ота изложена на страницах машинописного текста, иллюстрирова-а 21 рисунком и 18 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и метод» исследования.

Исследования выполнены на 308 беспородша морских свинках мас-ой 300-400 г. В работе представлены данные 159 стендовых эксперимен-ов и 37 гемоперфузий на морских свинках, с использованием углеродно-о гранулированного гемосорбента СКН и волокнистого углеродного мате-иала АУВМ-Днепр-МН. Исследованы сыворотки и плазмы крови 41 больно-о РС до и после лечения эфферентными методами детоксикации и 10 до-оров.

Модель ЭАЭ у морских свинок воспроизводили подкожным введени-м jв 5 точек ) 1,0 мл энцефалитогенной смеси, содержащей 0,5 мл аствора ОБМ из расчета 100 мкг белка на животное и 0,5 мл полного дъюванта Фрейнда, по Козулиной Е.П. и др.(1972). Антиген (ОБМ) поучали по методу Палладина А.В. и др.(1970) из очищенной фракции об-его миелина, выделенного из белого вещества головного мозга быка о Autillo L.(1964). Иммобилизацию антигена на углеродных матрицах ри получении иммуносорбентов осуществляли способом физической ад-орбции или реакцией ковалентного сочетания в присутствии водорас-воримого карбодиимида. Прочность удерживания лиганда матрицей оце-ивали методом спектрофлюориметрии.

Для оценки неспецифических поглотительных свойств исходных глеродных матриц и полученных иммуносорбентов использовали спек-рофотометрический метод определения кинетики адсорбции ими из одных растворов маркерных метаболитов: креатинина (А.=235 нм), мо-евой кислоты (Х=296 нм) и витамина В12 (Х=361 нм). Специфическую оглотительную емкость адсорбентов оценивали по убыли из сорбатов БМ определением содержания белка по методу Lowry о. et al.(I95I).

Уровень содержания антител к ОБМ в сыворотках крови морских винок оценивали методом твердофазного неконкурентного иммунофер-ентного анализа по Irie Н. et al.(I98I) в собственной модификации.

Лимфоциты из периферической крови животных и больных РС выде-яли по Boyum А.(1968). Содержание E-РОК в крови морских свинок пределяли по stadooker и. et al.(1973), а в крови больных РС - по

Jondal M. et al.(I972). Содержание EAC-POK определяли no Shevach E. et al.(I972) и Bianco C. et al.(I970) соответственно. Кроме того, в крови больных определяли количество функционально активных Еа-РОН по Kerman R. et al.(I976); о соотношении иммунорегуляторных-субпопуляций Т-лимфоцитов судили по результатам теста на теофиллшчувс-твительность по Shore a. et al.(I978). Содержание в сыворотке крови больных иммуноглобулинов классов G, м, л определяли методом радиальной иммунодиффузии по Mancini G.(1965), используя моноспецифические анти-G-, анти-м-, анти-А-сыворотки фирмы "Sevac" (ЧССР) и эталонную сыворотку фирмы "Boehringer" (ФРГ). Феномен торможения миграции лейкоцитов крови морских свинок в присутствии ОБМ изучали по методу АртемоЕОй А.Г.(1973) с использованием пятиканальных прямоугольных капилляров Перфильева-Рабе. Гематологические показатели определяли традиционными методами.

Компоненты средней молекулярной массы выделяли из плазмы крови методом ультрафильтрации с последующим анализом методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на системе HPLC ("¡Jillipore-waters",CUlA). Содержание альбумина в сыворотке креви определяли по Hill Р.(1983). Альбуминовую фракцию из плазмы крови выделяли путем высаливания сульфатом натрия с последующим диализом. Связывающую способность альбумина по отношению к гидрофобному маркеру конго красному определяли по Чёгеру С.(1975). Константу связывания и число центров связывания альбумина с маркером метиловым красным определяли методом дифференциальной спектроскопии с регистрацией дифференциальных спектров с помощью спектрофотометра DU-70 ("Beckman", Австрия). Температуру денатурации альбумина определяли методом дифференциальной сканирующей калориметрии на микрокалориметре ДСМ-4.

Содержание общих липидов, холестерина и фосфолипидов в плазме крови определяли с помощью стандартных наборов фирмы "bioMerieux" (Франция). В сыворотке крови определяли активность щелочной фос-фатазы ПО Bessey О. et al.(I946), кислой фосфатазы по Fishman W., Lemer P.(1953) и общей протеолитической активности по Воремеен-ко К.Н.(1978).

Процедуру гомокарбоперфузии у морских свинок производили под котеминовым наркозом (50 мг/кг массы) по артерио-венозной схеме с использованием перистальтического насоса. Объем заполнения экстракорпорального круга - 3-4 мл, скорость перфузии - 1,8-2,0 мл/мин, объем перфузии - 3 общих объема циркулирующей крови, продолжитель-

ность перфузии - 30-45 минут.

Представленные в работе данные подвергнуты статистической обработке по критерию Стыодента-Фишера.

Результаты исследований и их обсуждение. ¡.Иммунологические и биохимические изменения в динамике развития ЭАЭ.

Показано, что развитие ЭЛЭ у морских свинок, индуцированного введением высокоочиценного ОБМ из мозга быка, сопровождается выращенными иммунологическими изменениями. В латентном периоде развития патологии (10-е сутки после сенсибилизации) в периферической крови-кивотных снижено на 40,4% (р<0,01) по сравнению с интактными морски-да свинками относительное содержание Ед-Р0К и достоверно не изменя-зтся содержание Е-РОК. При развитии характерных признаков ЭАЭ (15-[8-е сутки после сенсибилизации) сохранялась тенденция к снижению содержания субпопуляции Еа-Р0К, однако при этом общее содержание Е-РОК товишалось на 23,4% (р<0,02). Относительное содержание ЕАС-РОК в ди-шмике развития ЭАЭ достоверно не изменялось. У 42% морских свинок с хорологическими признаками ЭАЭ, в отличие от животных в латентном териоде заболевания, с помощью теста ингибиции миграции лейкоцитов Зыло зарегистрировано наличие выраженной гиперчувствительности замедленного типа по отношению к ОБМ. О помощью твердофазного иммунофер-лентного анализа было показано, что развитие ЭАЭ, начиная уже с латентного периода заболевания, характеризуется высоким уровнем содержания антител к ОРМ.

Параллельно установлено, что в латентном периоде развития за-5олевания увеличивается активность кислой фосфатазы в сыворотке кро-ш животных на 48,7% (р<0,001), а при наличии характерных признаков ЗАЭ - на 81,5% (р<0,001) по сравнению с интактными морскими свинками. )дноьременно снижается активность щелочной фосфатазы соответственно 1а 37,8% (р<0,001) и 58,7% (р<0,001). В латентном периоде развития ЭАЭ содержание общего холестерина в плазме крови снижается на 30% :р<0,05), а общих лигаздов - на 18,6% (р<0,05). Развитие характер-шх признаков ЭАЭ сопровождается сохраняющейся тенденцией к сниже-шю данных показателей при увеличении на 23% (р<0,05) уровня содер-<ания фосфолипидов, что может свидетельствовать об активно текущем демиелинизирувдем процессе. Развитие у животных ЭАЭ сопровождается

повышением общей протеолитической активности сыворотки крови, соста вившим к 10-м суткам после сенсибилизации 33,6% (р<и,02), а к 1518-м - 50,6% (р<0,001) по сравнению с контролем. При этом наблюдается снижение содержания общего белка плазмы крови и, прежде всего, альбумина на 18,5-32% (р<0,001). Кроме того, в процессе развития ЭА отмечено накопление в крови метаболитов средней молекулярной массы (<30 кДа). Так, уже к 10-м суткам наблюдалось увеличение данного по казателя на 48% (рч0,05) по сравнению с контролем. Данные дифференциальной спектроскопии и сканирующей калориметрии указывают на вира жешое изменение связывающей способности альбумина крови. К 10-м су кам после сенсибилизации ОШ максимум температуры денатурации альбу мина, выделенного из пула плазмы крови животных, составил 68,0±0,6° по сравнению с 63,9±0,5°0 в норме, что свидетельствует о значительной загруженности белка продуктами метаболизма. При развитии неврологических признаков ЭАЭ максимум температуры денатурации альбумина составил 66,8iO,b°C. Параллельно наблюдалось снижение величины константы связывания альбумина с маркерным красителем метиловым красны на 35% (р<0,05) преимущественно за счет уменьшения числа центров бе ка доступных для комплексообразования с данным лигандим с 1,05±0,06 до 0,79±0,05 (р<0,05).

Полученные данные свидетельствуют о том, что отмеченные нами иммунологические сдвиги при развитии ЭАЭ у морских свинок сопровождаются рядом метаболических изменений, указывающих на наличие эндогенной интоксикации в организме при активно протекающем иммунологи-чески обусловленном процессе демиелинизации.

2.Получение иммуносорбентов на основе углеродных активированных матриц и оценка их специфических и неспецифических поглотительных свойств.

При получении иммуносорбентов, предназначенных для удаления из плазмы крови антител к ОБМ, в качестве матриц были использованы грг нулированный углеродный гемосорбент типа СКН и активированный углеродный волокнистый материал АУВМ-Днепр-Ш.

Показано, что метод физической адсорбции из водных 0,03-0,09% растворов ОБМ позволяет иммобилизовать на углеродных матрицах СКН i АУВМ соответственно около 7 мг и 65 мг бежа на I г адсорбента. Достаточно прочная фиксация лиганда на матрицах достигается при иммо-

билизации OEM в динамическом режиме при скорости перфузии белкового раствора 2,0 мл/мин в течение 3 часов. Оценка прочности фиксации лиганда на матрице показала, что лишь при обработке полученных им-муносорбентов 6 М раствором мочевины в первые минуты контакта элюи-рующего раствора с матрицей происходит десорбция следовых количеств антигена, по-видимому, связанного с матрицей водородными связями.

В экспериментах in vivo по гемоперфузии были использованы имму-носорбенты, получешше методом физической адсорбции, с содержанием лиганда около I мг на I г СКН и 2 мг на I г АУВМ. Общее количество иммобилизованного ОБМ составляло 2,5 мг в расчете на один экспериментальный перфузионный массообменник.

В опытах in vitro по оценке специфических поглотительных свойств были использованы иммуносорбенты, полученные реакцией ковалентного сочетания в присутствии бифункционального сшивающего агента 1-этил-З-(3-диметиламинопропил) карбодиимида на основе гранулированных матриц типа СКН. Содержание антигена составляло около I мг на I г матрицы.

Эффективность сорбции онти-ОБМ антител на иммуносорбентах определяли с помощью иммуноферментного анализа после перфузии сывороток крови морских свинок с ЭАЭ и гатактных животных, служивших контролем. Условия перфузии соответствовали реальным условиям сорбционной процедуры in vivo. В качестве контроля на специфичность связывания была использована матрица углеродного материала сферического карбо-низата (СК^) с ковалентно присоединенным антигеном, имеющая минимальную мезопористость, подтвержденную в экспериментах по сорбции маркерных метаболитов (креатинин, мочевая кислота, витамин Bj2)-Перфузии подвергали как правило пул сывороток крови 3-5 экспериментальных животных.

Однократная перфузия пула сывороток крови,полученных от морских свинок в латентном периоде развития ЭАЭ, через иммуносорбенты на основе матриц типа СКН приводила к снижению содержания уровня анти-ОБМ антител в среднем на 30.7% (р<0,001) (рис.1). При перфузии пула сывороток животных с характерными признаками ЭАЭ через иммуносорбент наблюдалась сходная картина сорбции анти-ОБМ антител: величина снижения исходного уровня антител составила 33,2% (р<0,001) (рис.1). Перфузия пула сывороток крови морских свинок с ЭАЭ через углеродные адсорбенты, которые использовали в качестве матриц при получении им-муносорбентов, не вела к достоверному снижению уровня анти-ОБМ антител в исследуемом материале.

D (Я=405 ИМ)_]_

0,6 ~ I | - до II ГТГП - после II

0,5 - — —

0,4 -

0,3 - тп ТП

0,2 -0,1 -

А Б . В А Б В

С1Ш+0БМ СЮ^+ОБМ

Рис Л. Содержание анти-ОНМ антител в сыворотке крови морских свинок до и после перфузии (П) через иммуносорбенты in vitro:

А - интактше животныо;

Б - латентный период развития ЭАЭ;

В - наличие у животных характерных признаков ЭАЭ.

3

Условия перфузии: объем сорбента - 1,8 см ; объем перфузируемой сыворотки - 3,6 мл; скорость перфузии - 0,2 мл/мин.

Оценка неспецифических поглотительных свойств иммуносорбентов, полученных методом физической адсорбции и ковалентного сочетания, бь ла выполнена в опытах по кинетике сорбции из водных растворов марке! ных метаболитов малой и средней молекулярной массы: креатинина, моче вой кислоты и витамина В12> Иммобилизация ОБМ на гранулированных матрицах обоими способами снижала их способность к поглощению маркеро! малой молекулярной массы (креатинин и мочевая кислота) в среднем на 13-22%. Поглощение этих маркерных метаболитов иммуносорбентом на основе волокнистой матрицы снижалось лишь на 6-11%. Поглощение витамина Bj2 иммуносорбентами на основе гранулированного сорбента СКН по сравнению с исходными матрицами снижалось в среднем на 17-25% и не снижалось у иммуносорбента на основе волокнистого материала АУВМ.Эт! данные свидетельствуют, что иммобилизация на поверхности углеродных

адсорбентов ОБМ при получении селективных иммуносорбентов приводит к незначительному снижению их неспецифических поглотительных свойств.

Таким образом, полученные на основе углеродных активированных матриц иммунасорбенты можно отнести к комбинированным сорбентам, которые наряду со специфическими поглотительными свойствами по отношению к анти-ОБМ антителам, сохраняют неспецифическую поглотительную активность.

3.Оценка эффективности применения специфических и неспецифических сорбентов в экспериментах in vivo.

Сравнение эффективности неспецифической сорбционной процедуры и иммуносорбции в латентном периоде заболевания (11-е сутки после сенсибилизации) показало, что оба подхода позволяют предотвратить развитие заболевания у морских свинок. Однако, если применение ге-моперфузии через непокрытые адсорбенты СКН и АУВМ приводило к положительному результату после появления отдельных признаков патологического процесса к 18-19 суткам после сенсибилизации (падение массы тела, вялость движений, незначительные расстройства их координации), то применение гемоперфузии через иммуносорбенты на основе данных матриц вело к полному подавлению развития демиелинизирующего процесса, что может быть связано с эффективным удалением анти-ОБМ антител у этих животных.

Использование неспецифических углеродных гемосорбентов для ге-моперфузий у морских свинок с характерными клиническими признаками ЭАЭ, развивающимися к 15-18-м суткам после сенсибилизации, приводит лишь к кратковременному положительному терапевтическому эффекту, который выражается в частичном восстановлении двигательной активности и увеличении продолжительности жизни животных в среднем на 2-12 суток по сравнению с контрольными животными, которым гемоперфузия либо не выполнялась, либо проводилась через колонку с контрольным материалом - хирургическим шелком. При этом гранулированные гемосорбенты типа СКН и волокнистый углеродный материал АУВМ-Днепр-МН обладали сходной терапевтической эффективностью. Это коррелировало с данными хро-матографического анализа ультрафильтратов плазмы крови морских свинок с ЭАЭ (табл.1), указывающими на то, что неспецифическая эфферентная процедура приводила к снижению содержания компонентов плазмы сродней молекулярной массы на 33-44 % (р<0,05).

Таблица I.

Содержание компонентов с молекулярной массой <30 кДа в ультрафильтратах плазмы крови морских свинок с ЭАЭ до и после гемо-перфузии (усл.ед.площади хроматографических пиков х 106)( М+т)

Этапы исследования Тип сорбента

СКН АУВМ СКН+ОБМ АУВМ+ОБМ

до гемоперфузии 5,56±0,68 4,98*0,39 5,34±0,18 5,00±0,19

I час после гемоперфузии 3,71±0,66 2,79+0,44 3,51±0,29 3,42+0,58

24 часа после гемоперфузии 3,24+0,70 2,81+0,60 3,44+0,51 3,21+0,61

Проведение гемоперфузий у морских свинок при наличии характерных неврологических признаков ЭАЭ через иммуносорбенты на основе как гранулированных, так и волокнистых углеродных матриц приводило к выражен ной регрессии проявлений заболевания и после однократного, непродолжительного его обострения через 10-12 суток после проведения процедуры наблюдалась длительная ремиссия (в течение года). При этом снижение содержания метаболитов средней молекулярной массы в плазме крови морских свинок, подвергнутых процедуре иммуносорбции, составило 32-36% (р<0,05) (табл.1).

Кроме того, биохимические исследования показали, что перфузия сыворотки крови животных с ЭАЭ через иммуносорбенты :т у!Лго приводила также к снижению активности кислой фосфатазы до контрольного уровня - уровень снижения составил 54% (р<0,001) независимо от типа использовавшейся матрицы. При этом не наблюдалось нормализации повышенной при развитии ЭАЭ общей протеолитической активности сыворотки крови животных.

Положительный терапевтический эффект от применения иммуносорбен-тов как в латентном периоде развития ЭАЭ, так и при наличии характерной неврологической клиники коррелировал с эффективностью удаления с помощью данных сорбентов из сыворотки крови морских свинок анти-ОЬМ

1ТИТЙЛ (рис Л).

На основании результатов оценки влияния сорбционной терапии на )звитие ЭАЭ у морских свинок можно прийти к выводу, что с помощью ¡иного метода лечения возможно предупреждение развития демиелини-[рующего заболевания у экспериментальных животных независимо от ¡пользуемого при этом адсорбента (специфического или неспецифичес->го). На фоне развернутой клинической картины ЭАЭ выражешшм тера-1втическим эффектом обладает лишь специфическая иммуносорбция.

4.Оценка иммунокорригирующего и детоксицирующего эффектов сорбционной терапии при PC человека.

Процедуры гемосорбции у больных PC проводили через гранулирован-:е гемосорбенты CKH-IK, СКН-2К, СКН-4М и СУГС по вено-венозной схе-с объемной скоростью перфузии 100-120 мл/мин 2-3 раза с интервалом дней. Для энтеросорбции использовали гранулированные угли названных рок в количестве 90 г в сутки (за 3 приема) или волокнистый матери: АУВМ в количестве 0,9 г (в виде таблеток) ежедневно в течение 14-суток.

Терапия сорбционными средствами (гемо- или энтеросорбция и их четание) вела к значительному улучшению неврологического статуса . шх PC, позволяя купировать вновь появившиеся патологические мптомы, способствуя урекению рецедивов заболевания. Наиболее чет-й положительный эффект, характеризующийся восстановлением трофи-ских и двигательных функций и достижением продолжительной ремис-и (I год и болео), отмечен у больных с ремиттирукхцим типом тече-я заболевания в стадии обострения. У больных с исходно резко вы-женными патологическими нарушениями отмечалось либо частичное со-танное восстановление трофических и двигательных функций, либо еимуществешю улучшение трофических функций. По стобалльной шкале енки неврологического статуса Sipe J. et al.(I984) курс лечения, лючавший 2 гемосорбции, приводил к улучшению статуса с 64,8±3,5 до ,9t3,3 (р<0,05) баллов у больных с продолжительностью заболевания 2-х лет и с 47,4+4,8 до 72,3±4,5 (р<0,05) баллов - с продолжитель-стью PC более 2-х лет. Трехнедельный курс энтеросорбции вел к из-нению в неврологическом статусе от 52,0±3,4 до 79,0±3,0 (р<0,05) ллов. Наибольший аффект достигался при комбинированной сорбциошой рапии, включавшей 2 гемосорбции и последующий Ю-дневный курс эн-

теросорбции.

Исследование состояния клеточного и гуморального иммунитета у больных РС, подвергшихся сорбционной терапии, показало, что она обла дает иммунокорригирующш аффектом. Сорбционная терапия приводила к снижению исходно повышенного на 56% (р<0,05) абсолютного содержания субпопуляции функционально активных Т-лимфоцитов до уровня нормы, а также к снижению на 48% (р<0,05) содержания популяции В-лимфоцитов (табл.2). Нормализация содержания последних в периферической крови после проведения сорбционной терапии не сопровождалась достоверным изменением содержания иммуноглобулинов исследованных классов (чаОлЛ Достоверное увеличение иммунорегуляторного индекса Т-хелперы/Т-су-прессоры на 75,6% (р<0,02)(табл.2) по сравнению с его значением у больных РС до лечения сорбционними средствами может свидетельствовать о целесообразности использования данных средств при лечении аутоиммунных демиелинизирующих заболеваний человека.

Существенно то, что эффект иммунокоррекции достигался на фоне детоксицирующего воздействия сорбционных средств на организм. Это доказывается, в частности, снижением содержания компонентов средней молекулярной массы в плазме крови больных РС после лечения на 35,7% (р<0,05), а также повышением связывающей способности альбумина плаз мы по отношению к маркерному красителю конго красному на 90,0% (р<0,05).

Показано, что из 20 больных, у которых изучался обмен липидов, 6 человек имели повышенный на 50,0% (р<0,001) уровень общих липидов 13 - на 77,7% (р<0,001) уровень фосфолипидов и 18 - на 29,3% (р<0,0 уровень общего холестерина сыворотки крови по сравнению с величинам данных показателей у здоровых доноров. Лечение больных с применение гемо-, знтеросорбции или их сочетания приводило к снижению содержан общих липидов сыворотки крови в среднем на 28% (р<0,05), фосфолипидов - на 22% (р<0,05) и общего холестерина - на 24% (р<0,05) у пациентов с исходно повишенными показателями. Уровни содержания иссле дованных липидов сыворотки крови больных, у которых исходные значения были в пределах физиологической нормы до лечения, существенно и изменялись.

Таким образом, сорбционные сродства терапии могут оказывать кс ригирующее воздействие иа иммунную систему и способствуют восстановлению детоксикационного потенциала организма, что имеет первостепе нов зночонив в условиях прогрессирующего аутоиммунного поражения цс

тральной нервной системы, появления продуктов миелинолизиса и накопления избыточных количеств других патогенетически значимых метаболитов в циркулирующей крови больных РС.

Таблица 2.

Состояние клеточного и гуморального иммунитета у больных РС до и после сорбционной терапии ( М+т ).

Исследуемый показатель До лечения После лечения

содержание лимфоцитов*:

абс. (хЮ9/л) 2,07±0,34 I,76±0,24

% 32,9+4,00 35,8+3,80

содержание Е-РОК*:

абс. (хЮ9/л) 0,93+0,27 0,98+0,15

% 51,3+4,70 53,9+3,80

содержание Еа-РОК*:

абс. (хЮ9/л) 0,92±0,18 0,61+0,09

% 44,0±2,20 37,9+2,60

иммунорегуляторный

индекс * 0,82+0,14 1,44±0,17

содержание ЕАС-РОК*:

абс. (хЮ9/л) 0,60±0,10 0,31+0,07

% 30,8+4,60 17,5+2,00

содержание в сыворотке крови иммуноглобулинов (г/л)* *:

1в о 11,00+0,75 12,52±0,77

1ё м 0,70+0,09 0,80+0,11

1& А 2,41+0,25 2,58+0,26

* *# - п=8; - п=14.

ВЫВОДЫ.

I. В латентном периоде развития ЭАЭ в периферической крови морских свинок снижено относительное содержание активных Е-розеткообра-зующих клеток и значительно повышен уровень содержания анти-ОБМ антител; развитие характерных неврологических признаков заболевания сопровождается повышением общего содержания Т-лимфоцитов и сохране-

нием высокого уровня содержания анги-ОБМ антител.

2. ЭЛЭ у экспериментальных животных сопровождается накоплена в избыточных количествах продуктов метаболизма с молекулярной мас( менее 30 кДа, .снижением содержания в сыворотке крови альбумина и < способности к образованию комплексов с лигандами различной природ активацией процессов протеолиза, нарушением липидного обмена.

3. Показана возможность получения иммуносорбентов на основе < зической адсорбции и ковалентной иммобилизации основного белка mhi лина на поверхности активированных углеродных сорбентов. Доказано что полученные иммуносорбенты обладают как специфическими, так и i специфическими поглотительными свойствами.

4. Гемосорбционная терапия в латентном периоде развития ЭАЭ : морских свинок с использованием неспецифических и специфических а, сорбентов ведет к предотвращению развития заболевания. В отличие * этого при развитии у экспериментальных животных характерных клини ческих признаков ЭАЭ выраженным терапевтическим эффектом обладает лишь специфическая иммуносорбция, что свидетельствует о перспекти ности клинического применения аналогичных сорбентов.

Б. Неспецифическая сорбционная терапия (гемо-, энтеросорбция их сочетанное применение) оказывает иммунокорригирующее и детокси цирующее воздействие на организм больных PC, способствуя нормализ ции соотношения Т-хелперы/Т-супрессоры и содержания В-лимфоцитов периферической крови пациентов, а также снижению в плазме крови с держания метаболитов среднбй молекулярной массы, общего холестери фосфолипидов и нормализации транспортных функций альбумина, что с детельствует о целесообразности применения предложенных методов и средств терапии для лечения аутоиммунных демиелинизирующих заболе ний человека.

СПИСОК РАБОТ,ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Положительный эффект гемоперфузии при демиелинизирующих п цессах в эксперименте и клинике // 7-й Международный симпозиум не моперфузии: Тезисы докладов. - Киев. - Наукова думка. - 1986. - С -63 (соовт.: Н.П.Метальникова, А.А.Мухтарова).

2. Specific and non-cpeoifio hemoaorbents in experimental al gio encephalomyelitis (EAE) therapy // 1 est International oongrenc tho World Apheresis Association: Abstracts. - Tokyo, Japan. - 19i

P.81 (соавт.: N.P.Metal'nikova, V.G.Nioolaev, V.P.Sergeev).

3. Effect of hemoperfusion on the course of demyelinization processes: experimental and olinical pioture // Biomat., Art.Cells, Art. Org. - 1987. - 15,N1. - P.287-295 (соавт.: N.P.Metalnikova, A.A.Skoro-mets, I.M.Barbae, G.V.Lin'kova, E.A.Gorokhov).

4. Multiple solerosie: extracorporeal methods or enterosorption 7 // International Symposium on Haemoperfusion, Adsorbents and Immobilized Reactants: Abstracts. - RoBtock-Warnemiinde, G.D.R. - 1988. - P.50 (C08BT.: N.P.Metalnikova, V.G.Nioolaev, I.M.Barbae).

5. Evaluation of efficiency for multiple sclerosis efferent therapy // The ESFH 7-th Annual Meeting: Abstraots. - Uppsala, Sweden. -

1989. - С 10 (соавт.: N.Metalnikova, b.Popova, L.Usunova, P.Osadchy, B.Semenov).

6. Biospeoifio sorbents for medical use based on synthetio aoti-ve carbons.// Artif.Organs. - 1989. - 13,N4. - P.334 (соавт.: S.Mikha-lovsky, A.Noscov, T.Alekseyeva, N.Metal'nikova).

7. Способ неингаляционного наркоза для операций на морских свинках // Рефераты рацпредложений: Препринт Л I. - Киев. - 1990. - С.7.

8. Б1ох1м1чн! та ф!зико-xlм1чн! зм1ни альбум1ну в динам!ц1 екс-периментального алерг!чного енцефалом1ел1ту // Укр. б!ох1м. журн. -I99D. - 62,№ 3. - С.43-48 (соавт.: Н.П.Метальникова, С.И.Ханюченко, П.В.Осадчий, Я.Ф.Ковалшин).

9. Synthetio aotive carbons for selective removal of the antibodies against enoephalitogenio myelin basio protein // International carbon conference: Extended abstracts and programme. - Paris.-

1990.- P.134-135. (соавт.: N.Metal'nikova, S.Mikhalovsky, A.Nosoov). 10. Положительное решение Госкомитета СССР по делам изобретений

и открытий от 22 февраля 1990 г. по заявке » 4627108/30-14 от 23 ноя-Зря 1988 г. Способ лечения рассеянного склероза (соавт.: А.А.Морозова, И.М.Барбас, И.Н.Ермоленко, А.А.Скоромец, В.Г.Николаев, Н.П.Мвталь-яикова, Л.К.Лига, И.Г.Троценко).

Зан. GФормат 60x84/16. Уч.-иэд.л. 1,0 1одп1тслно к печати 20.09.1990 года._Тирах 100

1плиграфический участок Института теоретической физики ЛН УССР