Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунологические и биохимические аспекты сорбционных методов терапии демиелинизирующих заболеваний

МИНИСТЕРСТВО» ЗДРдВСЮХРАНЕНШ УКРАИНСКОЙ ССР

КИЕВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ ИМ.АКАДЕМИКА А.А.БОГОМОЛЬЦА.

На правах рукописи

Гуринв Наталия Михайловна

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СОРБЦИОННЫХ МЕТОДОВ ТЕРАПИИ ДЕМИЕЯИНИЗИРУЩИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

К и в в - 1990

Работа выполнена в секторе искусственных органов и медицине« биотехнологии Института проблем онкологии им. Р.Е.Кавецкого АН УС

Научный руководитель - кандидат медицинских наук,

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

профессор Я.В.Велик

- доктор медицинских наук, профессор Г.Н.Дранник

Ведущее учреждение - Институт экспериментальной медицины АМН ССС1

Защита состоится " " ОуиЛл-ЛЛ._199/ г. в 13 часо!

30 минут на заседании специализированного совета Д 088.13.06 по защите диссертаций па соискание ученой степени доктора наук при Киевском ордена Трудового Красного Знамени медицинском институте им.акад. А.А.Богомольца по адресу: 252057,Киев-57,проспектПове-ды, 34 (санитарно-гигиенический корпус, аудитория 2).

Отзывы на автореферат высылать по адресу: 252057, Киев-57, проспект Победы, 34. КМИ, санитарно-гигиенический корпус.

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке Киевского медицинского института (Киев-57, ул.Зоологическая, I).

старший научный сотрудник В.М.Юдин

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук

В.Г.Еордонос

' i ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

,'„. Актуальность проблемы. Рассеяшшй склероз (PC) занимает одно из пдрвих мест в ряду демиелшизирующих заболеваний центральной ЗДрвАой системы человека по частоте заболеваемости (Hallpike J. et al.,1983). Согласно аутоиммунной концепции патогенеза PC, основой процесса демиелинизации являются иммунологически обусловленные деструктивные изменения миелиновой оболочки нервных волокон (Raine е., Traugott U.,1984; НоГгаап P. et al.,1986), которые связаны с нарушением проницаемости гематоэнцефалического барьера (Chou с', et al., 1983; Forsberg P. et al.,1984) и выходом в циркуляцию энцефалито-генннх субстанций, в частности, основного белка миелина (ОБМ) и продуктов его деградации (Hasnim G.,1985). Сенсибилизация организма этими субстанциями характеризуется появлением клонов аутореак-тивных лимфоцитов и специфических аутоантител (агосте м.,1980; Paterson P. et al.,I98I; Ryberg В.,1982; Bellamy A. et al.,1986; Garciamerino A. et al.,1986).

Известно, что аналогичные аутоиммунные изменения, а именно, появление в сыворотке крови антител к ОБМ, сопровождают развитие экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЭАЭ), который является лабораторной моделью PC (Akiyama К. et al.,I98I; Irie H. et al.,I98I; cambl F.,Ьеев M.,1984). На этой модели показана возможность достижения положительного терапевтического эффекта при введении высоких доз ОБМ или энцефалитогенного пептида животным с индуцированным ЭАЭ (Терлецкая Я.Т. и др.,1976; Житнухин Ю.Л. и др.,1978; Drisooll В. et al.,1974,1975; Bttar D.,Whitaare С.,1988; Kennedy M. et al.,1988; Clayton J. et al.,1989). Полагают, что этот эффект реализуется з,а счет специфического связывания антител к ОБМ (Swanborg R., 1973) или же за счет элиминации антигенспецифических клонов Т-лимфо-цитов (DrlBooll в. et al.,1975). Важно отметить, что есть отдельные сообщения об аналогичном использовании гетерологичного ОБМ для лече-*ия PC у человека (Waktsman В.,1983; Weiss W.,Dambroeia Y.,1983).

До недавнего времени основным методом лечения PC было использование препаратов, обладающих неспецифическим супрессорннм воздействием на иммунную систему организма. Однако длительное применение им-лунодепрессантов может приводить к необратимым нарушениям клеточного иммунитета у больных, способствовать дальнейшему прогрессировашш PC i проявлению многочисленных осложнений, прежде всего, стероидной за-

висимости (Хондкариан O.A. и др.,1987; Ярош A.A. и др.,1990). Изе но также, что характерные для демиелмнизирущей патологии hmmyhoj ческие и биохимические изменения, как правило, сопровождаются изс точным накоплешем в крови продуктов метаболизма, в частности, Ое ков, которые могут угнетающе действовать на некоторые функции кле ного иммунитета, способствуя развитию аутоиммунного поражения hbj ной ткани на фоне эндогенной интоксикации организма (Галактионов и др.,1983; Niese о. et al.,1986). Очевидно, что рациональная Tej пия подобных патологических состояний должна решать две основные дачи: достижение направленного иммунокорригирукицего эффекта с uej элиминации или существенного торможения аутоиммунных реакций как основного патогенетического звена, а также детоксицирующего возде ствия.

Рядом авторов отмечен иммунокорригирующий эффект эфферентны: тодов терапии наряду с их выраженным детоксицирующим воздействие! организм, что обусловило успех применения для лечения демиелиниз! щих заболеваний человека, в частности PC, плазмафереза (Неретин I И др.,1988; Dau Р. et al.,1980; Hauser S.et al.,1983; Weiner H., Hosokawa S.,Oyamaguchl A.,1989), лимфоцитафереза (Medaer R. et а 1984), а также сорбции на аффинных иммуносорбентах типа IM-P с и мобилизованным фенилаланином (Nagaeato К. et al.,1988; Palm М. е al.,1988; Schmitt Е. et al.,1989).

Среди эфферентных методов терапии необходимыми свойствами д осуществления данной задачи может обладать и гемоперфузия через тивировашше углеродные гемосорбенты. В пользу этого свидетельст ет то, что неселективная гемоперфузия нашла широкое применение в ралии ряда иммунозависимых заболеваний (Молоденков М.Н. и др.,19 Дмитриев A.A. и др.,1982; Лопухин Ю.М. и др.,1982; Чучалин А.Г. др.,1982^ грандо С.А. .Дранник Г.II. ,1990; Nylcolaev N. et al.,1985 Синтетические активированные угли медицинского назначения явилис тагако перспективными матрицами и для создания специфических адсс бантов. На их основе разработаны сорбционше материалы с иммобш зованным комплексом протеолитических ферментов (Eretskaya Е.,196 иммуносорбент для лечения бронхиальной астмы (Чучалин А.Г.,1984) ДИК-содержащие гемоиммуносорбенты для лечения лучевых поражений ряда иммунозависимых патологий (Снеккова Е.А.,1988).

Очевидно, что поштки сочетания специфического удаления ан^ к ОВМ с неспецифической элиминацией из организма токсичных продц

;етаболизма, избыточное накопление которых ведет к эндогенной инток-икации, актуальны в плане разработки ноеых: подходов и средств лече-ия РС.

Целью настоящего исследования явилось изучение возможностей при-енения сорбциошшх методов, основанных на использовании активирован-их углей, в терапии демиелинизируквдих заболеваний.

В соответствии с целью исследования были поставлены следую-ие задачи :

. Изучить иммунологические и биохимические изменения, происходящие в организме экспериментальных животных в динамике развития ЭАЭ.

. Оценить эффективность гемосорбционной терапии с использованием

неспецифических углеродных адсорбентов при ЭАЭ у морских свинок. . Получить специфические иммуносорбенты на основе углеродных матриц, предназначенные для удаления антител к ОБМ из крови экспериментальных животных. . Проанализировать специфические и неспецифические поглотительные свойства полученных иммуносорбентов и оценить их терапевтическую эффективность при ЭАЭ у морских свинок. . Оценить эффективность применения гемо- и энтеросорбции при лечении больных РС по иммунологическим и биохимическим критериям.

Научная новизна исследования. Впервые показана возможность до-гижения положительного терапевтического эффекта у морских свинок с здуцировашшм ЭАЭ посредством сорбционных методов. Наиболее перс-зктивным является метод гемоиммуносорбции с использованием специфи-зских адсорбентов на основе различных углеродных матриц с иммобили-эвашшм ОБМ. С помощью комплекса иммунологических и биохимических мтериев показано, что реализация положительного эффекта гемосорб-ш при ЭАЭ достигается благодаря сочетанию специфических и неспеци-меских поглотительных свойств использованных иммуносорбентов. Тем 1мым показана принципиальная возможность разработки специфического юорбента для лечения больных РС. Эффективность неспецифических фбционных методов положительно верифицирована в клинике при лече-ш больных РО: показано, что применение гемо- и энтеросорбции при-)дит к нормализации хелпер-супрессорного соотношения Т-лимфоцитов содержания В-лимфоцитов крови, лшшдного обмена, содержания комитентов средней молекулярной массы плазмы крови и связывающей спорности альбумина.

Научно-практическая значимость работы. Предложенные на основании экспериментальных данных схемы гемо-, энтеросорбции и их сочетанного применения используются в неврологических отделениях I ШШ им.акад. М.П.Павлова и ЦКБ АН СССР (г.Москва) для лечения Солышх РС в стадии обострения заболеваш1Я. Сорбциошше средства терапии способствуют иммунокоррекции и восстановлению детоксикаци-онного потенциала оргашзма, вследствие чего достигается устойчивая ремиссия длительностью год и более у 85% больных.

Апробация работы. Основные результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на отчетных научных конференциях Института проблем онкологии им. Р.Е.Кавецкого АН УССР (Киев,1987, 1988); на 7-м Международном симпозиуме по гемоперфузии (Киев,1986); на Международном симпозиуме по гемоперфузии, адсорбентам и иммобилизованным реактантам (Росток,1988); на Международной конференции "СагЬопе-90" (Париж,IУ90); на заседании экспертного совета по апробациям докторских и кандидатских диссертаций при Киевском медицинском институте им.акад. А.А.Богомольца МЗ УССР (Киев,1990).

Публикации. Но материалам диссертации опубликовано 9 научнш работ и получено положительное решение Госкомитета СССР по делам ш бретений и открытий от 22 февраля 1990 г. по заявке № 4627108/30-1^ от 23 ноября 1988 г.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Иммунологические нарушения, наблюдаемые при развитии аутоиммунных демиелшизирующих заболеваний у экспериментальных животных и человека (ЭАЭ и РС), реализуются на фоне ряда метаболических изменений в организме, свидетельствующих о прогрессирующей эндогенной интоксикации.

2. Иммуьосорбенты на основе синтетических, углеродных матриц с иммобилизованным ОБМ проявляют как специфические, так и неспецифиче! кие поглотительные свойства, то есть являются комбинированными адсорбентами.

3. Предложенные сорбциошше методы детоксикации (гемо-, энтеросорб ция и их сочетание) с использованием отечественных активированных углей расширяют возможности эфферентной терапии демиелинизи руицих заболеваний человека.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав обзора литературы, пяти глав собственных результатов н их. обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, вклю-

зющего 241 наименование (83 отечественных и 158 зарубежных). Ра-зта изложена на -/79 страницах машинописного текста, иллюстрирова-э 21 рисунком и 18 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования.

Исследования выполнены на 308 беспородных морских свичках мас-)й 300-400 г. В работе представлены данные 159 стендовых эксперимен-зв и 37 гемоперфузий на морских свинках, с использованием углеродно) гранулированного гемосорбента СКН и волокнистого углеродного мате-1ала АУВМ-Днепр-МН. Исследованы сыворотки и плазмы крови 41 больно> РС до и после лечения эфферентными методами детоксикации и 10 до->ров.

Модель ЭАЭ у морских свинок воспроизводили подкожным введени-1 (в 5 точек ) 1,0 мл энцефалитогенной смеси, содержащей 0,5 мл ютвора ОБМ из расчета 100 мкг белка на животное и 0,5 мл полного гьюванта Фрейнда, по Козулиной Е.П. и др.(1972). Антиген (ОБМ) по-гчали по методу Палладина А.В. и др.(1970) из очищенной фракции об-)го миелина, выделенного из белого вещества головного мозга быка ) Autillo 1.(1964). Иммобилизацию антигена на углеродных матрицах ш получении иммуносорбентов осуществляли способом физической ад->рбции или реакцией ковалентного сочетания в присутствии водорас-юримого карбодиимида. Прочность удерживания лиганда матрицей оце-[вали Мбтодом спектрофлюориметрии.

Для оценки неспецифических поглотительных свойств исходных •леродных матриц и полученных иммуносорбентов использовали спек-юфотометрический метод определения кинетики адсорбции ими из (дных растворов маркерных метаболитов: креатинина (\=235 нм), молвой кислоты (А.=296 нм) и витамина В12 (Л=361 нм). Специфическую 1Глотительную емкость адсорбентов оценивали по убыли из сорбатов >М определением содержания Оэлка по методу Lowry 0. et al.(I95I).

Уровень содержания антител к ОБМ в сыворотках крови морских ¡инок оценивали методом твердофазного неконкурентного иммунофер-iHTHoro анализа по Irle Н. et al.(I981) в собственной модификации.

Лимфоциты из периферической крови животных и больных РС выде-|ли по Bpyum а.(1968). Содержание E-РОК в крови морских свинок гределяли по stadooker М. et al. (1973), а в крови больных РС - по

Jondal M. et al.(I972). Содержание EAC-POK определяли no Shevach et al.(1972) и Bianco C. et al.(I970) соответственно. Кроме того, в крови больных определяли количество функционально активных J5 —Г по Kerman R. et al.(I97G); о соотношении иммунорегуляторных субпо пуляций Т-лимфоцитов судили по результатам теста на теофшшшчувс твительность по Shore A. et al.(I978). Содержание в сыворотке кро ви больных иммуноглобулинов классов о, м, л определяли методом ра диальной иммунодиффузии по Manoini G.(I96b), используя моноспецифические анти-G-, анти-М-, анти-А-сыворотки фирмы "Sevac" (ЧССР) эталонную сыворотку фирмы "Boehringer" (ФРГ). Феномен торможения миграции лейкоцитов крови морских свинок в присутствии OEM изучали по методу Артемовой А.Г.(1973) с использованием пятиканальных прямоугольных капилляров Перфильева-Габе. Гематологические показа тели определят традиционными методами.

Компоненты средней молекулярной массы выделяли из плазмы крс ви методом ультрафильтрации с последующи анализом методом высокс эффективной жидкостной хроматографии на системе HPLC ("Millipore-Waters",CUJA). Содержание альбумина в сыворотке крови определяли л Hill Р.(1983). Альбуминовую фракцию из плазмы крови выделяли путе высаливания сульфатом натрия с последующим диализом. Связывающую способность альбумина по отношению к гидрофобному маркеру конго красному определяли по Чёгеру С.(1975). Константу связывания и чь ело центров связывания альбумина с маркером метиловым красным onj деляли методом дифференциальной спектроскопии с регистрацией диф) ренциальных спектров с помощью спектрофотометра DU-70 ("Beckman", Австрия). Температуру денатурации альбумина определяли методом да ференциальной сканирующей калориметрии на микрокалориметре ДСМ-4.

Содержание общих липидов, холестерина и фосфолипидов в плазь крови определяли с помощью стандартных наборов фирмы "bioMerietLx* (Франция). В сыворотке крови определяли активность щелочной фос-фатазы по Bessey О. et al.(I946), кислой фосфатазы по Pishman W., Lerner P.(1953) и общей протеолитической активности по Веремеен-ко К.Н. (1978).

Процедуру гемокарбоперфузии у морских свинок производили но, кетаминовым наркозом (50 мг/кг массы) по артерио-венозной схеме < использованием перистальтического насоса. Объем заполнения экстр; корпоралыюго круга - 3-4 мл, скорость перфузии - 1,8-2,0 мл/мин объем перфузии - 3 общих объема циркулирующей крови, лродолжител!

зсть перфузии - 30-45 минут.

Представленные в работе данные подвергнуты статистической образке по критерию Стьюдента-Фишера.

Результаты исследований и их обсуждение. Иммунологические и биохимические изменения в динамике развития ЭАЭ.

Показано, что развитио ЭАЭ у морских свинок, индуцированного шдением высокоочищенного ОБМ из мозга быка, сопровождается виражными иммунологическими изменениями. В латентном периоде развития 1Т0Л0ШИ (10-е сутки после сенсибилизации) в периферической крови ¡В0Т1ШХ снижено на 40,4% (р<0,01) по сравнению с интактными морски-! свинками относительно« содержание Ед-Р0К и достоверно не изменя-■ся содержание Е-РОК. При развитии характерных признаков ЭАЭ (15---е сутки после сенсибилизации) сохранялась тенденция к снижению со-ржаиия субпопуляции Еа-Р0К, однако при этом общее содержание Е-РОК вишалось на 23,4% (р<0,02). Относительное содержание ЕАС-РОК в ди-мике развития ЭАЭ достоверно не изменялось. У 42% морских свинок с врологическими признаками ЭАЭ, в отличие от животных в латентном риоде заболевания, с помощью теста ингибиции миграции лейкоцитов ло зарегистрировано наличие выраженной гиперчувствительности замед-нного типа по отношению к ОБМ. С помощью твердофазного иммунофер-нтного анализа было показано, что развитие ЭАЭ, начиная уже с ла-нтного периода заболевания, характеризуется высоким уровнем содер-ния антител к ОТ-'М.

Параллельно установлено, что в латентном периоде развития за-левания увеличивается активность кислой фосфатазы в сыворотке кро-животных на 48,7% (р<0,001), а при наличии характерных признаков Э - на 81,5% (pcO.OOI) по сравнению с интактными морскими свинками, повременно снижается активность щелочной фосфатазы соответственно 37,8% (р<0,001) и 58,7% (р<0,001). В латентном периоде развития Э содержание общего холестерина в плазме крови снижается на 30% <0,05), а общих липидов - на 18,6% (р<0,05). Развитие характер-х признаков ЭАЭ сопрововдается сохраняющейся тенденцией к сниже-о данных показателей при увеличении на 23% (р<0,05) уровня содер-зия фосфолипидов, что может свидетельствовать об активно текущем .телкнизируидем процессе. Развитие у животных ЭАЭ сопрововдается

повышением общей нротеолитической активности сыворотки крови, сост вившим к 10-м суткам после сенсибилизации 33,6% (p«j,G2), а к 1518-м - 50,6% (р<0,001) по сравнению с контролем. При этом наблюдается снижение содержания общего белка плазмы крови и, прежде всего альбумина на 18,5-32% (р<0,001). Кроме того, в процессе развития Э отмечено накопление в крови метаболитов средней молекулярной массы (<30 кДа). Так, уже к 10-м суткам наблюдалось увеличение данного п казателя на 48% (p<0,U5) по сравнению с контролем. Данные дифферен циалыюй спектроскопии и сканирующей калориметрии указывают на выр кенное изменение связывающей способности альбумина крови. К 10-м с кам после сенсибилизации ОШ максимум температуры денатурации альб мина, выделенного из пула плазмы крови животных, составил 68,0±0,6 по сравнению с 63,9±0,5°0 в норме, что свидетельствует о значитель ной загруженности белка продуктами метаболизма. При развитии невро логических признаков ЭАЭ максимум температуры денатурации альбумин составил 66,8±0,Ь°С. Параллельно наблюдалось снижение величины кон станты связывания альбумина с маркерным красителем метиловым краен на 35% (р<0,05) преимущественно за счет уменьшения числа центров б ка доступных для кошиюксообразования с данным лигандим с 1,05±0,0 до 0,79±0,05 (р<0,05).

Полученные данные свидетельствуют о том, что отмеченные нами иммунологические сдвиги при развитии ЭАЭ у морских свинок сопровож даются рядом метаболических изменений, указывающих на наличие энда генной интоксикации в организме при активно протекающем иммунологи чески обусловленном процессе демиелинизации.

2.Получение иммуносорбентов на основе углеродных активированных матриц и оценка их специфических и неспецифических поглотительных свойств.

При получении иммуносорбентов, предназначенных для удаления v плазмы крови антител к ОБМ, в качестве матриц были использованы Г{ нулнрованный углеродный гемосорбент типа СКН и активированный угле родный волокнистый материал АУВМ-Днепр-МН.

Показано, что метод физической адсорбции из водных 0,03-0,093 растворов ОБМ позволяет иммобилизовать на углеродных матрицах СКН АУВМ соответственно около 7 мг и 65 мг белка на I г адсорбента. Дс статочяо прочная фиксация лиганда на матрицах достигается при имме

■илизации ОБМ в динамическом режиме при скорости перфузии белкового ^створа 2,0 мл/мин в течение 3 часов. Оценка прочности фиксации иганда на матрице показала, что лишь при обработке полученных им-уносорбентов 6 М раствором мочевины в первые минуты контакта элюи-ующего раствора с матрицей происходит десорбция следовых количеств нтигена, по-видимому, связанного с матрицей водородными связями.

В экспериментах in vivo по гемоперфузии были использованы имму-осорбенты, полученные методом физической адсорбции, с содержанием иганда около I мг на I г СКН и 2 мг на I г АУВМ. Общее количество «мобилизованного ОБМ составляло 2,5 мг в расчете на один экспери-энталышй перфузионный массообменник.

В опытах in vitro по оценке специфических поглотительных свойств jли использованы иммуносорбенты, полученные реакцией ковалентного со-зтания в присутствии бифункционального сшивающего агента 1-этил-З-3-диметиламинопропил) карбодиимида на основе гранулированных матриц та СКН. Содержание антигена составляло около I мг на I г матрицы.

Эффективность сорбции анти-ОБМ антител на иммуносорбентах опре-эляли с помощью иммуноферментного анализа после перфузии сывороток зови морских свинок с ЭАЭ и интактных животных, служивших контро-зн. Условия перфузии соответствовали реальным условиям сорбционной юцедуры in vivo. В качестве контроля на специфичность связывания 1ла использована матрица углеродного материала сферического карбоната (CKHjj) с ковалентно присоединенным антигеном, имеющая мини-¡льную мезопористость, подтвержденную в экспериментах по сорбции фкерных метаболитов (креатинин, мочевая кислота, витамин В12)-|рфузии подвергали как правило пул сывороток крови 3-5 эксперимен-1ЛЬНЫХ животных.

Однократная перфузия пула сывороток крови,полученных от морских ¡инок в латентном периоде развития ЭАЭ, через иммуносорбенты на ос-ве матриц типа СКН приводила к снижению содержания уровня анти-ОБМ ;тител в среднем на 30.7% (р<0,001) (рис.1). При перфузии пула сы-роток животных с характерными признаками ЭАЭ через иммуносорбент блюдалась сходная картина сорбции анти-ОБМ антител: величина сни-ния исходного уровня антител составила 33,2% (р<0,001) (рис.1), рфузия пула сывороток крови морских свинок с ЭАЭ через углеродные сорбенты, которые использовали в качестве матриц при получении им-носорбентов, не вела к достоверному снижению уровня анти-ОБМ ан-тел в исследуемом материале.

- А Б В А Б В

СКН+ОБМ CKI^+ОБМ

Рис.1. Содержание анти-ОЬМ антител в сыворотке крови морских евино! до и после перфузии (П) через иммуносорбенты in vitro:

А - интактные животные;

Б - латентный период развития ЭАЭ;

В - наличие у животных характерных признаков ЭАЭ.

3

Условия перфузии: объем сорбента - 1,8 см ; объем порфузируемой ci воротки - 3,6 мл; скорость перфузии - 0,2 мл/мш

Оценка неспецифических поглотительных свойств иммуносорбентов полученных методом физической адсорбции и ковалентного сочетания, < ла выполнена в опытах по кинетике сорбции из водных растворов марк< ных метаболитов малой и средней молекулярной массы: креатинина, мо1 вой кислоты и витамина В^- Иммобилизация ОБМ на гранулированных mi трицах обоими способами снижала их способность к поглощению маркер« малой молекулярной массы (креатинин и мочевая кислота) в среднем н: 13-22%. Поглощение этих маркерных метаболитов иммуносорбентом на О' ново волоюшстой матрицы снижалось лишь на 6-11%. Поглощение витаи на В12 иммуносорбентами на основе гранулированного сорбента СКН по сравнению с исходными матрицами снижалось в среднем на 17-25% и не снижалось у иммуносорбента на основе волокнистого материала аувм.Э данные свидетельствуют, что иммобилизация на поверхности углеродны

адсорбентов ОБМ при получении селективных шмуносорбентов приводит к незначительному снижению их неспецифических поглотительных свойств.

Таким образом, полученные на основе углеродных активировашшх матриц иммуносорбенты можно отнести к комбинированным сорбентам, которые наряду со специфическими поглотительными свойствам по отношению к анти-ОБМ антителам, сохраняют неспецифическую поглотительную активность.

3.Оценка эффективности применения специфических и неспецифических сорбентов в экспериментах in vivo.

Сравнение эффективности неспецифической сорбционной процедуры л иммуносорбции в латентном периоде заболевания (11-е сутки после сенсибилизации) показало, что оба подхода позволяют предотвратить эазвитие заболевания у морских свинок. Однако, если применение ге-лоперфузии через непокрытые адсорбенты СКН и АУБМ приводило к поло-кительному результату после появления отдельных признаков патологи-1еского процесса к 18-19 суткам после сенсибилизации (падение мае-зы тела, вялость движений, незначительные расстройства их координации), то применение гемоперфузии через иммуносорбенты на основе дан-шх матриц вело к полному подавлению развития демиелинизирукмцего провеса, что может быть связано с эффективным удалением анти-ОБМ антител у этих животных.

Использование неспецифических углеродных гемосорбентов для ге-гоперфузий у морских свинок с характерными клиническими признаками )АЭ, развивающимися к 15-18-м суткам после сенсибилизации, приводит гашь к кратковременному положительному терапевтическому эффекту, ко-'орый выражается в частичном восстановлении двигательной активности i увеличении продолжительности жизни животных в среднем на 2-12 су-'ок по сравнению с контрольными животными, которым гемоперфузия либо ie выполнялась, либо проводилась через колонку с контрольным материа-юм - хирургическим шелком. При этом гранулированные гемосорбенты ти-ia СКН и волокнистый углеродный материал АУВМ-Днепр-МН обладали сход-юй терапевтической эффективностью. Это коррелировало с данными хро-ттографического анализа ультрафильтратов плазмы крови морских свили с ЭАЭ (табл.Х), указывающими на то, что неспецифическая эфферент-ая процедура приводила к снижению содержания компонентов плазмы сред-ей молекулярной массы на 33-44 % (р<0,05).

Таблица I.

Содержание компонентов с молекулярной массой <30 кДа в ультрафильтратах плазмы крови морских свинок с ЭАЭ до и после гемо-перфузии (усл.ед.площади хроматографических пиков х 106)( М±ш)

Этапы исследования Тип сорбента

СКН АУВМ СКН+ОБМ АУВМ+ОБ

ДО гемоперфузии 5,56+0,68 4,98+0,39 5,34+0,18 5,00±0,

I час после гемоперфузии 3,71+0,66 2,79+0,44 3,51+0,29 3,42+0,

24 часа после гемоперфузии 3,24±0,70 2,81±0,60 3,44+0,51 3,21±0,

Проведение гемоперфузий у морских свинок при наличии характерн неврологических признаков ЭАЭ через иммуносорбенты на основе как гр нулированных, так и волокнистых углеродных матриц приводило к вира» ной регрессии проявлений заболевания и после однократного, непродол жительного его обострения через 10-12 суток после проведения процедуры наблюдалась длительная ремиссия (в течение года). При этом сш кение содержания метаболитов средней молекулярной массы в плазме кр ви морских свинок, подвергнутых процедуре иммуносорбции, составило 32-36% (р<0,05) (табл.1).

Кроме того, биохимические исследования показали, что перфузия сыворотки крови животных с ЭАЭ через иммуносорбенты у1Лго приводила также к снижению активности кислой фосфатазы до контрольного уровня - уровень снижения составил 54% (р<0,001) независимо от типа использовавшейся матрицы. При этом не наблюдалось нормализации повышенной при развитии ЭАЭ общей протеолитической активности сыворотки крови животных.

Положительный терапевтический эффект от применения иммуносорб! тов как в латентном периоде развития ЭАЭ, так и при наличии характ* ной неврологической клиники коррелировал с эффективностью удаления помощью данных сорбентов из сыворотки крови морских свинок анти-0Б1

■ител (рис.1).

На оснований результатов оценки влияния сорбциошюй терапии на ■витие ЭАЭ у морских свинок можно прийти к выводу, что с помощью ного метода лечения возможно предупреждение развития демиелини-ущего заболевания у экспериментальных животных независимо от ользуемого при этом адсорбента (специфического или неспецифичес-о). На фоне развернутой клинической картины ЭАЭ выраженным тера-тическим эффектом обладает лишь специфическая иммуносорбция.

4.Оценка иммунокорригируицего и двтоксицирующвго эффектов сорбциошюй терапии при PC человека.

Процедуры гемосорбции у больных PC проводили через гранулирован-гемосорбенты CKH-IK, С1Ш-2К, СКН-4М и СУГС по вено-венозной схе-с объемной скоростью перфузии 100-120 мл/мин 2-3 раза с интервалом ней. Для энтеросорбции использовали гранулированные угли названных эк в количестве 90 г в сутки (за 3 приема) или волокнистый матери-АУВМ в количестве 0,9 г (в виде таблеток) ежедневно в течение 14-суток.

Терапия сорбционными средствами (гемо- или энтеросорбция и их этание) вела к значительному улучшению неврологического статуса

шх PC, позволяя купировать вновь появившиеся патологические тгомы, способствуя урекению рецедавов заболевания. Наиболее чет-положительный эффект, характеризующийся восстановлением трофи-«IX и двигательных функций и достижением продолжительной ремис-(I год и болс-о), отмечен у больных с ремиттирующим типом тече-заболевания в стадии обострения. У больных с исходно резко вы-;иными патологическими нарушениями отмечалось либо частичное совиное восстановление трофических и двигательных функций, либо имущественно улучшение трофических функций. По стобалльной шкале жи неврологического статуса Sipe J. et al.(I984) курс лечения, зчавший 2 гемосорбции, приводил к улучшению статуса с 64,8±3,5 до Э±3,3 (р<0,05) баллов у больных с продолжительностью заболевания 1-х лет и с 47,4±4,8 до 72,3±4,5 (р<0,05) баллов - с продолжитель-:ью PC более 2-х лет. Трехнедельный курс энтеросорбции вел к издано в неврологическом статусе от 52,0+3,4 до 79,0±3,0 (р<0,05) юв. Наибольший эффект достигался при комбинированной сорбционной ниш, включавшей 2 гемосорбции и последующий 10-дневный курс эн-

теросорбции.

Исследование состояния клеточного и гуморального иммунитета у больных РС, подвергшихся сорбционной терапии, показало, что она об. дает иммунокорригирующим эффектом. Сорбционная терапия приводила к снижению исходно повышенного на 56% (р<0,05) абсолютного содержани, субшпуляции функционально активных Т-лимфоцитов до уровня нормы, также к снижению на 48% (р<0,05) содержания популяции В-лимфоцитов (табл.2). Нормализация содержания последних в периферической крови после проведения сорбционной терапии не сопровождалась достоверным изменением содержания иммуноглобулинов исследованных классов (табл Достоверное увеличение иммунорегуляторного индекса Т-хелперы/Т-су-прессоры на 75,6% (р<0,02)(табл.2) по сравнению с его значением у .больных РС до лечения сорбционшми средствами может свидетельствовать о целесообразности использования данных средств при лечении аутоиммунных демиелинизирувдих заболеваний человека.

Существенно то, что эффект иммунокоррекции достигался на фоне детоксицирующего воздействия сорбционных средств на организм. Это доказывается, в частности, снижением содержания компонентов средне молекулярной массы в плазме крови больных РС после лечения на 35,7 (р<0,05), а также повышением связывающей способности альбумина пла мы по отношению к маркерному красителю конго красному на 90,0% (р<0,05).

Показано, что из 20 больных, у которых изучался обмен лилидое 6 человек имели повышенный на 50,0% (р<0,001) уровень общих липидс 13 - на 77,7% (р<0,001) уровень фосфолипидов и 18 - на 29,3% (р<0, уровень общего холестерина сыворотки крови по сравнению с величиш данных показателей у здоровых доноров. Лечение больных с применена гемо-, энтеросорбции или их сочетания приводило к снижению содержг общих липидов сыворотки крови в среднем на 28% (р<0,05), фосфолиш дов - на 2г% (р<0,05) и общего холестерина - на 24% (р<0,05) у пациентов с исходно повышенными показателями. Уровни содержания исс. довашшх липидов сыворотки крови больных, у которых исходные знач( ния были в пределах физиологической нормы до лечения, существенно изменялись.

Таким образом, сорбционные сродства терапии могут оказывать 1 ригируюцее воздействие на иммунную систему и способствуют Еосстан влешю детоксикационного потенциала организма, что имеет первосте: нов значение в условиях прогрессирующего аутоиммунного.поражения

тральной нервной системы, появления продуктов миелинолизиса и накопления избыточных количеств других патогенетически значимых метаболитов в циркулирующей крови больных РС.

Таблица 2.

Состояние клеточного и гуморального иммунитета у больных РС до и после сорбционной терапии ( М+т ).

Исследуемый показатель До лечения После лечешя

содержание лимфоцитов*:

абс. (хЮ9/л) 2,07+0,34 1,76+0,24

% 32,9±4,00 35,8±3,80

содержание Е-РОК*:

абс. (хЮ9/л) 0,93+0,2? 0,98+0,15

% 51,3*4,70 53,9±3,80

содержание Еа-РОК*:

абс. (хЮ9/л) 0,92+0,18 0,61±0,09

% 44,0+2,20 37,9±2,60

иммунорегуляторный

индекс * 0,82+0,14 1,44+0,17

содержание ЕАС-РОК*:

абс. (хЮ9/л) 0,60+0,10 0,31+0,07

% 30,8+4,60 17,5±2,00

содержание в сыворотке крови иммуноглобулинов (г/л)**:

18 О 11,00+0,75 12,52+0,77

1« м 0,70+0,09 0,80±0,11

1« А 2,41±0,25 2,58+0,26

* ** - п=8; - п=14.

ВЫВОДЫ.

I. В латентном периоде развития ЭАЭ в периферической крови моржих свинок снижено относительное содержание активных Е-розеткообра-1ующих клеток и значительно повышен уровень содержания анти-ОБМ антител; развитие характерных неврологических признаков заболевания гапровождается повышением общего содержания Т-лимфоцитов и сохране-

нием высокого уровня содержания анти-ОБМ антител.

2. ЭЛЭ у экспериментальных животных сопровождается накоплег в избыточных количествах продуктов метаболизма с молекулярной мг менее 30 кДа, .снижением содержания в сыворотке крови альбумина i способности к образованию комплексов с лигандами различной прирс активацией процессов протеолиза, нарушением липидного обмена.

3. Показана возможность получения иммуносорбентов на основе зической адсорбции и ковалентной иммобилизации основного белка t лина на поверхности активированных углеродных сорбентов. Доказа! что полученные иммуносорбенты обладают как специфическими, так i специфическими поглотительными свойствами.

4. Гемосорбционная терапия в латентном периоде развития ЭА! морских свинок с использованием неспецифических и специфических сорбентов ведет к предотвращению развития заболевания. В отличи< этого при развитии у экспериментальных животных характерных kjmj ческих признаков ЭЛЭ выраженным терапевтическим эффектом облада! лишь специфическая иммуносорбция, что свидетельствует о перепек1 ности клинического применения аналогичных сорбентов.

5. Неспецифическая сорбционная терапия (гемо-, энтеросорбц их сочетанное применение) оказывает иммунокорригиругацее и деток цирующее воздействие на организм больных PC, способствуя нормал ции соотношения Т-хелперы/Т-супрессоры и содержания В-лимфоцито периферической крови пациентов, а также снижению в плазме крови держания метаболитов средней молекулярной массы, общего холесте фосфолштидов и нормализации транспортных функций альбумина, что детельствует о целесообразности применения предложенных методов средств терапии для лечения аутоиммунных демиелинизирующих забо ний человека.

.СПИСОК РАБОТ,ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Положительный эффект гемоперфузии при демиелинизирующих цессах в эксперименте и клинике // 7-й Международный симпозиум моперфузии: Тезисы докладов. - Киев. - Наукова думка. - 1986. --63 (соовт.: Н.П.Метальникова, А.А.Мухторова).

2. Specific and rion-epeoliLo hemosorbentis in experimental gio encephalomyelitis (EAE) therapy // let International oongrt the World Apheresi8 Association: Abntraota. - Tokyo, Japan. - 1

?.81 (соавт.: M.P.Metal'nikova, V.G.Nioolaev, V.P.Sergeev).

3. Effect of hemoperlusion on the course of demyelinization pro-jesses: experimental and olinical picture // Biomat., Art.Cells, Art. )rg. - 1987. - 15,N1. - P.287-295 (соавт.: N.P.Metalnikova, A.A.Skoro-lets, I.M.Barbae, G.V.Lin'kova, E.A.Gorokhov).

4. Multiple sclerosis: extracorporeal methods or enterosorption ? '/ International Symposium on Haemoperfusion, Adsorbents and Immobili-;ed Reaotants: Abstracts. - Rostock-Warnemiinde, G.D.R. - 1988. - P.50 соавт.: N.P.Metalnikova, V.G.Nioolaev, I.M.Barbae).

5. Evaluation of efficiency for multiple sclerosis efferent the-apy // The ESFH 7-th Annual Meeting: Abstracts. - Uppsala, Sweden. -989. - G 10 (соавт.: N.Metalnikova, L.Popova, L.Usunova, P.Osadchy, .Semenov).

6. Biospeoifio sorbents for medical use based on synthetic acti-s carbons // Artif.Organs. - 1989. - 13,N4. - P.334 (СОЭВТ.: S.Mikha-Dvsky, A.Noscov, T.Alekseyeva, N.Metal'nikova).

7. Способ неингаляционного наркоза для операций на морских свин-зх // Рефераты рац.предложений: Препринт № I. - Киев. - 1990. - С.7.

8. BloxlMl4Ht та ф1зико-х1м!чн1 зм1ни альбумну в динам 1ц1 екс-зриментального алерг!чного енцефалом!ел!ту // Укр. б1ох!м. журн. -Э90. - 62,№ 3. - С.43-48 (соавт.: Н.П.Метальникова, С.И.Хашоченко, .В.ОсадчиЙ, Я.Ф.Ковалишин).

9. Synthetic aotive oarbons for selective removal of the anti->dies against enoephalitogenic myelin basic protein // Intemati-lal carbon conference: Extended abstraots and programme. - PariB.->90.- P.134-135. (соавт.: fi.Metal'nikova, S.Mikhalovsky, A.Nosoov).

10. Положительное решение Госкомитета СССР по делам изобретений открытий от 22 февраля 1990 г. по заявке J6 4627108/30-14 от 23 ноя-я 1988 г. Способ лечения рассеянного склероза (соавт.: А.А.Морозо-, И.М.Барбас, И.Н.Ермоленко, А.А.Скоромец, В.Г.Николаев, Н.П.Металь-кова, Л.К.Лыга, И.Г.Троценко).

к. Формлг 60x84/16. Уч.-изд.л. 1,0 дрисгшо к печати 20.09.1990 гот._Тираж 100

лигрчфитсский учлсток Института теоретической физики АН УССР