Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Иммунологические аспекты и возможности иммунотропных воздействий при вирусных инфекциях

На правах рукописи

Болков Михаил Артёмович

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ И ВОЗМОЖНОСТИ ИММУНОТРОПНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙ ПРИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЯХ

14.03.09 — клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Екатеринбург-2013 005062180

005062180

Работа выполнена в лаборатории иммунологии воспаления Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института иммунологии и физиологии УрО РАН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор ТУЗАНКИНА Ирина Александровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор ЮШКОВА Татьяна Александровна

фармакологии ГБОУ ВПО

«Пермская государственная

фармацевтическая академия»

Минздрава России

доктор медицинских наук, профессор, ЧУЧКОВА Наталья Николаевна

главный научный сотрудник лаборатории иммунопатофизиологии ФБГУН «Института иммунологии и физиологии» УрО РАН

Ведущая организация - ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения России, г.Челябинск

Защита состоится «_»_2013 г. в_часов на заседании Совета по защите

диссертаций на соискание ученой степени доктора наук, на соискание ученой степени кандидата наук Д 004.027.01 при ФБГУН Институте иммунологии и физиологии УрО РАН по адресу: 620049, Российская Федерация, г.Екатеринбург, ул.Первомайская, 106.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке УрО РАН (620041, г.Екатеринбург, ул.С.Ковалевской, д.22/20), с авторефератом — на сайте ВАК- vak2.ed.gov.ru.

Автореферат разослан «_»_2013 г.

Ученый секретарь Совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук, на соискание ученой степени кандидата наук Д 004.027.01 при ИИФ УрО РАН, Д.М.Н., проф.

И.А. Тузанкина

Актуальность проблемы

В последние годы острые респираторные инфекции занимают до 80% структуры острой патологии раннего детского возраста (Волкова Н.В., 2008, Заманихина Е.В., 2009, Малюга О.М., 2012, Учайкин В.Ф., 2012). По данным Федерального центра гигиены и эпидемиологии, заболеваемость ОРВИ составляет 19 482,2 на 100000 населения. При этом, заболеваемость ОРВИ детей превышает таковую у взрослых в 8,4 раза (Сергеева И.В., 2012).

Проблема формирования патологии у детей, их развития на ранних этапах онтогенеза - наиболее важные задачи современной науки, поскольку здоровье граждан России, ее будущее во многом определяется состоянием здоровья детей.

Дети дошкольного возраста, пребывая в организованных детских коллективах и активно общаясь в социуме, расширяют спектр контактов с инфекционными агентами. На этом этапе онтогенеза происходит закрепление привычного реагирования иммунной системы на них (Ботвиньева В.В., 2000).

Представляет интерес широко дискутируемый вопрос о частых повторных инфекциях у детей и о правомочности использования термина «часто болеющие дети» (ЧБД) для определенной категории таких детей. Несмотря на то, что изменения иммунологических параметров носят, чаще всего, функциональный характер, частые инфекции у детей могут приводить к раннему формированию хронической патологии из-за повреждений различных систем организма при частых инфекционных процессах.

Феномен часто болеющих детей требует особого подхода к лечению респираторных вирусных инфекций и профилактики повторных инфекционных эпизодов.

Существующая проблема лечения обусловлена быстрым развитием вирусной инфекции в организме, низкой эффективностью противовирусных препаратов и развитием толерантности вирусов к ним. Перспективным представляется путь воздействия на иммунные механизмы для получения противовирусного эффекта (Тузанкина И.А., 2012).

Несмотря на то, что эти вопросы интересуют многих исследователей, проблема формирования патологии у детей и лечения вирусных заболеваний не

теряет своей актуальности. В центре внимания оказываются иммунопатогенетические механизмы, что обуславливает повышенный интерес различных исследователей к этим вопросам. Предпринимаются попытки раскрыть характер иммунологических изменений, но еще многое остается неизвестным, а проблема часто болеющих детей - до конца не решённой и в настоящее время. Между тем, роль широкого разнообразия вирусов в указанных процессах зачастую является определяющей.

Известно, что вирусные инфекции занимают стабильно лидирующие позиции в спектре инфекционной патологии, отсутствуют эффективные средства противодействия им, это побуждает к разработке новых средств противовирусной направленности. В этой связи, весьма перспективным направлением таких разработок могут оказаться иммунологические воздействия.

Все вышесказанное обусловило необходимость проведения нашей работы.

Цель исследования:

Оценка иммунного функционирования при вирусных инфекциях в условиях различных вариантов иммунотропных воздействий

Задачи исследования:

1. Оценка параметров иммунитета у детей дошкольного возраста с частыми рецидивирующими вирусными инфекциями респираторного тракта в сравнении с относительно здоровыми детьми.

2. Оценка параметров иммунитета у детей дошкольного возраста с частыми рецидивирующими вирусными инфекциями респираторного тракта в условиях иммунотропных воздействий.

3. Оценка течения герпесвирусной инфекции и цитокинового профиля у лабораторных животных (беспородные белые мыши) в условиях иммунотропных воздействий.

4. Оценка течения инфекционного процесса при инфицировании культуры клеток почек зелёных мартышек VERO вирусом простого герпеса в условиях иммунотропных воздействий.

Научная новизна

Получены новые данные, характеризующие иммунологический профиль часто и длительно болеющих респираторными вирусными инфекциями детей дошкольного возраста.

Получены объективные доказательства эффективности использования бактериальных лизатов при реабилитации часто и длительно болеющих респираторными инфекциями детей дошкольного возраста.

Выявлены изменения . цитокинового профиля, объясняющие выживаемость лабораторных животных на разных стадиях развития герпетической инфекции.

Получены экспериментальные доказательства наличия противовирусного эффекта у препарата иммунотропной направленности на модели герпетической инфекции у белых беспородных мышей и на культуре клеток почек VERO Е6.

Теоретическая и практическая значимость

Теоретическая • значимость работы заключается в получении современной иммунологической характеристики детей дошкольного возраста, переносящих частые повторные и длительно протекающие вирусные инфекции респираторного тракта. ;

Выявленные закономерности воздействия бактериальных лизатов на иммунный профиль человека обосновывают их использование в реабилитационных программах часто и длительно болеющих детей дошкольного возраста.

Полученные данные могут быть использованы в практическом здравоохранении для оценки категории часто и длительно болеющих респираторными инфекциями детей, что составляет практическую значимость проведённого исследования.

Выявленные противовирусные эффекты препаратов, имеющих иммунотропную направленность на моделях лабораторных животных и культуры клеток, позволяют формировать дальнейшие исследовательские программы по разработке новых методов купирования вирусных инфекций.

Положения, выносимые на защиту

1. Часто и длительно болеющие респираторными инфекциями дети имеют достоверные отличия иммунологических параметров от относительно здоровых детей того же возраста.

2. Часто и длительно болеющие респираторными инфекциями дети имеют объективные обоснования для применения иммунотропных препаратов.

3. Противовирусный эффект может быть обеспечен общими механизмами поддержания гомеостаза при использовании препарата иммунотропной направленности без непосредственного вовлечения компонентов иммунной системы.

Внедрение результатов работы.

Рекомендованные в диссертации методы иммунотропных вмешательств при персистенции вирусов у детей дошкольного возраста внедрены в практику детских учреждений здравоохранения Свердловской области, а также в учебный процесс на факультете постдипломного образования УГМА. Апробация работы.

Основные положения диссертации представлены на III окружной научно-практической конференции «Актуальные аспекты вирусных инфекций в современный период» (Екатеринбург, 2009г.), на городской конференции аллергологов-иммунологов «Актуальные вопросы аллергологии, иммунологии и пульмонологии» (Екатеринбург, 2009г.), на российской конференции «Иммунотерапевтические технологии в медицине» (Екатеринбург, 2010), 14-м интернациональном конгрессе иммунологов (Япония, Кобе, 2010), на конференции «Российский опыт применения Имунорикса, обобщение и практические рекомендации» (Москва, 2010), на VIII конференции иммунологов Урала (Сыктывкар, 2010), на I, II, III и IV всероссийских школах по клинической иммунологии «Иммунология для врачей» (Пушкинские горы, 2010-2013), VI и VII российской конференции с международным участием «Иммунологические чтения в Челябинске» (Челябинск, 2011 и 2012), региональной конференция для терапевтов (Екатеринбург, 2011), VI международном Конгрессе «Рациональная фармакотерапия» (Санкт-Петербург, 2011 и 2012), научно-практической

конференции «Актуальные вопросы педиатрии и современной гомеопатии» (Тюмень, 2011), региональной научно-практической конференции для терапевтов, инфекционистов и врачей других специальностей «Респираторные инфекции — междисциплинарная проблема» (Екатеринбург, 2011), II российском Конгрессе педиатров Урала с международным участием «Актуальные проблемы педиатрии» (Екатеринбург, 2012), на I конгрессе терапевтов Уральского Федерального округа (Екатеринбург, 2012), областной конференции отоларингологов (Екатеринбург, 2012), на межрегиональной научно-практической конференции Уральского федерального округа «Актуальные вопросы инфекционной патологии» (Екатеринбург, 2012 и 2013), на проблемной комиссии по аллергологии и иммунологии Института иммунологии и физиологии УрО РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них — 6 в изданиях, рекомендованных ВАК, статей — 6, тезисы в зарубежном издании - 1, монография - 1.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 143 страницах, иллюстрирована 3 таблицами и 28 рисунками, состоит из введения, главы обзора литературы, главы описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 133 отечественных и 134 иностранных источников.

Материалы, методы и результаты исследований

Для выполнения поставленной цели было проведено комплексное клинико-инструментальное и лабораторное исследование 100 детей младшего дошкольного возраста от 4 до 7 лет.

Контрольную группу составили 19 детей дошкольного возраста 4-7 лет, посещающих детские дошкольные учреждения, болевших за предшествующий год не более 2 раз, причем последний раз не менее, чем за 3 месяца до обследования. Их не вакцинировали в течение 3 месяцев до исследования. Математическая обработка результатов исследования подтвердила однородность выборки. В группу часто и длительно болеющих респираторными инфекциями включен 81 ребенок. Все часто и длительно болеющие дети получали витаминно-микроэлементные комплексы, им

проводились мероприятия, улучшающие функциональное состояние органов и систем, а также необходимое симптоматическое лечение в случае развития острого респираторного заболевания.

На первом этапе исследования было необходимо выяснить, действительно ли существуют объективные отличия параметров иммунной системы у часто и длительно болеющих детей от относительно здоровых детей.

В исследуемой группе часто и длительно болеющих детей дошкольного возраста был проведен комплекс клинических и лабораторных исследований.

При оценке клинических параметров учитывалось число обострений, суммарная длительность обострений, длительность лечения антибиотиками, продолжительность госпитализаций.

Группу часто и длительно болеющих детей характеризовали следующие клинические данные. Средняя продолжительность острых инфекционных эпизодов составляла от 14,5 до 15,2 суток, т.е. острые эпизоды были длительными. Суммарная длительность обострений составила у разных детей от 51 до 202 дней в году. Тяжесть острых инфекционных эпизодов только в 15% случаев была легкой, в 75% -средней, и в 10% случаев — тяжёлой, с развитием осложнений респираторных инфекций в виде отитов, синуситов или бронхитов, а для лечения требовались условия госпитализации и антибактериальная терапия. Дебют частых повторных респираторных заболеваний более чем у 40% детей наблюдался очень рано - в первые 2 года жизни.

При осмотре таких детей отоларингологом часто обнаруживались аденоидная вегетация I и II степени с аденоидитами, хронический фарингит, риносинусит и тонзиллит с подострым течением — то есть имел место непрерывный, вялотекущий воспалительный процесс в верхних отделах респираторного тракта и прилегающих ЛОР-органах.

Для проведения сравнительного анализа лабораторных иммунологических данных часто и длительно болеющих детей и относительно здоровых детей были определены 27 параметров (таблица 1). В группе часто и длительно болеющих детей выявлен дефицит фагоцитарной функции нейтрофилов, усугубляемый истощением

резервных возможностей организма при постоянных частых повторных инфекционных эпизодах, инверсия соотношения к- и л-типоп легких цепей иммуноглобулинов в клетках (СЭ19+к+ и СП 19+).+).

Таблица 1 - Иммунологический профиль детей дошкольного возраста

Иммунологические показатели Часто и длительно болеющие дети Отн здо осительно зо вые дети Достоверность отличий

п M±in п М+ш Р

Лейкоциты 20 6,74±1,79 19 7.21+1.45 0.37

Моноциты % 19 5.26±2.54 19 5.74+3.93 0.66

Моноциты абс 19 0.36±0.22 19 0.42+0.33 0.51

Лимфоциты % 19 52.63±10.71 19 50.05+10.35 0.46

Лимфоциты абс. 20 3.61±1.23 19 3.61+1.05 0.99

Т-лнмфоциты СОЗ+ % 19 68.05±7.91 19 77.21+4.05 <0.01

Т-лимфоциты СОЗ+ абс. 19 2.50±0.90 19 2.78+0.79 0.32

В-лимфоциты СШ9+ % 19 20.58±6.16 19 14.05+5.36 <0.01

В-лимфоцнты СО 19+ абс. 19 0.73±0.30 19 0.49+0.20 <0.01

С016+С056+ лимфоциты % 19 10.46+5.46 19 13.89+4.37 0.04

С016+С056+ лимфоциты абс 19 0.39+0.20 19 0.48+0.17 0.12

Т-хелперы СР4+ % 19 40.79±6.34 19 48.05+6.24 <0.01

Т-хелперы С04+абс. . 19 1.50+0.55 19 1.70+0.43 0.21

Т-цитотокс. С08+ % 19 27.79+5.09 19 33.84+8.57 0.01

Т-цитотокс. С08+абс. 19 1.04+0.44 19 1.20+0.44 0.26

Индекс С04+/С08+ 19 1.39+0.45 19 1.50+0.38 0.45

к+11+ 19 0,61 (0,6:1) 19 2,0 (2:1) А

1&А 19 0.81+0.28 19 1.02+0.36 0.06

1ЙМ 20 0.76+0.42 19 1.25+0.25 <0.01

180 20 9.98+4.68 19 9.61+0.80 0.73

Фагоцитоз споит.,% 19 32.68+19.34 19 56.47+12.83 <0.01

Фагоцитоз стимул.,% 19 39.89+17.41 19 70.84+9.55 <0.01

Фагоцитоз споит., 1 ()'/л 19 0.94+0.67 19 1.69+0.62 <0.01

Фагоцитоз стимул., 10ч/л 19 1.13+0.72 19 2.06+0.66 <0.01

фагоцитарное число, споит. 19 6.33+1.53 19 7.21+1.00 0.04

фагоцитарное число, стимул. 19 6.31+1.42 19 8.06+0.87 <0.01

ЦИК 13 49.85+22.73 19 47.42+37.22 0.84

Примечание'. * нормальное соотношение к+лимфоцитов / Х+лимфоцитов 2:1 (Хаитов P.M., 2000 г.), ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы. Жирным шрифтом выделены достоверные отличия (р<0,05).

Хаитов P.M., 2000г., указывает на то, что соотношение количеств к и А, — видоспецифичный и строго стабильный генетический признак: у человека оно равно 2:1, в наших исследованиях это соотношение равно 0,6:1. Функциональных различий между иммуноглобулинами с лёгкими к и А. цепями до настоящего времени не выявлено, но, по нашему мнению, изменение этого соотношения может

свидетельствовать о потенциальных возможностях клеток в отношении продукции антител и может быть использовано в комплексной оценке специфического противоинфекционного иммунитета.

Для того, чтобы оценить клеточные и гуморальные параметры иммунной регуляции у детей дошкольного возраста с частыми рецидивирующими вирусными инфекциями респираторного тракта в условиях иммунотропных воздействий, был выбран препарат системных бактериальных лизатов.

Применение бактериальных лизатов является одним из самых распространенных во всем мире путей иммунотропных воздействий, поскольку механизмы, приводящие к иммунологическим эффектам, являются физиологическими, суть которых — индукция иммунного ответа антигенами инфекционных агентов нашего окружения. Энтеральный путь введения системных бактериальных лизатов является наиболее физиологичным, поскольку в этом случае используется мукозальный путь иммунного обеспечения (Chahine B.G., 2010). Иммунный ответ, при этом, может быть обеспечен минимальными событиями, в короткие сроки и даже при отсутствии функциональных резервов (Медуницин Н.В., 2005, Lusardi М., 1996). Препарат, который был выбран для проведения нашего исследования, содержит бактериальные лизагы 8 бактерий обычного окружения человека (Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella ozaenae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus viridans, Streptococcus pyogenes, Moraxella catarrhalis). Дети получали препарат по 1 капсуле в течение 10 дней в месяц на протяжении 3 месяцев.

Группу исследуемых детей для оценки эффектов системных бактериальных лизатов составили 42 ребёнка. Все дети получали витаминно-минеральные комплексы, а 32 из них, кроме этого, получали системные бактериальные лизаты.

Каждый ребенок наблюдался в течение 6 месяцев. Учитывались клинико-анамнестические данные за аналогичный период предшествующего года и за период наблюдения. Полученные данные позволяют достоверно оценить динамику

изменений клинических показателей, выделенных для анализа эффекта применения исследуемых терапевтических воздействий (таблица 2).

Таблица 2 - Клинико-анамнестнческие данные за аналогичный период _предшествующего года и за период наблюдения._

Показатель (медианы) I группа (с баклизатами) п 32 ' ] II группа (сравнения) п=10 I группа (с баклизатами) п=32 II группа (сравнения) п=10

До исследования (6 месяцев) Период наблюдения (6 месяцев)

число острых эпизодов 4.87 4.73 1.02 3.07**

суммарная длительность острых эпизодов 55.52 47.03* 8.75 33.67**

длительность лечения антибиотиками 20.01 16.40 1.67 13.93*

длительность госпитализаций 2.79 1.40 0.22 1.40***

Примечание: I группа - дети, получавшие при лечении препарат системных бактериальных лизатов; II группа - дети,, получавшие только базисную терапию; Достоверные отличия показателя в 2-х группах между собой до или после лечения: * - р<0,42; ** - р<0,0001; *** - р<0,09.

Средние значения в группах ярко демонстрируют положительный эффект системных бактериальных лизатов. Но более объективны непараметрические показатели, дающие статистическую характеристику параметрам с негаусовским распределением в группах. Поэтому был вычислен ряд непараметрических показателей с помощью тестов Волда-Волфовица Ранца, Манна-Уитни, Колмогорова-Смирнова и медианного теста. Они подтвердили достоверные отличия значений определяемых показателей до и после лечения в группе детей, получавших препарат, и незначимые — у детей, не получавших препарат.

Клинический эффект сопровождался положительной динамикой лабораторных показателей, отражающих характер иммунологических модуляций. Анализировались клеточные параметры, гуморальная продукция клеток специфической защиты (специфические инфекционные антитела) и показатели неспецифической защиты.

Первое обследование проведено всем детям перед началом периода наблюдения, второе - через 3 месяца от начала, когда в основной группе прием препарата был закончен, третье — через б месяцев от начала периода наблюдения, то есть через 3 месяца после завершения приема препарата системных бактериальных лизатов (рисунок 1).

Параметр До исследования Через 3 месяца Через 6 месяцев

СОЗ+лимфоциты С019+лимфоциты С04+лимфоциты 1Ь4+лимфоциты (Th2) CD4+/CD8+ соотношение HLA DR+лимфоциты (активироваиные) CD45 RO+лимфоциты (памяти) CD 19+к+лимфоциты IgM сывороточный IFN-y в сыворотке крови

-

С045+СОЗ+лимфоциты Специфические антитела: -Streptococcus pneumoniae -Haemophilis influenzae -Staphylococcus aureus Фагоцитоз нейтрофилов спонтанный: -фагоцитарный индекс -фагоцитарное число -абс.число фаг.нейтрофилов Фагоцитоз нейтрофилов стимулированный: -фагоцитарный индекс -фагоцитарное число -абс.число фаг.нейтрофилов С2-фракция комплемента > контроль

-

СШ6+С056+лимфоциты (NK) 1Ь2+лимфоциты (ТЫ) IgG сывороточный IgE общий Общее количество нейтрофилов CD 14+лейкоциты (моноциты) Циркулирующие иммунные комплексы шш контроль

Рисунок 1 - Схематичное изображение динамики лабораторных параметров у

детей с нарушениями антибактериальной защиты (иммуномодулирующий эффект системных бактериальных лизатов)

Анализируя результат воздействия препарата системных бактериальных лизатов на иммунные параметры исследуемых детей можно заключить, что был выявлен истинный иммуйомодулирующий эффект, при котором повышенные значения лабораторных параметров постепенно снижались, а сниженные — повышались. Ряд параметров, сниженных по-сравнению со значениями у относительно здоровых детей, вначале продолжали своё снижение, расходуясь для обеспечения иммунных функций, далее нормализовались.

Так, сначала наблюдается снижение концентрации специфических антител в сыворотке крови из-за расходования резервных возможностей и потребления их в ходе иммунного ответа во время приема препарата, а затем значительное, высоко достоверное повышение их выработки к 6-ти месяцам, что свидетельствует об эффективности иммунного ответа, поддерживаемой механизмами иммунной памяти.

В наблюдаемый период снижалось число лимфоцитов, содержащих каппа- и лямбда-типы легких цепей иммуноглобулинов (С019+К+ и СЭ19+Х+), что может объясняться использованием их для антителообразования в ходе иммунного ответа. Через 6 месяцев от начала наблюдения произошло высоко достоверное повышение числа клеток с к-цепями и снижение /.-содержащих клеток, то есть изменилось соотношение их в сторону нормализации (нормальное соотношение кЛ у человека 2:1), что важно для обеспечения нормальной антителопродукции, в том числе специфической - закрепленной иммунологической памятью. Этот факт является еще одним свидетельством иммуномодулирующего эффекта системных бактериальных лизатов.

Выявлено постоянное увеличение индуцируемой продукции №N-7, концентрация которого в сыворотке крови нарастала и через 3 месяца, и еще более достоверно — через 6 месяцев (почти в 2 раза по сравнению с исходными данными), то есть более чем через 3 месяца после завершения приема препарата пациентами.

Таким образом, после -завершения 3-месячного курса приема системных бактериальных лизатов, иммунологическая картина отражала наличие адекватного системного иммунного ответа, с участием параметров адаптивного иммунитета и

стимуляции врожденных факторов иммунитета.

Через 3 месяца после завершения приема системных бактериальных лизатов (6 месяцев наблюдения) положительный эффект не только сохранялся, но и приводил к нормализации многих иммунологических параметров, необходимых для осуществления антибактериальной защиты организма детей, иммунокомпрометированных ранее. Это соответствовало наблюдаемому положительному клиническому эффекту.

Активно дискутируется вопрос о возможности применения иммунотропных препаратов для получения противовирусного эффекта при воздействии на иммунные механизмы. Поэтому в качестве второго иммунотропного препарата был выбран пидотимод, который рекомендован ВОЗ к использованию в качестве иммуномодулирующего препарата для лечения вирусных инфекций респираторного и мочевыделительного трактов (WHO, 1997). Но до настоящего времени не описан механизм его противовирусного эффекта. Для оценки наличия такого эффекта был выбран непродолжительный курс (30 дней).

Исследуемая группа состояла из 39 детей в возрасте от 4 до 7 лет. Все дети получали витаминно-минеральные комплексы, а 20 детей из них получали пидотимод.

Среди клинических параметров оценивались частота, длительность и тяжесть острых инфекционных эпизодов, продолжительность антибиотикотерапии и продолжительность госпитализации.

Лабораторное иммунологическое исследование включало определение количества лейкоцитов, лейкоцитарной формулы, популяций и субпопуляций лимфоцитов: CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD16+CD56+, CD19+, CD3+CD25+, CD3+HLA-DR+; оценку спонтанной и индуцированной микробными полисахаридами поглотительной активности нейтрофилов, содержание сывороточных иммуноглобулинов классов А, М, G и общего иммуноглобулина Е, уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК).

Среди вирусологических лабораторных параметров проводилось определение антигенов вирусов группы ОРВИ, вируса простого герпеса, цитомегаловируса в биологических субстратах (мазки со слизистой оболочки полости рта и носа,

сыворотка крови, моча) в реакции иммунофлуоресценции - РИФ, а также уровень специфических антител в парных сыворотках крови к вирусам гриппа, парагриппа, энтеровирусу, респираторно-синцитиапыгой инфекции в серологических реакциях: торможения гемагглютинации - РТГА и связывания комплемента - РСК.

Лабораторные исследования проводились 2-кратно - до начала терапии и через 1 месяц. Проводился еженедельный клинический контроль.

Для математической обработки результатов исследований использовали непараметрический критерий Уилкоксона и критерий х2- Расчеты проводили с помощью специализированной статистической программы 81а115Нса 7, достоверными считали различия при р<0,05.

До лечения исследуемые группы были статистически однородны по клиническим и лабораторным параметрам. Через месяц от начала терапии были выявлены следующие различия; в анализируемых группах. Продолжительность острых эпизодов в группе детей, принимавших препарат, снизилась с 14,5 до 5,2 суток, тогда как во второй группе она осталась на прежнем уровне.

За период наблюдения в 1-й группе снизилась тяжесть острых инфекционных эпизодов, во 2-й группе она изменилась незначительно, один ребенок был госпитализирован по поводу осложнения ОРВИ в виде отита.

В 1 -й группе, принимающих препарат, антибиотикотерапия не потребовалась ни в одном случае, во второй группе - в 65% случаев заболеваний они применялись.

При оценке иммунологических данных выявлено преобладание пациентов с лейкопенией (более чем в 65%) и эозинофилией (более чем в 70%). Через месяц после начала лечения были выявлены достоверные различия указанных групп детей по иммунологическим параметрам. В группе детей, получавших прецарат, увеличилось абсолютное количество лейкоцитов, возросло абсолютное число палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов; уменьшилось абсолютное и относительное количество эозинофилов. При анализе количества лимфоцитов в их субпопуляциях выявлено достоверное увеличение относительного количества С019+лимфоцитов, относительного и абсолютного содержания НЬА-011+л и м ф о ц ито в, снижение относительного и абсолютного количества С025+лимфоцитов - показателя ранней активации лимфоцитов, снижение

относительного количества фагоцитирующих нейтрофилов в тестах стимулированного фагоцитоза.

В группе детей, получавших только витаминно-минеральные комплексы, наблюдалось лишь уменьшение относительного числа базофилов и увеличение С04+/СЭ8+ индекса.

Для выявления этиологии инфекционных процессов и их влияния на иммунологические параметры проводились вирусологические исследования (клеток буккального эпителия, мазков со слизистой оболочки рта и носа, сыворотки крови, мочи). До лечения в обеих группах наиболее часто встречались антигены респираторных вирусов (в 58,0% и 75,0% случаев) и герпесвирусов (45,0% и 65,0% соответственно).

После лечения (через месяц от начала терапии) при сопоставлении групп между собой по наличию вирусных антигенов и антител не было выявлено достоверных различий, что согласуется с физиологическими условиями формирования иммунного ответа и функционирования организма. Для того, чтобы получить достоверный прирост специфических антител, необходим более продолжительный срок наблюдения, и, возможно, более продолжительный курс применения препаратов, поскольку его эффект может быть обусловлен " обеспечением защиты организма от развития инфекций и снижением вирусной активности.

При более продолжительном наблюдении исследуемых групп детей дошкольного возраста был выявлен пролонгированный эффект проведённого терапевтического курса. Дети были исследованы клиническими методами через 8 недель, 3 и 6 месяцев после начала приёма препарата.

За первые три месяца наблюдений суммарное количество острых инфекционных эпизодов у всех исследуемых детей снизилось, при этом, через три месяца после проведенного лечения дети из 2-й группы (получавших витаминно-минеральные комплексы и симптоматическую терапию) болели несколько реже, чем дети, ^получившие иммунотропное лечение. Тем не менее, спустя ещё три месяца, дети, получавшие иммунотропный препарат, продолжали проявлять тенденцию снижения количества острых инфекционных эпизодов, тогда как суммарное

количество инфекционных эпизодов у детей из второй группы практически не изменилось.

Суммарное количество дней болезни оказалось более показательным критерием эффективности применённой терапии. В 1-й группе с иммунотропным лечением через 3 и 6 месяцев суммарное количество дней болезни было 67 и 63 дня соответственно, тогда как во 2-й группе — 177 и 202 дня.

На протяжении 6 месяцев после начала исследований, в 1-й группе наблюдалась тенденция снижения среднего количества острых инфекционных эпизодов на одного исследуемого - 0,55±0,17 и 0,40±0,13 через 3 и 6 месяцев соответственно. В группе детей без иммунотропного вмешательства среднее число инфекционных эпизодов к 3 и 6 месяцу наблюдения было 0,47±0,12 и 0,53±0,22.

Ярко демонстрирует положительный клинический эффект проведенной терапии в 1-й группе среднее количество дней болезни на 1 исследуемого. Этот показатель через 3 месяца после начала наблюдений (то есть через 2 месяца после окончания терапии) в первой группе составил 3,35±1,19 дней против и 9,32±2,67 дней во второй группе. Через 6 месяцев среднее количество дней болезни на 1 исследуемого в первой группе было 3,15±1,36 против 10,63±4,27 дней во второй группе.

В первой группе через 2 месяца после окончания терапии при заболеваниях не приходилось применять антибиотики, и через 6 месяцев наблюдений суммарная продолжительность приёма антибиотика не превысила 10 дней на всю группу, тогда как во второй группе суммарная продолжительность приёма антибиотиков через 3 и через 6 месяцев составила 40 и 43 дня соответственно.

Таким образом, в группе пациентов, получивших иммунотропный препарат, наблюдался длительный положительный клинический эффект, который был очевиден и через 5 месяцев после окончания терапии. Причем, в этой группе пациентов клинический эффект сопровождался изменениями лабораторных иммунологических параметров, т.е. наблюдалось иммуномодулирующее действие препарата, что не исключает опосредованного противовирусного эффекта. Клинический эффект выражался в сокращении длительности заболевания,

уменьшении его тяжести, выраженности симптомов инфекций верхних дыхательных путей и ЛОР-органов, потребности в приеме антибиотиков.

Не исключено, что выявленный клинический эффект мог быть результатом непосредственного противовирусного эффекта препарата, который назначался коротким курсом.

Для решения вопроса о механизмах, которые привели к клиническому улучшению, сопровождаемому положительной динамикой лабораторных иммунологических параметров, было проведено экспериментальное исследование, в котором использовано 45 беспородных белых мышей из питомника-вивария ОКБ №1 г. Екатеринбурга. Следует отметить, что, несмотря на предпочтительность использования для экспериментальных животных чистых линий, данный эксперимент имел целью проанализировать эффект действия фармакологического препарата на механизмы противовирусной защиты. Результат может быть неоднородным даже в группе чистокровных линий лабораторных животных, поскольку определяется полиморфизмом метаболических реакций в условиях эпигенетических воздействий, а интересующий нас результат может отражать эту разнородность. Получаемый эффект может определяться противовирусными воздействиями в отношении определенных вирусов, однородность которых обеспечивалась условиями проведения эксперимента.

Мышей, отобранных методом сплошной выборки, разделили на 3 группы — по 15 мышей в каждой. Первую группу мышей внутрибрюшинно инфицировали вирусом простого герпеса в мышиной летальной дозе, применение которой вызывает гибель 50% животных (в объеме 0,2 мл) для воспроизведения острой герпетической инфекции.

Вторая группа мышей была инфицирована одновременно с первой группой той >ке дозой вируса в том же объеме. Мыши этой группы перед исследованием получали ежедневно в течение 3 недель пидотимод в объеме 0,025 мг/л рег о я (в перерасчете на массу тела животного).

Третья группа мышей была контрольной, в которой мышам внутрибрюшинно вводили 0,2 мл 0,9% физиологического раствора для исключения различий реакций по факту прокола брюшины.

В первой группе мышей выживаемость к 10 дню эксперимента составила 53,3% а во второй группе - 86,7% (/?<0.05).

У животных второй группы, получавшей препарат, при гистологическом исследовании лёгких, печени, почек, селезенки, тимуса и головного мозга патологические изменения были менее выражены (рисунок 2). Структурные изменения в органах второй группы были менее выражены по сравнению с первой группой инфицированных животных, не получавших препарат.

. ■ -. : Шр^--': ГСР .......€.. фЩр:

=": I" ■! "=.:: .

rf УЩф.

ЪШ^З " ШШШ'Ш, | шд^^^^^^ММИМЁ^Й щш| 11 '.¿л"Т Ш^Щ |

. ■ > ~ , -

Рисунок 2 - Гистохимическое исследование среза ткани головного мозга мышей с

герпетической инфекцией без лечения (слева) и на фоне приёма препарата (справа).

Иллюстрировали этот процесс проведённые исследования уровня цитокинов в сыворотке крови экспериментальных животных. Так у первой группы животных, при сравнении с животными второй группы, получавших препарат, были повышены уровни цитокинов IL6, IL12p70, TNF-a на 9 день, IL 18 - на 7, а ILl-a - на 11-й день после инфицирования, что можно объяснить ответом на острую вирусную инфекцию, учитывая «провоспалительную» активность перечисленных цитокинов. В то же время, уровень ILIO, напротив, был ниже, чем в группе мышей, получавших препарат.

Пик значений большинства цитокинов приходится на начало падежа мышей. То есть, на фоне подъема уровня провоспалительных цитокинов, животные стали погибать, что вполне согласуется с аналогичными данными о повышении уровня смертности при инфекционпо-токсическом шоке у людей на фоне цитокинового криза (Гусев Е.Ю., 2008, Кетлинский С.А., 2008). Умеренное повышение цитокинов провоспалительного характера и сравнительно высокий уровень ILIO может объяснять более высокую выживаемость животных во второй группе, за счет имевшего места провоспалительного эффекта.

Выявленный эффект препарата мог объясняться системной реакцией организма. Поэтому для ответа на вопрос о возможном наличии непосредственного противовирусного эффекта препарата проведен следующий эксперимент на культуре соматических клеток, что исключало наличие иммунных механизмов и позволило оценить этот эффект. Были использованы перевиваемые культуры клеток почек зеленых мартышек Vero-Еб. Образцы разделили на три группы.

"В первую группу в питательную среду клеток Vero-Еб вносили вирус простого герпеса (ВПГ). Во вторую, наряду с вирусом, в культуру клеток однократно перед инфицированием вносили препарат в максимально переносимой дозе, которая не вызывала цитотоксического эффекта. Третья группа — контрольная. В неё не вносили ни препарат, ни вирус.

Констатировано цитопатическое действие вируса простого герпеса (ВПГ), введенного в культуру клеток (первая группа), которое представляло собой дегенеративные изменения в клетках как результат репродукции в них вирусов. Через 24 часа под действием ВПГ монослой культуры клеток становился полиморфным. Наблюдалась деструкция ядер и цитоплазмы. Через 48 часов после инфицирования наступала дезориентация клеточного роста, разрушение клеточных оболочек и структур, клетки округлялись, увеличивались в размере, появлялись клетки с гигантскими ядрами и патологией интерфазного ядра, отмечалась вакуолизация ядер и цитоплазмы клеток. Через 72 часа наблюдалось образование симпластов, происходили пикнотические изменения цитоагломератов, монослой был практически весь разрушен.

Во второй группе клеточных культур с присутствующим препаратом в максимально переносимой концентрации, препятствия к проникновению данного вируса в клетки не было выявлено. В ней также происходили изменения, подобные тем, что были в первой группе, но цитопатический эффект — пикноз и разрушение монослоя - наступил в более поздние сроки, через 96 часов. При окрашивании препаратов в реакции иммунофлюоресценции второй группы (Vero Е6 с препаратом) через 24 часа после внесения в среду ВПГ в культуре клеток наблюдались ярко выраженные очаги флуоресценции. Свечение в форме зерен выявлялось только в ядрах, в цитоплазме свечение отсутствовало. В более поздние

сроки монослой был практически весь разрушен и все измененные клетки флуоресцировали. При иммунофлюоресцентном окрашивании препаратов первой группы идентифицировать локализацию свечения было практически невозможно, поскольку все клетки были разрушены вирусом.

В третьей, контрольной культуре клеток, в качестве которой служили клетки Vero-Еб без внесения в среду препарата и вируса, при световой микроскопии монослой был однородным, без видимых изменений. При окрашивании этих препаратов культуры клеток Vero Е6 обнаруживалось только фоновое свечение.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что, кроме иммуномодулирующего эффекта, у тестируемого препарата был выявлен противовирусный эффект, который проявился в задержке цитопатического действия монослоя пораженных клеток. Учитывая, что препарат был внесен в культуру клеток однократно перед инфицированием, можно предположить, что повторное его введение (как рекомендовано производителем при его применении в клинических условиях) может оказаться более эффективным и пролонгировать эффект прямого иммунонезависимого противовирусного действия.

Полученные результаты позволили сделать следующие выводы.

1. Часто и длительно болеющие респираторными инфекциями дети имеют достоверные отличия иммунологических параметров от относительно здоровых детей в виде сниженных значений параметров нейтрофильного фагоцитоза, концентраций сывороточных IgM, относительных количеств CD3+, CD4+ и С08+лимфоцитов, повышения относительного и абсолютного количеств CD 19+лимфоцитов, инверсии CD19+K+ и CD19+Я,+лимфоцитов.

2. Использование бактериальных лизатов у часто и длительно болеющих детей эффективно и безопасно приводит к достоверному клиническому эффекту, сопровождаемому положительными изменениями лабораторных иммунологических параметров - фагоцитарных, специфических инфекционных антител, популяций и субпопуляций лимфоцитов, в том числе CD19+K+ .

3. Применение иммунотропного препарата пидотимод приводит к снижению частоты и тяжести острых инфекционных эпизодов вирусной этиологии,

.предупреждает развитие бактериальных осложнений вирусных заболеваний респираторного тракта, нивелируя потребность в антибактериальной терапии и госпитализации.

4. Применение иммунотропного препарата пидотимод в экспериментальной модели развития герпетической инфекции на беспородистых белых мышах, приводит к повышению их выживаемости.

5. Использование иммунотропного препарата пидотимод в эксперименте на культуре клеток почек зелёных мартышек VERO Е6, инфицированных вирусом простого герпеса, приводит к задержке цитопатического действия монослоя поражённых клеток.

Практические рекомендации

1. При иммунологической оценке детей дошкольного возраста, часто и длительно болеющих респираторными инфекциями, следует учитывать наличие характерных изменений иммунологических параметров повышенные значения количества С1319+лимфоцитов и сниженные значения параметров нейтрофильного фагоцитоза, относительного числа CD3+, С04+лимфоцитов, и CD19 1 к I лимфоцитов.

2. В реабилитационных схемах часто и длительно болеющих респираторными . инфекциями детей дошкольного возраста, необходимо использовать .препараты иммунотропной направленности, имеющие физиологический эффект бактериальных лизатов.

3. Детям дошкольного возраста, часто и длительно болеющим вирусными инфекциями, необходимо использовать пидотимод, что позволит исключить развитие вирусных инфекций и их бактериальных осложнений.

Автор выражает глубокую благодарность исследователям за помощь в исполнении настоящей работы и высокий профессионализм: Симбирцеву A.C., Мальчикову И.А., Шершневу В.Н., Азовской Т.Ю., Власовой И.А., Пашниной И.А., Медведевой И.А.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Волков М.А. Иммунологическая характеристика детей с клиническими признаками нарушения противоинфекционной защиты в зависимости от наличия социопатических факторов в перинатальном периоде развития / E.J1. Истомина, И.А. Тузанкина, М.А. Болков // Российский иммунологический журнал. -2010 -Т.4 (13), № 4. -С.420.

2. Болков М.А. Иммунологическая характеристика часто болеющих детей раннего возраста из разных социальных групп / Е.Л.Истомина, М.А.Болков // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2010. - № 2/1 (29): темат. вып. по аллергологии и иммунологии. - С. 142 -143. :

3. Болков М.А. Клинико-иммунологические особенности состояния детей, часто и длительно болеющих вирусными инфекциями / И.А. Тузанкина, Ю.В. Григорьева, Е.В. Власова, И.А. Пашнина, М.А. Болков, В.К. Слободенюк, И.А. Мальчиков, В.Н. Шершнев // Здоровье населения и среда обитания: информ. бюлл. - 2009. - № 7. - С.33-36.

4. Болков М.А. Оценка противовирусной активности препарата пидотимод при герпетической инфекции в эксперименте на животных / И.А. Тузанкина, И.А. Мальчиков, A.C. Симбирцев, Ю.В. Григорьева, С.Ю. Медведева, И.А. Ольков, М.А. Болков // Цитокины и воспаление. -2011.-Т. 10, № 4. - С.31-34.

5. Болков М.А. Оценка противовирусной активности препарата пидотимод при герпетической инфекции в эксперименте на клеточных культурах / И.А. Тузанкина, И.А. Мальчиков, A.B. Петров, A.C. Симбирцев, Ю.В. Григорьева, С.Ю. Медведева, И.А. Ольков, М.А. Болков // Цитокины и воспаление. - 2012. - Т. 11, № 1. - С.60-63.

6. Болков М.А. Применение смеси лизатов бактерий у детей первого года жизни с повторными бактериальными инфекциями респираторного тракта и ЛОР-органов / Е.В. Власова, И.А. Тузанкина, В.Н. Шершнев, М.А. Болков // Вопросы современной педиатрии. - 2009. -Т.8, № 5. - С. 18-24.

Монография:

1. Болков М.А Иммунные механизмы патологии у детей / И.А. Тузанкина, В.А. Черешнев, И.А. Мальчиков, Е.Л. Истомина, М.А. Болков. - Екатеринбург: НИСО УрО РАН №9(13)-35, 2013. -206 с

Публикации в других изданиях:

8. Bolkov М.А. Immunological aspects of frequent respiratory infections at children of preschool age / M.A. Bolkov, E.L. Istomina, I.A. Tuzankina, E.V. Vlasova, I.A. Pashnina, S.N. Boyarsky // International immunology (Abstr. book of 14th Int. Congress of Immunology). - Kobe, Japan, 2010. -Vol.22, suppl. I, Aug. - P.35.

Список сокращений

ВОЗ - Всемирная Организация

Здравоохранения лимф - лимфоциты лейк — лейкоциты

ОКБ - областная клиническая больница ОРВИ - острая респираторная вирусная инфекция

РИФ - реакция иммунофлюоресценции

РС-вирус- вирус респираторно-синцитиальной инфекции

С/яд. - сегментоядерные (нейтрофилы) ЦИК - циркулирующие иммунные

комплексы ЦМВ - цитомегаловирус ЧБД- часто болеющие дети

Волков Михаил Артёмович

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ • И ВОЗМОЖНОСТИ ИММУНОТРОПНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙ ПРИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЯХ

Специальность 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 24.05.2013. Формат 60x84 Vie Гарнитура Times New Roman. Печать цифровая. Бумага ВХИ. Усл. печ. листов 7. Тираж 120. Заказ 152.

Отпечатано в типографии «GetCard» г. Екатеринбург, ул. Комсомольская, 41