Автореферат и диссертация по медицине (14.00.43) на тему:Иммунологические аспекты хронического воспаления у больных муковисцидозом

На правах рукописи

БУЛГАКОВА Татьяна Викторовна

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХРОНИЧЕСКОГО ВОСПАЛЕНИЯ У БОЛЬНЫХ МУКОВИСЦИДОЗОМ

14.00.43 -пульмонология

14.0036 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2004

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте пульмонологии при Санкт-Петербургском государственном медицинском университете имени акад. И.П.Павлова

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Гембицкая Татьяна Евгеньевна

доктор биологических наук Сесь Татьяна Павловна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Серебрякова Валентина Ивановна доктор медицинских наук, профессор Назаров Петр Григорьевич

Ведущая организация: ГОУ ДПО Санкт-Петербургская медицинская академия постдипломного образования Министерства Здравоохранения РФ

Защита диссертации состоится « %0» агфеяя 2004 г. в 'ЛЗ часов на заседании диссертационного совета Д 208.090.02 при Санкт-Петербургском государственном медицинском университете имени акад. И.П. Павлова в НИИ пульмонологии (197089, г. Санкт-Петербург, ул. Рентгена, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им.акад. И.П. Павлова по адресу: ул. Л.Толстого. 6/8.

Автореферат разослан « ¡6» (Л/Я/Ьл^С^. 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

А.Л. Александров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Муковисцидоз (MB) - тяжелое наследственное заболевание аутосомно-рецессивного типа, вызываемое мутацией гена, расположенного на длинном плече 7-й хромосомы в области q31-q32, проявляющееся системным поражением экзокринных желез и требующее лечения в течение всей жизни больного (Капранов Н.И., 2001; Гембицкая Т.Е., и соавт., 2003). Клинические проявления MB связаны с дефектом гена MB, который кодирует белок, участвующий в регуляции транспорта ионов хлора через апикальную мембрану эпителиальных клеток, что приводит к почти полному отсутствию секреции хлоридов эпителием экзокринных желез (Boucher R.C., 1991).

Прогрессирующее поражение легких определяет тяжесть и прогноз исхода при муковисцидозе. Первичным патофизиологическим последствием дефекта гена MB является нарушение функции слизистых бронхиальных желез дыхательных путей, ведущее к увеличению продукции вязкого бронхиального секрета, который накапливается вследствие замедленного оттока и вызывает закупорку бронхов слизисто-гнойными пробками. Вслед за этим наступает раннее развитие инфекционных процессов (Вишнякова Л.А., Сологуб Т.С., Желенина Л.А., 1999; Hoiby N., 2001), вызываемых микроорганизмами, имеющими предрасположенность к колонизации в дыхательных путях (Pseudomonas aeruginosa, Peudomonas cepacia, Staphylococcus aureus). Персистенция в легких Ps aeruginosa происходит, как правило, при наличии иммунного дефекта, однако, клинические исследования показали, что первичного системного иммунодефицита у больных MB нет (Bedard M. et al., 1993). Возможно, определенную роль в порочном цикле хронического воспаления при MB играют местные факторы защиты, предотвращающие искоренение инфекции (Hoiby N., 2001). По мере прогрессирования заболевания доля нейтрофилов в бронхоальвеолярном пространстве нарастает (Hoiby N., 2001; Пухальский А.Л., Шмарина Г.В., Капранов НИ., 2002). Происходит активный фагоцитоз нейтрофилами Ps. aeruginosa, который, однако, не является завершенным (Church J., Keens T. et al., 1979). Активация нейтрофилов приводит к выделению различных секреторных продуктов, участвующих в киллинге бактерий. Одной из главных функций нейтрофилов является защита легких от бактериальной инфекции. Нейтрофильные белки, такие как миелопероксидаза (МРО) и лактоферрин (LF), обеспечивают с одной стороны атимикробную защиту

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА Cnm®öf»r % Q • О»

(Кокряков В.Н., 1999), а с другой - повреждают эпителиальные и эндотелиальные клетки ткани легкого. В связи с этим, исследование содержания МРО и LF в периферической крови, мокроте и ЖБАЛ больных MB в зависимости от активности патологического процесса и наличия бактериальной инфекции является актуальным. Известно, что нейтрофилы имеют гранулы, содержащие протеиназы, в том числе эластазу, протеиназу 3, катепсин G. Исследование активности нейтрофильной эластазы (NE) и ее основного ингибитора оц -ингибитора протеиназ у больных MB в разных биологических жидкостях даст возможность выявить соотношение между протеазами и их игибиторами как на системном уровне, так и непосредственно в очаге повреждения.

Исследования последних лет показали, что у больных MB имеется нарушение иммунорегуляции во всех звеньях иммунного ответа. Но до сих пор нет единого мнения о механизмах формирования иммунологической недостаточности при данном заболевании. Поэтому одной из главных задач клинической иммунологии является изучение иммунного статуса и поиск критериев оценки тяжести течения заболевания и активности воспалительного процесса у больных MB. Согласно современным представлениям, цитокиновая регуляция играет ключевую роль в формировании того или иного типа воспалительного процесса. Причем, особую роль играют цитокины, синтезируемые непосредственно в очаге воспаления эффекторными клетками -альвеолярными макрофагами, Т-лимфоцитами, эндотелиальными клетками и бронхолегочным эпителием. В связи с этим, большое значение приобретают исследования уровня цитокинов в мокроте, жидкости бронхоальвеолярного лаважа - 1Ь-1р, ТИР-а, Ш-8 и других провоспалительных цитокинов.

Исследования функциональной активности иммунной системы, активности протеолитичсских ферментов, а также функциональной активности нейтрофилов позволит более объективно оценить тяжесть течения заболевания и контролировать эффективность противовоспалительной терапии и проводить своевременную коррекцию лечения больных MB. что является одной из основных задач клинической иммунологии.

Цель исследования: Оценить функциональную активность клеток -эффекторов воспаления в легких у больных муковисцидозом и использовать полученные данные для оценки тяжести течения

заболсвания и коррекции проводимой терапии. Задачи исследования:

1. Оценить особенности иммунного статуса у больных муковисцидозом в динамике заболевания: определить содержание иммуноглобулинов А, М, G в сыворотке крови; определить фагоцитарную активность нейтрофилов и клеток моноцитарно-макрофагального ряда в крови и ЖБАЛ; произвести фенотипирование лейкоцитов; определить количество циркулирующих иммунных комплексов в периферической крови.

2. Изучить уровень цитокинов ТЫР-а, 1р, 1Ь- 8 в ЖБАЛ, мокроте и периферической крови у обследуемых больных в динамике заболевания.

3. Исследовать уровень 1Ь- 4, ЮТ^-у, Е в мокроте и периферической крови больных MB в динамике заболевания.

4. Определить активность эластазы и а1- ингибитора протеиназ в сыворотке крови, мокроте и ЖБАЛ в зависимости от тяжести течения и динамики заболевания.

5. Определить количество миелопероксидазы (МРО) и лактоферрина (LF) в сыворотке крови, мокроте и ЖБАЛ больных MB в зависимости от тяжести течения, динамики заболевания и влияния синегнойной инфекции. Положения, выносимые на защиту:

1. Доминирующим типом клеток-эффекторов воспаления в легочной ткани больных MB являются нейтрофилы.

2. В мокроте и ЖБАЛ больных MB формируется выраженный дисбаланс в системе протеазы / ингибиторы вследствие повышения активности нейтрофильной эластазы и относительной недостаточности ее основного ингибитора - а] - PI.

3. Уровень провоспалительных цитокинов, катионных белков нейтрофилов - МРО и LF в мокроте больных муковисцидозом, а также степень выраженности дисбаланса в системе протеазы/ингибиторы являются вспомогательными лабораторными критериями для оценки активности хронического воспалительного процесса в легочной ткани больных муковисцидозом и эффективности проводимой терапии.

4. Иммунопатогенез муковисцидоза характеризуется активацией Т-лимфоцитов-хелперов 1 и 2 типа, что свидетельствует об активации как клеточного, так и гуморального иммунного ответа.

Научная новизна исследования. Получены новые данные, свидетельствующие о повышении синтеза провоспалительных цитокинов в очаге воспаления у больных муковисцидозом. Выявлены наиболее информативные параметры изменения функциональной активности нейтрофилов у больных муковисцидозом,

позволяющие оценить активность хронического воспаления в легочной ткани больных муковисцидозом - уровень миелопероксидазы, лактоферрина и активность эластазы.

Получены новые данные о степени выраженности дисбаланса в протеазо-антипротеазной системе в очаге поражения у больных муковисцидозом.

Получены новые данные, свидетельствующие об активации 2-х субпопуляций Т-лимфоцитов-хелперов (ТЪ| И ТЬг ) в очаге воспаления у больных муковисцидозом.

Практическая' значимость работы. Предложен к применению в практическое здравоохранение «Способ оценки хронического воспалительного процесса в бронхолегочной системе больных муковисцидозом» (Патент № 2216737 от 19.03.2002 г.), позволяющий оценивать тяжесть течения заболевания, активность воспалительного процесса и эффективность проводимой терапии на основании определения уровня провоспалительных цитокинов и

оценки протеазо-антипротеазного баланса по определению активности эластазы и уровню -ингибитора протеиназ в мокроте больных

муковисцидозом.

Реализация и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ. Результаты исследований апробированы на Ежегодной конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 1997,1998, 1999), Ежегодном Конгрессе Европейского общества пульмонологов (Берлин, 1997; Мадрид, 1999; Флоренция, 2000; Берлин, 2001; Вена, 2003), «Муковисцидоз - 97» (Москва, 1997), Булатовских чтениях (Санкт-Петербург, 1998, 2000, 2001), Всероссийских научных конференциях с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003), 13-ом Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2003). Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 5 рисунками и содержит 20 таблиц. Список литературы включает 32 отечественных и 117 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

С целью решения поставленных задач проведено исследование 78 детей и взрослых больных муковисцидозом в возрасте от 1 до 39 лет (средний возраст 11,85+0,82 лет), с 1996 по 2001 г.г. Больные имели

смешанную (легочно-кишечную) форму MB. Для оценки степени тяжести течения заболевания была использована шкала Швахмана-Кульчинского (Schwachman H., Kulcsycki L., 1958, Рачинский СВ., 1976), согласно которой 42 больных имели среднетяжелое течение и 36 больных тяжелое течение. Первую (I, п=27; 34%) и третью группы (III, п=16; 21%) составили дети и взрослые со среднетяжелым состоянием, вторую (II; п=24, 31%) и четвертую группы (IV, п=11; 14%) составили дети и взрослые с тяжелым течением MB.

Уровень иммуноглобулинов A, G, М, Е определяли в сыворотке крови, мокроте и ЖБАЛ методом иммуноферментного анализа с использованием тест-систем фирмы «Полигност» (Санкт-Петербург). Показатели оптической плотности образцов измеряли на фотометре «ELM - 3000» фирмы «DRG» (США) при длине волны 492 нм и выражали в [г/л].

Уровень цитокинов определяли в

сыворотке крови, мокроте и ЖБАЛ методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих тест-систем ТОО «Цитокин» (Санкт-Петербург). Показатели оптической плотности образцов измеряли на фотометре «ELM - 3000» фирмы «DRG» (США) при длине волны 492 нм и выражали в [пг/мл].

Уровень МРО и LF определяли в сыворотке крови, мокроте и ЖБАЛ методом иммуноферментного анализа с использованием кроличьих антител. Показатели оптической плотности образцов измеряли на фотометре «ELM - 3000» фирмы «DRG» (США) при длине волны 492 нм. Уровень МРО и LF выражали в [нг/мл].

Уровень ЦИК в сыворотке крови измеряли нефелометрическим способом на фотоэлектрическом колориметре КФК - 2МП (длина волны 450 нм, светофильтр 440) по методу Haskova V. с соавторами (1977) в реакции осаждения полиэтиленгликолем (ПЭГ, м.м. 6000, «Serva», Швеция). Оптическую плотность выражали в условных единицах.

Определение фагоцитарной активности моноцитов и нейтрофилов в сыворотке крови и ЖБАЛ проводили по методу Шмелева Е.И. с соавторами (1981), оценивая их поглотительную способность по степени захватывания частиц латекса. Поглотительную активность фагоцитов оценивали по двум показателям: фагоцитарного числа, ФЧ - процент (%) фагоцитирующих клеток и фагоцитарного индекса, ФИ - среднее число частиц латекса, поглощенных одной клеткой.

Иммунофенотипирование лейкоцитов (CD4, CD8, CD 16, CD20) проводили с помощью набора моноклональных и поликлональных антител «Клоноспектр» методом непрямой иммунофлуоресценции (разработчик НПЦ «Медбиоспектр», Москва). Выделение мононуклеаров из

периферической крови выполняли по методу Воуum А. (1968) в модификации Хейфица Л.Б. и Абалкина В. А. (1973). Подсчет проводили с помощью флуоресцентного микроскопа «ЛЮМАМ И2» («ЛОМО», Россия) с использованием объектива х90 и окуляра х7-10.

Активность эластазы нейтрофилов в сыворотке крови, мокроте и ЖБАЛ определяли спектрофотометрическим методом (Meyer K.C.et al, 1991) с использованием синтетического субстрата паранитрофенилового эфира ^бутил^-аланил^-аланил^-аланина в ацетонитриле (BANPE, «Sigma», США). Учет реакции проводили на спектрофотометре "Spekoll 220" (Германия) при длине волны 400 нм. Показатель эластазной активности выражали в условных единицах активности [нмоль/мл мин].

Уровень ai-PI в сыворотке крови, мокроте и жидкости бронхоальвеолярного лаважа определяли методом ракетного иммуноэлектрофореза (Аксельсен Н. и соавт., 1977). Уровень a - PI выражали в [мкг/мл].

Статистическая обработка цифровых результатов осуществлялась на персональном компьютере IBM PC Pentium II с помощью прикладных программ «Statistica» (версия 6) и «Биостатистика» (Гланц С., 1998) с использованием параметрических и непараметрических критериев. Достоверность различий оценивали по t - критерию Стьюдента и непараметрическому критерию Манна - Уитни. При р<0.05 различия считались достоверными. Для оценки тесноты связи между разными признаками использовали корреляционный анализ с применением коэффициента корреляции Пирсона, ранговой корреляции Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Активность эластазы и уровень в сыворотке крови

увеличивались у всех обследуемых больных, по сравнению с контрольной группой. Обострение заболевания сопровождалось более значительным повышением активности данного фермента (р<0.005) по сравнению с периодом минимальной активности и не зависело от тяжести течения заболевания у детей, в то время как у взрослых отмечалась увеличение эластазной активности с нарастанием тяжести течения заболевания (р<0.005).

Наряду с повышением эластазной активности и уровня в

сыворотке крови выявлялось достоверное (р<0,005) повышение активности этого фермента и увеличение содержания в мокроте

больных MB во всех возрастных группах в период обострения, относительно минимальной активности воспалительного процесса (Рис.1). По мере нарастания тяжести заболевания активность нейтрофильной

эластазы и уровень ai -PI повышались у всех обследуемых больных MB.

нмоль/

мкг/мл

мл.мин

350 300 250 200 150 100 50 0

активность эластазы

350 300 250 200 150 100 50 О

а!-ингибитор протеаз

1 гр. 2 гр. 3 гр. 4 гр.

î гр- 2 гр. 3 гр. 4 гр.

□ Мин. активность ■ Обострение

Рис. 1. Активность эластазы и уровень ai - ингибитора протеаз в мокроте у больных муковисцидозом.

При исследовании эластазной активности нейтрофилов и aj -PI в ЖБАЛ у больных муковисцидозом было выявлено достоверное (р<0,001) повышение этого показателя независимо от активности воспалительного процесса по сравнению с показателями контрольной группы. Обострение заболевания сопровождалось достоверным (р<0.005) увеличением активности нейтрофильной эластазы в ЖБАЛ относительно минимальной активности воспалительного процесса.

Ранее полученные нами результаты (Булгакова Т.В., Сесь Т.П., Суркова Е.А., и соавт., 2000), а также данные зарубежных авторов (Meyer, 1991; O'Connor., 1993) о повышении активности нейтрофильной эластазы в мокроте и ЖБАЛ больных MB с нарастанием тяжести течения заболевания и активности воспалительного процесса, свидетельствуют о нарушении равновесия в системе протеазы/антипротеазы не только в проксимальных, но и в дистальных отделах легких больных MB и являются одним из главных прогностических критериев развития серьезных изменений в легких, способствующих в дальнейшем развитию деструкции легочной ткани больных MB.

В обеих возрастных группах было выявлено достоверное (р<0,05) по сравнению с показателями здоровых лиц повышение уровня и

TNF-a в сыворотке крови в оба исследуемых периода. Достоверные

различия (р<0,01) в показателях наблюдались также между обострением заболевания и минимальной активностью воспалительного процесса. Параллельно мы проанализировали уровень провоспалительных цитокинов IL-lß, IL-8 и TNF-a в мокроте и ЖБАЛ, и оказалось, что уровень у больных муковисцидозом в мокроте и

ЖБАЛ достоверно (р<0,001) повышен в период обострения заболевания относительно минимальной активности воспалительного процесса в разных возрастных группах. Содержание IL-8 в мокроте и ЖБАЛ у больных муковисцидозом в 30-100 раз превышает аналогичные значения в сыворотке крови, что свидетельствует о преобладании локального синтеза IL-8 в очаге воспаления - в легких.

Значительное возрастание содержания МРО и LF в сыворотке крови, мокроте и ЖБАЛ установлено у всех обследуемых больных MB. Увеличение концентрации МРО в 2-3 раза и 10-15 -кратное увеличение LF в сыворотке крови свидетельствует о значительной активации нейтрофилов уже при минимальной активности заболевания, а обострение воспалительного процесса приводит лишь к незначительному возрастанию уровня МРО и LF. Вместе с тем, содержание LF достоверно повышалось при обострении воспалительного процесса по сравнению с минимальной активностью заболевания. У больных MB наблюдается положительная линейная корреляция между сывороточным содержанием МРО и LF у всех обследуемых больных MB, коэффициент корреляции Пирсона составил г =0,647, р<0,001; коэффициент детерминации составил 1^=0.419.

При исследовании содержания МРО и LF в мокроте мы установили достоверное (р<0,05) увеличение уровня этих белков при обострении заболевания по сравнению с минимальной активностью воспалительного процесса в группе детей и взрослых больных MB независимо от тяжести течения заболевания. Анализ содержания МРО и LF в ЖБАЛ в общей группе детей и взрослых больных MB показал достоверное (р<0,001) повышение количества МРО и LF в оба исследуемых периода, по сравнению с показателями контрольной группы. Повышение содержания МРО и LF в мокроте и ЖБАЛ больных MB свидетельствуют об активации нейтрофилов непосредственно в очаге поражения. Это подтверждается сильной положительной линейной корреляцией между содержанием МРО и LF в мокроте всех обследованных больных MB, коэффициент корреляции Пирсона составил г=0,747, р<0,001; коэффициент детерминации составил 1^=0,559. Графическое представление корреляции приведено на рис. 2.

14000 12000 10000

|

i 8000 ъ

« 6000

ГТ

га

CL

¡5 4000

I

£

* 2000 0

-2000

-200 0 200 400 600 800 1000 1200

концентрация МРО, нг/мл

Рис. 2. Диаграмма рассеяния для концентрации МРО и LF в мокроте больных муковисцидозом

Уровень нейтрофильных белков МРО и LF в сыворотке крови и мокроте больных MB зависит не только от активности воспалительного процесса, но и наличия бактериальной инфекции, прежде всего синегнойной палочки. В наших исследованиях инфицирование Ps. aeruginosa приводило к снижению содержания МРО в сыворотке крови, в то время как содержание МРО и LF в мокроте достоверно увеличивалось. Наличие Ps. aeruginosa у больных MB, несмотря на увеличение содержания МРО и LF в очаге воспаления, может быть связано с изменением фенотипа мукоидного штамма Ps. aeruginosa,

обеспечивающего его большую устойчивость к различным факторам (Mathee К., Ciofu О., Strenbrg С, 1999) и со способностью Ps. aeruginosa супрессировать дыхательный взрыв нейтрофилов (Eichler I., Joris L., HsuY.P. etal., 1989; Terada L.S., Johansen K., Nowbar S., et al. 1999).

Во всех группах обследованных детей больных MB в сыворотке крови, как в период обострения заболевания, так и в период минимальной активности воспалительного процесса, был повышен уровень по сравнению с показателями здоровых детей (р<0,005). При этом в сыворотке крови больных MB наблюдалось снижение содержания

и повышение уровня IL-4 по мере нарастания тяжести заболевания.

Таким образом, у детей больных MB в зависимости от тяжести течения заболевания в сыворотке крови наблюдается различное соотношение уровня IFN-y - продукта Th лимфоцитов и IL-4, преимущественно синтезируемого Th: клетками. У больных со среднетяжелым течением MB более выражена активация реакций клеточного иммунитета, опосредованных клетками. У детей с тяжелым течением MB

преобладает гуморальный тип иммунного ответа.

При исследовании уровня IFN-y и IL-4 в мокроте, то есть непосредственно в очаге повреждения, во всех группах детей больных MB было выявлено достоверное (р<0.005) увеличение содержания этих цитокинов в период обострения заболевания относительно минимальной активности воспалительного процесса. Содержание IFN-y и IL-4 в мокроте детей больных MB повышалось при нарастании тяжести заболевания, но достоверность (р<0.05) определялась только для IFN-y.

Нарастание тяжести заболевания сопровождалось повышением содержания в мокроте детей больных MB, что

свидетельствует об активации как гуморального, так и клеточного иммунитета непосредственно в очаге воспаления

Учитывая факт повышения содержания сывороточного у всех групп обследованных больных, мы проанализировали уровни общего Ig E в сыворотке крови у детей больных MB. Больные были разделены на группы в зависимости от возраста. Во всех обследованных группах больных MB было отмечено увеличение содержания общего Ig E в сыворотке крови независимо от возраста и периода течения заболевания относительно здоровых лиц той же возрастной группы.

Одну из причин увеличения общего Ig E по данным литературы связывают с наличием у больных MB аллергического бронхолегочного аспергиллеза (АВРА) (Старовойтова Э.В., и соавт., 1999: Skov M., Koch С, et al., 2000). вызванного главным образом Aspergillus fumigatus и Candida albicans. По данным Старовойтовой Э.В (Старовойтова Э.В., Романюк Ф.П.. и соавт.. 1999) одновременное увеличение специфического Ig Е к грибам и общего Ig Е было отмечено у 40% больных MB. Причем по мере нарастания тяжести течения болезни имело место бактериально-микотическая ассоциация. Повышение общего Ig E происходит, в том числе, за счет специфического Ig Е к Pseudomonas aeruginosa (Skov M.. Koch С, et al., 2000). Увеличение общего Ig E, также связывают с наличием специфических иммуноглобулинов Е к пищевым, пыльцевым и бытовым аллергенам.

Проведенные нами исследования дают возможность предположить, что

системные и местные ответы отражают особенности разных типов течения хронического воспаления у больных муковисцидозом. Каждому варианту течения заболевания соответствует определенный ТЫ или ^2 цитокиновый профиль и соответствующий тип иммунного ответа.

ВЫВОДЫ

1. Хронический инфекционно - воспалительный процесс в легочной ткани больных муковисцидозом сопровождается привлечением полиморфноядерных лейкоцитов в очаг поражения из периферической крови. Характерным является высокое содержание нейтрофилов в ЖБАЛ (выявляется у 97% пациентов MB) независимо от фазы активности заболевания. Обострение заболевания сопровождается достоверно более высоким содержанием нейтрофилов в бронхолегочной системе больных MB по сравнению с периодом минимальной активности воспаления.

2. Привлечение нейтрофилов в легочную ткань обусловлено высоким уровнем Ш-8 - основного хематтрактанта для нейтрофилов. Уровень Ш-8 в мокроте и ЖБАЛ больных MB в 30 - 100 раз превышает аналогичные значения в сыворотке крови, что свидетельствует о преобладании, локального синтеза Ш-8 в очаге воспаления - в легких.

3. Привлечение нейтрофилов в легочную ткань больных MB характеризуется их выраженной активацией, о чем свидетельствует высокий уровень катионных белков - миелоперосидазы и лактоферрина, а также высокая активность эластазы в сыворотке крови, мокроте и ЖБАЛ больных. Присоединение синегнойной инфекции сопровождается достоверным повышением уровней МРО и LF в мокроте больных.

4. Высокое содержание активированных нейтрофилов в очаге воспаления приводит к развитию выраженного дисбаланса, в протеазо / антипротеазной системе за счет повышения активности эластазы на фоне относительной недостаточности

5. Регуляция воспалительного процесса у больных MB осуществляется провоспалительными цитокинами, что проявляется высокими, уровнями

в сыворотке крови, мокроте и ЖБАЛ больных. Максимальные значения выявляются в биологических

жидкостях, приближенных к очагу воспаления - в ЖБАЛ и мокроте. Обострение заболевания сопровождается достоверно более высокими концентрациями ТОТ-а и 1Ир в сыворотке крови, мокроте и ЖБАЛ, по сравнению с аналогичными показателями периода минимальной активности воспалительного процесса.

6. Хронический воспалительный процесс при MB характеризуется

активацией Т-лимфоцитов-хелперов 1 и 2 типа, что проявляется в повышении уровней ШЫ-у и 1Ь-4 в мокроте и сыворотке крови больных. Нарастание тяжести заболевания характеризуется относительным снижением концентрации 1РЫ-у и повышением уровня Ш-4, что свидетельствует о преимущественной активации клеточного звена иммунитета при среднетяжелом течении заболевания и гуморального иммунного ответа при тяжелом течении. Повышение содержания Ш-4 в сыворотке крови больных MB сопровождается увеличением общего ^ E в оба исследуемых периода заболевания.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для проведения иммунологических исследований, касающихся оценки тяжести течения воспалительного процесса и эффективности проводимой терапии у больных муковисцидозом целесообразно исследовать мокроту пациентов, которая является доступной и информативной биологической жидкостью.

2. Наиболее информативными лабораторными критериями оценки активности хронического воспаления в легочной ткани больных муковисцидозом являются уровни провоспалительных цитокинов - 1Ь-1(3.

и отношение эластаза в мокроте больных.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Сесь Т.П.. Богданова А.В., Гембицкая Т.Е., Мурыгина Г.Л., Булгакова Т.В. Особенности активации Т-лимфоцитов-хелперов при хронической бронхолегочной патологии у детей // Сборник тезисов 8 национального конгресса по Болезням органов дыхания. М. - 1998. -№18. - С. 1956.

2. Булгакова Т.В., Сесь Т.П., Суркова Е.А., Желенина Л.А.,Бойцова Е.В. Уровни ФНО -а, ИЛ-8 и ИЛ-1 у детей с муковисцидозом // Сборник тезисов 8 национального конгресса по Болезням органов дыхания, М. -1998.-№2.-С. 191.

3. Желенина Л.А., Фаустова М.Е., Доценко Е.К., Булгакова Т.В.. Орлов А.В., Гончарова В.А., Вишнякова Л.А., Гембицкая Т.Е. Механизмы бронхиальной обструкции v больных муковисцидозом // Пульмоногия. -1998.-№4. -С.27-ЗО.

4. Гембицкая Т.Е., Ковалева Л.Ф., Желенина Л. А., Булгакова Т.В.. Каменева М.Ю. Особенности организации помощи и диспансерное

наблюдение взрослых больных муковисцидозом // Сборник тезисов 10 национального конгресса по Болезням органов дыхания, М.2000.- С. 156.

5. Булгакова Т.В, Сесь Т.П., Суркова Е.А., Доценко Е.К., Желенина Л.А., Гембицкая Т.Е. Особенности воспалительного процесса у больных муковисцидозом. //Медицинская иммунология. - 2000. -№ 4. - С. 421-424.

6. Булгакова Т.В., Сесь Т.П., Суркова Е.А., Желенина Л.А., Гембицкая Т.Е. Изучение маркеров воспаления в мокроте у больных муковисцидозом // Сборник тезисов 10 национального конгресса по Болезням органов дыхания, М. - 2000. - С. 111.

7. Сесь Т.П., Малышев М.Е.. Мурыгина Г.Л., Булгакова Т.В., Желенина Л.А., Бойцова Е.В., Богданова А.В., Гембицкая Т.Е., Орлова Г.П., Бажанов А. А. Уровни цитокинов в различных биологических жидкостях у больных бронхолегочными заболеваниями // Сборник тезисов 10 национального конгресса по Болезням органов дыхания, М. - 2000. - С. 114.

8. Сесь Т.П., Булгакова Т.В, Суркова Е.А, Доценко Е.К., Гембицкая Т.Е., Желенина Л.А., Бойцова Е.В. «Способ оценки хронического воспалительного процесса в бронхолегочной системе больных муковисцидозом» (Патент № 2216737 от 19.03. 2002 г.).

9. BulgakovaT.V., Surkova E.A., Guembitskaia Т.Е., Bogdanova A.V., Jelenina L.A., Ses T.P. Level of circulating immune complexes and organospecific autoantibodies in children with cystic fibrosis // Abst. book ERS Annual Congress, Berlin, Germany. - 1997. - P.334.

10. Jelenina L, Faustova M., Dotsenko E., Surkova E., Bulgakova T. Biochemical composition and Theological propertiens of sputum in CF patients withPs. aeruginosa infection // Allergy. - 1999. -Vol. 54. - P. 309.

11. Bulgakova T.V., Ses T.P., Surkova E.A.,Dotsenko E.A., Jelenina L.A. Levels of interleukin-8, elastase activity and a-1 -proteinase inhibitor in children with cystic fibrosis // Abst. book ERS Annual Congress, Madrid, Spain. -1999. - P.448.

12. Bulgakova T.V., Ses T.P., Surkova, Guembitskaia Т.Е., Kovaleva L.F., Mitkina L.A. Inflammatory markers in sputum and bronchoalveolar lavage fluid in patients with cystic fibrosis // Abst. book ERS Annual Congress, Florence, Italy. - 2000. - P.209.

13. Bulgakova T.V., Surkova E.A., Ses T.P.,Aleshina G.M., Sologub T.S., Boitsova. E.V. Myeloperoxidase and lactoferrin in serum of children. with exacerbation of cystic fibrosis // Abst. book ERS Annual Congress, Berlin, Germany. - 2001. -V.18. - P. 126.

14. Bulgakova T.V., Surkova E. A, Ses T.P., Guembitskaia Т.Е., Jelenina L.A. Levels of interleukin- 4 and interferon - g in serum and sputum in children with cystic fibrosis // Abst. book ERS Annual Congress, Vienna, Austria. - 2003. -V.22.-P. 1542.

»-7459

Лицензия ПЛД№ 69-217 от 22.10.1997г.

Подписано в печать 27.02.2004г. Обьём - 1п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1-02

Отпечатано с готового оригинал-макета

в типографии ООО «Полигон» 198096, Санкт-Петербург, пр. Стачек, 82 тел: 184-13-35

Актуальность проблемы

Муковисцидоз (MB) - тяжелое наследственное заболевание аутосомно-рецессивного типа, вызываемое мутацией гена, расположенного на длинном плече 7-й хромосомы в области q 31-q 32, проявляющееся системным поражением экзокринных желез и требующее лечения в течение всей жизни больного (Капранов Н.И., 2001; Гембицкая Т.Е., 2003). Клинические проявления MB связаны с дефектом гена MB, который кодирует белок, участвующий в регуляции транспорта ионов хлора через апикальную мембрану эпителиальных клеток и приводящего к почти полному отсутствию секреции хлоридов эпителием экзокринных желез (Boucher R.C., 1991; Амелина Е.Л., Чучалин А.Г., 1997).

Прогрессирующее поражение легких определяет тяжесть и прогноз исхода при муковисцидозе. Считается, что первичным патофизиологическим последствием дефекта гена MB является нарушение функции слизистых бронхиальных желез дыхательных путей, ведущее к увеличению продукции вязкого бронхиального секрета, который накапливается вследствие замедленного оттока и вызывает закупорку бронхов слизисто-гнойными пробками. Вслед за этим наступает раннее развитие инфекционных процессов (Вишнякова JI.A., Сологуб Т.С., Желенина J1.A., 1999; Hoiby N., 2001), вызываемых микроорганизмами, имеющими предрасположенность к колонизации в дыхательных путях (Psendomonas aeruginosa, Peudomonas cepacia, Staphylococcus aureus). Персистенция в легких Ps. aeruginosa происходит, как правило, при наличии иммунного дефекта, однако клинические исследования показали, что первичного системного иммунодефицита у больных MB нет (Bedard М. et al., 1993). Возможно, определенную роль в порочном цикле хронического воспаления при MB играют местные факторы защиты, предотвращающие искоренение инфекции (Hoiby N., 2001). По мере прогрессирования заболевания доля нейтрофилов в бронхоальвеолярном пространстве нарастает (Hoiby N., 2001; Пухальский A.JI., Шмарина Г.В., Капранов Н.И., 2002). Происходит активный фагоцитоз нейтрофилами Ps. aeruginosa, который, однако, не является завершенным (Church J., Keens Т. et al., 1979). Активация нейтрофилов приводит к выделению различных секреторных продуктов, участвующих в киллинге бактерий. Одной из главных функций нейтрофилов является защита легких от бактериальной инфекции. Нейтрофильные белки, такие как миелопероксидаза (МРО) и лактоферрин (LF), обеспечивают с одной стороны атимикробную защиту (Кокряков В.Н., 1999), а с другой - повреждают эпителиальные и эндотелиальные клетки ткани легкого. В связи с этим, исследование содержания МРО и LF в периферической крови, мокроте и ЖБАЛ больных MB в зависимости от активности патологического процесса и наличия бактериальной инфекции является актуальным. Известно, что нейтрофилы имеют гранулы, содержащие протеиназы, в том числе эластазу, протеиназу 3, катепсин G. Исследование активности нейтрофильной эластазы (NE) и ее основного ингибитора ai-ингибитора протеиназ у больных MB в разных биологических жидкостях даст возможность выявить соотношение между протеазами и их игибиторами как на системном уровне, так и непосредственно в очаге повреждения.

Исследования последних лет показали, что у больных MB имеется нарушение иммунорегуляции во всех звеньях иммунного ответа. Но до сих пор нет единого мнения о механизмах формирования иммунологической недостаточности при данном заболевании. Поэтому одной из главных задач клинической иммунологии является изучение иммунного статуса и поиск критериев оценки тяжести течения заболевания и активности воспалительного процесса у больных MB.

Согласно современным представлениям, цитокиновая регуляция играет ключевую роль в формировании того или иного типа воспалительного процесса. Причем особую роль играют цитокины, синтезируемые непосредственно в очаге воспаления эффекторными клетками — альвеолярными макрофагами, Т-лимфоцитами, эндотелиальными клетками и бронхолегочным эпителием. В связи с этим, большое значение приобретают исследования уровня цитокинов в мокроте, жидкости бронхоальвеолярного лаважа - IL-lp, TNF-a, IL-8 и других провоспалительных цитокинов.

Исследования функциональной активности иммунной системы, активности протеолитических ферментов, а также функциональной активности нейтрофилов позволит более объективно оценить тяжесть течения заболевания и контролировать эффективность противовоспалительной терапии и проводить своевременную коррекцию лечения больных MB, что является одной из основных задач клинической иммунологии.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в изучении функциональной активности клеток - эффекторов воспаления в легких у больных муковисцидозом и использовании полученных данных для оценки тяжести течения заболевания и коррекции проводимой терапии.

Были поставлены следующие задачи:

1. Оценить особенности иммунного статуса у больных муковисцидозом в динамике заболевания: -определить содержание Ig А, М, G в сыворотке крови; -определить фагоцитарную активность нейтрофилов и клеток моноцитарно-макрофагального ряда в крови и ЖБАЛ -произвести фенотипирование лейкоцитов;

-определить количество циркулирующих иммунных комплексов в периферической крови.

2. Изучить уровень цитокинов TNF-oc, интерлейкина - 1(3, интерлейкина - 8 в ЖБАЛ, мокроте и периферической крови у обследуемых больных в динамике заболевания.

3. Исследовать уровень интерлейкина - 4, INF-y , общего Ig Е в мокроте и сыворотке крови больных MB в динамике заболевания.

4. Определить активность эластазы и al- ингибитора протеиназ в мокроте, периферической крови и ЖБАЛ в зависимости от тяжести течения и динамики заболевания.

5. Определить количество миелопероксидазы (МРО) и лактоферрина (LF) в сыворотке периферической крови, мокроте и ЖБАЛ больных MB в зависимости от тяжести течения, динамики заболевания и влияния синегнойной инфекции.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Доминирующим типом клеток-эффекторов воспаления в легочной ткани больных MB являются нейтрофилы.

2. В мокроте и ЖБАЛ больных MB формируется выраженный дисбаланс в системе протеазы / ингибиторы вследствие повышения активности нейтрофильной эластазы и относительной недостаточности ее основного ингибитора -ai-PI.

3. Уровень провоспалительных цитокинов, катионных белков нейтрофилов - миелопероксидазы и лактоферрина в мокроте больных муковисцидозом, а также степень выраженности дисбаланса в системе протеазы / ингибиторы являются вспомогательными лабораторными критериями для оценки активности хронического воспалительного процесса в легочной ткани больных муковисцидозом и эффективности проводимой терапии.

4. Иммунопатогенез муковисцидоза характеризуется активацией Т-лимфоцитов-хелперов 1 и 2 типа, что свидетельствует об активации как клеточного, так и гуморального иммунного ответа.

Научная новизна работы: Получены новые данные, свидетельствующие о повышении синтеза провоспалительных цитокинов - IL-8, IL-lp и TNFa в очаге воспаления у больных муковисцидозом.

Выявлены наиболее информативные параметры изменения функциональной активности нейтрофилов у больных муковисцидозом, позволяющие оценить активность хронического воспаления в легочной ткани больных муковисцидозом - уровень миелопероксидазы, лактоферрина и активность эластазы.

Получены новые данные о степени выраженности дисбаланса в протеазо-антипротеазной системе в очаге поражения у больных муковисцидозом.

Получены новые данные, свидетельствующие об активации 2-х субпопуляций Т-лимфоцитов-хелперов (Thi и ТЬг) в очаге воспаления у больных муковисцидозом.

Практическая значимость. Предложен к применению в практическое здравоохранение «Способ оценки хронического воспалительного процесса в бронхолегочной системе больных муковисцидозом» (Изобретение № 2002 107082, патент 2216737 от 19.03.2002 г.), позволяющий оценивать тяжесть течения заболевания, активность воспалительного процесса и эффективность проводимой терапии, на основании определения уровня провоспалительных цитокинов (интерлейкина - 8 и фактора некроза опухоли альфа) и оценки протеазо-антипротеазного баланса по определению активности эластазы и уровню альфа 1 -ингибитора протеиназ в мокроте больных муковисцидозом.

Реализация и апробация работы

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Ежегодной конференции молодых ученых (Санкт-Петербург, 1997,1998, 1999), Ежегодном Конгрессе Европейского общества пульмонологов (Берлин, 1997; Мадрид, 1999; Флоренция, 2000; Берлин, 2001; Вена, 2003), «Муковисцидоз - 97» (Москва, 1997), Булатовских чтениях (Санкт-Петербург, 1998, 2000, 2001), Всероссийских научных конференциях с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003), 13-ом Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Санкт-Петербург, 2003).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц, 5 рисунков и состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы, насчитывающего 149 источников (32 - на русском и 117 - на иностранных языках).

ВЫВОДЫ

1. Хронический инфекционно - воспалительный процесс в легочной ткани больных муковисцидозом сопровождается привлечением полиморфноядерных лейкоцитов в очаг поражения из периферической крови. Характерным является высокое содержание нейтрофилов в ЖБАЛ (выявляется у 97% пациентов MB) независимо от фазы активности заболевания. Обострение бронхолегочного процесса сопровождается достоверно более высоким содержанием нейтрофилов, по сравнению с периодом минимальной активности воспаления.

2. Привлечения нейтрофилов в легочную ткань обусловлено высоким уровнем IL-8 - основного хематтрактанта для нейтрофилов. Уровень IL-8 в мокроте и ЖБАЛ больных MB в 30 - 100 раз превышает аналогичные значения в сыворотке крови, что свидетельствует о преобладании локального синтеза IL-8 в очаге воспаления - в легких.

3. Привлечение нейтрофилов в легочную ткань больных MB характеризуется их выраженной активацией, о чем свидетельствуют высокие уровни катионных белков -миелоперосидазы и лактоферрина, а также высокая активность эластазы в сыворотке крови, мокроте и ЖБАЛ больных. Присоединение синегнойной инфекции сопровождается достоверным повышением уровней МРО и LF в мокроте больных.

4. Высокое содержание активированных нейтрофилов в очаге воспаления приводит к развитию выраженного дисбаланса в протеазо / антипротеазной системе, за счет повышения активности эластазы на фоне относительной недостаточности ai — PI.

5. Регуляция воспалительного процесса у больных MB осуществляется провоспалительными цитокинами, что проявляется высоким уровнем TNF-a и IL-ip в сыворотке крови, мокроте и ЖБАЛ больных. Максимальные значения TNF-a и IL-ip выявляются в биологических жидкостях, приближенных к очагу воспаления - в ЖБАЛ и мокроте. Обострение заболевания сопровождается достоверно более высокими концентрациями TNF-a и IL-ip в сыворотке крови, мокроте и ЖБАЛ, по сравнению с аналогичными показателями в фазу минимальной активностью воспалительного процесса.

6. Хронический воспалительный процесс при MB характеризуется активацией Т-лимфоцитов-хелперов 1 и 2 типа, что проявляется в повышении уровней IFN-y и IL-4 в мокроте и сыворотке крови больных. Нарастание тяжести заболевания характеризуется относительным снижением концентрации IFN-y и повышением уровня IL-4 , что свидетельствует о преимущественной активации клеточного звена иммунитета при среднетяжелом течении заболевания и гуморального иммунного ответа при тяжелом течении. Повышение содержания IL-4 в сыворотке крови больных MB сопровождается увеличением общего Ig Е в оба исследуемых периода заболевания.

Ill

Практические рекомендации

1. Для проведения иммунологических исследований по оценке тяжести течения воспалительного процесса и эффективности проводимой терапии у больных муковисцидозом целесообразно исследовать мокроту пациентов, которая является доступной и информативной биологической жидкостью.

2. Наиболее информативными лабораторными критериями оценки активности хронического воспаления в легочной ткани больных муковисцидозом являются уровень провоспалительных цитокинов - IL-1J3, IL-8 и TNF-a и отношение aj - PI / эластаза в мокроте больных. (Изобретение «Способ оценки хронического воспалительного процесса в бронхолегочной системе у больных муковисцидозом», патент №2216737 от 19.03.2002).