Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Иммунологическая характеристика Pgp170 позитивного рака молочной железы

ЕНГАЙ Дина Анатольевна

ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Pgpl70 -ПОЗИТИВНОГО РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ. 14.00.14 — онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ии^1Б4Э9Б

003164996

ЕНГАЙ Дина Анатольевна

ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Рйр170 -ПОЗИТИВНОГО РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ. 14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

/

Работа выполнена в ГУ Российский Онкологический Научный Центр им. Н.Н.Блохина РАМН (директор, академик РАН и РАМН, профессор Давыдов М.И.)

Научные руководители:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Поддубная И.В. доктор медицинских наук, профессор Тупицын H.H.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, Профессор Петерсон С.Б. доктор биологических наук, профессор Бочарова О.А.

Ведущее научное учреждение: Государственный научный центр

Институт иммунологии Федерального Медико-биологического Агентства Российской Федерации

Защита диссертации состоится "27" марта 2008г.

в 14 00 часов на заседании специализированного совета К 001 017 01 при ГУ Российском Онкологическом Научном Центре им ННБлохина (115478 Москва, Каширское шоссе, 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Российского Онкологического Научного Центра им Н Н Блохина РАМН

Автореферат разослан "_"_2008г

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских наук, профессор

Шишкин Ю В

Актуальность темы.

Рак молочной железы - одно из самых распространенных онкологических заболеваний у женщин Статистические данные последних лет свидетельствуют о неуклонном, интенсивном росте заболеваемости и смертности от рака молочной железы, несмотря на значительный прогресс в лечении заболевания, достигнутый в результате совершенствования хирургических и лекарственных методов. Лечение данной категории больных остается одной из наиболее сложных задач современной онкологии В связи с этим не теряет своей актуальности разработка новых подходов к общему прогнозу заболевания и выбору наиболее адекватных схем лечения для каждой больной

В последние годы большое внимание в этой области уделяется различным молекулярным и клеточным маркерам, характеризующим фундаментальные биологические свойства опухоли Тем не менее, из-за большого числа потенциально значимых молекулярно-биологических факторов и из-за больших расхождений представленных в литературе данных об их прогностической ценности, выбор определенного типа терапии, основанный на биологических характеристиках опухоли, остается затруднительным и неопределенным для врача Многие исследователи вообще довольно скептически относятся к возможностям практического использования этих параметров в настоящее время из-за существующей во многих западных странах тенденции к повсеместному применению адъювантной терапии Тем не менее, по крайней мере, в трех ситуациях прогностические факторы могут быть полезны во-первых, для выявления пациентов с очень хорошим прогнозом, для которых осложнения и стоимость лечения не будут оправданы имеющимся риском рецидива, во-вторых, для выявления группы больных с очень плохим прогнозом, которым требуется более агрессивное адъювантное лечение, и, в-третьих, для определения чувствительности или резистентности больных к конкретным

видам терапии Возможно, наличие экспрессии гена множественной

лекарственной устойчивости позволит наряду с другими молекулярно-

биологическими маркерами выделить прогностически неблагоприятную

группу больных раком молочной железы для выбора наиболее адекватной

схемы адъювантного лечения

На основании исследования молекулярно-биологических

особенностей опухоли может быть создана новая таргетная стратегия

лечения Знание специфических биологических характеристик опухоли

может помочь и в усовершенствовании существующих схем терапии, и в

развитии новых подходов к лечению, основанных, например, на

иммунотерапии, генной терапии или на модификации системы передачи

регуляторных сигналов в клетке

В течение последних 30-ти лет ведутся активные исследования

множественной лекарственной устойчивости (МЛУ)

Множественная лекарственная устойчивость — это резистентность

популяции клеток опухоли одновременно * к целому ряду

химиотерапевтических препаратов разного химического строения и с

разным механизмом действия на клетку Множественная лекарственная

устойчивость представляет собой серьезное препятствие на пути успешного

лекарственного лечения злокачественных новообразований Исследования

последних лет показали, что молекулярные механизмы множественной

лекарственной устойчивости разнообразны и могут быть обусловлены

включением различных механизмов, характеризующих разные этапы

осуществления токсического действия химиопрепарата на клетку — от

ограничения накопления лекарства внутри клетки до отмены программы

гибели клетки, индуцируемой веществом Нередко в клетке включается

несколько защитных механизмов, однако чаще всего преобладает какой-то

один механизм Наиболее изученными механизмами, клиническая

значимость которых при некоторых формах новообразований выявлена,

являются активация трансмембранных транспортных белков, выводящих 1

различные вещества из клетки (к ним принадлежит Р-гликопротеин), активация ферментов системы глутатиона, детоксицирующей препараты, изменения генов и белков, контролирующих апоптоз и выживаемость клетки (в первую очередь р53 и Вс1-2)

Р-гликопротеин (Pgp 170), продукт гена множественной лекарственной устойчивости (МОЮ), наряду с другими онкогенами и супрессорными генами, рассматривается в последнее время как потенциальная мишень для новых схем противоопухолевой терапии, направленных на преодоление лекарственной резистентности

По данным мировой литературы нарастание экспрессии МОШД^ПО может наблюдаться после химио- и лучевой терапии, а также с увеличением стадии заболевания Истинное представление об экспрессии Р§р170 клетками рака молочной железы дает исследование опухолевой ткани до назначения лекарственной терапии В этой связи особую актуальность приобретает изучение экспрессии Р§р170 и оценка множественной лекарственной резистентности у больных операбельным раком молочной железы с наличием метастазов в региональные лимфоузлы, которым необходимо проведение адъювантной полихимиотерапии По этой причине в работе мы уделили особое внимание исследованию больных раком молочной железы ПЬ-ГОс стадий (в основном, Т2К1-ЗМ0), для которых выбор адъювантной терапии и оценка множественной лекарственной резистентности актуальна с практической точки зрения

В работе проведено изучение иммунофенотипической, клинико-морфологической и прогностической роли экспрессии опухолевыми клетками Р-гликопротеина, кодируемого геном множественной лекарственной резистентности, у больных раком молочной железы

Цель работы.

Целью исследования явилась иммунологическая характеристика Рдр 170-позитивного рака молочной железы

Основные задачи исследования.

1 Определить иммуногистохимическим методом экспрессию белка Р-гликопротеина (продукта гена множественной лекарственной резистентности) в клетках рака у больных раком молочной железы Т2Ш-ЗМО стадий

2 Определить особенности иммунофенотипа клеток рака молочной железы Т2Ы1-ЗМ0 стадий

3 Проанализировать взаимосвязь экспрессии Р-гликопротеина с клинико-морфологическими характеристиками больных раком молочной железы Т2М1-ЗМ0 стадий

4 Проанализировать взаимосвязь экспрессии Р-гликопротеина с результатами адьювантного лечения в исследованной группе больных

Научная новизна.

Впервые определены особенности иммунофенотипа клеток рака молочной железы Т2М1-ЗМ0 стадии На клетках первичной опухоли изучена экспрессия гена множественной лекарственной резистентности (МОЮ) с помощью иммуногистохимического метода Исследована взаимосвязь иммунофенотипа клеток рака молочной железы Т2Ы1-ЗМ0 стадии с основными клинико-морфологическими признаками, с результатами лечения, а также с экспрессией гена множественной лекарственной резистентности

Показано, что больные раком молочной железы стадии Т2№-ЗМ0 в изученной группе имеют целый ряд традиционно неблагоприятных прогностических признаков сохранная менструальная функция (63%), наличие 3 степени злокачественности в 22 % случаев, большой размер (>3см) опухолевого узла (55%), наличие метастазов в 6-10 аксиллярных лимфоузлах (26%) и, наконец, отрицательный рецепторный статус РЭ-РП-(51%)

Иммунофенотип клеток рака молочной железы Т2№-ЗМ0 стадии также характеризуется целым рядом прогностически неблагоприятных признаков, низкий уровень экспрессии молекул НЬА I и II классов, молекулы апогггоза СБ 95, довольно высокий уровень экспрессии молекул СБ 54 и СБ 71, а также низкое количество туморинфильтрирующих лимфоцитов Впервые обнаружена достоверная корреляция экспрессии молекул СБ 45, СО 71 и СЕ) 95 с экспрессией молекулы СБ 54, что может указывать на довольно высокий метастатический потенциал исследованных клеток

При исследовании экспрессии Рйр 170 впервые обнаружена высокодостоверная корреляция с молекулой апоптоза (СБ 95) и достоверная ассоциация с молекулой адгезии (СО 54/1САМ -1)

Анализ взаимосвязи частоты экспрессии Рцр 170 с клинико-морфологическими особенностями опухолевых клеток у больных раком молочной железы Т2Ы1-ЗМ0 стадии показал независимость Р§р 170 детерминанты от большинства изученных признаков. Однако выявлено несколько очень важных, на наш взгляд, статистически значимых ассоциаций экспрессии Р§р 170 с морфологическим вариантом опухоли, со степенью злокачественности, а также с количеством метастатически пораженных лимфоузлов, что может косвенно свидетельствовать о сильном отрицательном прогностическом влиянии экспрессии гена множественной лекарственной резистентности при раке молочной железы Т2Ш-ЗМ0 стадии

Не выявлено каких-либо особенностей экспрессии гена множественной лекарственной резистентности МБШЛ^р 170 у больных раком молочной железы Т2Ш-ЗМ0 стадии, связанных с объемом операции, послеоперационной лучевой и гормональной терапией

Выявлена статистически достоверная ассоциация экспрессии гена МОШЛ^р 170 с прогрессированием рака молочной железы Т2№-ЗМ0 стадии в первые 45 месяцев, а также с адъювантной полихимиотерапией Получено весьма важное, на наш взгляд, наблюдение прогрессирование РМЖ на антрациклинсодержащих схемах наблюдалось преимущественно у больных с экспрессией молекулы Pgpl70

Практическая значимость исследования.

В результате проведенного исследования определен иммунофенотип клеток рака молочной железы Т2Ы1-ЗМ0 стадии у больных с прогностически неблагоприятными клинико-морфологическими

признаками, что позволит оптимизировать адьювантную терапию у данной категории пациенток

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 136 страницах машинописного текста. Содержит введение, 3 главы, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 122 источника отечественных и зарубежных авторов Работа иллюстрирована 62 таблицами

Апробация диссертации.

Апробация диссертации состоялась 26 июня 2007года на совместной научной конференции сотрудников кафедры онкологии ГОУ ДПО РМАПО,

хирургического отделения диагностики опухолей, хирургического отделения молочных желез, отдела патологической анатомии, лаборатории иммунологии гемопоэза и лаборатории иммунологии опухолей ГУ РОШД им Н Н Блохина РАМН

Материалы и методы исследования.

Материалом для настоящего исследования послужили данные клинического, морфологического и иммуногистохимического обследования 51 больной раком молочной железы, проходивших лечение в различных отделениях ГУ РОНЦ им НН Блохина РАМН в 2002 году Больные стадированы согласно Международной клинической классификации злокачественных опухолей по системе TNM Согласно 5 изданию, 1997 г. все пациентки имели стадию IIb Согласно 6 изданию TNM, 2003 г 69% больных (35/51) имели стадию IIb, 20% больных (10/51)- 1Па (T2N2M0) и 11% больных (6/51)-Шс (T2N3M0) [таблица №1] Исследование проспективное, нерандомизированное.

Таблица №1.

Распределение больных раком молочной железы согласно Международной клинической классификации злокачественных опухолей по системе ТТУМ, издание б, 2003 года.

Стадия TNM Отечественная классификация Количество больных Процент

T2N1M0 IIb 35/51 69%

T2N2M0 Illa 10/51 20%

T2N3M0 IIIc 6/51 11%

Возраст пациенток находился в пределах от 36 до 77 лет (медиана — 54

года)

Для определения экспрессии гена множественной лекарственной резистентности (МЕЖ 170) была отобрана группа больных раком молочной железы, не получавших неоадъювантную терапию, поскольку в целом ряде работ доказано изменение уровня экспрессии М1Ж1 после лечения Учитывая исходную распространенность процесса, на первом этапе всем больным проведено оперативное лечение в различном объеме: радикальная мастактомия с сохранением большой и малой грудных мышц — 37 больным (73%), радикальная мастэктомия с сохранением обеих грудных мышц в радиохирургическом варианте выполнена 1 больной (2%), органосохраняющая операция - радикальная резекция молочной железы — 13 больным (25%)

У всех больных был изучен операционный материал для уточнения гистологического строения опухоли, определения степени распространенности и злокачественности процесса, а также для исследования уровня рецепторов стероидных гормонов и иммунофенотипа опухолевых клеток

Оценка гистологического строения опухолей проводилась в отделе патологической анатомии опухолей человека РОНЦ им Н Н Блохина РАМН по критериям ВОЗ (1988г )

По гистологическому строению все опухоли распределились следующим образом: инфильтрирующий протоковый рак - 31 больная (61%) инфильтрирующий дольковый рак — 12 больных (23%), другие же гистологические формы составили 16% (8 больных), из них медуллярный рак — 3 больных (6%), тубулярный рак — 3 больных (6%), инфильтрирующий протоковый рак с преобладанием внутрипротокового компонента — 2 больных (4%) [таблица №2].

Таблица №2.

Морфологические варианты опухоли.

Гистологический тип Количество больных Процент

Инфильтративный 31/51 61%

протоковый

Инфильтративный 12/51 23%

дольковый

Другие варианты

медуллярный 3/51 6%

тубулярный 3/51 6%

инфильтрирующий 2/51 4%

протоковый рак с

преобладанием

внутрипротокового

компонента

Всего 51 100%

У всех пациенток при детальном гистологическом анализе был также определен такой важный показатель как степень злокачественности опухоли

(таблица №3)

Таблица №3.

Степень злокачественности рака молочной железы.

Степень злокачественности Количество больных Процент

2-я ст злокачественности 40/51 78%

3-я ст злокачественности 11/51 22%

Всего 51 100%

Распределение больных по размеру опухолевого узла и количеству метастатически пораженных лимфоузлов показано в таблицах № 4, 5

Таблица №4. Размер опухолевого узла._

Размер опухолевого узла Частота Процент

2-3 см 23/51 45%

3 - 4 см 16/51 31%

4-5см 12/51 24%

Всего 51 100%

Таблица №5.

Количество метастатических лимфоузлов._

Количество метастатических лимфоузлов Частота Процент

Метастазы в 1-3 лимфоузла 35/51 69%

Метастазы в 4-9 лимфоузлов 10/51 20%

Метастазы в 10 и > лимфоузлов 6/51- 11%

Всего 51 100%

Адьювантная полихимиотерапия проведена почти всем больным (46/51, 90%) по схеме CMF или CAF (таблица №6) 6 больным (13%) проведено 6 курсов по схеме CMF циклофосфамид 100 мг/м2 внутрь ежедневно с 1-го по 14-й день, метотрексат 50 мг/м2 внутривенно в 1-й и 8-й день, фторурацил 600 мг/м2 внутривенно в 1-й и 8-й день, повторение курса каждые 4 недели 40 больных (87%) получили в послеоперационном периоде от 4 до 6 курсов полихимиотерапии по схеме CAF циклофосфамид 100 мг/м2 внутрь или внутримышечно с 1-го по 14-й день, доксорубицин 30 мг/м2 внутривенно в 1-й и 8-й день, фторурацил 500 мг/м2 внутривенно в 1-й и 8-й день, повторение курса каждые 4 недели

Таблица №6.

Варианты адьювантной полихимиотерапии в исследованной группе больных.

Схема адьювантной полихимиотерапии Количество больных

СМБ х 6 курсов 6 (13%)

САБ х 4 курса 12(26%)

САБ х 6 курсов 28 (61%)

Всего 46 (100%)

Таким образом, большинство больных (78%) в послеоперационном периоде получили от 4 до 6 курсов полихимиотерапии с включением антрациклино в

В зависимости от наличия или отсутствия рецепторов стероидных гормонов в опухоли были выделены четыре группы больных (таблица №7)

Таблица №7. Экспрессия рецепторов стероидных гормонов.

Рецепторный статус Частота Процент

РЭ-РП- 26/51 51,0%

РЭ-РП+ 6/51 11,8%

РЭ+РП- 9/51 17,6%

РЭ+РП+ 10/51 19,6%

Таким образом мы видим, что более половины исследованных (51%) составляют женщины с отрицательным статусом рецепторов стероидных гормонов РЭ-РП-, традиционно являющимся одним из основных неблагоприятных прогностических признаков у больных рацом молочной железы, а наиболее благоприятная в прогностическом отношении группа больных с РЭ+РП+ статусом составила всего 20%.

Гормонотерапия проводилась женщинам с положительным рецепторным статусом опухоли уровень РЭ и РП не менее 10 фмоль/мг белка Больные в постменопаузе получали тамоксифен в суммарной дозе 20 мг в сутки в течение длительного времени Пациенткам с гормонозависимыми опухолями в пременопаузе выполнялась овариэктомия с длительным последующим применением тамоксифена в дозе 20 мг в сутки (таблица №8)

Таблица №8. Вид адъюваитной гормонотерапии.

Адъювантная гормонотерапия Частота Процент

Не проводилась 28/51 54,9%

Тамоксифен 23/51 45,1%

Лучевая терапия проводилась больным после органосохраняющей операции на оставшуюся часть молочной железы по РОД 2 Гр, СОД 50 Гр и на регионарные зоны РОД 2 Гр, СОД 34-42 Гр, (13/51 больных, 25%)

Таким образом, изученная нами группа больных раком молочной железы T2N1-3M0 стадии имеет целый ряд традиционно прогностически неблагоприятных признаков сохранная менструальная функция (63%), наличие 3 степени злокачественности в 22 % случаев, большой размер (>3см) опухолевого узла (55%), наличие > 4 метастазов в аксиллярных лимфоузлах (31%) и, наконец, отрицательный рецепторный статус РЭ-РП- (51%)

Больные были прослежены в течение 42 — 54 месяцев (медиана 45 мес) За время наблюдения у 37 пациенток не наблюдалось прогрессирования заболевания Из всей группы исследованных больных у 27% (14/51) отмечено прогрессирование заболевания в сроки от 2 до 45 месяцев, средний срок прогрессирования рака молочной железы при этом составил 21 месяц Метастазы в печень наблюдались чаще всего и составили 36% (5/14) от всей группы больных с прогрессированием заболевания. Далее, по мере убывания следует группа больных с метастазами в легкие, 29%

(4/14), больные с другими метастазами (в кости, в надключичные лимфоузлы, в головной мозг) составили 35% От прогрессирования заболевания умерло 3 человека

Иммунологические исследования проводились на криостатных срезах 51 удаленной первичной опухоли. Иммуногистохимически экспрессия Р-гликопротеина была выявлена у 19 больных (37%)

В иммуногистохимическом анализе использовались непрямая и прямая реакции иммунофлуоресценции на криостатных срезах.

Препараты изучали на люминисцентном микроскопе АХЮРЬАЫ-2 при увеличении х400.

При иммунофенотипировании клеток первичной опухоли использованы моноклональные антитела к эпителиальным антигенам НЕА — 125 к панэпителиальному антигену, 1СО-25 к МиС-1, к антигенам главного комплекса гистосовместимости: 1СО-53 к НЬА-1 и 1СО-1 к ПЬА-ОЯ. К лейкоцитарным антигенам Н-1е 1 к СО 45, 1СО-20 к СБ38 1СО-88 к трансферриновому рецептору СО 71, 1СО-160 к рецептору апоптоза С095; Му-13 к СО 54, а также 1ЛС-2 к Pgp 170, любезно предоставленное Е Б Мечетнером, США

При иммунофенотипировании опухолевых клеток результаты реакций учитывали полуколичественным методом Выделяли три типа взаимодействия антител с опухолевыми клетками.

1 Отсутствие реакции.

2 Мозаичная реакция

3 Мономорфная реакция.

При иммунофенотипировании иммунокомпетентных клеток результаты реакции оценивали полуколичественным методом.

1 Практически полное отсутствие лимфоидной инфильтрации

2 Слабая инфильтрация

3. Умеренная инфильтрация.

4. Выраженная инфильтрация.

Данные историй болезней и всех исследований были занесены в специально созданную базу данных Расчеты проводились на персональном компьютере с помощью пакета программ «Статистика для Windows» (StatSoft Inc , 1996, Version 5,0)

Результаты исследования и их обсуждение.

1. Клииико-морфологическая характеристика и результаты лечения больных раком молочной железы T2N1-3M0 стадии.

Для попытки изучения биологических свойс гв опухолевых клеток все исследованные пациентки были разделены на 2 группы с учетом стандартных (общеизвестных) прогностических факторов больные без прогрессирования рака молочной железы в течение первых 45 месяцев и больные с прогрессированием заболевания в течение этого же срока

Обнаружено, что в исследуемой группе больных частота прогрессирования не зависит от морфологического варианта опухоли р=0,49 и от степени злокачественности опухоли р=0,13. Однако выявлена следующая тенденция: в группе больных с прогрессированием заболевания 3 степень злокачественности встретилась в 36% случаев (5/14), в то время кейс в группе больных без прогрессирования заболевания аналогичный показатель наблюдался в 2 раза реже - 16% (6/37)

Не было выявлено статистически значимой связи между прогрессированием заболевания и размером опухолевого узла в исследованной группе больных р=0,43, а также числом метастатически пораженных лимфоузлов р=0,37, однако, с увеличением числа метастатически пораженных лимфоузлов частота прогрессирования возрастает в 3,7 раза (с 21% до 79%)

В изученной группе больных не обнаружено статистически значимой зависимости частоты прогрессирования от статуса рецепторов эстрогенов

р=0,11, от статуса рецепторов прогестерона р=0,78 и от различных сочетаний стероидных рецепторов р=0,19.

Обнаружена статистически значимая корреляция частоты прогрессирования от вида адъювантной полихимиотерапии р=0,003 (таблица №9)

Таблица №9.

Зависимость частоты прогрессирования рака молочной железы от вида адъювантной полихимиотерапии.

Схема адъювантной полихимиотерапии

Категория больных Без СМБхб САРх4 САРхб Итого

ПХТ

Без 5 6 9 17 37

прогрессирования 14% 16% 24% 46% 100%

РМЖ

Прогрессирование 0 0 3 11 14

РМЖ 0% 0% 21% 79% 100%

Итого 5 6 12 28 51

10% 12% 24% 54% 100%

Прогрессирование не наблюдалось у больных, получавших адъювантную терапию по схеме СМР; ни в одном из этих случаев не отмечено экспрессии опухолевыми клетками Р§р170 Прогрессирование отмечено у 27% (14/51) больных, получивших в адъювантном режиме антрациклин-содержащие схемы Безусловно, в первую очередь данный факт обусловлен наличием неблагоприятных клинико-морфологических признаков, на основании которых пациенткам рекомендованы антрациклиновые антибиотики С другой стороны, по данным мировой литературы механизм множественной лекарственной резистентности, обусловленный гиперэкспрессией Р£р170/М0111, реализуется к определенному спектру химиопрепарагов, куда вместе с антрациклинами

также входят алкалоиды растительного происхождения, подофиллотоксины, таксаны и др Косвенно полученные данные могут свидетельствовать о том, что устойчивость, обусловленная гиперэкспрессией белкового продукта гена множественной лекарственной резистентности, может проявляться на антрациклин-содержащих

В группе больных с прогрессированием заболевания процент больных (29%), Получавших тамоксифен, в 1,7 раза ниже, чем в группе больных без прогрессирования рака молочной железы (51%), данные статистически не достоверны р=0,12 Следовательно, применение тамоксифена ассоциируется с более низкой частотой прогрессирования

Таким образом, мы рассмотрели 2 группы больных раком молочной железы Т2Ш-ЗМ0 без прогрессирования заболевания в течение первых 45 месяцев (73%, 37 больных из 51) и с прогрессированием заболевания в течение этого же срока (27%, 14 больных из 51) В группе больных с прогрессированием заболевания обнаружен целый ряд традиционно неблагоприятных прогностических признаков 64% пациенток с РЭ-РП-статусом, наличие в 36% случаев третьей степени злокачественности опухоли, а также то, что 79% больных имели метастазы в более чем 1 аксиллярном лимфоузле

Высокий процент (27%) прогрессирования рака молочной железы в сроки до 4 лет после операции можно объяснить наличием как неблагоприятных клинико-морфологических характеристик опухоли, так и биологическими свойствами, в числе которых мы предполагаем участие гена множественной лекарственной резистентности

2. Иммунофенотипическая характеристика опухолевых клеток больных раком молочной железы Т2М-ЗМ0 стадии, взаимосвязь экспрессии различных антигенов.

Была изучена частота экспрессии антигенов на клетках рака молочной железы в исследованной группе больных (таблица №10)

Таблица№10.

Частота экспрессии антигенов на клетках рака молочной железы.

Опухолевый маркер Тип реакции

Мономорфная Мозаичная Отсутствие реакции

НЬА-1 31% (16/51) 12% (6/51) 57% (29/51)

НЬА-П 10% (5/51) 14% (7/51) 76% (39/51)

СК 100% 0 0

мис-1 65% (33/51) 29% (15/51) 6% (3/51)

СБ 95 22% (11/51) 0 78% (40/51)

СО 54 0 41% (21/51) 59% (30/51)

СО 71 53% (27/51) 16% (8/51) 31% (16/51)

Рдр 170 27% (14/51) 10% (5/51) 63% (32/51)

Обнаружена умеренная инфильтрация опухоли лимфоцитами (таблица №11)

Таблица №11.

Маркер Тип реакции Всего

Выраженная инфильтрация Умеренная инфильтрация Единичные клетки

СО 45 39% (20/51) 16% (8/51) 45% (23/51) 51 (100%)

СО 38 20% (10/51) 72% (37/51) 8% (4/51) 51 (100%)

Для оценки корреляции между иммунофенотипическими маркерами рака молочной железы и инфильтрацией ткани опухоли лимфоцитами и плазмоцитами уровни экспрессии антигенов на опухоли и уровни местных иммунных реакций были оценены в баллах

Выявлена достоверная взаимосвязь снижения уровней экспрессии молекул НЬА-1 с отсутствием на мембране раковых клеток НЬА-П — антигенов, р=0,0003

Экспрессия молекул НЬА-1 на опухолевых клетках была достоверно связана с уровнями лимфоидной инфильтрации рака молочной железы (СБ 45), р=0,003

Определена взаимосвязь антигенов гистосовместимости I класса с уровнем лимфоидной инфильтрации, р=0,003.

Аналогичная ситуация отмечена для СО 38+ плазмоцитов: наблюдается положительная ассоциация НЬА-1 с уровнем плазмоцитарной инфильтрации опухоли (СБ 38), р=0,017

Таким образом, для иммунофенотипа рака молочной железы Т2Ы1-ЗМ0 стадии характерна тесная взаимосвязь антигенов гистосовместимости с различными типами иммунологических реакций в ткани опухоли

, Все вышесказанное является косвенным подтверждением того, что для реализации местного противоопухолевого иммунитета необходимо взаимодействие лимфоцитов с молекулами НЬА I и II классов на клетках рака молочной железы

Наблюдалась достоверная взаимосвязь между уровнями лимфоидной (СО 45) и плазмоцитарной (СП 38) инфильтрации, р=0,0009

Обнаружена достоверная корреляция экспрессии антигена НЬА-П с уровнем плазмоцитарной инфильтрации (СБ 38), р=0,001

Выявлена достоверная взаимосвязь лимфоидной инфильтрации (СО 45) с экспрессией антигена мембран жировых глобул молока (МиС-1), р=0,04

Обнаружена достоверная взаимосвязь лимфоидной инфильтрации (СО 45) с экспрессией молекулы адгезии 1САМ 1, р=0,04: по мере нарастания лимфоидной инфильтрации (СО 45) в опухоли пропорция 1САМ 1 позитивных клеток возрастает с 26% до 45%, то есть более чем в полтора раза

Отмечена статистически значимая корреляция экспрессии рецептора трансферрина СО 71 с молекулой адгезии 1САМ 1 по мере нарастания числа СО 71 антигенпозитивных клеток увеличивается частота экспрессии 1САМ 1 более чем в два раза, с 26% до 56%, р=0,007

Полученные результаты позволяют говорить о наличии тенденции к нарастанию экспрессии рецептора трансферрина в условиях повышенной экспрессии молекул адгезии. Это может быть основой для создания высокопролифелирующего клеточного пула и являться причиной неблагоприятного прогноза у данной группы исследованных больных.

Косвенным подтверждением вышесказанному может служить и тот факт, что обнаружена статистически достоверная взаимосвязь молекулы апоптоза (СО 95) с рецептором адгезии (1САМ 1) нарастание частоты экспрессии 1САМ 1 по мере увеличения экспресии СБ 95 с 37% до 55%, то есть, в полтора раза, р=0,001.

Ассоциации с другими иммунофенотипическими маркерами опухоли не отмечено

Таким образом, исследованная группа больных раком молочной железы Т21Ч1-ЗМ0 стадии по совокупности описанных иммунофенотипических характеристик обладает целым рядом прогностически неблагоприятных признаков: низкий уровень экспрессии молекул НЬА I и П классов, молекулы апоптоза СО 95, довольно высокий уровень экспрессии молекул 1САМ 1 и СО 71, а также низкая активность

туморинфильтрирующих лимфоцитов Впервые обнаружена достоверная корреляция экспрессий молекул CD 45, CD 71 и CD 95 с экспрессией молекулы ICAM 1

3. Экспрессия Pgp 170 при раке молочной железы T2N1-3M0 стадии. Связь с иммунофенотипом опухолевых клеток.

В нашей работе с целью обнаружения Р-гликопротеина использовалось моноклональное антитело UIC-2 Положительная экспрессия Pgpl70 выявлена у 37% больных

Антиген Pgp 170 был взаимосвязан с экспрессией ряда других молекул на мембране клеток рака молочной железы T2N1-3M0 стадии

Мономорфный тип реакции молекул HLA-I в подруппе Pgp 170 негативных больных обнаружен в 35% случаев (11/32) Аналогичный показатель для Pgp 170 - позитивных больных составил всего 14% (2/14) Иными словами, отчетливая мономорфная экспрессия HLA-I при Pgp 170 положительных опухолях встречается в 2 раза реже, р=0,24

Не наблюдалось статистической взаимосвязи экспрессии молекул Pgp 170 и HLA — II Однако, отчетливая пропорция мономорфно экспрессирующих HLA - П клеток в подгруппе Pgp 170 негативных больных составила 9% (3/32), в то время как для Pgp 170 позитивных больных этот же показатель равен нулю (0/14), р=0,12 Учитывая синхронность экспрессий молекул гистосовместимости HLA -1 и HLA — II, в данном случае можно предположить реализацию механизма антигенного упрощения опухоли в условиях формирования резистентных клонов по мере опухолевой прогрессии

Была проанализирована связь экспрессии молекул Pgp 170 с уровнями местной иммунной реакции в опухоли В подгруппе Pgp 170 негативных больных уровни CD 45+лимфоидной инфильтрации были примерно одинаковы В подгруппе же Pgp 170 позитивных больных отсутствие

лимфоидной инфильтрации отмечалось в 53% случаев (10/19), а выраженная инфильтрация наблюдалась у 36% больных (7/19)

Таким образом, не наблюдалось взаимосвязи между общим уровнем лимфоидной инфильтрации и экспрессией гена множественной лекарственной резистентности на клетках РМЖ Т2Ы1-ЗМО стадии

При сопоставлении клеточной экспрессии Р£р 170 с плазмоцитарной СО 38+ инфильтрацией опухоли не обнаружено статистически значимых различий, р=0,074, но тенденция к некоторому увеличению доли больных с отсутствием плазмоцитарной инфильтрации (16%, 3/19) в сравнении с подгруппой, положительной по Pgpl70, также сохраняется (аналогично результатам, полученным по экспрессии СО 45)

Таким образом, при оценке подгруппы Pgpl70 позитивных больных прослеживается тенденция к снижению уровня иммунокомпетентных клеток (СО 45 и СО 38)

Трансферриновый рецептор (РТФ) необходим для жизнедеятельности опухолевых клеток В нашем исследовании в подгруппе Р§р170 негативных больных, отсутствие антигена СО 71 обнаружено в 37% случаев (12/32), мономорфный же тип реакции встречался в 47% (15/32) В подгруппе больных, мономорфно экспрессирующих Pgpl70, доли больных с негативной или мономорфной экспрессией СО 71 составили соответственно 21% (3/14) и 72% (10/14)

Иными словами, пропорция СО 71 мономорфно экспрессирующих клеток в подруппе Р£р170 + больше в 1,5 раза Различия, однако, не были статистически значимыми, р=0,3

В исследовании не обнаружено значимых статистических ассоциаций при сопоставлении экспрессий Р§р170 и НМРО — 1 детерминант, р=0,72

Интересные данные получены при анализе взаимосвязи антигенов Р§р170 и СО 95 В подгруппе больных, экспрессирующих белок Р£р170, мономорфно представленных СО 95+ клеток в 1,5 раза меньше, чем в Рзр170 отрицательной подгруппе больных. 16% (3/19) и 25% (8/32),

соответственно. Различия статистически высокодостоверны, р=0,00012 Подобная взаимосвязь, хотя и представляется весьма очевидной, ранее не была описана. Логично предположить, что гибель клеток, не обладающих лекарственной резистентностью, осуществляется путем апоптоза, в том числе, СО 45 — опосредованно

Одной из главных причин ускользания опухоли от иммунологического надзора является отсутствие распознавания опухолевых клеток Т-лимфоцитами вследствие неадекватной презентации антигенов Это может происходить по разным причинам, в числе которых может быть недостаточная экспрессия таких лигандов как 1САМ 1, ЬРА 1, В 7

На клетках РМЖ молекула 1САМ 1 экспрессирована в 50% случаев [0§адуа, е1 а1,2002] В нашей работе этот показатель составил 41% (21/51)

В подгруппе больных, мономорфно экспрессирующих опухолевыми клетками Р§р170, наблюдалось троекратное увеличение пропорции 1САМ I - позитивных клеток в сравнении с подгруппой Р§р170 - негативных больных. 64% (9/14) и 28% (9/32), различия статистически достоверны, р = 0,014. Иными словами, лекарственная резистентность, обусловленная экспрессией Р%р 170, более характерна для высокодифференцированных опухолей, способных экспрессировать молекулы адгезии 1САМ1

При сопоставлении показателей Pgpl70 позитивной и Р§р170 негативной подгрупп выявлены следующие тенденции в Р§р170 позитивной подгруппе процент НЬА 1+, НЬА П+, СБ 71+, 1САМ 1+ (положительных) больных выше, а процент СО 95+ больных ниже, уровень же лимфоидной инфильтрации в подгруппе Pgpl70 позитивных больных, в целом, также несколько ниже

4. Связь экспрессии Рёр170 с клинико — морфологическими характеристиками больных раком молочной железы Т21У1-ЗМ0 стадии.

Была проанализирована взаимосвязь частоты экспрессии Pgp 170 с основными клинико-морфологическими факторами

Частота экспрессии Pgpl70 достоверно не зависела от возраста (р=0,2) и от менструального статуса больных (р=0,06) Напротив, частота экспрессии Pgpl70 достоверно зависела от гистологического строения опухоли, р=0,007 Показано, что процент долькового рака более чем в 1,5 раза выше в Pgpl70 позитивной подгруппе в сравнении с Pgpl70 негативной (37% и 22%, соответственно) В целом ряде работ показано, что дольковая форма рака молочной железы является в большей степени химиорезистентной, чем протоковая Возможно, наличие увеличенной экспрессии Pgpl70 в подгруппе инфильтративного долькового рака является одной из причин устойчивости больных к химиотерапии Несколько выше процент инфильтративного протокового рака в Pgpl70 негативной подгруппе (78%) относительно Pgpl70 позитивной (63%)

Обнаружено, что экспрессия Pgpl70 высокодостоверно взаимосвязана со степенью злокачественности опухоли, р=0,00006

В Pgpl70 негативной подгруппе вторая и третья степени злокачественности составляют 72% (23/32) и 28% (9/32), соответственно, а в Pgpl70 позитивной подгруппе вторая и третья степени злокачественности встречаются в 89% (17/19) и 11% (2/19) случаев, соответственно. То есть, мы видим достоверное увеличение пропорции больных со второй степенью злокачественности и уменьшение числа больных с третьей степенью злокачественности в Pgpl70 позитивной подгруппе в сравнении с Pgpl70 негативной подгруппой Степень злокачественности определяется по модифицированной схеме Bloom — Richardson (1957) по сумме баллов, полученных при оценке следующих параметров опухолевых клеток образование тубулярных и протоковоподобных структур, клеточный полиморфизм и число митозов Таким образом, опухоли со второй степенью злокачественности являются более дифференцированными, «зрелыми» и могут быть более резистентными по отношению к химиотерапии по сравнению с опухолями, имеющими 3 степень злокачественности и характеризуются большим пролиферативным потенциалом На основании

вышеизложенного, становится понятным наличие именно в Р{2р170 позитивной подгруппе увеличенной пропорции больных со 2 степенью злокачественности

Экспрессия Р§р170 достоверно не имела связи с размером опухоли молочной железы, р=0,92

Отмечена связь экспрессия Р§р170 (на грани достоверности) с количеством метастатически пораженных аксиллярных лимфоузлов, р=0,05 При отсутствии экспрессии Р§р170 метастазы в 1 лимфоузел, а также метастазы в двух и более лимфоузлах встречались одинаково часто и составили по 50% В то же время при положительной экспрессии Рцр! 70 метастазы в один лимфоузел наблюдались несколько реже (32%), а метастазы в двух и более лимфоузлах - несколько чаще (68%), что может быть обусловлено более «агрессивной природой» химиорезистентных опухолей

Экспрессия Р§р170 достоверно не зависела от наличия или отсутствия в опухолевой ткани рецепторов эстрогенов, р=0,44 и рецепторов прогестерона, р=0,139

Таким образом, сопоставление частоты экспрессии Р§р170 с клинико-морфологическими особенностями больных раком молочной железы Т2Ы1-ЗМО стадии показал независимость Рцр170 детерминанты от большинства изученных признаков Однако выявлено несколько очень важных, на наш взгляд, статистически важных ассоциаций экспрессии Pgpl70 с морфологическим вариантом опухоли, со степенью злокачественности, а также с количеством метастатически пораженных лимфоузлов, что может косвенно свидетельствовать об отрицательном прогностическом влиянии экспрессии гена множественной лекарственной резистентности при раке молочной железы Т2Ш-ЗМ0 стадии

5. Связь экспрессии Pgpl70 с результатами лечения у больных раком молочной железы Т2Ш-ЗМ0 стадии.

Из всей группы больных прогрессирование рака молочной железы отмечено в сроки от 2 до 45 месяцев у 14 пациенток (27%)

Многие авторы считают, что экспрессия гена множественной лекарственной резистентности (МОИ. 1) достоверно выше у больных с прогрессированием рака молочной железы, по сравнению с больными без прогрессирования основного заболевания (Н Ви^ег ег а1, 2003, Е X 1л е1 а1, 2002)

Проведен статистический анализ взаимосвязи частоты прогрессирования рака молочной железы в исследованной группе больных с экспрессией молекулы Р§р170 Обнаружено, что из всей группы больных с положительной экспрессией Рцр 170 прогрессирование РМЖ отмечено у 37% (7 случаев из 19), в то время как в Р§р170 негативной группе больных прогрессирование рака молочной железы наблюдалось только у 22% (7/32) женщин, то есть почти вдвое меньше, различия статистически достоверны, р=0,0026 (таблица №12)

Таким образом, экспрессия гена множественной лекарственной резистентности (МОЯ 1) достоверно выше у больных с прогрессированием рака молочной железы Т2И1 -ЗМ0 стадии

Таблица №12.

Взаимосвязь частоты прогрессирования рака молочной железы с экспрессией Pgpl70.

Категория больных Экспрессия Рур170- Экспрессия РБр170+ Итого

Без прогрессирования рака молочной железы 78 % (25) 63% (12) 37

Прогрессирование рака молочной железы 22% (7) 37% (7) 14

Итого 32 (100%) 19(100%) 51

Был проведен статистический анализ взаимосвязи степени злокачественности с частотой экспрессии продукта гена множественной лекарственной резистентности в группах больных как с прогрессированием, так и без прогрессирования рака молочной железы T2N1-3M0 стадии (таблицы №13,14)

С осторожностью оценивая полученные данные, можно заметить, что в группе больных с прогрессированием рака молочной железы, из 9 больных (64%, 9/14), имевших 2 степень злокачественности, положительная экспрессия Pgpl70 наблюдалась в 56% случаев (5/9) В группе же больных без прогрессирования заболевания аналогичный показатель составил 39% (12/31), то есть был в 1,4 раза меньше Таким образом, пропорция Pgpl70 позитивных больных со 2 степенью злокачественности больше именно в группе больных с прогрессированием заболевания, и, возможно, в данном случае экспрессия гена множественной лекарственной резистентности является маркером плохого прогноза для исследуемых больных

Таблица №13.

Взаимосвязь степени злокачественности опухоли с частотой экспрессии Pgpl70 в группе больных с прогрессированием рака молочной железы.

Степень злокачественности Больные с прогрессированием РМЖ(п=14)

Pgpl70 + Pgpl70-

2 степень злокачественности 56% (5/9) 44% (4/9)

3 степень злокачественности 40% (2/5) 60% (3/5)

р=0,57

Таблица №14.

Взаимосвязь степени злокачественности с частотой экспрессии Pgpl70 в группе больных без прогрессирования рака молочной железы.

Степень злокачественности Больные без прогрессирования РМЖ (п=37)

Р§р170 + РёР170-

2 степень злокачественности 39% (12/31) 61% (19/31)

3 степень злокачественности 0% (0/6) 100% (6/6)

р=0,00004

Еще более интересные данные получены при анализе подгрупп Р§р170 позитивных больных с 3 степенью злокачественности В группе больных с прогрессированием заболевания, имевших 3 степень злокачественности, экспрессия Р§р170 отмечена в 40% случаев, в то время как в группе больных без прогрессирования РМЖ экспрессии Pgpl70 при 3 степени злокачественности не установлено

Очевидно, интерпретация данных, полученных при анализе столь малых выборок, весьма спорна, тем не менее, мы можем предположить, что больные с 3 степенью злокачественности и положительной экспрессией Р§р170 имеют шанс (в 40% случаев, исходя из нашего исследования) появления отдаленных метастазов в ближайшие 45 месяцев

Прогрессирование рака молочной железы Т2Ш-ЗМ0 стадии в указанные сроки не отмечено у больных, получивших в адъювантном режиме 6 курсов полихимиотерапии по схеме СМБ Прогрессирование заболевания выявлено в эти же сроки у пациенток после использования антрациклин-содержащих схем Это, конечно же, не говорит о преимуществах схемы С МБ, а объясняется лишь тем, что мономорфная реакция Рцр 170 встречалась только в подгруппе больных, получивших в адъювантном режиме антрациклин-содержащие схемы терапии. В группе же

пациенток, лечившихся по схеме С МБ, не отмечено ни мозаичной, ни мономорфной реакций Р§р170

В нашем исследовании больные с экспрессией Р§р170 получали антрациклин-содержащие схемы Взаимосвязь обнаруженной нами ассоциации прогрессирования рака молочной железы в сроки до 45 месяцев после радикальной операции с экспрессией Р§р170 открывает возможности идентификации прогностически неблагоприятной группы больных на основе экспрессии Р§р170 на этапе до назначения адъювантной химиотерапии

31

Выводы:

1 Экспрессия продукта гена множественной лекарственной устойчивости МОШ/Р§р 170 на клетках рака молочной железы Т2Ш-ЗМ0 наблюдается в 37% случаев и не имеет прямой ассоциации со стандартными- клиническими и морфологическими факторами прогноза

2 Рак молочной железы Т2Ш-ЗМ0 имеет ряд иммунофенотипических особенностей низкая частота экспрессии мономорфных детерминант НЬА I и II классов, рецептора алоптоза, отсутствие, выраженной лимфоидной инфильтрации, высокая экспрессия трансферринового рецептора

3 Экспрессия С071, С095 и уровень лимфоидной инфильтрации достоверно взаимосвязаны с наличием на опухоли молекулы 1САМ 1 при раке молочной железы Т2Ы1-ЗМО

4 Pgpl70 - позитивная группа больных раком молочной железы не имеет иммунофенотипических особенностей экспрессии молекул НЬА-1, НЬЛ-ОЯ, СО 71, МиС-1, инфильтрации лимфоцитами (С045+) и плазмоцитами (С038+) Отмечается обратная корреляция экспрессии Pgpl70 с экспрессией рецептора алоптоза СО 95, и прямая -сЮАМ 1

5 Экспрессия Pgpl70 не ассоциирована с возрастом больных, менструальным и рецепторным статусом, однако достоверно чаще наблюдается при инфильтративном дольковом раке, 2 степени злокачественности и метастатическом поражении нескольких лимфатических узлов.

6 При наличии на опухолевых клетках молекулы Р§р170 и проведении адъювантной полихимиотерапии по схеме САР отмечается достоверно большая частота прогрессирования в течение первых 45 месяцев по сравнению с группой Pgpl70 негативных случаев (р=0,003)

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1 «Значение экспрессии гена множественной лекарственной резистентности у больных раком молочной железы» Енгай Д А, Поддубная И В , Тупицын Н Н. Врач 2007 №12 С 75

2 «Особенности иммунофенотипа клеток рака молочной железы ПЬ стадии» Енгай Д А, Поддубная И В , Тупицын Н Н

Сибирский онкологический журнал, 2007 №4(24) С 66-69

Актуальность темы исследования. Рак молочной железы - одно из самых распространенных онкологических заболеваний у женщин. Статистические данные последних лег свидетельствуют о неуклонном, интенсивном росте заболеваемости и смертности от рака молочной железы, несмотря на значительный прогресс в лечении заболевания, достигнутый в результате совершенствования хирургических и лекарственных методов. Около 40% женщин, поступающих в стационары, - это больные с распространенным раком молочной железы. Лечение данной категории пациенток очень сложно. В связи с этим не теряет своей актуальности разработка новых подходов к общему прогнозу заболевания и выбору наиболее адекватных схем лечения для каждой больной. В последние годы большое внимание в этой области уделяется различным молекулярным и клеточным маркерам, характеризующим фундаментальные биологические свойства опухоли. Тем не менее, из-за большого числа потенциально значимых молекулярно-биологических факторов и из-за больших расхождений представленных в литературе данных об их прогностической ценности, выбор определенного типа терапии, основанный на биологических характеристиках опухоли, остается затруднительным и неопределенным для врача. Многие исследователи вообще довольно скептически относятся к возможностям практического использования этих параметров в настоящее время из-за существующей во многих западных странах тенденции к повсеместному применению адъювантной терапии. Тем не менее, по крайней мере, в трех ситуациях прогностические факторы могут быть полезны: во-первых, для выявления пациентов с очень хорошим прогнозом, для которых осложнения и стоимость лечения не будут оправданы имеющимся риском рецидива; во-вторых, для выявления группы больных с очень плохим прогнозом, которым требуется более агрессивное адъювантное лечение, и. в-третьих, для определения чувствительности или резистентности больных к конкретным видам терапии.

Кроме того, на основании исследования молекулярно-биологических особенностей опухоли может быть создана новая стратегия лечения, непосредственно влияющая на определенные молекулы и процессы. Знание специфических биологических характеристик опухоли может помочь и в усовершенствовании существующих схем терапии, и в развитии новых подходов к лечению, основанных, например, на иммунотерапии, генной терапии или на модификации системы передачи регуляторных сигналов в клетке.

В течение последних 30-ти лет ведутся активные исследования множественной лекарственной устойчивости (МЛУ).

Множественная лекарственная устойчивость - это >• невосприимчивость популяции клеток опухоли одновременно к целому ряду химиотерапевтических препаратов разного химического строения и с разным механизмом действия на клетку. МЛУ представляет собой серьезное препятствие на пути успешного лечения злокачественных новообразований. Исследования последних лет показали, что молекулярные механизмы МЛУ множественны и лекарственная устойчивость клетки может определяться включением различных механизмов, характеризующих разные этапы осуществления токсического действия химиопрепарата на клетку - от ограничения накопления лекарства внутри клетки до отмены программы гибели клетки, индуцируемой веществом. Нередко в клетке включается несколько защитных механизмов, однако чаще всего преобладает какой-то один механизм. Наиболее изученными механизмами, чья клиническая значимость при некоторых формах новообразований выявлена, являются активация трансмембранных транспортных белков, выводящих различные вещества из клетки (к ним принадлежит Р-гликопротеин); активация ферментов системы глутатиона, детоксифицирущей препараты; изменения генов и белков, контролирующих апоптоз и выживаемость клетки (в первую очередь р53 и Bcl-2), [А.А.Ставровская, 2000].

Р-гликопротеин (Pgp 170), продукт гена множественной лекарственной устойчивости (MDR1), наряду с другими онкогенами, супрессорными генами и секреторными белками, рассматривается в последнее время как потенциальная мишень для новых схем противоопухолевой терапии, направленных на преодоление МЛУ (Peer D. et. al., 2004; Jin J. et aL 2005).

Несмотря на довольно значительное количество иммунофенотипических и клинических исследований Р-гликопротеина при раке молочной железы (Trock В. J. et al., 1997), однозначного ответа на вопрос о роли Pgp 170 у больных этим злокачественным новообразованием не получено. По-прежпему остается актуальной оценка иммунофенотипической, клинико-морфологической и, в конечном счете, прогностической роли экспрессии Р-гликопротеина, кодируемого геном множественной лекарственной резистентности, в опухолях больных местнораспространенным раком молочной железы.

ЦЕЛЬ: Определение клинико-иммунологических параметров Pgp 170-позитивного рака молочной железы T2N1-3M0 стадии - для выбора оптимальной тактики адьювантного лечения.

ЗАДАЧИ.

1. Определение иммуногистохимическим методом экспрессии белка Р-гликопротеина (продукта гена множественной лекарственной резистентности) на клетках опухолей больных раком молочной железы T2N1-3M0 стадии.

2. Определение особенностей иммунофенотипа клеток рака молочной железы T2N1-3M0 стадии.

3. Проанализировать взаимосвязь экспрессии Р-гликопротеина с клинико-морфологическими характеристиками больных раком молочной железы T2N1-3M0 стадии.

4. Проанализировать взаимосвязь экспрессии Р-гликопротеина с результатами адьювантного лечения в исследованной группе больных.

Научная новизна: Впервые определены особенности иммунофенотипа клеток рака молочной железы T2N1-3M0 стадии. На клетках первичной опухоли изучена экспрессия гена множественной лекарственной резистентности (MDR1) с помощью иммуногистохимического метода. Исследована взаимосвязь иммунофенотипа клеток рака иголочной железы T2N1-3M0 стадии с основными клинико-морфологическими признаками, с результатами лечения, а также с экспрессией гена множественной лекарственной резистентности.

Показано, что больные раком молочной железы стадии T2N1-3M0 в изученной группе имеют целый ряд традиционно неблагоприятных прогностических признаков: молодой возраст (43%), сохранная менструальная функция (63%), преобладание инфильтрирующих гистологических вариантов опухолей (84%), наличие 3 степени злокачественности в 22 % случаев, большой размер (>3см) опухолевого узла (55%), наличие метастазов в 6-10 аксиллярных лимфоузлах (26%) и, наконец, отрицательный рецепторный статус РЭ-РГ1- (51%).

Иммунофенотип клеток рака молочной железы T2N1-3M0 стадии также характеризуется целым рядом прогностически неблагоприятных признаков: низкий уровень экспрессии молекул HLA I и II классов, молекулы апоптоза CD 95, довольно высокий уровень экспрессии молекул CD 54 и CD 71, а также низкое количество туморинфильтрирующих лимфоцитов. Впервые обнаружена достоверная корреляция экспрессии молекул CD 45, CD 71 и CD 95 с экспрессией молекулы CD 54, что может указывать на довольно высокий метастатический по тенциал исследованных клеток.

При исследовании экспрессии PgpL70 впервые обнаружена высокодостоверная корреляция с молетсулой апоитоза (CD 95) и достоверная ассоциация с молекулой адгезии (CD 54/ICAM - 1).

Анализ взаимосвязи частот!,i экспрессии Pgpl70 с клинико-морфологическими особенностями опухолевых клеток у больных раком молочной железы T2N1-3M0 стадии показал независимость Pgpl70 детерминанты от большинства изученных признаков. Однако выявлено несколько очень важных, на наш взгляд, статистически значимых ассоциаций экспрессии Pgpl70: с морфологическим вариантом опухоли, со степенью злокачественности, а также с количеством метастатически пораженных лимфоузлов, что может косвенно свидетельствовать о сильном отрицательном прогностическом блеянии экспрессии гена множественной лекарственной резистентности при раке молочной железы T2N1-3M0 стадии.

Не выявлено каких-либо особенностей экспрессии гена множественной лекарственной резистентности MDRl/Pgp 170 у больных раком молочной железы T2N1-3M0 стадии, связанных с объемом операции, послеоперационной лучевой и гормональной терапией.

Выявлена статистически достоверная ассоциация экспрессии гена MDRl/Pgp 170 с прогрессировавшем рака молочной железы T2N1-3M0 стадии в первые 45 месяцев, а также с адъювантной полихимиотерапией. Получено весьма важное, на наш взгляд, наблюдение: прогрессирование РМЖ отмечено только на антрациклинсодержащих схемах по сравнению со схемой CMF.

Практическая значимость.

Определение иммунофенотипа клеток рака молочной железы T2N1-ЗМО стадии у больных с прогностически неблагоприятными клинико-морфологическими признаками позволит оптимизировать адьювантную терапию у данной категории пациенток.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. I

3.1. Клинико-морфологическая характеристика и результаты лечения больных раком молочной железы T2N1-3M0 стадии.

Изучены данные 51 больной раком молочной железы T2N1-3M0 стадии. Лечение пациенток проведено в различных отделениях РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН в 2002году.

Представляется актуальным изучение особенностей рака молочной железы T2N1-3M0, поскольку на-сегодняшний день вопросы по тактике лечения, подбору оптимальной схемы химиотерапии . и преодолению лекарственной резистентности именно для данной категории пациенток остаются во многом спорными. .

Тем не менее, не всегда удается предсказать течение болезни с помощью * «классических» факторов прогноза. Возможно, совокупность именно молекулярно-биологических. маркеров опухоли позволит более адекватно прогнозировать течение заболевания и, вследствие этого, индивидуализировать тактику лечения больных раком молочной железы T2N1-3M0 стадии.

В нашей работе для попытки изучения биологических свойств опухолевых клеток все исследованные пациентки были разделены на 2 группы с учетом стандартных (общеизвестных) прогностических факторов: больные.без.прогрессирования рака молочной железы в течение первых 45 месяцев и больные с прогрессированием заболевания в течение этого же срока.

Обнаружено, что . в исследуемой : группе больных частота прогрессирования не зависит от морфологического варианта опухоли (таблица№12).

Зависимость частоты прогрессирования рака молочной железы от морфологического варианта опухоли.

Категория больных Морфологический вариант опухоли Итого инфильтративный протоковый инфильтративный дольковый другой

Без прогрессирования РМЖ 22 59,5% 8 21,6% 7 18,9% 37 100%

Прогрессирование РМЖ 9 64,3% 4 28,6% 1 7,1% 14 100%

Итого 31 60,8% 12 23,5% 8 15,7% 51 100% р=0,49 (метод Пирсона)

Как известно, 3 степень злокачественности значимо ухудшает прогноз больных раком молочной железы. В нашей работе в группе больных с прогрессированием заболевания 3 степень злокачественности встретилась в 36% случаев (5/14), в то время как в группе больных без прогрессирования заболевания аналогичный показатель составил 16% (6/37), то есть уменьшился более чем в 2 раза (таблица №13).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Проведено одномоментеное проспективное исследование 51 больной раком молочной железы T2N1-3M0 стадии, лечившихся в различных отделениях РОЩ им. Н.Н.Блохина РАМН в 2002г.

Определены клинико-иммунологические особенности клеток Pgp 170 позитивного рака молочной железы T2N1-3M0 стадии. На клетках первичной опухоли изучена экспрессия продукта гена множественной лекарственной резистентности (MDR1) с помощью иммуногистохимического метода. Экспрессия продукта гена MDR1 -Pgpl70 - обнаружена у 37% больных (19/51) с помощью моноклонального антитела UIC - 2. Исследована взаимосвязь иммунофенотипа клеток рака молочной железы T2N1-3M0 стадии с основными клинико-морфологическими признаками, с проведенным лечением, а также с экспрессией гена множественной лекарственной резистентности.

Показано, что больные РМЖ исследованной группы имеют.целый ряд традиционно> неблагоприятных прогностических признаков: молодой возраст (43%), сохранная менструальная функция (63%), преобладание инфильтрирующих гистологических вариантов опухолей (84%), наличие 3 степени злокачественности в 22 % случаев, большой размер (>3см) опухолевого узла (55%), наличие метастазов в 6-10 аксиллярных лимфоузлах (26%) и, наконец, отрицательный рецепторный статус РЭ-РП-(51%).

Для изучения биологических свойств опухолевых клеток все исследованные пациентки были разделены на 2 группы с учетом стандартных (общеизвестных) прогностических факторов: больные без прогрессирования рака молочной железы в течение первых 45 месяцев и больные с прогрессированием заболевания в течение этого же срока.

Оказалось, что в исследованной группе больных раком молочной железы T2N1-3M0 стадии частота прогрессирования не зависела от

117 большинства клинико-морфологических признаков: от морфологического варианта опухоли (р=0,49), от степени злокачественности (р=0,13), от размера опухолевого узла (р=0,43), от количества метастатически пораженных лимфоузлов (р=0,13) и, наконец, от стероидного статуса опухоли (р=0,19).

Обнаружено, что иммунофенотип клеток у больных раком молочной железы T2N1-3M0 стадии характеризуется целым рядом прогностически неблагоприятных признаков. При исследовании экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости HLA I класса мономорфный тип реакции отмечен в в 31% (16/51) случаев, мозаичный - в 12% (6/51) случаев и отсутствие экспрессии антигена отмечено в 57% (29/51) наблюдений. Для молекул HLA II класса: мономорфный тип реакции отмечен в 10% (5/51) случаев, мозаичный - 14% (7/51) случаев и отсутствие экспрессии антигена отмечено в 76% (39/51) наблюдений. При исследовании экспрессии молекулы апоптоза CD 95 мономорфный» тип реакции отмечен в небольшом проценте случаев - 22% (11/51), отсутствие реакции наблюдалось в 78%

40/51) случаев и мозаичная реакция отсутствовала. Только мозаичный тип реакции был отмечен в 41% (21/51) случаев при рассмотрении экспрессии молекул адгезии CD 54, обнаруженных с помощью МКА My 13 (ICAM-1), мономорфный тип реакции не наблюдался вовсе и полностью отсутствовала экспрессия антигена в 59% (30/51) наблюдений. При изучении уровня экспрессии рецептора трансферрина CD 71 были получены следующие данные: мономорфный тип реакции отмечен в 53% (27/51) случаев, мозаичный тип реакции — в 16% (8/51) случаев и отсутствие реакции — в

31% (16/51) наблюдений. В целом наблюдалась низкая активность туморинфильтрирующих лимфоцитов: в случае с CD 45 преобладала минимальная реакция с наличием лишь единичных клеток в срезах - 45%

23/51), в 39% (20/51) отмечалась выраженная инфильтрация, реже всего наблюдалась умеренная инфильтрация - 16% (8/51). Количество плазмоцитов (CD 38+) в срезах рака молочной железы в большинстве

118 случаев (72%, 37/51) было умеренным, в 20% (10 случаев из 51) -выраженным и в 8% (4/51) случаев - минимальным.

При исследовании корреляционных связей между изученными иммунофенотипическими маркерами получены весьма интересные данные. Экспрессия молекул HLA-DR наблюдалась в абсолютном большинстве случаев при наличии на мембране клеток рака молочной железы антигенов HLA-I (р=0,0003). Экспрессия молекул HLA-I на опухолевых клетках была достоверно связана (положительная умеренная ассоциация) с уровнями лимфоидной инфильтрации рака молочной железы (CD 45), р=0,003. Аналогичная ситуация отмечена для CD 38+ плазмоцитов: при отсутствии экспрессии HLA-I выраженная плазмоцитарная инфильтрация (CD 38+) обнаружена в 7% случаев, а при мономорфной реакции HLA-I доля CD 38 позитивных клеток возрастает до 44%, т.е. более чем в 6 раз, р=0,017. Наблюдалась достоверная, взаимосвязь между уровнями лимфоидной (CD 45) и плазмоцитарной (CD* 38) инфильтрации, р=0,0009. Обнаружена достоверная корреляция экспрессии антигена HLA—II с уровнем плазмоцитарной инфильтрации (CD 38), р=0,001. Обнаружена невысокая достоверная взаимосвязь лимфоидной инфильтрации (CD 45) с экспрессией молекулы адгезии My 13 (ICAM 1), р=0,04. Отмечена статистически значимая корреляция экспрессии рецептора трансферрина CD 71 с молекулой адгезии ICAM 1, р=0,007. Аналогичным образом обнаружена статистически достоверная взаимосвязь молекулы апоптоза (CD 95) с рецептором адгезии (ICAM 1), р=0,001.

При исследовании частоты экспрессии антигенов Pgp 170 и CD 95 обнаружены интересные корреляции. В подгруппе больных, положительно реагирующих с детерминантой устойчивости Pgp 170, мономорфно представленных CD 95+ клеток в 1,5 раза меньше, чем в Pgp 170 отрицательной подгруппе больных: 16% (3/19) и 25% (8/32), соответственно. Различия статистически высоко достоверны, р = 0,00012.

При сопоставлении экспрессии молекулы Pgp 170 с

119 экспрессией молекулы My 13 (ICAM 1) также наблюдалась положительная корреляция, р = 0,014.

Анализ взаимосвязи частоты экспрессии Pgp 170 с клинико-морфологическими особенностями больных раком молочной железы T2N1-ЗМО стадии показал независимость Pgp 170 детерминанты от большинства изученных признаков. Однако, выявлено несколько статистически значимых ассоциаций экспрессии Pgp 170: с морфологическим вариантом опухоли (р=0,007); со степенью злокачественности (р=0,00006), а также с количеством метастатически пораженных лимфоузлов (р=0,05), что может косвенно свидетельствовать о сильном отрицательном прогностическом влиянии экспрессии гена множественной лекарственной резистентности при раке молочной железы T2N1-3M0 стадии.

Не выявлено каких-либо особенностей экспрессии гена множественной лекарственной резистентности MDRl/Pgp 170 у больных раком молочной > железьг T2N1-3M0 стадии в связи с объемом операции, послеоперационной лучевой и гормональной терапией:

Выявлена статистически достоверная ассоциация экспрессии* гена MDRl/Pgp 170 с прогрессированием рака молочной железы T2N1-3M0 стадии в первые 45 месяцев (р = 0,0026), а также с адъювантной полихимиотерапией (р = 0,05). Получено весьма важное, на наш взгляд, наблюдение: повышенная экспрессия Pgp 170 отмечена при прогрессировании на антрациклинсодержащих схемах.

Таким образом, иммунофенотип клеток больных молочной железы T2N1-3M0 стадии характеризуется целым рядом прогностически неблагоприятных признаков, взаимосвязанных как между собой, так и с клинико-морфологическими характеристиками, имеющими, также отрицательное прогностическое значение, и, в конечном счете, определяющие высокую частоту прогрессирования (27%) и короткую безрецидивную выживаемость (менее 45 месяцев).

Дальнейшие, более углубленные, исследования

120 иммунофенотипа рака молочной железы позволят в будущем оптимизировать схемы адьювантного лечения больных изученной нозологии.

Экспрессия продукта гена множественной лекарственной устойчивости MDRl/Pgp 170 на клетках рака молочной железы T2N1-3M0 стадии наблюдается в 37% случаев и не имеет прямой ассоциации со стандартными клиническими и морфологическими факторами прогноза. Рак молочной железы T2N1-3M0 стадии имеет ряд иммунофенотипических особенностей: низкая частота экспрессии мономорфных детерминант HLA I и II классов, рецептора Fas/APO 1, отсутствие, как правило, выраженной лимфоидной инфильтрации, высокая экспрессия трансферринового рецептора.

Экспрессия CD 71, CD 95 и уровни лимфоидной инфильтрации рака молочной железы T2N1-3M0 стадии достоверно взаимосвязаны с наличием на опухоли молекулы ICAM 1.

Pgp 170 - позитивная группа больных раком молочной железы не имеет стандартных иммунофенотипических особенностей экспрессии молекул HLA-I, HLA-DR, CD 71, MUC-1, инфильтрации лимфоцитами CD 45+ и плазмоцитами CD 38+. Отмечается обратная корреляция экспрессии Pgp 170 с экспрессией рецептора апоптоза CD 95, и прямая - с ICAM 1.

Экспрессия Pgp 170 не ассоциирована с возрастом больных, менструальным и рецепторным статусом, однако достоверно чаще наблюдается при инфильтративном дольковом раке, 2 степени злокачественности и метастатическом поражении нескольких лимфатических узлов.

При наличии на опухолевых клетках молекулы Pgp 170 и проведении адъювантной полихимиотерапии по схеме CAF отмечается достоверно большая частота прогрессирования в течение первых 45 месяцев по сравнению с группой Pgp 170 негативных случаев.