Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунохимическая характеристика структуры популяции специфических IgG и секретирующих их антителообразующих клеток в динамике инфекционного процесса (модель: экспериментальный грипп)

■.ц О 3 94 .

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ

На правах рукописи

ДУХИН Андрей Ильич

УДК 616.98i578.832.U-092.9-078.33

ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТРУКТУРЫ ПОПУЛЯЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ¡ев и СЕКРЕТИРУЮЩИХ ИХ АНТИТЕЛ ООБРАЗУЮЩИХ КЛЕТОК В ДИНАМИКЕ ИНФЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА (МОДЕЛЬ) ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ГРИПП)

140036 - аллергология п иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 199»

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Р.Я.Поляк кандидат медицинских наук Б.Л.Вонцеховским

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, А.Б.Жебрун доктор медицинских наук, профессор И.С.Фрейдлин

Ведущее учреждение - Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Л.Ппстера

Защити диссертации состоится . 1992 г. в У-^. час

на заседании специализированного совета Д 001.23.02 Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Паилова, д. 12).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ зксперимен тальной медицины РАМН.

Автореферат разослан . . 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор медицинских паук

ТТ Г. Назаров

- • А- '

и1"^ктуальность работы. Несмотря на многочисленные исследования и значительный объем накопленного фактического материала проблема анализа гуморального звена противовирусного иммунитета остается актуальной, как в плане изучения механизмов действия факторов защиты, так и в плане получения корректного прогпоза заболевания [Ada G.L.,Jones P.D.,1986].

Причины этого связаны с радом аспектов, одним из которых является низкая информативность усредненных показателей, традиционно используемых в прикладной иммунологии при оценке состояния гуморального звена иммунитета [Поляк Р.Я. и др., 1987; Марчук Г.И. и др.,1938]. Современные представления о свойствах популяции антител, определяемых клональнон структурой [Jerne,1955; Burnet, 1959] и колебательным характером функционирования антителопродуцентов [Macario A.J.L., Conway de Macario-Е., 1973], предполагают необходимость детального исследования этой популяции, учитывающего гетерогенность антител по аффинитету.

Становление гуморального звена иммунитета при вирусных инфекциях включает как синтез различных субпопуляций антител, так и их элиминацию в ходе взаимодействия с антигенами репродуцирующегося возбудителя [Dintzis U.M., Dintzis R.Z., 1988]. При этом наличие значительных количеств вирусных антигенов в крови или в тканях, длительное присутствие которых характерно для вирусной патологии [Дубровина Т.Я. и др. ' I9S6-91; Леонтьева Г.Ф.,1987; Иванова И.Л. и др.,19к9], не только снижает уровень циркулирующих антител, но и оказывает существенное влияние на структуру их популяции [Глинн Л., Стыоард М.,1983; Мерингова Л.Ф. и др., 1989]. Таким образом, характеристика лишь популяции свободно циркулирующих антител может не в полной мере отражать становление гуморального звена иммунного ответа и приводить к ошибочным заключениям о роли специфических иммуноглобулинов (Ig) в патогенезе вирусной инфекции.

В настоящее время становится ясным, что дл>1 получения адекватных оценок функционирования механизмов противовирусного иммунитета необходимо выполнение комплексных исследований различных звеньев иммунного ответа в динамике их становления [Поляк Р.Я. и flp.,I9S6; Петров Р.В.,1988]. Однако, возможность сопоставления получаемых показателей определяется заложенными в основу применяемых методов принципами [Войцеховский Б.Л. и др., 1989]. Только в том случае, когда методч базируются на строго определенных физикотхимических критериях может быть обеспечена универсальность сопоставления.

Все вышесказанное обусловливает актуальность совершенствования' методических подходов анализа гуморального звена иммунного отпета при вирусной патологии.

Базой для получения адекватных оценок роли антител (AT) и механизмов реализации их функций в патогенезе вирусных инфекций, могут стать методы исследования гетерогенной популяции специфических Ig, непосредственно продуцируемых В-клетками, основанные на таких определенных физико-химических понятиях, как аффинитет и концентрация.

Методические подходы анализа количества и аффинитета АТ, секре-тируемых антителообразующими клетками (АОК), были предложены в работах Ерне [Jeme N.K., et al.,1974). Их непосредственное применение для исследования гуморального звена иммунитета при вирусной инфекции сталкивается с рядом проблем, что и обусловило необходимость разработки новой технологии исследования, базирующейся на современных методах иммунохимии, математического моделирования и обработки результатов измерений. Созданию такой технологии и анализу с ее помощью гуморального звена иммунного ответа при экспериментальной гриппозной инфекции посвящена данная работа.

Цель и задачи работы. Основная цель работы заключалась в разработке методических приемов детального исследования гуморального звена иммунного ответа при вирусной инфекции, базирующихся на иммунохимическом анализе гетерогенной популяции IgG-секретирующих антителообразующих клеток (IgG-AOK) и продуцируемых ими антител.

Были определены следующие задачи:'

1. Оптимизировать этапы иммунохимического анализа специфических АОК и секретируемых ими антивирусных IgG.

2. Разработать алгоритмы оценки резул ьтатов эксперимента с реализацией их в виде соответствующего программного обеспечения, позволяющие осуществлять автоматический сбор и анализ экспериментальных данных.

3. Разработать математическую модель процесса секреции АТ отдельными антителопродуцентами в условиях эксперимента, позволяющую оценить гетерогенность популяции IgG-AOK, на основании анализа их продуктивности и аффинитета секретируемых АТ.

4. Используя разработанные принципы исследовать динамику формирования гуморального звена иммунного ответа при развитии гриппозно» инфекции различной тяжести. При этом изучить изменение количеств;! вирусспецифических IgG-AOK в пуле спленоцитов инфицированных мышей, структуру популяции этих АОК, их клональный спектр и продуктивность в сопоставлении с данными традиционого вирусологического i иммунологического анализа.

Научная новизна. Создана высокочувствительная и воспроизводима! автоматизированная технология исследования популяции специфически) IgG-AOK и секретируемых ими АТ.

Впервые осуществлена автоматизация этапа сбора и анализа результа тов определения АОК, реализованная в виде пакета прикладных nporpaMs на базе лазерного денситометра и персональной ЭВМ типа IBM-PC-AT.

. Впервые предложена математическая модель процессов, лежащих j основе разработанного метода исследования антителопродуцентов, поз во ляющая оценить продуктивность индивидуальных IgG-AOK и аффините секретируемых ими АТ.

С помощью созданного метода охарактеризована динамика формирования гуморального звена иммунного зтвета при экспериментальном гриппе у мышей:

- у интактных животных обнаружено предсуществование специфических ^О-секретирующих антителопродуцентов с низкой функциональной активностью;

- впервые описаны изменения в структуре популяции ^в-АОК, происходящие уже на ранних сроках инфекционного процесса (2-3 сутки) одновременно с появлением специфических ^б-содержащих иммунных комплексов и предшествующие появлению специфических 1цО в циркуляции;

- вперпые исследованы клопальный спектр 1дО-лОК и их продуктивность в динамике гриппозной инфекции. Показан колебательный характер изменения клональной структуры ^в-АОК и увеличение продуктивности АОК внутри клона;

- установлено, что в иммунном ответе принимает участие ограниченное количество клонов вирусспецифических ^в-АОК, а их распределение по аффинитету имеет дискретный спектр;

- описаны особенности формирования гуморального звена при гриппозной инфекции различной тяжести.

Получено экспериментальное подтверждение недостаточной информативности усредненных показателей количества специфических ^С-АОК и уровня циркулирующих в крови ^С-АТ для оценки их роли в патогенезе вирусной инфекции.

Теоретическое значение рпботы состоит в развитии представлений о механизмах формирования гуморального звена иммунного ответа и роли вирусспецифических в патогенезе вирусной инфекции, а также обосновании соответствующей методологии исследования гуморальных эффекторов.

Практическая ценность рпботы, Работа носит в основном теоретический характер. Ее прикладной аспект связан с созданием способа комплексного исследования вирусспецифических антителопродуцентов, включающего оценку количества 1кС-АОК и их индивидуальной функциональной активности, выражаемой в количестве и качестве секретируемых АТ. Метод был использован при разработке эксперименталыю-математиче-ско модели прогнозирования исхода вирусной инфекции п оценке перспективных препаратов антивирусного действия (совместно с сотрудниками Отдела вычислительной математики АН СССР, Одесского института эпидемиологии и вирусологии им. И.И.Мечникова и Проблемной лаборатории Оренбургского мединститута). На разработанный метод получено авторское свидетельство N 4670592/30-14(047405)

1. Разработан адаптированный к модельной гриппозной инфекции метод исследования вирусспецифических антителопродуценгов, включающий

оценку количества ^О-АОК и их индивидуальной функциональной активности, выражаемой я интенсивности секреции и качестве продуцируемых антител.

2. Предложена математическая модель процессов, лежащих в основе разработаного метода исследования антителопродуцентов, позволяющая оценить продуктивность ^С-АОК и аффинитет секретируемых ими АТ.

3. Разработаны и реализованы в виде пакета прикладных программ алгоритмы оценки результатов эксперимента, обеспечивающие автоматический сбор и анализ экспериментальных данных.

4. Применение разработанной методической базы позволило получить новую информацию о динамикестановления гуморального звена иммунного ответа при экспериментальном гриппе разной тяжести:

- обнаружены изменения популяции [еб-АОК в динамике гриппозной инфекции, не связанные с увеличением их общего количества и зависимые от заражающей дозы вируса;

- выявлен колебательный характер изменений структуры популяции 1цО-АОК в динамике гриппозной инфекции и дискретность распределения вирусспецифических 1£С-ЛТ по аффинитету.

Апробация диссертационного материала. Материалы диссертации доложены на Международном рабочем совещании "Математическое моделирование в иммунологии и медицине" (Киев, 1989); на Всесоюзном симпозиуме "Новые подходы к химиотерапии вирусных инфекций" (Рига, 1989); на заседаниях Ленинградского научного общества иммунологов в 1989 и 1990 г.г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ и получено авторское свидетельство на изобретение.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, глава, посвященная материалам и методам исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, указатель литературы. Работа иллюстрирована 22 рисунками и 5 таблицами. Список литературы включает работ, из них УЛ отечественных и

иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

Использовали вирус гриппа A/PR/8/34 (H1N1) и вирус гриппа D/Ле-шшград/86, накапливаемые в развивающихся куриных эмбрионах.

Эксперименты выполнены на мышах самцах гибридах первого поколения - Fl (СВА х С57В1аск) массой 16-18 г.

J

Пул клеток селезенки получали по общепринятой методике и культивировали о модифицированной среде с добавками [Мещерякова с соавт., 1979].

Тени эритроцитов барана получали по Dodge J.T. et al [1963].

Для проведения иммуноферментного анализа (ИФА) вирус гриппа А очищали оталлантоисных белков в градиенте плотности сахарозы [Методы вирусологии и мол. биологии, 1972].

Экспериментальную гриппозную инфекцию моделировали интрана-зальным заражением мышей под легким эфирным наркозом сублетальнымн (3,0-4,0 Ig ЭИД50) и летальными (6,0-7,0 Ig ЭИД50) дозами вируса гриппа A/PR/8/34 (Н INI), Летальность учитывали в течении 14 дней в группе из 20 животных.

Все исследования в динамике инфекции проводили в течении 21 дня при нелетальной форме и в течении 7 дней - при летальной. Инфекционную активность вируса гриппа в легких мышей определяли общепринятым методом титрования вируссодержащего материала на развивающихся куриных эмбрионах. Содержание суммарного вирусного антигена (АГ) определяли методом "иммунодот" в модификации Ивановой И.А- и соапт. [1989] .

Определение вирусспецифических IgG и IgO-содержащих иммунных комплексов (IgO-ИК) в сыворотке инфицированных животных и кажущейся константы диссоциации (Кд) реакции АГ - AT осуществляли в ИФА в модификациях Меринговой Л.Ф. [1988-1990] и при ее участии. Расчет Кд и оценку распределения вирусспецифических IgO по аффинитету производили с помощью программы "ImmunoAssay'1 <R) [Войцеховский Б.Л. (Copyright (С) 1990,1991)].

Определение вирусспецифических IgO-AOK осуществляли по Moller S.A., Borrebaeck C.A.K. [1985] в нашей модификации (подробнее - см. раздел "Результаты собственных исследований и обсуждение"). При определении количества специфических IgO-AOK полученные после выполнения иммунохимической части нитроцеллюлозные фильтры (НЦФ) (Mlllipore) подвергали двумерному сканированию на лазерном денситометре "Ultroscan XL" (LKB) с передачей данных на компьютер IBM-PC-AT й последующей обработкой результатов с помощью пакета программ "OSXL", прилагаемому к денситометру. Дальнейшие процедуры с данными описаны о разделе "Результаты собственных исследований и обсуждение" и реализованы в виде пакета программ "АРС" (AntlbodyjProduclna Cells) [Духин А.И. il др.,1991].

Математическую обработку результатов экспериментов проводили на компьютере IBM PC AT с помощью пакета прикладных программ "ImmunoAssay" . Для первичной обработки н фильтрации данных исполь-

- определение вирусных АГбылп проведено м.н.с. лаборатории молекулярной вирусологии НИИЭМ РАМН И.А.ИнановоЙ.

G

зовали алгоритмы дисперсионного анализа [Ашмарнн И.П.,1979]. В части экспериментов достоверность полученных результатов оценивалась по ь крнтсрию Стыодента [Лакин Г.Ф.,1980]. При оценке значений аффинитета и количества секретируемых В-клеткой АТ подгонку расчетного распределения оптической плотности к экспериментальному осуществляли методом наименьших квадратов с помощью алгоритма Нелдера-Мида [Химмельблау Д.,1975]. Математическая обработка данных была выполнена при участии Б.Л.Войцеховского и И.И.Агафоновой.

Результаты собственных исследований и обсуждение

Разработка экспериментальной базы иммунохимического исследования гуморального звена иммунного ответа при вирусной инфекции

В основу разработки метода детального исследования гуморального звена иммунного ответа при вирусной инфекции были положены принципы иммунохимического определения АОК. Среди существующих методов, объединенных общим названием - иммуноточечное определение АОК, можно выделить метод F1PA (Filter Immuno-Plaque Assay), обладающий рядом принципиальных достоинств: высокой чувствительностью, длительной сохранностью первичных материалов, применением в анализе безвредных стандартных реактивов. Этот метод, базируется на связывании AT, секретируемых B-клетками, с фиксированным на НЦФ антигеном » непосредственной близости от клетки и последующем выявлении участков фиксации этих AT в иммуноферментном анализе. Для создания метода исследования гуморального звена противовирусного иммуннитета потребовалось используя эти принципы существенно их развить и дополнить, что было осуществлено за несколько этапов:

-отработка и оптимизация иммунохимического определения AT класса IgG на НЦФ;

- автоматизация этапа учета результатов;

- оценка влияния условии культивирования суспензии спленоцитов мышей на результаты исследования антителопродуцентов.и оптимизация этих условий;

- разработка математической модели и соответствующего программного обеспечения, позволяющей оценить количество и аффинитет IgG-AT, продуцируемых единичной АОК.

Для оптимизации иммунохимнческих этапов метода был выполнен ряд опытов, совокупность которых позволила выбрать приемлемые условия проведения эксперимента. Были изучены условия иммобилизации на НЦФ вируса гриппа А. Проведено сравнение блокирующих растворов, используемых для снижения неспецифического взаимодействия AT и коныпгата с подложкой и иммобилизованными на ней гетерологичными АГ. Оптимизированы условия окраски НЦФ специфичным и обеспечивающим высокую чувствительность всего метода субстратом (п-фениленднамин).

В результате, создана экспериментальная база определения вирусспе-цифическнх IgG-AOK и секретируем^х ими AT, иммунохимическая часть которой включает:

- этап сорбции. В качестве АГ использовали очищенный в градиенте плотности сахарозы вирус гриппа A/PR/8/34 в концентрации 0.6 мг/мл вирусного белка в физиологическом фосфатном буфере (ФФБ). Сорбцию вируса проводили в течении 1 часа при комнатной t°. НЦФ отмывали от несвязавшегося белка 199 средой, содержащей 10% эмбриональной сыворотки, после чего фильтры помещали на дно лунок культурального планшета.

- этап культивирования спленоцитов. Поверх НЦФ с иммобилизованным АГ наносили суспензию спленоцитов инфицированных или интактных мышей, содержащую 5Х105 клеток. Планшеты с фильтрами помещали в СОг-инкубатор (t°=37.0°С, 5% С02) на 3 часа. После чего НЦФ извлекали из планшетов, клетки смывали, интенсивно встряхивая фильтры в охлажденном растворе ФФБ, содержащем 10 мМ ЭДТА. Свободные участки .связывания на НЦФ "забивали" инкубированием фильтров в ФФБ, содержащем обезжиренное молоко (1:1).

- этап связывания конъюгата. Фильтры переносили в раствор конъю-гата (антитела против IgG мыши, меченные пероксидазой хрена) в рабочем разведении и инкубировали в течение ночи при 4°С. После серии промывок (3 раза в буфере с молоком, 2 раза в ФФБ и 1 раз в дистиллированной воде) фильтры подсушивали.

- этап окрашивания. НЦФ помещали на 7 минут в раствор субстрата ( I мг/мл п-фенилендиамина в 0,2 М фосфат-цитратном буфере рН 6,25), содержащий 0,05% Н2О2. Развитие окраски останавливали перенося НЦФ в дистиллированную воду. Подсчет окрашенных пятен, соответствующих индивидуальным IgG-AOK, на сухих фильтрах выполняли визуально в проходящем свете.

С целью определения специфичности метода были выполнены эксперименты по определению вирусспецифических IgG-AOK в пуле спленоцитов, полученных от инфицированных гриппом мышей, на НЦФ, содержащих гомологичный (вирус гриппа А), или гетерологичные АГ (тени эритроцитов барана или вирус гриппа В). Установлено, что количество IgG-AOK, определяемых в реакциях с гетерологичными АГ, сравнимо с количеством IgG-AOK в контроле (у неинфицированных мышей), и значительно меньше количества IgG-AOK, обнаруживаемых на НЦФ с гомологичным АГ. Кроме количественных отличий опыта от контроля бы ли выявлены качественные различия определяемых пятен, ныражавшиеся в различии их интенсивности окраски и размера. Обнаруженная гетерогенность пятен, отражает функциональную гетерогенность самой популяции IgG-AOK, п которой постоянно представлены антителопродуценты из различных клонов и находящиеся на разных стадиях дифференцировки [Harris T.N. etal, 1966].

Для объективной оценки характеристик пятен был разработан соответствующий способ учета. Получаемые после выполнения метода НЦФ, под-

перга.™ сканированию в двухмерном режиме на лазерном денситометре, с последующе!'! программой обработкой данных. Для каждого из фильтров получали таблицу определяемых оптически плотных образований и строили распределение количества выявляемых пятен ("следов" АОК) по величине их оптической плотности.

Полученные распределения (рис.1) характеризовались снижением количества выявляемых ^в-АОК по мере возрастания оптической плотиости [00] их "следов" на НЦФ при исследовании спленоцитов как инфицированных мышей (кривая 2), так и интактных животных (кривая 1). Естественно, общее количество выявляемых ^в-АОК, в случае анализа спленоцитов инфицированных мышей, было значительно больше.

160 140 120 100 60 60 40 20

0.1 0.2

0.3

0.4

О.С

0.6 0.7 0.0

ОО

Рис. 1. Гистограммы распределения выявляемых пятен ("следов" АОК) по величине их оптической плотности

ДО-АОК определяли в культуре спленоцитов мышей: интактных (1) и инфицированных вирусом гриппа (2) в дозе 3.5 ^ ЭИД50 на 21 сутки после заражения. По оси абсцисс - амплитуда оптической плотности пятна, по оси ординат - количество обнаруженных на НЦФ пятен с данной оптической плотностью в пересчете на 106 спленоцитов.

Обнаружение специфических (реагирующих с вирусными АГ) АОК в контроле нельзя объяснить лишь артефактами методики, так как количество АОК с низкой "активностью" (оптическая плотность пятен ни НЦФ 0.2) существенно увеличивается в результате развития иммунного ответа. По-видимому, высокая чувствительность предложенного метода позволяет регистрировать ^С-АОК с низкой продуктивностью или секретиру-ющие низкоаффинные АТ широкой специфичности, способные связываться с АГ вируса гриппа. По данным СаваН Р. и Г^кнк А.Ь. [1989] количество таких клеток у интактных животных значительно.

Из анализа данных распределения ^б-АОК по интенсивности окрашенных пятен следует также, что, как абсолютное число определяемых в эксперименте АОК, так и соотношение опыт/контроль зависят от чувстви-

1

телыюсти используемого метода. Это еще раз подтверждает неопределенность и, следовательно, низкую информативность такого усредненного показателя, как общее количество АОК.

Оценка параметров каждого пятна позволила ввести объективную характеристику функциональной активности индивидуальной ЛОК. Уровень этой активности может быть выражен через величину оптической плотности пятна ("следа" АОК) на НЦФ, проявляющегося в результате выполнения анализа. Если предположить, что интенсивность окраски каждого пятна пропорциональна как количеству так и аффинитету секретируемых клеткой АТ, то, следовательно, оптическая плотность пятна характеризует основную функцию АОК - продукцию АТ способных связываться с ЛГ с определенным сродством.

Описанный выше способ учета результатов позволил проанализировать влияние условий культивирования спленоцитов на результаты определения ^(З-ЛОК. Были исследованы -влияние плотности клеточной суспензии, концентрации эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота в среде культивирования и продолжительности культивирования. Выявлена значительная чувствительность клеточной популяции к условиям культивирования. Влияние сказывалось как на общем количестве определяемых ^в-ДОК, так и на их функциональной активности. Все это предполагает строгое соблюдение условий культивирования в сопоставляемых экспериментах.

Таким образом, оптимизация иммунохимической части метода и привлечение соответствующей приборной базы для оценки результатов эксперимента заложили основы технологии детального исследования гуморального звена иммунного ответа у инфицированных вирусом гриппа животных. В результате, удалось объективизировать определение количества ^О-АОК и их функциональной активности при краткосрочном культивировании клеточной суспензии.

Автоматизация учета результатов и разработка математической модели для оценки аффинитета и количества АТ, продуцируемых индивидуальными АОК

Детальная характеристика совокупности секретируемых АОК 1вС-ан-тител требует значительного увеличения объема первичных данных, анализ которых не возможен без привлечения вычислительной техники, современных методов обработки результатов измерений и математического моделирования. Для этого был разработан н применен автоматизированный способ учета результатов . Данные сканирования НЦФ передавали преянме реального времени с денситометра на компьютер 1ВМ-РС-АТ. Из полученной цифровой матрицы путем статистической медианной фильтрации с разлнч-

- автоматизация эксперимента и разработка математической модели осуществлялась в соавторстве со ст.н.с. лаборатории вычислительных методов ИЭМ РАМН к.физ.-м.н. И.И. Агафоновой.

ными "окнами" и последующим поиском локальных максимумов, выделали центры пятен (учитывали только сигналы, превышающие дисперсию"шума" минимум в 2.5 раза), регистрировали их количество, амплитуду и форму распределения оптической плотности по радиусу (рис.2, кривая 1). Итогом этого этапа исследования было определение общего числа пятен (количество ДО-АОК) в исследуемом препарате, расчет амплитуды оптической плотности каждого пятна (функциональная активность каждой АОК) и соответствующее их представление. Полученное распределение оптической плотности по радиусу использовали в математической модели для оценки секретируемых ЛТ.

Рис. 2. Распределение оптической платности (I), определяемое в эксперименте, и гипотетическое распределение антител (2) вокруг сек-ретирующнх клеток (Л и В) (В верхней части рисунка приведены реальные пятна ("следы" ЛОК) на НЦФ- Увеличение - Х20).

По оси абсцисс - оптическая плотность, по оси ординат - расстояние.

Для выявления характера соотношении мевду продуктивностью индивидуальной АОК, аффинитетом секретируемых 1£0-антнтел и параметрами окрашенных пятен, регистрируемых на НЦФ, была разработана математическая модель, описывающая процесс диффузии антител из точечного источника, которым'является АОК. При этом учитывалось что клетка синтезирует гомогенные АТ с постоянной скоростью - ((2), находится на границе между жидкой фазой (среда культивирования) и пористым нмму-носорбентом (НЦФ с иммобилизованным А Г), а АТ, диффундирующие в НЦФ, одновременно связываются с АГ. Считая, что скорость секреции АТ и их количество много меньше скорости реакции АГ-АТ и количества сор-

бировшшого АГ можно предположить, что реакция между ними идет п равновесных условиях и соотношение свободных и связанных AT определяется уравнением закона действующих масс: Sb = К Sf, где Sb - концентрация связанных AT, Sf - концентрация свободных ЛТ, К - константа равновесия реакции АГ-АТ (аффинитет). Учтя все перечисленные положения и представив их в математической форме можно аналитически решить полученное выражение относительно Sb и таким образом описать предполагаемое распределение AT (Sb), связавшихся вокругсекретируюшей клетки с АГ, фиксированным на НЦФ, за время культивирования (кривая 2 на рисунке 2.).

Однако, в реальном эксперименте при денситометрировании (рис.2, кривая 1) анализируется распределение не самих AT, а распределение по НЦФ окрашенного продукта ферментативной реакции. Поэтому реальный пик оптической плотности, вследствие диффузии продукта от места синтеза до места фиксации на НЦФ, значительно шире пика распределения AT. При этом мы исходили из предположения, что коньюгат (anTH-IgG-мыши, меченные пероксидазой хрена) равномерно связывается с IgG, иммобилизованными на АГ, а размер пор ннтроцеллюлозной матрицы много больше размера молекул продукта ферментативной реакции.

Учтя в математической модели описанные выше процессы, удалось промоделировать распределение продукта ферментатипной реакции с высокой степенью (95%) соответствующее реально измеряемому и одновременно оценить продуктивность (Q), аффинитет (К) и коэффициент диффузии (D) секретируемых отдельной клеткой AT. Разработанный алгоритм был реализован в виде пакета программ "APC" (Antibody-Producing Cells).

Дальнейшая верификация математической модели осуществлялась в ходе экспериментов с инфицированными животными путем оценки соответствия получаемых результатов данным, известным из литературы.

Применение разработанной методической базы при изучении

динамики формирования гуморального звена иммунного ответа при экспериментальном гриппе разной тяжести

Разработанная методическая база в полном объеме была реализована при анализе формирования гуморального звена иммунного ответа в динамике экспериментальной гриппозной инфекции разной тяжести. При этом, наряду с определением показателей вирусной репродукции и исследованием гуморальных факторов в крови, удалось сопоставить общее количество вирусспецифическнх IgG-AOK в нммунокомпетентном органе, охарактеризовать их распределение по функциональной активности, а также исследовать структуру популяции секретируемых IgG-AT.

Для контроля за течением инфекции оценивали показатели вирусной репродукции - содержание вируса и вирусного АГ в легких. Уровень этих показателей достигал максимума в период от 3 до 5 суток, как в случае летальной, так и нелетпльной форм инфекции, естественно, с некоторым превышением при более высокой заражающей дозе вируса.

Состояние гуморального звена иммунного ответа в крови оценивали пп уровню пируссиецифпчсских IgG и циркулирующих lgG-содержащпх сщ'

цифнческих иммунных комплексов (рис.3). Накопление 1£0-АТ происходило сходным образом при обеих формах инфекции начиная с 6 суток и их количество при нелетальной инфекции поддерживалось на высоком уровне на протяжении всего срока наблюдения (до 21 суток) (рис. 3,Л).

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21

Рис. 3. Динамика показателей гуморального звена иммунного ответа в крови инфицированных мышей

Л - вирусспецнфическне ^0, В г специфические циркулирующие ^О-ИК при летальной (I) и нелегальной (2) формах гриппозной инфекции. По осям: абсцисс • время (сутки) после заражения; ординат (в условных единицах) - содержание специфических 1бО (А), вирусс-пецифических 1еО-ИК (В).

Результаты исследования содержания специфических 1рО-ИК продемонстрировали выраженную цикличность их появлений как в острую фазу инфекции, так в на протяжении 3-х недель наблюдения (рис. 3,0) .'Существенное значение имеет факт выявления 1вО-ИК на 3 сутки, то есть еще до того момента, как в сыворотке обнаруживали 1еО-АТ. Сходные результаты получены при анализе специфических ИК при гепатите (ТеоП1орои1о$ А., ШхоПР.,»980].

С помощью разработанного нами метода была изучена динамика коли -чества 1§0-А0К, определяемых в селезенке мышей, инфицированных различными дозами вцруса гриппа А (рис. 4).

Рис. 4. Динамика количества специфических IgG-AOK в селезенке инфицированных вирусом гриппа мышей

По осям: абсцисс - время (сутки) после заражения; ординат - количество определяемых АОК в пересчете на 105 сплеиоцитов за вычетам

контроля. Заражение: 106ЭИД50 (летальная инфекция) - 1; 10 ЭИД50 (не летальный процесс) - 2.

Обнаружено их появление при высокой дозе заражения уже с первых дней после начала инфекции (кривая 1), достоверно (р<0.01) наличие специфических IgG-AOK регистрировали начиная с 3-х суток.

Полученные данные согласуются с результатами раннего выявления циркулирующих специфических IgG-ИК и их более высоким уровнем при тяжелой форме инфекции. Это также свидетельствует об участии специфических IgG в реализации противовирусных механизмов защиты уже в первые дни инфекционного процесса.

Установлено, что в группе животных с нелегальной инфекцией существенное увеличение количества специфических IgG-AOK происходит лишь с 8-х суток (кривая 2). Их высокий уровень сохраняется до 21 дня (срок наблюдения) и носит колебательный характер. Наличие подобных колебаний уровня IgG-AOK на более поздних сроках известно из данных литературы [Jones P.D., Ada G.L.,1987], Явления цикличности характерны и для параметров, описывающих содержание вирусного АГ п органе-мишени, клеточное звено иммунитета [Поляк Р.Я. и др.,1986-1991; Шидлопская U.K.,1987; Шидловская U.K. идр., I9S9], а также аффинитет циркулирующих AT [Леденцопа Р.Ю., Кпсляк 13.М. 1989]. Общин вид полученных кривых количества специфических IgG-сскретирующпх АОК соответствует результатам, опубликованным другими авторами [Jones P.D., Ada G.L., 19861.

Для изученных групп животных были оценены показатели функциональной активности АОК. что позволило обнаружить существенную пере-

стройку о популяции АОК уже и первые дни развития инфекции. Так, в группе животных, инфицированных нелетальной дозой вируса, при почти неизменном общем количестве АОК в течении первых 7 суток, изменяется их функциональная структура. Появляются более высокоактивные ^С-АОК и уже к 4 суткам значительно возрастает нх доля в общем количестве АОК. При этом в спленоцитах мышей с летальной инфекцией, где доза заражения на два порядка выше, при общем увеличении количества АОК доля высокоактивных клеток даже несколько снижается к б суткам. Это может быть связано с эффектом индукции толерантности высокой дозой вирусного АГ.

Непрерывное изменение структуры популяции 1ёО-АОК в селезенке продолжается и после возрастания на 8 сутки нх общего количества (рис. 5). Колебание этих параметров, по-видимому, связано как с коротким временем жизни индивидуальных АОК, так и сих интенсивным обменом с другими органами [Горизонтов П.Д. исоавт.,1983]. Однако, можно выделить общую тенденцию к постоянному возрастанию количества функционально активных АОК, продолжающемуся и после завершения острого вирусного процесса. Причиной этого может являться длительное присутствие в организме вирусных АГ [Дубровина Т.Я. и др.,1987-1991; Зуев П.А.,1988;].

Рис. 5. Динамика функциональной активности ^О-АОК в пуле спле-ноцитов мышей, инфицированных вирусом гриппа в дозе 10 ЭИД50 на всем сроке наблюдения. По осям: X - условные единицы функциональной активности; У - количество АОК в пересчете на 10 сплено-цнтов; Ъ - время (сутки ) после заражения. ''

Исследования популяции ^О-АТ, непосредственно секретнруемых АОК, проведенные с использованием математической модели, носили в большинстве своем методологический характер. На отдельных сроках раз-

вития вирусной инфекции были выполнены эксперименты, в которых пар-ралельно с исследованием популяции lgC-AOK и AT ими секретируемых, анализировали пул циркулирующих IgG-AT. Показано принципиальное совпадение структуры аффнннитета этих популяций. Хотя в случае анализа популяции IgG-AT, непосредственно секретируемых АОК, картона Имеет более сложный, детальный характер.

Обнаруженное на отдаленных сроках вирусной инфекции соответствие структур популяций IgG-AT. определяемых в'крови и секретируемых АОК, может быть еще одним подтверждением адекватности используемой математической модели.

В результате исследования аффинного спектра AT продуцируемых АОК в динамике вирусной инфекции был получеи ряд гистограмм (рис. б), характеризующих клональный состав селезеночной популяции АОК. На всех распределениях AT четко разбиваются на группы по аффинитету. Дискретный характер их распределения позволяет предположить соответствие каждой группы отдельному клону IgG-AOK. Тем более, что количество выявленных групп (10-15) сравнимо с известным из литературы количеством клонов АОК, задействованных в первичном иммунном ответе [Staudt L.M.,GerhanJ W.,1983].;

I i

И ,,н

15

п'

Ii 1.1 Ii Ii I 1

10

J I

In ■ ■

J_U_

III i

2 3 4 б

' LI

И

2 41 4.1

11

в 7

1. I

К

Рис. б. Распределение АОК по аффинитету секретируемых АТ в динамике вирусной инфекции. По оси абсцисс - относительные единицы аффинитета АТ; по оси ординат - количество определяемых АОК в пересчете на 105 спленощггов. К - контроль, 2,7,10,15 - сутки после заражения.

В некоторых случаях клональный спектр 1§С-А0К, полученных от интактных животных, почти полностью совпадал с распределениями полученными от инфицированных мышей. Это позволяет говорить о предсуще-ствовании клонов ^Ь-АОК у интактных животных, хотя и в значительно меньших количествах.

7

Одновременно с исследованием клсшалыюга спектра 1дО-АОК были получены оценки их производительности. Обнаружение падение максимальной производительности АОК по мере роста аффинитета секретируемых ими АТ (разница почти на порядок между низкоаффинными и высокоаффинными АТ). В литературе нам не удалось обнаружить каких-либо результатов оценки продуктивности (¿С-АОК из различных клопов.

Несмотря на незначительное количество ^в-АОК, определяемых в пулеспленоцитов шггактных мышей, удалось сравнить их продуктивность с продуктивностью АОК инфицированных мышей, что продемонстрировало значительное увеличение как средних, так и максимальных значений этих показателей в каждом клоне. Увеличение продуктивности специфических аитнтелопродуцентов в динамике нммуного ответа на другие АГ известно из литературы [Ь№ег.Ке1а1., 1976].

Таким образом, можно предположить, что формирование популяции вирусспецифических 1еС в процессе развития вирусной инфекции происходит в большей степени за счет увеличения количества специфических ^С-АОК и роста их продуктивности и в меньшей - за счет появления новых высокоаффинных клонов.

Таким образом, с помощью разработанного метода исследования вирусспецифических антителопродуцентов и секретируемых ими АТ, удалось детально охарактеризовать динамику формирования гуморального иммунного ответа при экспериментальном гриппе. Обнаружено предсуществова-ние специфических ^С-секретирующих антителопродуцентов с низкой функциональной активностью у ннтактных животных. Показано, что уже на ранних сроках инфекционного процесса (2-3 сутки) происходят изменения в структуре популяции |£0-А0К, предшествующие появлению специфических 1&С в циркуляции. Впервые исследованы динамика функциональной активности, клоналыюго спектра и продуктивности 1ёС-АОК при гриппозной инфекции. Показан колебательный характер изменения этих параметров. Установлено, что в иммунном ответе принимает участие ограниченное количество клонов вирусспецифических |£С-АОК, а их распределение по аффинитету имеет дискретный спектр. Выявлен рост продуктивности вирус-специфических 1уС-АОК в динамике иммунного ответа.

ВЫВОДЫ

1. Разработан адаптированный к экспериментальной гриппозной инфекции метод исследования вирусспецифических антителопродуцентов, включающий оценку количества ^в-АОК и их индивидуальной функциональной активности, выражаемой в количестве и качестве секретируемых антител.

2. Предложена математическая модель процессов, лежащих в основе разработанного метода исследования ннтителопродуцентов..позволяющая оценить продуктивность индивидуальных ^О-АОК и аффйшл'ет секретируемых ими антител.

3. Впервые разработаны и реализованы в виде пакета прикладных программ алгоритмы оценки результатов эксперимента, обеспечивающие автоматический сбор и анализ данных.

4. Применение разработанной технологии исследования позволило детально охарактеризовать динамику формирования в иммунокомпетентяом органе гуморального звена иммунного ответа при экспериментальном гриппе у мышей (вирусгриппа А/Р!?/8/34 - межлиненные гибридыР (С57В1ас1 ХСВА):

- обнаружено предсуществопание пирусспецифичесхнх 1вО-антнте-лопродуцентов, с низкой функциональной активностью у ннтлктных животных;

- уже на ранних сроках инфекционного процесса (2-3 сутки) происходят изменения в структуре популяции 160-А0К, предшествующие появлению специфических в циркуляции;

- впервые исследованы клепальный спектр ^С-АОК и их продуктивность в динамике развития гриппозной инфекции. Показан колебательный характер изменения этих параметров;

- установлено, что в иммунном ответе принимает участие ограниченное количество клонов вирусспецифнческйх 1дО-ЛОК, а их распределение По аффинитету имеет дискретный спектр;

- выявлены существенные различия в сроках появления и функциональной активности антителопродуцентов прн гриппозной инфекции разной тяжести.

Список работ, опубликованных по теме диссертации!

1. Системный анализ вирусного поражения организма и противовирусного действия хнмнопрепаратов на модели гриппа// Стратегия возбудителя в организме хозяина.-Л.-1987.-С.10-25. (Соавт.: Поляк Р.Я., Белых Л.М., Войцеховский Б.Л. и др.)

2. Возможные пути усовершенствования отдельных этапов иммуно-ферментного анализа // Твердофазный нммуноферметный анализ. - Л., 1988.-С. 71-75.

3. Применение методов химической кинетики для оценки аффинитета циркулирующих свободных и связанных с антигеном антител (модель -экспериментальный грипп )//Иммунология.-1989.-М.6.-С.48-51 (Соавт Мерингова Л.Ф.,Войцеховский БЛ., и др.)

4. Дифференцированное изучение популяции специфических антител как возможный путь повышения прогностической значимости показателей гуморального иммунитета прн гриппе// Вестник АМН CCCP.-1989.-N11,-С.75-80. (Соавт.: Мерингова Л.Ф., Яковлева И.О., Войцеховский БЛ., Поляк Р.Я.)

5. Исследование общих закономерностей гуморального иммунного ответа при вирусной инфекции посредством дискретного анализа свойств спе-

. цифических иммуноглобулинов // Вестник АМН СССР.- 1989 .-N И.- С. 81-87 (Соавт.; Войцеховский Б-Л-, Мерингова Л.Ф., Агафонова И.И.)

6. Функциональнее активности антителообраауюших клеток в динамике экспериментальной гриппозной инфекции мышей- // Вестник АМН СССР,-1991 .-N4,-С. 8-И.

7. Иммунохнмическаа характеристика структуры популяции антитело-образу юших клеток при экспериментальном гриппе // Вестник АМН СССР.- 1991 N 4.- С. 14 - »8. ( Соавт.: Агафонова И.И., Войцеховский Б.Л.)

- 8- Биологическое равновесие в организме при вирусной инфекции разной тяжести ("ца модели гриппа)//Вестник АМН СССР.-1991.-N 4.-С.34-40 (Саовт.: Поляк Р.Я., Войцеховский В.Л., Дубровина Т.Я. и др.).

0. Specific antibodies pnd antibody-producing cells upon experimental influenza // In: "Selected topics on Mathematical models in immunology and medicine".-1990.-Austria, I1ASA.-P.95-101. ( Cowork.: Vojisekhovskij B.L. Agafonova J.I., Merlngova L P.)

10. Model for analysis of drag action during experimental influenza // In: "Selected toplct on Mathematical models in immunology and medicine".-1990.-Austrla, UASA.-P.45-49. ( Cowoik.: Poljak R.Ya., Chetverlkova L.K. et al.)

11. "Способ определения активности антителообрцзующих клеток" авторское свидетельство N 4670592/30-14(047405) от 12 апреля 1989 г. (Соавт.: Агафонова И.И., Войцеховский Б.Л.)

Poai-m.CneriiK.3aK.56.Tup.tQO.t2 02.92.