Автореферат и диссертация по медицине (14.00.15) на тему:Морфофункциональные особенности паренхиматозных и стромальных клеток рака молочной железы после лучевой тирапии

ж

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РФ

РГ6 ОД СМОЛЕНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ] 3 ДЕН 1ч- П МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

На правах рукописи УДК 618. 19-006.6-085.849. 19-091.8 ДУБЕНСКАЯ Людмила Игоревна

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ПАРЕНХИМАТОЗНЫХ И СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПОСЛЕ ЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИИ

14.00.15 — патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Волгоград — 1996

Работа выполнена в Смоленской государственной медицинской академии.

Исследование проводилось в Центральной научно-исследовательской лаборатории, на кафедре патологической анатомии Смоленской медицинской академии.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор А. Е. Доросевич;

доктор медицинских наук, профессор А. Ю. Барышников.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских паук, профессор В. И. Даниленко;

доктор медицинских наук, профессор В. В. Ермилов.

Ведущая организация — Научно-исследовательский институт морфологии человека (РАМН).

Защита состоится «., » _-У И ВОРЯ_ ¡995 г_

в «—Ю._» часов на заседании специализированного совета

К 084.54.04 при Вологодской медицинской академии по адресу: 400066, Волгоград, Площадь Павших борцов, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Волгоградской медицинской академии но адресу: Волгоград, Площадь Павших Борцов, 1.

Автореферат разослан «_£_» АЕКСГ&РЯ_ 1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета, к. м. н.

Н. Н. МИШИНА

Актуальность проблемы. Успех лучевого лечения злокачественных опухолей, планирование лучевого воздействия и прогнозирование его результатов ставят задачи определения и учета радиобиологических. морфологических и молекулярно-биологических характеристик популяций клеток опухоли конкретных больных (Цыб А. Ф. .1987). Ряд исследователей считает рак молочной железы (РМЯ) радиорезистентной опухолью (Friedman Л.,1988). Однако полноценность лучевого лечения зависят от индивидуальной "отвечаемости" на лучевое воздействие, которая реализуется как на уровне организма, так и на уровне клеточных популяций в пределах органа, пораженного опухолью.

Примечательно, что сходства и различия органоспецифичности (метаболическая, иммунобиологической и др.) неизменных и раковых ♦ клеток могут служить основой для поиска новых подходов к модификации радиочувствительности опухоли (Лушников Е.Ф..-1977).Функциональное состояние внеопухолевой ткани изменяется взаимообусловлен™ с развитием и становлением злокачественного процесса в органе и противоопухолевым лечебным воздействием, эффект* которого во многом определяется сохранностью местных гомеостатических систем. Оценка лечебного эффекта лучевого воздействия на уровне "опухоль - внеопухолевая ткань" тем более важна при современных тенденциях к уменьшению объема оперативных вмешательств при РМЯ, однако в настоящее время проводится только в опухоли. Следовательно. необходима разработка информативных систем изучения облученных тканей (в том числе, неопухолевых) на наиболее доступном - морфологическом уровне, поскольку многие важнейшие особенности паренхимы и стромы опухоли могут быть установлены самыми простыми, традиционными методами морфологического исследования.

В связи с тем, что радиочувствительность тканей зависит от свойственного ей характера межтканевой интеграции (Токин И.Б..1974), особое значение в оценке морфофунЛционального состояния облученной опухоли приобретает анализ паренхиматозно-стро-мальных взаимоотношений, которые отражают процессы межклеточных взаимодействий (Казанин В. И., 1983) и являются основополагающим звеном структурного гомеостаза ткани.

Сложность взаимоотношений паренхимы и стромы опухоли определяется тем. что обе эти составные часта являются многокомпонентными системами с присущими им особенностями, которые в свою

х

очередь тесно связаны между собой. Так, изменения в спектре экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости опухолевыми клетками приводят к нарушениям иммунного контроля опухолевого роста и изменениям функциональных возможностей клеток-эффекторов (Whitwell H.L..1984). влияющих на состояние опухоли. Характеристики зон ядрышкового организатора отражают общу» направленность биосинтетических процессов, происходящих в малигни-зированной ткани, тесно связаны с пролиферативной активность», которая является одной из базисных характеристик опухолевого процесса и фактической радиочувствительности опухоли.

Таким образом, полноценный анализ паренхиматозно-стромаль-ных взаимоотношений при опухолевом росте и оценка адекватности лучевой терапии не возможны без синтеза методов исследования и знаний, которые лежат пока в рамках разных научных дисциплин (онкоиммунологии, цитологии, патоморфологии и др.). Единство природы определяет неизбежность синтеза знаний; поэтому изучение паренхиматозно-стромальных взаимоотношений даже морфологически может быть проведено на разных уровнях организации структурных элементов (Дикштейн Е.А. ,1987). Такой подход предоставляет возможности интеграции морфологических эквивалентов деятельности местных гомеостатаческих систем, обеспечивающих целостность и функциональные возможности клеток, тканей.. органа в целом при развитии злокачественной опухоли и во многом определяющих успешность противоопухолевых лечебных мероприятий.

Цель исследования - Изучить морфофункцйональные особенности и взаимоотношения паренхиматозных и строгальных компонентов молочной железы больных РМЖ после лучевого лечения с помощью выявления и анализа корреляционных взаимосвязей морфометрических показателей, параметров ЯОР и результатов иммунотипирования.

Решались следующие задачи :

1. Количественно оценить эпителиальные и соединительнотканные клетки, их митотический режим, площади паренхимы и строки, сосудистого русла, клетки специфического иммунитета и неспецифической резистентности в опухолевых и внеопухолевых тканях больных РМЖ до- и после ЛТ.

2. Определить уровень экспрессии HLA-I и HLA-II антигенов в эпителии, количества лимфоцитов отдельных популяций (субпопуля-

2

дай) в паренхиме и строме опухоли и внеопухолевой И больных дои после ЛТ.

3. Охарактеризовать количественные показатели реакции Ая-ЖЖэ в эпителии, строме, иммуноцитах.

4. Сравнить морфометрические показатели разных методов исследования в тканях вне опухоли и опухоли МЖ до- и после ЛТ.

5. Проанализировать однотипные системы корреляционных взаимосвязей, объединяющих морфометрические показатели, уровень экспрессии НЬА антигенов эпителием, ^субпопуляционный состав лимфо-цитарных инфильтратов во внеопухолевой МЖ - опухоли больных после ЛТ и до ЛТ.

6. Выявить особенности корреляционных взаимосвязей активированных (ЯОР) лимфоцитов и плазмоцитов с их общими количествами (морфометрия), отдельными субпопуляциями (иммунофенотипирова-ние), активностью ЯОР эпителия и стромы (метод А^ДОв) в зависимости от принадлежности ткани к внеопухолевой МЖ и опухоли до- и после ЛТ.

Научная новизна.

1. Определено, что оценка морфофункционального состояния тканей опухоли и внеопухолевой молочной железы больных после лучевого лечения может проводиться в однотипных системах корреляционных взаимосвязей . объединяющих традиционные морфометрические показатели, представительство НЬА-антигенов в эпителии. ЯОР-характеристики эпителия и соединительнотканных клеток, суб-популяционный состав внутритканевых иммуноцитов.

2. Предложена и применена расширенная схема одновременного учета реакции серебрения ядрышковых организаторов на гистологических срезах в эпителиальных клетках с разной активность» ЯОР. прилежащих соединительнотканных клетках и внутритканевых иммуно-цитах.

3. Выявлены системы корреляционных взаимосвязей между ЯОР-показателями эпителия и стромы, соответствующими ЯОР-показа-телями опухолевых и внеопухолевых тканей молочной железы у больных до- и после лучевого лечения.

4. Показано, что активность ядрышкообразующих регионов эпителиальных клеток взаимосвязана с экспрессией эпителием антигенов Н1А.

з

6. Показано, что участие иммуноцитов в паренхиматозно-стро-мальных взаимоотношениях молочной железы отражается системами корреляционных взаимосвязей активированных (по численности ЯОР} лимфоцитов и плазмоцитов с общими количествами клеток специфического иммунитета и неспецифической резистентности (морфомет-рия). активированными лимфоцитами, их субпопуляциями (иммунофлю-оресценция).

Практическая значимость работы. В результате проведенного исследования показано, что взаимосвязи морфометрических показателей между собой, включая характеристики ЯОР, представительство HLA-антигенов в эпителии, результаты иммунофенотипирования, уточняют нарушения паренхиматозно-стромальных взаимоотношений как в опухолевых, так и во внеопухолевых тканях после лучевой терапий.

Учет результатов импрегнации AgKORs на гистологическом срезе опухолевых тканей необходимо проводить комплексно, т.е. с выяснением преобладающего типа распределения ЯОР, преимущественной диспергированностью ЯОР по ядру или ядрышкам клеток, учетом характеристик ЯОР не только непосредственно в эпителии, но ив клетках окружающей соединительной ткани, иммуноцитах.

Показана необходимость изучения морфофункционального состояния молочной железы больных после лучевой терапии на уровне "опухоль - внеопухолевая ткань", что предлагается проводить с помощью анализа однотипных систем корреляционных взаимосвязей между результатами различных методов исследования. Последние должны включать как наиболее доступные методы морфологического исследования, так и морфометрическую оценку результатов иммуно-фенотипирование опухолевых, иммунокомпетентных клеток, показателей активности ЯОР клеток паренхимы и стромы.

Основные положения выносимые на защиту:

1. Одновременное изучение патоморфологических изменений опухолевых и внеопухолевых участков молочной железы, осуществляемое в однотипных системах корреляционных взаимосвязей, существенно расширяет возможности оценки морфофункционального состояния всей молочной железы после лучевой терапии РМЖ.

2. Системы взаимосвязей мевду морфометрическими показателя-

4

ми. в том числе, характеристиками ЯОР. результатами иммунофено-типирования. изменяются и нарушаются как в опухоли непосредственно. так и во внеопухолевых тканях после лучевой терапии.

3. Лучевое воздействие не приводит к изменениям показателей ЯОР в сохранных участках облученного опухолевого эпителия.

4. Нарушения со стороны местных иммунных реакций при опухолевом росте до и после лучевой терапии проявляются преимущественно в "изоляции" активированных (ЯОР) иммуноцитов в системах корреляционных взаимосвязей с общими количествами последних, а также отдельными субпопуляциями лимфоцитов .

Апробация работы.' Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Смоленского областного научно-практического общества патологоанатомов (1993, 1995), конференции молодых ученых Смоленского медицинского института (1993), заседании проблемной комиссии "Иммунология и иммуноморфология" Смоленской медицинской академии (1995).

Публикации. По основным материалам диссертации опубликовано 8 научных работ и 1 принята в печать.

Реализация работе. Результаты диссертационного исследования, касающиеся особенностей паренхиматозно-стромальных взаимоотношений в опухоли и внеопухолевых участках молочной железы после лечебного облучения используются при чтении лекций и проведения практических занятий на кафедре патологической анатомии СГМА.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, глав, посвященных обзору литературы, материалам и методам исследования, 4-х глав собственных исследований, а так же заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, приложения (таблицы и схемы). Работа изложена на (Щ страницах машинописного текста, иллюстрирована (7) рисунками, 6 таблицами, 15 схемами. Указатель литературы содержит 145 работ, в том числе 74 отечественных и 71 зарубежный источник.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследовался гистологический материал Оп и внеопухолевой МЖ

двух групп больных. Первую группу составили женщины, больные РМЖ (20) до лучевой терапии, вторую - больные РМЕ (80) после предоперационного облучения по интенсивно-концентрированной методике.

Морфометрическое исследование проводилось в тканях опухоли и соответствующей неопухолевой молочной железы 20 больных РМЖ до лучевой терапии (ЛТ) й 80 больных после ЛТ . Для постановки реакции иммунофлюоресценции (РИФ) и определения субпопуляций лимфоцитов, а так же экспрессии НЬА - антигенов эпителием использовались ткани опухоли и неопухолевой молочной железы 15 больных РМЖ до лучевой терапии и 50 больных после ЛТ. Подсчет результатов реакции АяКОЕб проводился-в материале 15 больных РМЖ до'ЛТ (опухоль и неопухолевая ткань) и 60 больных после ЛТ. Срезы одного и того не участка тканей исследованы каждым из перечисленных выше методов.

Кусочки Оп (непосредственно опухолевый узел) и отдаленной от опухолевого узла МЖ вырезались из макропрепарата (сектор, радикально удаленная МЖ) немедленно после операции. Каждый забранный кусочек разделялся на две части, одну часть помещали в 10-процентный нейтральный формалин (далее следовали общепринятая проводка и изготовление парафиновых блоков), вторую часть натив-ного материала использовали для постановки РИФ.Из парафиновых блоков изготавливали срезы толщиной 4-7 мкм, . ¡которые окрашивались гематоксилином и эозином, азур-эозином, гематоксилином и сафранином (метахроматическое окрашивание зернистости тучных клеток), пикрофуксином по уап С1еэоп.

Количественный морфометрический анализ площади паренхимы (Пар) и стромы (Стр) проводили в 40 полях зрения при увеличении Х400 с помощью окулярной измерительной сетки Г. Г. Автандилова (1984). Площадь Пар и Стр вычислялась в процентном отношении к просчитанной площади среза.Площадь сосудистого русла (Сое) в пределах Пар и собственно Стр определяли как среднюю арифметическую суммы площадей просветов всех выявленных сосудов, диаметр которых измеряли с помощью окулярного микрометра. Производился учет абсолютных количеств клеток (Кл) на поле зрения. При увеличении х400 в кавдом из сорока полей зрения подсчитывались : эпителиальные (Эпит) Кл. лимфоциты (Лф), плазматические клетки (ПКл) - в Пар, собственно соединительнотканные (СТК) Кл, тучные

(Тч) клетки. Лф. ПКл. гранулоциты (Гр) - в Стр. Одновременно учи-

6

тывались количества митозов в эпителии и СТК Кл . митотический индекс (МИ) рассчитывался на 1000 клеток.

Для определения и подсчета результатов реакции AgNORs использовались парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм. Импрегнация проводилась по стандартной методике (Crocer J.. 1987).Учет результатов проводился в 100 клетках каздого вида при увеличении х900 (1000) на микроскопе "Laboval" (Karl Zeiss, Jena).

Мы сочли необходимым считать ЯОР эпителия отдельно в клетках каждого из трех типов распределения ЯОР, описанных ранее (Сгосег J.,1989), условно обозначив их : 1 тип клеток ( импрег-нируготся ядрышки целиком или ЯОР внутри них), 2 тип клеток { ЯОР внутри ядрышек и свободно в ядре), 3 тип клеток (диспергированные по ядру ЯОР).В 100 Эпит Кл считали абсолютные количества клеток, принадлежащих к каждому типу распределения ЯОР. содержание каждого типа Кл выражалось в процентах по отношению к подсчитанному числу Эпит клеток. Для Кл 1-го типа считали среднее количество ядрышек (Ядр) и ЯОР (внутриядрышковые) на клетку этого типа. Для Кл 2-го типа считали среднее количество Ядр, диспергированных (Лисп) по ядру ЯОР, и общее количество ЯОР (внутриядрышковые + Дисп ЯОР) на клетку 2-го типа. В Кл 3-го типа считали ЯОР на клетку. Для сопоставления результатов импрегнации, подсчитанных предлагаемым нами способом, с общепринятой схемой учета, рассчитывали общие для всех Эпит Кл количества : ЯОР - (ЯОР Кл 1-го типа + ЯОР Кл 2-го типа + ЯОР Кл 3-го типа) : 100. Ядр = (Ядр Кл 1-го типа * Ядр Кл 2-го типа) : (абсолютные количества Кл 1-го + 2-го типов). ДиспЯОР » (ДиспЯОР Кл 2-го типа +■ ЯОР Кл 3-го типа) : (абсолютные количества Кл 2-го + 3-го типов).Одновременно с подсчетом ЯОР в эпителии учитывали ЯОР СТК Кл. Рассчитывалось среднее количество Ядр, Дисп ЯОР и ЯОР. Ядра ЛФ и ПКл содержали или 0-3 крупных гранулы Ag (обозначены нами как "неактивированные" по состоянию ЯОР). или множественные депозиты Ag ("активированные", Акт(ЯОР)).В 50 - 100 ЛФ (и ПКл) рассчитывалось процентное содержание Акт(ЯОР) Лф и ПКл.

Непрямая РИФ ставилась на криостатных срезах тканей МЯ (Оп и внеопухолевая Ш) по общепринятым правилам и с контролями специфичности. Первичные моноклональные антитела получены в ОНЦ РАМН (табл. 1). второй слой - F(ab)2 фрагменты вторичных анти-

7

Таблица 1

ХАРАКТЕРИСТИКА СПЕЦИФИЧЕСКИХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ*, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ

Название МКАТ Кластер дифференцировки Специфичность связывания МКАТ

ИКО-1 антигены НЬА II класса

ИКО-53 антигены НЬА I класса

ИК0-80 CD5 общая популяция Т-клеток

ИКО-87 CD7 общая популяция Т-клеток

ИКО-90 CD3 зрелые Т-кпетки

ИКО-86 HK0-86Lot г CD4 Т-хелперы/индукторы

ИКО-31 CD8 Т-супрессоры/киллеры

ИК0-105 CD25 интерлейкин-2

ККО-116 CD16 естественные киллеры

ИКО-88 CD30 антиген активации Т- и ' В-клеток

ИК0-20 CD38 антиген активации Т. плазматических клеток, естественные киллеры

ИКО-66 CD37 ' преимущественно В-клетки, (Т. моноциты)

ИК0-30 /л - цепь .М В-клеток

ИКО-91 CD22 В-клетки

* Выражаю искреннюю благодарность профессору, д.м.н. A.D. Барышникову за любезно предоставленные для работы моноклональные антитела.

тел. меченых FITC.Просмотр результатов РИФ проводился на люми-нисцентном микроскопе "Laboval" (Karl Zeiss, Jena) при увеличении х400 и х900 .Результаты РИФ оценивались полуколичественно, и выражались в процентом содержании антиген-положительных (аг+) клеток по отношению к общему количеству присутствующих Кл данного вида (Лф, Эпит клетки) в каждом поле зрения : 100 % - абсолютное преобладание аг+ Кл. 75' % - 2/3 клеток аг+. 50 % - 1/2 клеток аг+, 25 % - минимальное количество аг+ Кл конкретного вида. В статистическом анализе использовались показатели РИФ, рассчитанные как среднее арифметическое процентного содержания аг* Кл во всех полях зрения (в паренхиме и строме отдельно).

Весь цифровой материал был обработан с помощью методов математической статистики. предлагаемых пакетом статпрограмм "STATGRAFICS" Version 2.6. Все обсуждаемые различия между количественными параметрами и корреляционные взаимосвязи, приводимые далее в тексте, таблицах и схемах, значимы (|г( > 0.5) и достоверны (р < 0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Внеопухолевые участки МЯ больных PMS до ЛТ характеризовались следующими особенностями паренхиматозно-стромальных взаимоотношений. В пределах Пар прямо, взаимосвязаны площадь Пар и Лф. В Стр отмечена развитая система положительных корреляций : ПКл взаимосвязаны с Гр, Тч Кл, численностью СТК Кл. Отмечены взаимосвязи между: Тч клетками - Сое. Гр - МИ СТК Кл. Собственно па-ренхиматозно-стромальные взаимоотношения представлены обратными корреляциями площади Пар с Тч Кл и сосудами Стр. Лф Пар с площадью Стр. Прямо взаимосвязаны ЛФ паренхимы и стромы.

Эпителий, как правило; экспрессировал антигены HLA. однако в ряде случаев отмечалась и мозаичная экспрессия HLA-DR. Лф. инфильтрирующие Пар и Стр. в варьирующих количествах представлены субпопуляциями Т- и В-Кл , причем в паренхиме не обнаруживались активированные (CD30*) Лф, а в строме - зрелые Т-клетки (CD3*). Корреляционный анализ показал, что количества ряда одноименных субпопуляций Лф Пар и Стр (IgM*, CD7*. CD4*) соответственно прямо взаимосвязаны между собой.

Учет результатов импрегнации AgNORs выявил, что внеопухоле-

9

вый эпителий больных до ЛТ содержит преимущественно клетки 1-г< типа распределения ЯОР (72,9±9,4%), соответствующего покоящемус; состоянию популяции. Однако в эпителии присутствовали и Кл с более выраженной, судя по типу распределения, активностью ЯОР : 2-й тип - 18,3+5,2%, 3-й - 9,7+5,5% клеток.

Показано, что стромальные клетки, в том числе, собственн< соединительной ткани а так же Лф и ПКл, содержат в варьирущи: количествах депозиты Ав. соответствующие ЯОР. Так.обнаруживало« в среднем 29,1110,04% Акт(Я0Р)Лф и 67,5+ 14.7% Акт(ЯОР) ПКл.

Определено, что количество ЯОР в Эпнт Кл 3-го типа обратнс коррелировало с уровнем экспресии как НЬА-1, так и НЬА-П антигенов в эпителии (схема 1). Наряду с тем, что численность Я01 взаимосвязана с антигенами НЬА, обеспечивающими доступность I иммунологическому распознаванию, вполне логично, что показател* ЯОР взаимосвязаны и с морфометрическими показателями клеток-эффекторов иммунологических реакций. Так, с количествами ПКл у Гр стромы (морфометрия) коррелировали: содержание Эпит Кл 1-гс типа (обратно), количества Кл 2-го, 3-го типов (прямо). С Лф Стр взаимосвязано (прямо) количество Дисп ЯОР Кл 2-го типа . Примечательно. что содержание Кл каждого из трех типов положительно коррелировало с ЛФ, экспрессирующими один из антигенов активации -СОЗО. и Б-Кл. <Ш37+ (схема 2). .<:

Функциональные возможности Акт(ЯОР) ЛФ и ПКл в реализации паренхиматозно-стромальных взаимоотношений оценивались в системах корреляционных взаимосвязей с общими количествами свободных клеток стромы (морфометрия), субпопуляциями внутритканевых (РИФ). ЯОР-показателями эпителия и соединительной ткани.

Показано, что количества Акт (ЯОР) ЛФ и ПКл прямо взаимосвязаны между собой и Гр. Кроме того. Акт(ЯОР) Лф обратно коррелировали с Лф Пар и прямо - с ПКл Стр. Акт(ЯОР) ПКл положительно взаимосвязаны с общим количеством ПКл стромы.

Акт(ЯОР) иммуноциты широко коррелировали с Лф Т- и Б- популяций, и Лф. экспрессирующими антигены активации (схема 3).

Акт(ЯОР) ЛФ и ПКл однотипно взаимосвязаны с ЯОР показателями эпителия и СТК Кл : обратно - с количеством ядрышек Эпит Кл, прямо - с количествами ЯОР и ДиспЯОР Кл соединительной ткани.

Исследование непосредственно Оп больных РМК до ЛТ показало, что в Пар Оп по сравнению с енеопухолевой паренхимой достоверно

ю

больше Лф (соответственно 5.19± 2,4 и 0.1±0.1), возрастал МИ эпителия (1,69±0,5 и 0,23±0,2). В строме Оп уменьшались площадь Сое (1,48±0,4 и 4,52±1,1} и количество Тч 'Кл (0,12+0,04 и 0.55±0,14). В опухолевой паренхиме отмечена более развитая система корреляций, чем во внеопухолевой. Так, с МИ опухоли прямо взаимосвязаны : площадь Пар. Лф, ПКл. Отмечены положительные корреляции между : количеством Эпит Кл и Сое в пределах паренхимы, Лф и ПКл. Строма Оп, напротив, имела менее выраженную систему взаимосвязей : прямо коррелировали Тч Кл и Сое, Лф и ПКл, количество СТК Кл и площадь Стр. Собственно паренхиматозно-стро-мальные взаимосвязи выражались в обратных корреляциях между:площадью Пар и количеством СТК Кл, МИ эпителия - площадью Стр и ко-

Схема 1. ВЗАИМОСВЯЗИ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ЯОР С

личеством стромальных Кл. Лф Пар -ЛФ Стр, ПКл Пар -ПКл Стр.

Опухолевый эпителий экспрессировал НЬА антигены, причем в различных участках одной и той же Оп отмечали как мозаичный характер распределения НЬА, так и полную потерю экспрессии. Статистическое сравнение не подтвердило достоверности различий между уровнем экспрессии Н1А в Оп и соответствующем неопухолевом эпителии. Лф, инфильтрирующие Пар и Стр Оп, принадлежали к Т-, В- популяциям, экспрессировали антигены активации, ИЛ-2 (СВ25), С016 (естественные киллеры). Примечательно, что в паренхиме и строме Оп количества большинства одноименных субпопуляций Лф изменялись содружественно и в одном направлении (Т:СВ7, С05. СОЗ.С08,С04,С025;В:ЗД,СВ22,С037; активированные Лф:С030, С038).

Результаты импрегнации AgH0Rs показали преобладание в опухолевом эпителии Кл 2-го типа распределения ЙОР (соответствует пролиферирующему состоянию клеточной популяции). Показано, что в Оп достоверно возрастала численность ЯОР (15.3±6,09, внеопухоле-вый эпителий-4.22±0.65) и ДиспЯОР (соответственно 8,45±1.4 и 1,85+0.72). В СТК Кл опухолевого узла так же достоверно возрастала численность ЯОР (7.37+1,49 и 2,61±0.39) И ДйспЯОР (6,22+1,6 и 1,00+0,45). Среди инфильтрирующих опухолевые ткани Лф возрастала доля активированных (ЯОР) Кл (соответственно 60,56±10,4% и 29. ШО, 04%). ПКл были представлены в основном активированными по состоянию ЯОР (92,0±5,6%).

Взаимосвязи показателей ЯОР с экспрессией НЬА эпителием, свойственные внеопухолевой МЖ, в Оп не сохранялись (схема 1):так, ЯОР (общепринятый подсчет) обратно взаимосвязаны с НЬА-1, прямая взаимосвязь отмечена между ЯОР Кл 2-го типа и Н1А-1. Взаимосвязи параметров ЯОР с морфометрическими показателями лейкоцитов шире в Оп : ЯОР (общепринятый подсчет} прямо коррелировали с Лф Пар и Стр', количество Кл 1-го типа обратно взаимосвязано с Лф и ПКл Пар и Стр,при этом ЯОР Кл 1-го типа прямо коррелировали с Лф Стр и ПКл Пар. Количество Кл 2-го типа прямо взаимосвязано с Лф и ПКл Пар и ПКл Стр, ЯОР Кл этого типа положительно коррелировало с Пкл.В отличие от внеопухолевой МЖ. в ОП только численность Кл 2-го типа взаимосвязана (прямо) с В-Кл (Сй37*) и Т-Лф (С05+) (схема 2).

В Оп не сохранялись взаимосвязи активированных (ЯОР) имму-ноцитов с морфометрическими показателями лейкоцитов, отмеченные

12

к

С х е м а 2.

ВЗАИМОСВЯЗИ ЯОР ЭШТРИАЛЬНЬК КЛЕТОК МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ С ПОПУЛЯЦИЯМИ (субпопуляциями) КММУНСЩИТОВ ДО И ПОСЛЕ ЛТ '

Внеопухолевзя Ш до ЛТ

¡Кол-во Кл ¡1го типа

| Кол-во Кл |2го тала

| Кол-во Кл |Зго типа

(+) _!_

|В: CD37+

M

I акт. Лф; 1CD301"

—!— (+)

Р M К до ЛТ

|Кол-во Кл| |1го типа |

г

I-1 IB: CD37

!Кол-во Кл|—С+Л |2го типа | [

«-—;-1 ¡Т: CD5+

!_

I-1

|Кол-во Кл| |Зго типа I

Внеопухолевзя МЖ после ЛТ

¡Кол-во Кл}—(-)Нзкт. Лф: |1го типа |. ' . |CD38+

1-'-> |Ts/o:

I-1 |CD8+

¡Кол-во Кн(—(+)HB:CD22'*' |2го иша I 1-

I-1 IB: CD22r

IКол-во Кл| |T: CD7+ |Зго тепа f-(+)HTh: CM*

P M S после ЛТ

г

1 Кол-во Кл| |1го типа |

I_I

<-1 I-1

,|Кол-во Кл|-(-)Нак?- Лф: | |2го пота | |CD 30+ |

L.

|Кол-во Кл| | В: |Зго типа НС+)Н CD 37+

/

(ни з. йзшзсшз шшрошш а« пор «mismos с шмитш, зщрсслрщш шнгот i- « в- доашзи

5нпг»»ш ÍI и П Р H I jo !!

I- ЦИМВД В- limn j Акт. íi

С05* СЗЗ* j CD?* I CD4* j COS* , , In ,1 ... 1 ¡9 »• j CD22* j C037* J C038* J CE30*

¡«.(KP) U Cl-i -(♦I- —W- —(*)-

Ut.tiOPI JIj -iH- _t»)J —i»)J —(*)J t"l —

oí»»» î-ij

CD 5*

ht.(JOP) li

¡кт.(ЯОР) HI«

Smtjieinu SI «мм ЛГ

PII socit It

T- кати

8- t« i

cb5* 1 ш* i cm* i 1« й* i

В- метки

!? ti-

li!. WP) Ii

¡».im?) ii>

—(+î-

SÍT.ISOPI J»

âKt.IMPl gli

-(♦M

во внеопухолевой МЖ. Так, Акт(Я0Р)Лф взаимосвязаны (обратно) только с Тч Кл, Акт(ЯОР)ПКл отрицательно коррелировали с ПКл Пар и Стр. Взаимосвязи с отдельными популяциями Лф так же утрачены в Оп (схема 3) : отмечена только одна взаимосвязь (обратная) -между Акт(Я0Р)Лф и общей популяцией Т-Кл.

Акт(ЯОР) иммуноциты опухоли взаимосвязаны с ЯОР Зпит и СТК Кл : Акт(ЯОР)ПКл обратно коррелировали с ЯОР, ядрышками, ДиспЯОР эпителия. Акт(ЯОР)Лф прямо взаимосвязаны с ЯОР и ДиспЯОР СТК Кл. обратно - с ядрышками эпителия и стромы.

При исследовании внеопухолевых участков МЖ больных после ЛТ отмечено, что средние значения морфометрических показателей данной группы больных соответственно не отличаются от показателей внеопухолевой МЖ больных до ЛТ за исключением площади Сое Стр, которая достоверно выше после лучевого воздействия (10.9±1,0 и 4,52±1,1). В Пар более развита система взаимосвязей, положительно коррелировали:площадь Сое Пар с Лф и ПКл, Лф и ПКл, площадь Пар и МИ. В Стр,напротив, отмечена только одна взаимосвязь'(прямая) - между Лф и МИ СТК Кл. Показатели паренхимы и стромы изменяются взаимосогласованно. Так, прямо коррелировали:Лф Пар и Стр. ПКл Пар, и Стр. МИ (и количества) Эпит и СТК Кл.

Показано, что уровень и характер экспрессии HLA эпителием, как и количества Лф отдельных субпопуляций, до, и после лучевого воздействия достоверно не отличаются. Как и до ЛТ, в МЖ больных после ЛТ В-Кл (CD22+) и соответственно Т-Кл (CD7*,CD5*) паренхимы и стромы прямо взаимосвязаны.

Показатели ЯОР (общепринятый подсчет) внеопухолевого эпителия достоверно не изменяются под влиянием лучевого воздействия. Тем не менее, количество Кл 2-го типа достоверно возрастало (28,8±4,5% и 18.3+5,255), как и ЯОР Кл 3-го типа (9,48+0,9% и 6,7310,78%). Количество ДиспЯОР Кл 2-го типа достоверно снижалось (3,05t0,22 и 3,41i0,44). Примечательно, что в МЖ после лучевого воздействия достоверно возрастали показатели ЯОР СТК Кл:ЯОР (5,08±0,5 И 2.61+0,39) И ДиспЯОР (3,74±0.52 и 1,0±0,45). Содержание Акт(ЯОР) ЛФ и ПКл не изменялось.

ЯОР-показатели эпителия после ЛТ широко коррелировали с экспрессией HL.A-I : отмечались как обратные, так и прямая взаимосвязь (схема 1). Показаны прямые корреляционные взаимосвязи ЯОР и с морфометрическими показателями лейкоцитов : с Лф Пар,

15

ПКл Пар и Стр прямо коррелировали ЯОР 2-го типа Кл, с ПКл Пар -количество Кл 3-го типа. Количества Кл трех типов распределения ЯОР взаимосвязаны с рядом субпопулядий Лф (схема 2), причем с активированными Лф, Ts/c и В-Лф взаимосвязаны и Кл 1-го типа (обратно), и Кл 2-го типа (прямо).С В-Лф, Т-Кл и Th прямо взаимосвязана численность Кл 3-го типа..

Взаимосвязи Акт(ЯОР) иммуноцитов с лейкоцитами выглядят иначе в МЖ после ЛТ. Так, Акт(ЯОР) Лф коррелировали (обратно) с ПКл Пар, Акт(ЯОР) ПКл не взаимосвязаны с морфометрическими показателями лейкоцитов. Спектр субпопуляций Лф, взаимосвязанных с Акт(ЯОР) иммуноцитами заметно сужен (схема 3) : Взаимосвязь с CD5+ Т-Кл становится прямой, с В-Кл (IgíT) и Ts/c (CD8+)-обратной. Взаимосвязи Акт(ЯОР) Лф и ПКл с ЯОР эпителия и стромы весьма сходны независимо от лучевого воздействия : Акт(ЯОР) Лф прямо взаимосвязаны с ДиспЯОР СТК Кл, Акт(ЯОР)ПКл обратно коррелировали с ЯОР,ядрышками,ДиспЯОР эпителия.

Непосредственно в Оп после ЛТ по сравнению с внеопухолевыми участками, достоверно возрастали МИ эпителия (3,9±1.1 и 0,6+0.44). количество Лф Пар (2,0340.7 и 0,240,1), и уменьшались количество Тч Кл (0.140.03 и 1,03+0,24). площадь Сое Стр (2.3±0,7 и 10,9+1.0), численность Гр Стр (0.4+0,3 и 0.6±0.21). По сравнению с РМЖ до ЛТ, после ЛТ в Оп достоверно уменьшалось количество Эпит Кл (105.8+8.7 и 148.34417,12 до ЛТ) и возрастал их МИ (3,9±1,1 и 1,69±0,5). Паренхиматозно-стромальные взаимоотношения характеризовались утратой согласованности в изменениях показателей внутри Пар,между Пар и Стр.Так, в Пар сохраняется прямая взаимосвязь Лф - ПКл и появляется обратная корреляция между ПКл и площадью Пар. В строме Оп. как и jo ЛТ, прямо коррелировали Лф и ПКл, Тч Кл и площадь Сое. Паренхиматозно-стромаль-ные взаимосвязи ограничены прямыми корреляциями:Лф Пар-Лф Стр. МИ эпителия-МИ СТК Кл, и обратной-МИ эпителия Тч Кл.

Характер и уровень экспрессии HLA антигенов Оп под влиянием ЛТ не изменялся, однако непосредственно в опухолевом эпителии достоверно выше экспрессия HLA-DR. чем в соответствующем внеопу-холевом (83,345.6% и 62,545,9%). Показано,что у больных после ЛТ уровни экспрессии HLA-I опухолью и внеопухолевым эпителием прямо взаимосвязаны.' При этом, в опухолевой Пар после ЛТ В-Кл (IgM+) содержалось достоверно меньше, чем во внеопухолевой (2.4±1,6 и

16

12,5+2,9) и Стр облученной Оп (16,7+3.2), а так же в паренхиме Оп до ЛТ (20,0+8,2). Кроме того, в отроме Оп после ЛТ, по сравнению со Стр Оп до ЛТ, снижалось количество Тг/с (4,8+2,2 и 15,0±5,5). В опухолевых тканях после ЛТ не обнаруживались Лф, продуцирующие ИЛ-2. Прямые корреляции между количествами одноименных субпопуляций Лф в опухолевой Пар и Стр после ЛТ (Ш-СП1б+, активированные Лф СИЗО*), охватывали меньше пубпопу-ляций Лф, чем до ЛТ.

Как и в Оп до ЛТ, после ЛТ в эпителии преобладали Кл 2-го типа ЯОР. При этом, показатели ЯОР Оп, подсчитанные общепринятым и предлагаемым нами способами, достоверно не изменялись под влиянием ЛТ. Показано, что у больных после ЛТ ЯОР-показатели Оп выше, чем в соответствующем внеопухолевом эпителии (ЯОР:10,81+1,32 и 4.97+0,56: ДиспЯОР: 9.0411,46 и 1,4210,43). ЯОР СТК Кл облученной Оп достоверно вше аналогичного показателя не только соответствующей внеопухолевой МЖЦ1.13±1,09 и 5,08±0.5), но и СТК Кл Оп до ЛТ (7,37±1,49). По сравнению с внеопухолевой МЖ. в оИ после -ЛТ достоверно больше Акт(ЯОР) Лф (65,0915,4 и 29,33+5.82). Показано, что количества Акт(ЯОР) Лф и ГЖл в Оп достоверно не изменяются под влиянием ЛТ.

Можно предполагать, что после ЛТ активность ЯОР Оп и экспрессия НЬА эпителием наименее согласованы как по сравнению с соответствующей внеопухолевой НИ. так и с РМЖ до ЛТ (схемаП : отмечена одна (прямая) -корреляция между яжрышками Кл 2-го типа и экспрессией НЬА-1. С морфометрическими показателями лейкоцитов отмечены прямые взаимосвязи - с Лф Пар и Стр : ЯОР. ДиспЯОР (общепринятый подсчет), ЯОР Кл 2-го типа; с Лф пар : ЯОР Кл 1-го типа: Лф стр : ДиспЯОР Кл 2-го типа. С ПКл и Гр Стр : ядрышки Кл 1-го типа, кроме того, с гранулоцитами - ЯОР Кл 1-го типа. Взаимосвязи с отдельными субиопуляциями Лф существенно изменяются (схема 2) : с активированными (С030+) Лф обратно взаимосвязано количество Кл 2-го типа, с В-Кл (С037+) прямо коррелировала численность Кл 3-го типа.

Примечательно, что Акт(ЯОР) Лф и ПКл в Оп после ЛТ утрачивали взаимосвязи между собой, с морфометрическими показателями лейкоцитов и ЯОР показателями Зпит и СТК Кл. Из всех определяемых в данной работе субпопуляций Лф, только В-Кл взаимосвязаны (прямо) с Акт(ЯОР) ПКл, тогда как Акт(Я0Р)Лф "изолированы" от Лф

17

отдельных субпопуляций (схема 3).

Таким образом, корреляционные взаимосвязи, включающие характеристики экспрессии НЬА-антигенов эпителием, качественный состав лимфоплазмоцитарных инфильтратов, показатели активности ЯОР эпителия. СТК Кл и иммуноцитов позволили выявить изменения и нарушения паренхиматозно-стромальных взаимоотношений как в облученной Оп. так и в соответствующей внеопухолевой МЖ.

ВЫВОДЫ

1. Существенные изменения паренхиматозно-стромальных взаимоотношений (рассогласование между показателями паренхимы и стромы., "внутри" них) после лучевой терапии рака молочной железы касаются не только опухоли непосредственно, но и внеопухолевых участков органа.

2. Показатели ЯОР опухолевых клеток не изменяются под влиянием лучевой терапии, тогда как активность ЯОР стромальных клеток молочной железы достоверно возрастает.

3. Эпителиальным клеткам молочной железы с разной активностью ЯОР (которой соответствуют клетки трех типов распределения ЯОР в предлагаемой схеме учета) свойственны как прямые, так и обратные взаимосвязи с представительством клеток специфического иммунитета, неспецифической резистентности и уровнем экспрессии НЬА эпителием.

4. Уровень экспрессии НЬА-1 и НЬАЧЖ антигенов опухолевым и внеопухолевым эпителием не отличается у больных до и после лучевой терапии, но после облучения внеопухолевый эпителий содержит достоверно меньше экспрессирующих НЬА-ОЙ клеток, чем непосредственно опухолевый. '

5. Изменения местного иммунного гомеостаза тканей рака молочной железы после лучевой терапии характеризуются не столько численными различиями присутствуювдх клеток-эффекторов, сколько изменениями их функциональных возможностей, оцениваемых в системах корреляционных взаимосвязей : активированных (ЯОР) иммуноцитов с их общими количествами, субпопуляционным составом лимфоцитов, биосинтетической активностью ЯОР эпителия и стромы; количеств одноименных субпопуляций лимфоцитов в паренхиматозном и

стромальном компонентах молочной железы.

18

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Оценка морофункционального состояния молочной железы после облучения РМЖ должна включать анализ паренхиматозно-стро-мальных взаимоотношений как в опухоли, так и во внеопухолевых тканях в однотипных системах взаимосвязей, включающих традиционные морфометрические характеристики, показатели ЯОР и количественные результаты иммунофенотипирования.

2. Учет импрегнированных зон ЯОР необходимо проводить с параллельным изучением уровня экспрессии HLA антигенов эпителием, поскольку усиление активности ЯОР взаимосвязано с потерей экспрессии HLA антигенов, обеспечивающих доступность к иммунологическому распознаванию.

5. Изменения в состоянии функциональной сохранности местных иммунокомпетентных клеток позволяет предполагать анализ корреляционных взаимосвязей активированных (ЯОР) иммуноцитсв с общими количествами клеток специфического иммунитета и неспецифической резистентности, лимфоцитами, экспрессирущими антигены активации, активностью ЯОР эпителия и стропы.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Абросимов А. ю.. Дубенская Л. И. Общие и местные проявления нарушений иммунитета у больных раком молочной железы I—II стадии. //Материалы докладов студенческой научной конференции Тбилисского медицинского института. - Тбилиси. 1985. - С. 141-142.

2. Доросевич А. Е., Дубенская Л. И., Никифорович П. А. Маркеры рака молочной железы как блокирующие факторы, объясняющие один из механизмов несостоятельности иммунологического надзора. //Тезисы докладов Смоленской областной научно-практической конференции онкологов.- Смоленск, 1987.- С.36-37.

3. Доросевич А. Е.. Баженов'С. М., Наперстникоз В. В., Дубенская Л. И. Последовательность изменений в системе зпителий-строма предрака и рака молочной железы как один из критериев иммунодефицита. //Всес. съезд патологоанатомов. 8-й: Тезисы докладов. - Тбилиси.1989.- С. 183-184.

4. Дубенская Л.И., Баженов С.М.. Доросевич А.Е. Особенности паренхиматозного и стромального компонентов рака молочной железы после лучевой терапии как уточнение неблагоприятного прог-

хэ

ноза. //Актуальные вопросы клинической онкологии : Тезисы докладов,- Томск, 1989,- Раздел 2.-С. 33-35.

5. Дубенская Л.й.. Баженов С.М.. НикйФорович А.Е. Взаимосвязи некоторых иммунологических показателей периферической крови у больных раком молочной железы II-III стадии. //Иммунология и проблемы прогнозирования : Тезисы докладов.- Смоленск,1990.-С. 74-78

6. Дубенская Л. И.. Доросевич А.Е., Абросимов C.D., Баженов С.Н., Никифорович П. А. Использование моноклональных антител при изучении лучевого патоморфоза рака молочной железы. //Актуальные вопросы патологической анатомии заболеваний населения Урала и Западной Сибири:Тезисы докладов I межрегиональной конференции патологоанатомов. /Под ред. В.Л.Коваленко,

B.Г.Бычкова. - Тюмень, 1991,- С.49-50.

7. Дубенская Л.й., Баженов С.М. Белки, ассоциированные с зонами ядрышкоЕого организатора : практическое применение в онкомор-Фологии и связь с биологическими особенностями опухоли. //Арх. пат,- 1992.- N 4. - С. 40-43.

8. Доросевич А.Е., Дубенская Л.И.. Барышников А.Ю.. Абросимов

C. Ю. Экспрессия ряда лейкоцитарных и нелейкоцитарных антигенов в тканях рака молочной железы при местном радиационном воздействии как морфологические проявления взаимодействия клеток паренхимы и стромы опухоли. //Арх. пат. 1994.- N 3.-С. 51-56.

9. Дубенская Л.И., Доросевич А.Е., Баженов С.М., Наперстникив В. В. Результаты расширенного учета реакции AgNORs в изучении паренхиматозно-стромальных взаимоотношений рака молочной железы. //Бюлл. экспер. биол.- 1995 (принята в печать).

Формат бумаги 00XSI7n Тир. 100 Зак.6482 Псч. листоа 1

Смоленская городская типография Индекс 2140С0, ул. Маршала Жукова. 15