Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуногенная и протективная активность анатоксина, полученного детоксикацией и инактивацией туберкулезных токсино-аллергенов

На правахрукописи

ТИМКОВА Елена Анатольевна

ИММУНОГЕННАЯ И ПРОТЕКТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ АНАТОКСИНА, ПОЛУЧЕННОГО ДЕТОКСИКАЦИЕЙ И ИНАКТИВАЦИЕЙ ТУБЕРКУЛЕЗНЫХ ТОКСИНО-АЛЛЕРГЕНОВ

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Курск - 2005

Работа выполнена на кафедре фтизиатрии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации» и лаборатории туберкулеза Курского НИИ агропромышленного производства

Научный руководитель : доктор медицинских наук, профессор

Коломиец Владислав Михайлович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Вельский Валентин Васильевич

кандидат медицинских наук Бондаренко Яна Ивановна

Ведущая организация : Воронежская государственная

медицинская академия имени Н.Н. Бурденко

Защита диссертации состоится « года в

«//у» часов на заседании диссертационного советаЛ. 208.039.01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет». (30504, г. Курск, ул. К. Маркса, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Минздрава России

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета

2005 г.

КАЛУЦКИЙ П.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Широкое и повсеместное распространение туберкулеза, наличие более 50 видов микобактерий, резкое повышение лекарственной устойчивости возбудителя к традиционным и новым средствам химио- и антибиотикотерапии, высокий процент смертности представляют серьезную медицинскую и социальную проблему (Пе-рельман М.И., 2001; Ридер ГА, 2001).

Во второй половине 80-х годов XX столетия создавалось впечатление, что профессия фтизиатра со дня на день канет в лету и армии борцов с чахоткой придется искать новую профессию. Однако с начала 90-х годов в России, да и во многих странах мира туберкулез вновь стал глобальной проблемой (Хоменко А.Г., 1996).

Среди инфекций туберкулез является наиболее используемой моделью в иммунологии и аллергологии. Почти нет теоретической проблемы иммунологии, которую не изучали бы с помощью микобактерий туберкулеза, туберкулина, вакцины БЦЖ (Авербах М.М., 1984; Адо А.Д., 1970; Литвинов В.И., 1974; Гордон А., Алистер Р., 2002).

В настоящее время пока нет достоверных сведений о том, какие компоненты (белки, липиды, полисахариды, нуклеиновые кислоты) индуцируют протективный эффект. Однако, очевидно, что для определения защитного эффекта важны адъювантное действие микобактерий и длительное персистирование иммуногенных антигенов в организме (Литвинов В.И. и др. 1996; Chaparas D., 1982).

Одним из критериев оценки вакцинных препаратов является уровень их иммуногенной активности, в первую очередь, способности вызывать выработку специфических антител. Однако методика серологической оценки иммунологической эффективности мало применима к вакцинам для профилактики ряда инфекций (бруцеллез, туляремия, туберкулез), в патогенезе которых ведущая роль принадлежит клеточному иммунитету. Иммуногенная эффективность соответствующих вакцин может оцениваться по профилактической эффективности и проявлению клеточного иммунитета или путем постановки кожно-аллергических проб (Медуницын Н.В., 2001; Еремеев В.В., 2001).

В то же время продолжаются исследования по получению и применению туберкулезного анатоксина, так как при других болезнях аналогичными препаратами достигнуты весомые результаты (Воробьев А.А., 1999; Ramon G., 1957).

Исходя из вышеизложенного следует, что одним из направлений предупреждения туберкулеза является поиск иммуногенных и протек-тивных антигенов из микобактерий с целью производства на их основе технологически выгодных и экологически безопасных эффективных биопрепаратов для специфической профилактики и лечения туберкулеза.

Цель и задачи исследований. Целью предпринятого исследования явилось изыскание оптимальных способов получения туберкулезных токсино-аллергенов, их детоксикации и инактивации для изготовления и применения специфических протективных биопрепаратов против туберкулеза.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать питательные среды для выделения и выращивания микобактерий туберкулеза (МБТ) при получении туберкулезных токси-но-аллергенов.

2. Определить оптимальный способ деструкции МБТ, детоксика-ции и инактивации формалином туберкулезных токсино-аллергенов;

3. Разработать рациональный и экологически безопасный способ получения туберкулезного анатоксина;

4. Изучить иммуногенные и протективные свойства туберкулезного анатоксина.

Научная новизна. Определены общие закономерности подбора химических ингредиентов жидких синтетических питательных сред для выращивания микобактерий туберкулеза при изготовлении протектив-ного биопрепарата. Выявленная устойчивость продуктов деструкции микобактерий туберкулеза к термическому воздействию позволила использовать водно-термическую обработку микроорганизмов для получения водорастворимых молекулярных токсино-аллергенов, а в последующем научно обосновать возможность их детоксикации и инактивации 0,8 % раствором формалина в два этапа при изготовлении анатоксина и использовать разработанную иммуноаллергическую модель для контроля процесса детоксикации формалином токсино-аллергенов.

Установленная иммунопротективная активность туберкулезного анатоксина к заражению микобактериями туберкулеза на морских свинках и кроликах позволила определить оптимальную дозу 2-3 мл на одно животное и сроки двукратной вакцинации с интервалом 14-21 день и ревакцинации через 7-8 месяцев на фоне кратковременной (в течение 35 месяцев) чувствительности животных к туберкулину.

Практическая ценность. Разработан и апробирован состав и способ приготовления жидкой синтетической среды для оптимального выращивания микобактерий туберкулеза с целью получения токсино-аллергенов.

Разработанная технология изготовления туберкулезного анатоксина путем детоксикации и инактивации токсино-аллергенов формалином в два этапа с последующей сорбцией на гидроокиси алюминия позволяет получить высокоэффективный протективный биопрепарат, способный вызывать у вакцинированных лабораторных животных аллерген-нейтрализующие и преципитирующие антитела.

Апробация работы. Основные материалы доложены и обсуждены на итоговой научной сессии Курского государственного медицинского университета (1997); научной конференции Курской СХА (2002); международных конференциях (Одесса, 1999, С-Петербург, 2004).

Публикации. По результатам исследований опубликовано 11 печатных работ и получен патент на «Способ получения туберкулезного анатоксина», № 2161984 бюл. № 2 от 20.01.2001 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты разработок оптимального состава плотной и жидкой синтетической питательной среды для выделения и выращивания мико-

бактерий туберкулеза с целью получения туберкулезных эндотоксино-аллергенов;

2. Способы деструкции микобактерий туберкулеза, детоксикации и инактивации формалином туберкулезных токсино-аллергенов;

3. Материалы изыскания рационального и экологически безопасного способа получения туберкулезного анатоксина;

4. Обоснование иммуногенных и протективных свойств туберкулезного анатоксина.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 124 страницах компьютерного текста и состоит из общей характеристики работы, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов, практических предложений.

Диссертация иллюстрирована 10 таблицами, 3 рисунками. Список использованной литературы включает 202 источника, в том числе 71 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

Выращивание микобактерий туберкулеза проводили на жидкой синтетической среде для получения токсино-аллергенов и их детокси-кации и дезаллергизации 0,8 % раствором формалина и сорбции на гидроокиси алюминия. Редуцирующее действие формалина на токсино-аллергены изучали на разработанной биологической модели аллергии с использованием сенсибилизированных морских свинок.

Деструкцию выращенных микобактерий туберкулеза на жидкой синтетической среде проводили посредством водно - термической обработки в автоклаве при 1,0 атм. (1,0±0,2 х 105 Па) от 1 часа до 3-х часов.

Изучение аллергизирующих свойств туберкулезного анатоксина проводили на морских свинках после 2-3-х кратной вакцинации животных с интервалом 14 дней по внутрикожной пробе в динамике развития поствакционального процесса с применением стандартного раствора туберкулина в разведении 1:100 и 1:500 (50 ТЕ и 10 ТЕ в 0,1 мл).

Для определения протективных свойств туберкулезного анатоксина морских свинок и кроликов опытных и контрольных групп через два месяца после вакцинации заражали взвесью возбудителя туберкулеза бычьего вида (штамм Балле) и человеческого вида (штамм 192) в дозе 0,001 и 0,0001 мг/см3. За клиническим состоянием животных вели наблюдение на протяжении 3-х месяцев, а затем морских свинок и кроликов эутаназировали оглушением и проводили патологоанатомические и бактериологические исследования.

Гипериммунную сыворотку получали после шестикратной вакцинации кроликов туберкулезным анатоксином в дозе 2,0-2,5 мл с интервалом 5-6 дней. Полученную сыворотку после отделения форменных элементов крови консервировали мертиолятом в разведении 1:10000.

Преципитирующие антитела гипериммунной сыворотки определяли с использованием нативных токсино-аллергенов (туберкулина без воздействия коагулянтов) в реакции иммунодиффузии в агаре (РИД) путем выдерживания чашек Петри с 2,5 % агара в термостате при 37 С в течение 24-48 часов.

Аллергеннейтрализующие антитела изучали путем смешивания цельной гипериммунной сыворотки и ее разведений 1:5 и 1:10 с туберкулином (50000 ТЕ/мл) в соотношении 1:1 и последующим выдерживанием смеси в термостате в течение 6-12 часов при 42° С и определением утраты аллергенных свойств на сенсибилизированных морских свинках по внутрикожной пробе с учетом реакции через 24 часа по гиперемии кожи. Дополнительные методы и материалы исследований использованы в соответствии с санитарными правилами (СП МЗ РФ 3.3.2.561-96) -М.-1998.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изыскание синтетической питательной среды для выращивания и выделения микобактерий туберкулеза

В результате поисковых вариантов исследований был сконструирован состав жидкой синтетической среды с повышенным содержанием

лимонной кислоты до 7 г на 1 литр и гликокола до 4,0 при снижении концентрации аспарагина до 1 г. Изучение ростовых свойств приготовленных семи вариантов питательных сред проводили с разным количеством вносимых ингредиентов и показателем рН от 6,2 до 7,4.

Для улучшения буферного состояния в состав разрабатываемой среды вносили бикарбонат натрия, хлористый натрий, а для повышения поверхностного натяжения и обеспечения поддержания пленки микобактерий на поверхности среды был испытан сернокислый цинк.

По результатам роста и накопления бактериальной массы установлен следующий оптимальный состав в граммах синтетической среды: рН 6,6±0,1; лимонной кислоты -7,0±0,5, гликокола 4,0, аспарагина 1,0; цитрата аммония-2,5; фосфорнокислого двузамещенного калия- 5,0; сернокислого магния- 0,7; хлористого натрия-0,3; сернокислого железа-0,05; сернокислого цинка-0,2; хлористого кобальта-0,1 глицерина 50 мл и дистиллированной воды до 1 литра. Нейтрализация кислой реакции среды проводится аммиаком до 6,8-6,9 перед автоклавированием при 1,0 атм. в течение 30 минут.

Питательные свойства предложенной синтетической среды не изменяются как при последовательном растворении ингредиентов, так и после предварительного смешивания их в сухом виде.

Накопление сухой бакмассы после 2-х месячного выращивания микобактерий туберкулеза после автоклавирования составляет в среднем 12,5±0,5 г/л, а влажной 120± 10 граммов.

Накопление микробной массы микобактерий туберкулеза представлены рисунком 1.

дни роста

Рис. 1. Динамика накопления бактериальной массы на синтетической среде

Сравнительная оценка разных методов деструкции микобактерий туберкулеза для получения растворимых эндотоксино-аллергенов

Из анализа результатов исследования культуральной жидкости следует, что микобактерий туберкулеза практически не выделяют в окружающую жидкую синтетическую среду туберкулопротеины и комплексные с ним соединения. Наличие до 0,20 мг/мл туберкулопротеина в культуральной жидкости можно объяснить за счет длительного взаимодействия температуры (37°С) и воды в течение 30-60 дней выращивания микобактерий туберкулеза и связанных с этим физиологических процессов деструкции и аутолиза микроорганизмов.

Учитывая, что все белково-липидо-полисахаридные компоненты и нуклеиновые кислоты являются иммуногенными и обладают в сочетании с адъювантами протективными свойствами (М.М. Авербах, 1976; В.В. Еремеев, 2001) были проведены исследования по изучению их состава и свойств, а также редуцирующего действия формалина на аллергенную активность с целью изготовления иммунопротективного препарата.

Биологические свойства и химический состав культурального фильтрата после 2-х месячного выращивания микобактерий туберкулеза на синтетической среде до и после автоклавирования и повторной водно-термической обработки микробной массы, представлены в таблице 1.

Из данных представленных в таблице 1 следует, что продукты водно-термической обработки микобактерий туберкулеза содержат полный набор биологически активных веществ и обладают высокой аллергенной активностью. Культуральный фильтрат после автоклавиро-вания микобактерий туберкулеза при 1 атм. в течение 60 минут при содержании эндотуберкулопротеина 0,70+0,04 мг/мл, полисахаридов 0,08 ±0,01 мг/мл, липидов 0,09 ± 0,01 мг/мл, РНК - 0,006+0,001 мг/мл и ДНК - 0,028+0.02 мг/мл обладает аллергенной активностью 52000+3000 ТЕ/мл (международных или туберкулиновых единиц, принятых в последнее время), установленной при титрации на сенсибилизированных (аллергизированных) морских свинках.

Таблица 1 - Химический состав и аллергенная активность продуктов водно-термического гидролиза микобактерий туберкулеза

№ п/п Показатели мг/мл Культуральный фильтрат 60-дневной туберкулезной культуры Водно-термический гидролизат бакмассы 200 г/л при 1 аггм.

До авто-клавиро-вания После автоклавирования 1 час 2 часа 3 часа

1 атм. 30 минут 1 атм. 3 часа

1 Белок 0,18±0,02 0,70*0,04 1,34±0,04 0,38+0,02 0,72±0,04 0,82±0,04

2 Полисахариды - 0,08±0,01 - 0,04±0,01 0,08±0,01 0,09±0,04

3 Липиды - 0,09±0,01 - 0,05±0,01 0,09+0,01 0,10±0,01

4 РНК - 0,006±0,001 - 0,003+0,001 0,006±0,001 0,007+0,01

5 ДНК - 0,028±0,002 - 0,016±0,002 0,028+0,002 0,032±0,002

6 Аллергенная активность ТЕ/мл 52000±3000 95000±5000 30000+3000 5300013000 60000+3000

Увеличение режима стерилизации показало, что автоклавирование микобактерий туберкулеза после шестидесятидневного роста на синтетической среде в двухлитровых биобутылях с объемом жидкости равной 1 литру и накоплении 120-130 г влажной бакмассы при 1 атм. (1,0±0,2 х 105 Па) в течение 3-х часов обеспечивает поступление в куль-туральную жидкость до 1,34±0,02 мг/мл туберкулопротеина, обладающего аллергенной активностью равной 95000±5000 ТЕ/мл.

Результаты сенсибилизации морских свинок и температурного воздействия на проявление реакции кожи на токсино-аллергены

Существующие модели, основанные на сенсибилизации (аллерги-зации) морских свинок живыми вирулентными МБТ или авирулентны-ми вакцины БЦЖ требуют соблюдения строгих мер безопасности на фоне падежа отдельных животных. Для изыскания безопасного средства и способа аллергизации морских свинок были использованы автоклави-рованные МБТ в суспензии различных адъювантов для образования депо на месте введения.

При этом было установлено, что на введение суспензии из убитых МБТ в минеральном масле и ланолине происходило образование у морских свинок гнойных абсцессов, а с гидроокистью алюминия не было. Последующие исследования показали, что суспензия, содержащая 5 г сухих автоклавированных микобактерий, 90 мл физиологического раствора и 10 мл гидроокиси алюминия (300 мг А12О3) при однократном подкожном введении морским свинкам в объеме 0,2-0,3 мл обеспечивала чувствительность кожи к туберкулину в течение 9-10 месяцев.

Разработанная биологическая модель аллергии была использована для изучения влияния охлаждения и перегревания на реактивность сен-

сибилизированных животных к туберкулину и определения редуцирующего действия формалина на токсино-аллерген (лат.reductю - снижение, утрата функций, свойств).

Для исследования использовали 32 морские свинки, сенсибилизированные убитыми микобактериями туберкулеза. Из них 12 морских свинок содержали в течение 24 часов до внутрикожного введения туберкулина при температуре 5±2°С, а вторая партия - 12 морских свинок подвергались 3-х кратному прогреванию при 45°С в термостате в течение 45 минут. Контролем служили 8 морских свинок, содержащихся при обычном температурном режиме 20-25°С.

Результаты исследования реактивности сенсибилизированных морских свинок, подвергнутых различным температурным воздействиям до и во время внутрикожного введения туберкулина, представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Средние величины диаметров воспаления кожи у аллергизи-рованных морских свинок, подвергнутых температурному воздействию

№ Кол-во Температурное Время Реакция Реакция кожи

п/п живот- воздействие учета Кожина в мм через

ж-х ных реакции 100 ТЕ 7 дней после

через в 0,1 мл температурного

в мм воздействия

на 100 ТЕ/мл

1 8 Контроль 20-25°С 24 часа 16±2 15±2

2 12 5 С в течение 24 часа 6,5 14,5±2

24 часов

3 12 45°С 3-х кратно 24 часа 6.5 15,5 ±2

по 1 часу в день

Установлено, что у аллергизированных морских свинок, подвергнутых переохлаждению или перегреванию, возникает полная анергия, сопровождаемая утратой реакции на туберкулин. Утраченное аллергическое состояние восстанавливается у морских свинок через 5-7 дней после перевода животных в нормальные температурные условия. Полученные результаты учитывались, как показания и противопоказания на введение туберкулина при изучении аллергенных свойств токсино-аллергенов и редуцирующего действия формалина на аллергенные свойства туберкулезного анатоксина.

Результаты изучения редуцирующего и инактивирующего действия формалина на туберкулезные токсино-аллергены

С учетом экспериментальных и клинических данных о лечебном и иммуномодулирующем действии туберкулина была поставлена задача получить из токсино-аллергенов микобактерий туберкулеза подобный анатоксину биопрепарат для профилактики туберкулеза.

С этой целью проведена инактивация и детоксикация туберкулезных токсино-аллергенов формалином.

Детоксикацию токсино-аллергенов, полученных воднотермиче-ской деструкцией МБТ 1,34 мг/мл проводили раствором формалина в два этапа с интервалом через 9-10 дней для получения конечной его концентрации 0,8 %.

Водный раствор формалина СН2=0, содержащий 37 % формальдегида вносили с таким расчетом, чтобы на первом этапе его содержание соответствовало 0,6 % концентрации. Это достигалось внесением 5,76 мл раствора формалина, а через 7-9 дней дополнительно прибавляли 1,92 мл формалина на 1 л раствора токсино-аллергена, чтобы получить его концентрацию 0,8 %.

В результате полная инактивация туберкулезных токсино-аллергенов (1,34 мг/мл = 100000 ТЕ/мл) получена путем их обработки формалином в концентрации 0,8 %. Результаты инактивации токсино-аллергенов формалином представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Динамика редуцирующего действия формалина на туберкулезные токсино-аллергены

№ Аллергенная Исход- Повторное Продолжи- Остаточ- Остаточная %

п/п активность ная внесение тельность ное со- аллергенная поте-

токсино- концент- форма- детоксикации держание активность ри

аллергена рация лина при 45°С формали- токсино- актив-

(ТЕ/мл) формалина (в%) через 10 дней (в%) (в днях) на (в %) аллергенов (ТЕ/мл) ности

I 100000 0,4 - 10 0,30±0,05 25000+500 75

2 100000 0,3 0,3 20 0,42+0,02 50001500 94

3 100000 0,3 0,4 20 0,46±0,02 2500±200 96

4 100000 0,6 0,2 20 с последующим автокла-вированием при 1 атм. в течение 30 минут 0,60±0,02 Отсутствует 100

Полноту инактивации аллергенных свойств токсино-аллергенов определяли при постановке внутрикожных проб с различными разведениями токсино-аллергенов (1:1000, 1:2000) на морских свинках, сенсибилизированных убитыми МБТ в суспензии гидроокиси алюминия. При этом отмечалось снижение исходной концентрации формалина с 0,8 % до 0,6 %. Снижение концентрации формалина в растворе токсино-аллергенов (протеино-липидо-полисахаридный комплекс) происходит в результате его связывания с аминогруппами аминокислот.

Проверка полученных токсино-аллергенов на токсичность проводилась на морских свинках одинаковых по полу и возрасту, зараженных лекарственно-устойчивыми микобактериями туберкулеза, выделенными от больных туберкулезом людей. Контролем служили туберкулезный токсино-аллерген (100000 ТЕ/мл), не подвергнутый инактивации и де-токсикации формалином.

При этом установлено, что здоровые морские свинки резко реагировали уже через 5-10 минут на подкожное введение нативного туберкулезного токсино-аллергена, но падежа животных не было. В этих же условиях у морских свинок, зараженных микобактериями туберкулеза, отмечена стопроцентная гибель (8 голов) в течение 48 часов.

В то же время, здоровые и зараженные микобактериями туберкулеза морские свинки не реагировали на туберкулезный токсино-аллерген, подвергнутый инактивации и детоксикации формалином. С учетом полученных результатов по детоксикации и инактивации растворимого туберкулезного токсино-аллергена с помощью формалина в основу получения и изучения иммуногенных и протективных свойств был взят способ изготовления туберкулезного анатоксина, путем деток-сикации и инактивации исходных токсино-аллергенов формалином с возможной перспективой получения эффективной вакцины.

Материалы по получению и изучению протективных

и иммуногенных свойств туберкулезного анатоксина

Туберкулезный анатоксин готовили путем детоксикации и инактивации формалином нативного молекулярного туберкулезного ток-сино-аллергена. Для повышения исходной концентрации и аллергенной активности токсино-аллергенов использовали водно-термическую деструкцию микобактерий туберкулеза, выращенных на синтетической питательной среде в течение 3-х часов вместо 1 часа при 1,0 х 105 Па (1 атм.). При этом достигнуто увеличение содержания белка с 0,70+0,02 мг/мл до 1,34+0,02 мг/мл и аллергенной активности от 52000+3000 ТЕ/мл до 95000 ТЕ/мл. После детоксикации и инактивации токсино-аллергенов 0,8 % раствором формалина в два этапа (1,34 мг/мл =95000ТЕ/мл) проводили сорбцию инактивированных туберкулезных токсино-аллергенов проводили на гидроокиси алюминия, из расчета 1-3 мг окиси алюминия (А12О3) на 1 мл анатоксина. После сорбции анатоксина на гидроокиси алюминия в течение 12-15 часов проводили декантацию 50 % надосадочной жидкости, что позволяло увеличить концентрацию токсино-аллергенов вдвое. Полученный препарат расфасовывали и подвергали автоклавированию при 0,8 атм. в течение 30 минут. Таким образом, основные технологические этапы изготовления туберкулезного анатоксина заключаются в следующем (рис.2).

Выращивание микобактерий туберкулеза в течение 60 дней в 2-х литровых биобутылях с объемом синтетической среды 1,0 л до получения 110-130 г

_влажной массы микроорганизмов_

_1_

Автоклавирование туберкулезной культуры при 1,0 атм. в течение 3-х часов

_до содержания 1,34±0,02 мг/мл туберкулопротеина_

_1_

Отделение культуральной жидкости от автоклавированных микобактерий туберкулеза фильтрацией через 3-5 слоев марли и фильтрующие ("Ф")

_пластины на фильтре Зейтца_

_;__

Детоксикация и инактивация токсино-аллергенов при 45°С в два этапа путем прибавления 5,76 мл (0,6 %) и 1,92 мл (0,2 %) формалина с интервалом 7 дней к 1 л раствора токсино-аллергенов 1,34±0,02 мг/мл (95000±10% ТЕ/ мл

_;_

Контроль на остаточное содержание формалина и полноту детоксикации и инктивации токсино-аллергенов на морских свинках, сенсибилизированных

_вакциной БЦЖ или убитыми микобактериями туберкулеза_

_*_

Сорбция инактивированных токсино-аллергенов на гидроокиси алюминия из расчета 1-3 мг окиси алюминия на 1 мл анатоксина в течение 12-15 часов

_(40 мл 25 мг/мл на 1 л)_

_i_

Декантация надосадочной жидкости (50 % от общего объема) для повышения концентрации препарата вдвое, т.е. до 2,68±0,02 мг/мл

_i_

Расфасовка препарата по флаконам и автоклавирование при 0,8 атм. _в течение 30 минут, этикетировка, упаковка препарата_

Рис.2 - Технология получения туберкулезного анатоксина

Предлагаемая оптимизированная технология изготовления туберкулезного анатоксина легко осуществима и основана на общем принципе детоксикации токсичных и инактивации аллергенных свойств токсинов и аллергенов.

Результаты определения десенсибилизирующих и аллергизирующих свойств туберкулезного анатоксина

Изучение десенсибилизирующих свойств туберкулезного анатоксина проводили на морских свинках, сенсибилизированных инактиви-рованными микобактериями туберкулеза (14 голов) и вакциной БЦЖ (16 голов), которым за 24-72 часа до внутрикожного введения 0,1 мл туберкулина в разведении 1:100 (50 ТЕ) ввели подкожно 2,0 мл тубер-

кулезного анатоксина. При этом было установлено, что туберкулезный анатоксин при подкожном введении сенсибилизированным морским свинкам подавляет кожную чувствительность к туберкулину в период от 3-х до 12 дней, но по истечении 15 суток у животных чувствительность к туберкулину полностью восстанавливается.

В последующем было установлено, что двух - и трехкратное подкожное введение здоровым морским свинкам туберкулезного анатоксина в объеме 2,0 мл с интервалом 10 дней не вызывало ответных аллергических реакций на внутрикожное введение 0,1 мл туберкулина (50 ТЕ) по истечении 10 суток после третьей инъекции препарата. Однако спустя 20 суток после 3-й инъекции туберкулезного анатоксина у морских свинок появилась чувствительность на внутрикожное введение туберкулина.

Полученные результаты дают основание считать, что туберкулезный анатоксин способен кратковременно аллергизировать организ-мморских свинок, т.е. вызывать у них чувствительность к туберкулину.

Указанная чувствительность к туберкулину у морских свинок на постоянном уровне сохранялась в течение 120+10 дней, а затем постепенно реакции на внутрикожное введение туберкулина у морских свинок угасали и практически по истечении 150-200 суток эти реакции не проявлялись.

Результаты изучения протективной активности туберкулезного анатоксина

Протективные свойства туберкулезного анатоксина изучали с использованием морских свинок и кроликов после их двукратной иммунизации с последующим заражением микобактериями туберкулеза бычьего и человеческого видов. Результаты протективной активности разных вариантов туберкулезного анатоксина при заражении морских свинок и кроликов 0,0001 мг микобактериями туберкулеза человеческого вида штамма № 192 представлены в таблице 4.

Из результатов по изучению протективной активности туберкулезного анатоксина следует, что надежную защиту от заражения туберкулезом морских свинок и кроликов обеспечивает туберкулезный анатоксин, приготовленный из токсино-аллергенов с аллергенной активностью 200000 ТЕ/см3 (2,68 мг/см3) до их полной детоксикации и инактивации формалином.

Для повышения техники безопасности при изготовлении туберкулезного анатоксина вместо вирулентных микобактерий туберкулеза бычьего вида штамма Уа11ае и человеческого вида штамма № 192 проводили выращивание авирулентных микобактерий туберкулеза бычьего вида вакцины БЦЖ на жидкой синтетической среде и последующее получение препарата по вышеуказанной технологии изготовления. По протективной активности предложенный препарат не отличался от вышеуказанных.

Таблица 4 - Результаты протективной активности разных вариантов туберкулезного анатоксина (ТА)

№ п/п Содержание ТЕ и протеина в 1 мл токсино-аллергена при получении ТА Виды и количество животных Способ вакцинации (2,0 мл подкожно) Количество животных

Пало через- Убито через'

60 дней 90 дней 90 дней

1 100000 ТЕ/мл и 1,34 м г/см3 протеина Морские свинки 6 голов Двукратно с интервалом 14 дней 1 2 3 отмечены поражения в печени, л/узлах

2 150000 ТЕ/мл н 2,68 мг/см3 протеина Морские свинки - 6 голов Кролики - 4 головы Двукратно с интервалом 14 дней Двукратно с интервалом 14 дней У 6 морских свинок отмечены поражения в почках, л/узла\ У 4-х кроликов поражения в печени, л/узлах

3 200000 ТЕ/мл и 2,74 мг/см3 туберкулогтротеина (токсино-аллергена) Морские свинки -18 голов Кролики - 7 голов Дву кратно с интервалом 14 дней Двукратно с интервалом 14 дней - - 18 голов отсутствуют поражения 7 голов отсутствуют поражения

4 Контроль 4 морские свинки 2 кролика Не вакцинированы 1 морская свинка 3 морские свинки 2 кролика

На полученный туберкулезный анатоксин из продуктов деструкции микобактерий БЦЖ получен патент № 2161984 от 20.01.2001 г.

Результаты изучения иммуногенной активности туберкулезного анатоксина

С целью изучения иммуногенной реактивности организма на введение туберкулезного анатоксина исследовали иммунную сыворотку. Для получения ее были взяты кролики массой 2,5-3,0 кг, которым 6-ти кратно подкожно в 2-3 точки вводили туберкулезный анатоксин в объеме 2,0 мл с интервалом 5-6 дней. На 10 сутки после окончания иммунизации получали сыворотку, которую консервировали мертиолятом в разведении 1:10000. Полученную сыворотку изучали на наличие аллер-геннейтрализующих и преципитирующих антител.

Результаты инактивирующего действия иммунной сыворотки на аллергенные свойства туберкулина, проведенные на сенсибилизированных морских свинках, представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Динамика инактивирующего действия специфической иммунной сыворотки на аллергенную активность туберкулина (токсино-аллергена)

№ п/п Разведения иммунной сыворотки Кол-во морских свинок Исходная аллергенная активность туберкулина Аллергенная активность после воздействия иммунной сыворотки на туберкулин Снижение аллергенной активности туберкулина в%

1 Цельная 6 50000 ТЕ/мл 20000 ТЕ/мл 60%

2 1:5 6 50000 ТЕ/мл 30000 ТЕ/мл 40%

3 1:10 6 50000 ТЕ/мл 40000 ТЕ/мл 20%

4 1:20 6 50000 ТЕ/мл 50000 ТЕ/мл Снижение аллергенной активности не установлено

5 Контроль 4 Без иммунной сыворотки 50000 ТЕ/мл Снижение аллергенной активности не установлено

Из данных, представленных в таблице 5, следует, что специфическая иммунная кроличья сыворотка, полученная после иммунизации туберкулезным анатоксином цельная и в разведении 1:5 и 1:10 после

15

выдерживания в смеси с туберкулином в термостате при 42-43°С в течение 6-12 часов вызывает снижение аллергенной активности нативного туберкулина соответственно на 60 %, 40 % и 20 %.

Для выявления уровня преципитирующих антител использовали реакцию иммунодиффузии в агаре.

Приготовление геля агара «Дифко» проводили путем внесения 2,5 грамма агара в стеклянную колбу с 100 мл фосфатного буфера с рН =7,2, которую затем ставили на баню с водой и доводили до кипения и полного расплавления агара. Расплавленный агар вносили в чашки Петри и оставляли в течение часа в покое с притертыми крышками. В уплотненном слое геля делали отверстие (лунки).

Контролем служила нормальная, не иммунная сыворотка кролика. В центральную лунку вносили 0,2 мл нативного растворимого токсино-аллергена с аллергенной активностью 50000 ТЕ/мл, а в лунки, расположенные вокруг центральной, вносили по 0,2 мл иммунной кроличьей сыворотки и нормальной в цельном виде и в разведении 1:5 и 1:10 и ставили в термостат при 37°С, с последующим визуальным просмотром через 24, 36 и 48 часов на наличие полосы преципитации на границе диффузии сывороток и антигена. При этом было установлено, что полосы преципитации были выявлены во всех случаях, где использовалась иммунная сыворотка и отсутствовала с нормальной сывороткой.

Из полученных данных следует, что туберкулезный анатоксин после 6-ти кратного подкожного введения кроликам в объеме 2,0 мл вызывает образование в организме аллергеннейтрализующие и преципи-тирующие антитела.

ВЫВОДЫ

1. Для получения туберкулезного токсино-аллергена разработана и апробирована жидкая синтетическая питательная среда, содержащая в граммах на 1 литр дистиллированной воды следующие ингредиенты: лимонной кислоты -7,0; лимоннокислого аммония 2-х замещенного (цитрат аммония) -5,0; гликокола - 4,0; аспарагина -1,0; сернокислого магния - 0,7; фосфорнокислого калия -5,0; сернокислого цинка -0,20; хлористого натрия - 0,3; сернокислого железа -0,05; хлористого кобаль-та-0,1; глицерина - 50 мл. Нейтрализация среды проводилась аммиаком до рН 6,8 ±0,1 перед автоклавированием при 1,0 атм. (1,0+0,2 х 105) Па в течение 30 минут. Ее использование позволяет при росте микобактерий туберкулеза в течение 50-55 дней получать повышенное накопление бактериальной массы до 12,0±0,5 г/л (сухого вещества).

2. При создании иммуно-аллергической модели для изучения аллергических реакций доказана возможность сенсибилизации морских свинок не только микобактериями БЦЖ, но и убитыми микобактериями туберкулеза человеческого или бычьего видов (10 мг/мл) путем подкожного введения суспензии с 3-5 мг/мл гидроокиси алюминия в объеме 0,2-0,3 мл.

3. Сенсибилизированные вакциной БЦЖ или убитыми микобакте-риями морские свинки, подвергнутые охлаждению или кратковременному перегреванию, теряют чувствительность кожи на внутрикожное введение 0,1 мл туберкулина (100 ТЕ). Восстановление утраченной чувствительности у животных к туберкулину происходит через 5-7 суток содержания их при 20°С.

4. Деструкция микобактерий туберкулеза в жидкой синтетической среде с помощью водно-термического воздействия при 1,0±0,2х105Па (1,0 атм.) в течение 3 часов позволяет получать из микроорганизмов до 1,34±0,02 мг/см3 (95000 ТЕ/мл) растворимых эндогенных белков в комплексе с липидами, полисахаридами и нуклеиновыми кислотами, обладающими аллергенными и токсичными свойствами, которые полностью инактивируются 0,8 % раствором формалина при 42° и 45°С в течение 12-15 суток.

5. Получение водорастворимых эндогенных токсино-аллергенов путем воднотермической обработки микобактерий туберкулеза и разработка метода инактивации и детоксикации аллергенных и токсичных свойств формалином являются основой для изготовления туберкулезного анатоксина, сорбированного на гидроокиси алюминия (1 мг/мл).

6. Двукратная вакцинация морских свинок и кроликов туберкулезным анатоксином в объеме 2,0-2,5 мл с интервалом 14 дней обеспечивает устойчивость животных от заболевания туберкулезом при подкожном заражении взвесью живых микобактерий туберкулеза бычьего или человеческого видов в дозе 0,0001 мг/см3 в течение 3 месяцев.

7. Иммуногенные свойства туберкулезного анатоксина характеризуются способностью вызывать чувствительность организма морских свинок к туберкулину и синтез у кроликов преципитирующих и аллер-геннейтрализующих антител.

8. Анатоксин, полученный предлагаемым способом из вакцинного штамма БЦЖ обладает свойствами характерными для анатоксина, изготовленного из вирулентных штаммов туберкулезных культур человеческого и бычьего видов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1.Предлагается использовать разработанную жидкую синтетическую питательную среду для выращивания микобактерий туберкулеза при получении токсино-аллергенов, и на ее солевой основе плотную минеральную агаровую среду для выделения микобактерий туберкулеза.

2. При использовании предлагаемого анатоксина учитывать депрессивные температурные воздействия - охлаждение и перегревание сенсибилизированных морских свинок, как противопоказания при проведении аллергических исследований с помощью туберкулина и изучения редуцирующего действия формалина на туберкулезные токсино-аллергены при получении туберкулезного анатоксина.

3. Полученные результаты предполагают возможность проведения клинических испытаний по изучению протективных свойств туберкулезного анатоксина на добровольцах в зоне повышенного риска заболевания туберкулезом.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Поздеев, А.В. Современные подходы получения и применения инактивированных биопрепаратов / А.В. Поздеев, Е.А. Евглевская // Материалы итоговой научной сессии КГМУ - Курск, 1997. - С. 130-131.

2. Евглевская, ЕА Материалы по получению экзо- и эндотоксинов./ ЕА Евглевская, А.В. Поздеев // Материалы итоговой научной сессии КГМУ.- Курск, 1997.- С. 54-55.

3. Евглевский, А.А Оптимизация способа изготовления туберкулезного анатоксина / А.А. Евглевский, Е.А. Тимкова // Аграрный вктник Причерном1рья: 36. наук произв.-междун.конф. эпизоотологов.-Одесса, 1999.- № 2.- С. 47-48.

4. Евглевский, А.А. Иммунобиологические свойства туберкулезного анатоксина // А.А. Евглевский, Е.А Тимкова Аграрный вютник При-черном1рья : Зб.наук произв.-межд.конф.эпизоотологов .- Одесса, 1999.-№2,- С. 53-54.

5. Пат. № 2161984 РФ Способ получения туберкулезного анатоксина / Урбан В.П., А.А. Евглевский, Е.А.Тимкова // Бюлл. 2001.- №2

6.Перспективность поиска новых биопрепаратов для профилактики туберкулеза. / В.М. Коломиец, A.M. Коваленко, Е.А. Тимкова, А.А. Евглевский // Проблемы туберкулеза,- 2002.-№ 10.- С.31-33.

7. Евглевский, Д.А. Особенности при выделении чистых культур ми-кобактерий туберкулеза. / Д.А. Евглевский, Е.А. Тимкова //Новые фармакологические средства: Мат-лы 15 Межд. науч.-практ. конф., посвященной 300-летию С-Петербурга 2003 г.- СПб., 2003.-С. 88-89.

8. Иммунопротективная активность туберкулезного анатоксина./ А.А. Евглевский, В.М. Коломиец, Е.А. Тимкова, О.Д. Печенин // Сб.науч.тр. Курских вузов.- Курск, 2003.- С.26-27.

9. Евглевский, А.А. Особенности конструирования синтетических сред для выращивания возбудителей туберкулеза при получении биопрепаратов / А.А. Евглевский, ЕА Тимкова //Мат-лы науч.-практ.конф. Курской СХА.- Курск, 2003.- С. 69-71.

10. Евглевский, Д.А. Оптимизация детоксикации и инактивации токсино-аллергенов при получении анатоксинов и аллергенов. / Д.А. Евглевский, С.Н. Норец., О.Д. Печенин, Е.А.Тимкова //Сб.науч. тр. Курских вузов.-Курск- 2004 - С. 10-12.

11. Евглевский, А.А. Эпизоотическая ситуация по туберкулезу в мире за последние 100 лет. / АА Евглевский., В.А Бусол., Е.А.Тимкова // Материалы научно-производственной конференции. «Актуальные проблемы эпизоотологии на современном этапе». С-Петербург.- 2004.-С.39-40.

Формат 60x84 1/16. Бумага для множительных аппаратов. Печать на копировальном аппарате КГСХА. Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100 экз.

тГ

16 ФЕВ 20С5 i- д \ К 11

Актуальность темы. Широкое и повсеместное распространение туберкулеза, наличие более 50 видов микобактерий, резкое повышение устойчивости возбудителя к традиционным и новым средствам химио- и антибиотикотерапии, высокий процент смертности представляют серьезную медицинскую и социальную проблему (Перельман М.И., 2001; Коломиец В.М. с соавт. 2002; Ридер Г.А. 2001; Toman. К., 1979).

Во второй половине 80-х годов XX столетия создавалось впечатление, что профессия фтизиатра со дня на день канет в лету и армии борцов с чахоткой придется искать новую профессию. Именно тогда сменяли вывеску «кафедра туберкулеза» на кафедру «фтизиопульмонологии». Однако с начала 90-х годов в России, да и во многих странах мира туберкулез вновь стал проблемой (Хоменко А.Г., 1996).

В настоящее время уровень заболеваемости туберкулезом в России в 10 раз выше, чем в странах Западной Европы, а осужденных - в 62 раза превышает среднероссийский показатель (более 4 тысяч случаев на 100 тысяч в 1999), смертность — в 28 раз. По сравнению с 1991 годом смертность в Российской Федерации возросла более чем в 2 раза (Коломиец В.М., 2001; Шилова М.В., 2001; Holmes C.B., Hausler H, Naunn P., 1998).

Микобактерии туберкулеза поражают любую ткань и могут находится в организме в 3-х состояниях: внеклеточное - метаболически активные, внутриклеточные - малоактивные и локализованные в казеозных массах.

Как инфекционное заболевание туберкулез является наиболее используемой моделью в иммунологии и аллергологии. Почти нет теоретической проблемы иммунологии, при изучении которой не использовали бы микобактерии туберкулеза, туберкулин, вакцину БЦЖ (Авербах М.М., 1976; Адо В.А., 1985; Литвинов В.И., 1974; Фрадкин В.А., 1990; Bernstein I.L., 1996; Asselinean I., Lederez E., 1991).

В настоящее время пока нет достоверных сведений о том, какие компоненты (белки, липиды, полисахариды, нуклеиновые кислоты) индуцируют протективныи эффект (Райк Э., 1966; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2000; Змушко Е.И. и др., 2001; Duros R. Y., 1945). Однако очевидно, что для определения защитного эффекта важны адъювантное действие микобактерий и длительное персистирование иммуногенных антигенов в организме (Тогунова А.И. Жулина Л.В., 1972; Литвинов В.И. и др. 1996).

Живая вакцина БЦЖ была получена А. Кальметтом и Ш. Гереном в 1919 году путем аттенуации вирулентных свойств микобактерий туберкулеза бычьего вида, выделенного в 1902 году Нокардом, после 230 кратного пересева в течение 13 лет на глицериновый картофель с желчью. С 1921 года вакцина БЦЖ в течение 35 лет применялась орально, а затем внутрикожно и является обязательной к применению в 64 странах мира и рекомендована в 118 государствах (Авербах М.М. Литвинов В.И., 1970; Таточенко В.К., Озерецковский H.A., 2001; Д.Т. Леви и др. 1999; Calmett А, 1937).

Одним из критериев оценки качества вакцинных препаратов является уровень их иммунологической активности, т.е. способность вызывать выработку специфических антител. В то же время методика серологической оценки иммунологической эффективности не применима к вакцинам ряда инфекций (бруцеллез, туляремия, туберкулез), в патогенезе которых ведущая роль принадлежит клеточному иммунитету. Иммунологическая эффективность таких вакцин может оцениваться по профилактической эффективности и проявлению клеточного иммунитета или путем постановки кожно-аллергических проб (Медуницын Н.В., 2001; Бектимиров Т.А. и др., 2001). В настоящее время продолжаются исследования по получению и применению противотуберкулезных протективных препаратов типа анатоксина, так как при других болезнях аналогичными препаратами достигнуты весомые результаты (Воробьев A.A., 1999; Костина З.И., 1993; Райкис Б.Н. Воронкин Н.И., 1987; Иллютович H.A., 1983; Ramon G, 1957).

На протяжении последнего десятилетия происходит поиск вакцин новых поколений (Еремеев В.В., 2001). Проблема патологии туберкулеза и приобретенного иммунодефицита поставила вопрос о целевой разработке иммуностимулирующих препаратов, и с этой целью в мире предлагается для исследований до 600 новых веществ в качестве иммуномодуляторов (Чучалин А.Г., 2000).

Исходя из вышеизложенного следует, что одним из направлений является поиск иммуногенных и протективных антигенов из микобактерий с целью производства на их основе технологически выгодных и экологически безопасных эффективных биопрепаратов для специфической профилактики и лечения туберкулеза.

Цель и задачи исследований. Целью предпринятого исследования явилось изыскание оптимальных способов получения туберкулезных токсино-аллергенов и их детоксикации и инктивации для изготовления и применения специфических протективных биопрепаратов против туберкулеза.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать питательные среды для выделения и выращивания микобактерий туберкулеза (МБТ) при получении туберкулезных токсино-аллергенов.

2. Определить оптимальный способ деструкции МБТ, детоксикации и инактивации формалином туберкулезных токсино-аллергенов.

3. Разработать рациональный и экологически безопасный способ получения туберкулезного анатоксина.

4. Изучить иммуногенные и протективные свойства туберкулезного анатоксина.

Научная новизна работы. Определены общие закономерности подбора химических ингредиентов жидких синтетических питательных сред для выращивания микобактерий туберкулеза при изготовлении протектив-ного биопрепарата. Выявленная устойчивость продуктов деструкции микобактерий туберкулеза к термическому воздействию позволила использовать водно-термическую обработку микроорганизмов для получения водорастворимых молекулярных токсино-аллергенов, а в последующем научно обосновать возможность их детоксикации и инактивации 0,8 % раствором формальдегида в два этапа при изготовлении анатоксина и использовать разработанную иммуноаллергическую модель (сенсибилизированных морских свинок) для контроля процесса детоксикации и инактивации формалином токсино-аллергенов.

Установленная иммунопротективная активность туберкулезного анатоксина к заражению микобактериями туберкулеза на морских свинках и кроликах позволила определить оптимальную дозу 2-3 мг на одно животное и сроки двукратной вакцинации с интервалом 14-21 день и ревакцинацию через 7-8 месяцев на фоне кратковременной в течение 3-5 месяцев чувствительности животных к туберкулину.

Практическая ценность работы. Разработан и апробирован состав и способ приготовления жидкой синтетической среды для оптимального выращивания микобактерий туберкулеза, а также использование ее состава в качестве плотной минеральной агаровой среды. На предложенной синтетической среде с лимонной кислотой, аспарагином и гликоколом возможно получить максимальный рост микобактерий туберкулеза в течение 50-55 дней с общим накоплением сухой бакмассы до 12,6 ±1,0 г/л.

Разработанная технология изготовления туберкулезного анатоксина путем детоксикации и инактивации токсино-аллергенов формалином в два этапа с последующей сорбцией на гидроокиси алюминия позволяет получить высокоэффективный протективный биопрепарат по экономически выгодной и экологически безопасной технологии.

Апробация работы. Основные материалы доложены и обсуждены на итоговой научной сессии Курского государственного медицинского университета, 1997; юбилейной конференции, посвященной 100-летию биологической промышленности. Курск, 1996; научной конференции Курской СХА, Курск, 2002; международных конференциях Одесса, 1999 и С-Петербург, 2004.

Публикации. По результатам исследований опубликовано 11 печатных работ, получен патент на «Способ получения туберкулезного анатоксина» № 2161984 бюл. № 2 от 20.01.2001 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты разработок оптимального состава плотной и жидкой синтетической питательной среды для выделения и выращивания микобактерий туберкулеза с целью получения туберкулезных эндотоксино-аллергенов;

2. Способы деструкции микобактерий туберкулеза, детоксикации и инактивации формалином туберкулезных токсино-аллергенов;

3. Материалы изыскания рационального и экологически безопасного способа получения туберкулезного анатоксина;

4. Обоснование иммуногенных и протективных свойств туберкулезного анатоксина.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК — активированные формы кислорода.

ПОЛ - процесс оксидации липидов.

АОЗ - антиоксидантная защита.

МБТ - микобактерии туберкулеза.

АМ - альвеолярные макрофаги.

СОД - супероксиддисмутаза.

МДА — малоновый диальдегид.

ПЧЗТ - повышенная чувствительность замедленного типа.

ППД — протеин пурифида дереват (очищенный туберкулин).

БЦЖ - бактерии кальмета - Герена).

УЗД - ультразвуковой дезинтегратор.

ПАВ - поверхностно-активные вещества.

МПБ - мясопептонный бульон.

МПА - мясопептонный агар.

СПС - синтетическая питательная среда.

ТЕ и МБ - туберкулиновые и международные единицы.

5. Выводы

1. Для получения туберкулезного токсино-аллергена разработана и апробирована жидкая синтетическая питательная среда, содержащая в граммах на 1 литр дистиллированной воды следующие ингредиенты: лимонной кислоты -7,0; лимоннокислого аммония 2-х замещенного (цитрат аммония) -5,0; гликокола - 4,0; аспарагина -1,0; сернокислого магния - 0,7; фосфорнокислого калия -5,0; сернокислого цинка -0,20; хлористого натрия -0,3; сернокислого железа -0,05; хлористого кобальта-0,1; глицерина - 50 мл. Нейтрализация среды проводилась аммиаком до рН 6,8 ±0,1 перед автоклавированием при 1,0 атм. (1,0+0,2 х 105) Па в течение 30 минут. Ее использование позволяет при росте микобактерий туберкулеза течение 50-55 дней получать повышенное накопление бактериальной массы до 12,0±0,5 г/дм (сухого вещества).

2. При создании иммуно-аллергической модели для изучения аллергических реакций доказана возможность сенсибилизации животных не только микобактериями БЦЖ, но и убитыми микобактериями туберкулеза человеческого или бычьего видов (10 мг/мл) путем подкожного введения суспензии с 3-5 мг/мл гидроокиси алюминия в объеме 0,2-0,3 мл.

3. Сенсибилизированные вакциной БЦЖ или убитыми микобактериями морские свинки, подвергнутые охлаждению или кратковременному перегреванию теряют чувствительность кожи на внутрикожное введение 0,1 мл туберкулина (100 ТЕ). Восстановление утраченной чувствительности у животных к туберкулину происходит через 5-7 суток содержания их при 20°С.

4. Деструкция микобактерий туберкулеза в жидкой синтетической среде с помощью водно-термического воздействия при 1,0±0,2х103Па (1,0 атм.) в течение 3 часов позволяет получать из микроорганизмов 1,34±0,02 мг/см (95000 ТЕ/мл) растворимых эндогенных белков в комплексе с липидами, полисахаридами и нуклеиновыми кислотами, обладающими аллергенными и токсичными свойствами, которые полностью инактивируются 0,8 % раствором формалина при 42°С - 45°С в течение 12-15 суток.

5. Получение водорастворимых эндогенных токсино-аллергенов путем водно-термической обработки микобактерий туберкулеза и разработка метода инактивации и детоксикации аллергенных и токсичных свойств формалином являются основой для изготовления туберкулезного анатоксина, сорбированного на гидроокиси алюминия (1 мг/мл).

6. Двукратная вакцинация морских свинок и кроликов туберкулезным анатоксином в объеме 2,0-2,5 мл с интервалом 14 дней обеспечивает устойчивость животных от заболевания туберкулезом при подкожном заражении взвесью живых микобактерий туберкулеза бычьего или человеческого видов в дозе 0,0001 мг/см" в течение 3 месяцев.

7. Иммунологические свойства туберкулезного анатоксина характеризуются способностью вызывать чувствительность организма морских свинок к туберкулину и синтез у кроликов преципитирующих и аллергеннейтрализующих антител.

8. Анатоксин, полученный предлагаемым способом из вакцинного штамма БЦЖ, обладает свойствами характерными для анатоксина, изготовленного из вирулентных штаммов туберкулезных культур человеческого и бычьего видов.

6. Практические рекомендации

1. Предлагается использовать разработанную жидкую синтетическую питательную среду для выращивания микобактерий туберкулеза при получении токсино-аллергенов, и на ее солевой основе плотную минеральную агаровую среду для выделения микобактерий туберкулеза.

2. При использовании предлагаемого анатоксина учитывать депрессивные температурные воздействия - охлаждение и перегревание сенсибилизированных морских свинок, как противопоказания при проведении аллергических исследований с помощью туберкулина и изучения редуцирующего действия формалина на туберкулезные токсино-аллергены при получении туберкулезного анатоксина.

3. Полученные результаты предполагают возможность проведения клинических испытаний по изучению протективных свойств туберкулезного анатоксина на добровольцах в зоне повышенного риска заболевания туберкулезом.