Автореферат и диссертация по медицине (14.00.13) на тему:Иммунофармакологические способы в диагностике миастении



На правах рукописи

ОЛЬХОВСКАЯ Елена Фёдоровна

ИММУНОФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ В ДИАГНОСТИКЕ МИАСТЕНИИ

14.00.13. - нервные болезни

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Пермь -1997

Работа выполнена на кафедре неврологии и в ЦНИЛ Пермской государственной медицинской академии.

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор A.A. Шутов доктор медицинских наук А.А Быкова

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Р.Г. Образцова доктор медицинских наук, профессор В.Н. Каплин

Ведущее учреждение -Нижегородская государственная медицинская академия.

Защита состоится 13 июня 1997 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К. 084. 09. 03. при Пермской государственной медицинской академии.

Адрес: 614000, г. Пермь, ул. Куйбышева, 39

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермской государственной медицинской академии (ул. Коммунистическая, 27).

Автореферат разослан " S " uUZtJ? ^ 1997 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук, доцент

J1.E. Леонова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Миастения является одним из наиболее тяжёлых прогрессирующих нервно-мышечных заболеваний. Это - относительно редкое заболевание (3-5 случаев на 100 тысяч населения), но не исключено, что оно встречается чаще, чем можно было бы думать, исходя из официальных сведений о его распространенности, поскольку, по данным литературы, на каждый случай выявленного заболевания приходится два случая не диагностированного (J. Kurtzke, 1978).

Первое описание миастении принадлежит Thomas Willis и относится к 1672 году. Таким образом, заболевание известно уже более 300 лет, но лишь в 1900 году миастения выделена в отдельную нозологическую форму. С тех пор в изучении этого заболевания достигнут значительный прогресс, накоплены некоторые знания о механизмах развития миастении, достигнуты определенные успехи в её лечении. Установлено, что наибольшее значение в формировании патологии нервно-мышечной передачи имеют антитела к ацетилхолиновому рецептору, которые обнаруживаются у 90 % больных генерализованной и у 60 % больных глазной формой миастении (B.W. Fulpius, 1983; H.J. Oosterhuis et al., 1983; A. Vincent et al., 1985). В настоящее время для выявления антител используется радиоиммунный метод, который требует дорогостоящего оснащения. Несмотря на то, что в диагностике миастении используется весь спектр приёмов клинической электромиографии, рентгенорадиологические методы исследования, направленные на визуализацию патологии вилочковой железы, диагноз "миастения", как правило, ставится с большим опозданием. По данным одних авторов (E.H. Пономарёва и соавт., 1987), время от начала заболевания до постановки правильного диагноза составляет от 1 до 7 лет. Другие (М.И. Кузин, Б.М. Гехт,1996) отмечают, что правильный диагноз

в течение первого года заболевания был поставлен лишь 30 % больных, а многим больным он был установлен спустя 10-15 лет после начала заболевания. Причинами поздней диагностики являются, несомненно, многообразие клинических форм и проявлений миастении. Затрудняет диагностику обилие неврологических феноменов, обусловленных поражением разных структур нейромоторного аппарата и центральной нервной системы. Патология обмена веществ и желёз внутренней секреции, болезней соединительной ткани и мышц нередко проявляют себя нейромышечными симптомами, протекающими под маской миастении. Наконец, отсутствуют надёжные и патогномоничные лабораторные тесты, делающие диагноз миастении достоверным. Ранее (A.A. Быкова, М.Ф. Гаришина, Т.А. Юшкова, 1986) для распознавания миастении была предложена иммунофарма-кологическая проба, диагностические возможности которой требуют дальнейшего изучения. Ошибки в диагностике влекут за собой неэффективную терапию, которая переводит заболевание в режим более тяжёлого течения.

Трудности своевременного распознавания миастении обусловливают актуальность поиска новых лабораторных способов диагностики этого заболевания.

Целью настоящей работы является разработка новых иммунофар-макологических способов диагностики миастении и клиническая апробация предложенной ранее иммунофармакологической пробы, а также решение вопроса о возможности использования их в клинической практике в качестве дифференциально-диагностических тестов.

Задачи исследования.

1. Изучить в крови больных миастенией содержание розеткообра-зующих лимфоцитов и антител, специфичных ацетилхолину;

2. На основе изученных показателей разработать новые способы диагностики миастении - клеточный вариант "ацетилхолинового теста" и гуморальный вариант "ацетилхолинового теста" и охарактеризовать их диагностические возможности;

3. Изучить в крови больных миастенией характер изменения содержания розеткообразующих лимфоцитов и антител, специфичных ацетил-холину, после изменения содержания эндогенного ацетилхолина при помощи антихолинэстеразных фармакологических препаратов;

4. Провести более полную апробацию в клинике ранее предложенного клеточного варианта "прозериновой пробы" и дать оценку его диагностическим возможностям;

5. Разработать гуморальный вариант "прозериновой пробы" и изучить его диагностические возможности;

6. Разработать клеточный и гуморальный варианты "калиминовой пробы" и изучить возможность их использования в качестве диагностических тестов.

Научная новизна работы. Впервые выявлено, что в сыворотке крови больных миастенией значительно повышены титры циркулирующих антиацетилхолиновых антител по сравнению с титрами антител в сыворотке крови лиц групп контроля и сравнения.

Исследован характер изменения титров антиацетилхолиновых антител в сыворотке крови больных миастенией после введения в организм фармакологических агентов, нарушающих баланс эндогенного ацетилхолина (прозерин, калимин). Оказалось, что в ответ на изменение его баланса в сыворотке крови больных миастенией изначально повышенный титр антиацетилхолиновых антител значительно снижается.

Показано, что механизм регуляции содержания эндогенного ацетилхолина у больных миастенией нарушен уже в дебюте заболевания. Он ос-

таётся изменённым на всём протяжении заболевания, и констатация этих изменений может использоваться для диагностики миастении в любом возрасте, при различном характере течения, разной степени тяжести, в любую фазу данной патологии. Величина титров антиацетилхолиновых антител и количество розеткообразующих лимфоцитов, специфичных аце-тилхолину, в крови больных миастенией зависят от продолжительности заболевания, степени генерализации, степени тяжести, типа течения миа-стенического процесса и не зависит от возраста больных и наличия прозе-ринорезистентности.

Предложены новые высокочувствительные и специфичные иммуно-фармакологические способы диагностики миастении - клеточный вариант "ацетилхолинового теста", гуморальный вариант "ацетилхолинового теста", ^моральный вариант "прозериновой пробы", клеточный и гуморальный варианты "калиминовой пробы".

Практическая значимость работы. Новые иммунофармакологиче-ские способы диагностики миастении будут способствовать ранней диагностике заболевания и окажутся особенно полезными для распознавания его стертых, атипичных и прозеринорезистентных форм. Они обеспечат возможность дифференциальной диагностики миастении и многочисленных миастеноподобных синдромов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. В крови практически здоровых лиц зарегистрировано присутствие небольшого количества розеткообразующих лимфоцитов и антител, специфичных ацетилхолину, величина которых значительно возрастает после введения в организм антихолинэстеразных препаратов, нарушающих баланс эндогенного ацетилхолина (прозерин, калимин).

2. В крови больных миастенией обнаружено повышенное, по сравнению со здоровыми лицами, содержание розеткообразующих лимфоци-

тов и антител, специфичных ацетилхолину, величина которых коррелирует с продолжительностью заболевания, степенью генерализации, степенью тяжести и типом течения миастенического процесса.

3. Высокое содержание розеткообразующих лимфоцитов, специфичных ацетилхолину и повышенные титры антиацетилхолиновых антител в крови являются маркёрами миастении, поскольку они повышены уже в дебюте заболевания и остаются таковыми на всём его протяжении. Констатация этих изменений может использоваться для диагностики миастении в любом возрасте, при различном характере течения, разной степени тяжести, в любую фазу данной патологии.

4. На введение в организм антихолинэстеразных препаратов, нарушающих баланс эндогенного ацетилхолива (прозерин, калимин) в крови больных миастенией наблюдается своеобразная, отличающаяся от таковой у здоровых и больных с другой патологией нервной системы, реакция, выражающаяся в значительном снижении числа розеткообразующйх лимфоцитов и титров антител, специфичных ацетилхолину.

5. Специфическая реакция на медиатор наблюдается уже в дебюте миастении и не изменяет своего характера на всём протяжении заболевания, что может использоваться для диагностики различных форм миастении, в том числе и прозеринорезистентных её вариантов.

Внедрение в практику. Новые иммунофармакологические способы диагностики миастении внедрены в работу лаборатории, организованной при иммунологическом отделе ЦНИЛ Пермской государственной медицинской академии. Они применяются в работе клиники неврологии на базе неврологического отделения Пермской областной клинической больницы. Материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре неврологии Пермской государственной медицинской академии.

Апробация работы. Основные положения диссертации отражены в докладах на II Международном конгрессе "Иммунореабилитация и реабилитация в медицине" (Турция, 1996), V съезде неврологов Пермской области (Пермь, 1996), I Международном медицинском конгрессе молодых учёных и студентов (Ижевск, 1996), Республиканской конференции неврологов, нейрохирургов и медицинских генетиков (Уфа, 1996), научно-практической конференции "Молодые учёные - к 80-летию Пермской государственной медицинской академии" (Пермь, 1996), научных сессиях Пермской государственной медицинской академии (Пермь, 1996, 1997), совместном заседании научной проблемной комиссии "Общая и прикладная иммунология" и кафедр неврологии лечебного, педиатрического факультета, кафедры неврологии последипломного образования Пермской государственной медицинской академии (1997).

Публикации. По материалам диссертации имеется 9 публикаций в отечественной и зарубежной печати, получено положительное решение о выдаче патента РФ № 96105123 от 25.02.97г. по разработанному методу "Способ диагностики миастении", поданы две заявки на предполагаемые изобретения "Способ диагностики миастении", на одну из которых от 9.11. 96 г получен номер государственной регистрации - 96122333.

Структура и объём работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы. Общий объём работы составляет 148 страниц машинописного текста, в том числе, 90 страниц непосредственно текста. Она иллюстрирована 39 таблицами, 31 рисунком и 8 клиническими наблюдениями. Указатель литературы включает 115 источников, в их числе 49 работ отечественных и 66 - зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Характеристика групп наблюдения. Обследованы 37 больных различными клиническими формами миастении. В одном случае имело место сочетание миастении и рассеянного склероза. Группа включала 26 (70,3 %) женщин и II (29,7 %) мужчин. Возраст больных был от 24 до 70 лет (средний возраст - 43,9 года).У 18 (48,6 %) больных наблюдалась локальная, у 19 (51,4 %) - генерализованная форма миастении.

Основные анамнестические и клинические данные, характеризующие больных основной группы, представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Анамнестические и клинические данные больных миастенией

Анамнестические и клинические данные

Больные миастенией (п = 37)

%

Возраст

- до 40 лет

- от 41 до 55 лет

- от 56 до 70 лет

15 13 9

40,6 35,0 24,4

Пол -муж. - жен.

11

26

29,7 -70,3

Форма заболевания

- локальная

- генерализованная

18 19

48,6 51,4

Давность заболевания

- до 1 года

- от 1 до 5 лет -от6 до 10 лет

- свыше 10 лет

4 17

7 9

10,8 45,9 18,9 24,4

Типы течения заболевания

- дебют

- стационарный

- прогрессирующий

4 15 18

10,8 40,6 48,6

Степени тяжести

- лёгкая

- средняя

- тяжёлая

16 15 6

43,2 40,6 16,2

Из 18 больных локальными формами миастении - у 14 (77,8 %) имела место глазная форма заболевания, у 4 (22,2 %) - краниальная. Среди 19 больных генерализованной формой миастении у 15 (78,9 %) присутствовали бульварные нарушения, у 5 (26,3 %) - наблюдалось расстройство дыхания. Заболевание дебютировало в возрасте от 16 до 67 лет (в среднем 38,2 года). Период от начала заболевания до установления настоящего диагноза составил от 1 месяца до 14 лет (в среднем 2,7 года). В процессе обследования в этот период больным устанавливались следующие диагнозы : острое нарушение мозгового кровообращения, дифтерия, миелоиатия, рассеянный склероз, рассеянный энцефаломиелит, энцефалит, опухоль головного мозга и другие.

Для сопоставительного анализа были привлечены:

Группа контроля - 30 практически здоровых лиц в возрасте от 22 до 50 лет (средний возраст - 36,6 года), из них 15 мужчин и 15 женщин. Данные её обследования использованы как лабораторный иммунологический контроль.

Первую группу сравнения - 30 человек с неврологической патологией, не имеющей аутоиммунной природы и не имитирующей миастению, но являющейся органическим заболеванием нервной системы - составили 12 мужчин и 18 женщин в возрасте от 22 до 59 лет (средний возраст - 39,2 года). У 26 (86,7 %) из них имел место остеохондроз поясничного отдела позвоночника с корешковым или мышечно-дистоническим синдромами, у 4 (13,3 %) - остеохондроз шейного отдела позвоночника с мышечно-дистоническим синдромом. Это была принципиально важная группа лабораторного контроля, поскольку изучение интересующих нас показателей экстраполируется фактически на всю неврологическую патологию, не имеющую клинических характеристик миастении.

Вторая группа сравнения - лица с заболеваниями, клиническая симптоматика которых имитировала миастению или на определённом этапе наблюдения больному устанавливался диагноз миастении. Она состояла из 20 человек (6 мужчин и 14 женщин) в возрасте от 16 до 67 лет (средний возраст - 38,8 года). У 5 (25 %) больных имел место рассеянный склероз в дебюте заболевания, у 4 (20 % ) - астенический невроз с миастеноподоб-ным синдромом, у 3 (15 %) - истерический невроз с миастеноподобным синдромом, у 3 (15 %) - миастеноподобный синдром как последствие острого нарушения мозгового кровообращения в бассейне основной артерии, у 2 (10 %) - аневризма внутренней сонной артерии, у 2 (10 %) - гипотиреоз с миастеноподобным синдромом, у 1 (5 %) - офтальмоплегическая миопа-тия. Это была наиболее важная, сформировавшаяся в процессе практической работы, группа лабораторного контроля, так как она включала больных. имеющих патологию с аут о иммунными механизмами развития (например, рассеянный склероз). И, в свою очередь, нас интересовал вопрос будут ли информативны иммунофармакологические способы диагностики в случае сочетания миастении и патологии со столь близкими аутоиммунными нарушениями?

Материалы и методы исследования. Все больные подверглись традиционному клиническому обследованию. В качестве дополнительных методов были использованы: классическая прозериновая проба, метод стимуляционной электромиографии, медиастиноскопия и компьютерная томография средостения. Кроме того, всем обследуемым проводилось специальное иммунологическое исследование крови (таблица 2), результаты которого в сопоставлении с клиническими данными и легли в основу настоящей работы. Исследовалось содержание розеткообразующих лимфоцитов и антител, специфичных ацетилхолину, в крови.

Для получения достоверных результатов соблюдались следующие условия: полная отмена медикаментозных препаратов на период обследования, проведение всех исследований утром натощак.

Лимфоидные клетки, специфичные ацетилхолину, выявляли в реакции специфического розеткообразования (РО). Из вены обследуемого забирали кровь в количестве 1,5 мл в центрифужную пробирку, содержащую такое же количество антикоагулянта. Затем осуществляли постановку реакции РО с ацетилхолиновым эритроцитарным диагностикумом. Из осадка готовили мазок и окрашивали по Романовскому-Гимза. Под микроскопом (при 900-кратном увеличении) считали 300 лимфоцитов, отмечая среди них число клеток, фиксировавших на своей поверхности 3 и более бараньих эритроцита - РОК. Зная абсолютное число лейкоцитов в 1 мкл крови и процентное содержание лимфоцитов, вычисляли абсолютное число РОК, специфичных ацетилхолину, в 1 мкл крови.

Антитела (AT), специфичные ацетилхолину, выявляли в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА). Из вены обследуемого в сухую центрифужную пробирку забирали кровь в количестве 1,5 мл для получения сыворотки. После чего осуществляли постановку РПГА с ацетилхолиновым эритроцитарным диагностикумом. Реакцию учитывали в случае от-сутсвия агглютинации в контроле. Максимальное разведение сыворотки, при котором наблюдалась положительная реакция, считали диагностически значимым титром. Средние значения пересчитывали и указывали также в - log 2 титра.

Специфичность реакций РО и ПГА доказывали путём торможения розеткообразования и гемагглютинации избытком ацетилхолина, а также путём одновременной постановки реакций с веществами иной химической структуры (серотонин, адреналин).

Таблица 2. Иммунологическое исследование крови

Клеточный вариант "ацетилхолинового теста" Реакция розеткообразования с ацетилхолиновым эритроцитарным диагностикумом для определения в крови- фонового содержания розеткообразующих лимфоцитов, специфичных ацетнлхолину

Гуморальный вариант "ацетилхолинового теста" ГПГЛ с' ацетилхолиновым эритроцитарным диагностикумом для определения в сыворотке крови фонового титра антиацетилхолиновых антител

Клеточный вариант "прозериноеой пробы" Реакция розеткообразования с ацетилхолиновым эритроцитарным диагностикумом через 30 мин. после п/к введения обследуемому 0,3 мл прозерина для определения в крови изменения фонового содержания розеткообразующих лимфоцитов, специфичных ацетнлхолину, после изменения баланса эндогенного ацетилхолина

Гуморальный вариант "прозериноеой пробы" РИГА с ацетилхолиновым эритроцитарным диагностикумом через 30 мин. после п/к введения обследуемому 0,3 мл прозерина для определения в сыворотке крови изменения фонового титра антиацетилхолиновых антител после изменения баланса эндогенного ацетилхолина

Клеточный вариант "калиминовой пробы" Реакция розеткообразования с ацетилхолиновым эритроцитарным диагностикумом через 12 час. после приёма обследуемым 0,06 г калимина для определения в крови изменения содержания розеткообразующих лимфоцитов, специфичных ацетнлхолину, после изменения баланса эндогенного ацетилхолина

Гуморальный вариант "калиминовой пробы" РПГА с ацетилхолиновым эритроцитарным диагностикумом через 12 час. после приёма обследуемым 0,06 г халнмина для определения в сыворотке крови изменения титра антиацетилхолиновых антител после изменения баланса эндогенного ацетилхолина

Все иммунологические исследования проводились автором лично на базе иммунологического отдела ( зав. - канд. биол. наук Л. К. Буренкова ) Центральной научно-исследовательской лаборатории (зав. - профессор М. Ф. Болотова) Пермской медицинской академии. Автор выражает благодарность за помощь в освоении методик и квалифицированные советы, а также за благожелательную и творческую атмосферу в коллективе лаборатории.

Результаты исследования и их обсуяодение. Классическая прозе-риновая проба у 9 (50 %) из 18 больных локальными формами миастении дала отрицательный или сомнительный результат (прозеринорезистент-ный вариант заболевания). Из 19 больных генерализованной формой миастении "драматический" эффект прозериновой пробы наблюдался у 2 (10,5 %), ещё у 12 (63,2 %) она была положительной, 5 (26,3 %) больных на введение прозерина не реагировали или их реакция вызывала сомнения.

Электромиографическое исследование, предпринятое у 9 (24,3 %) больных, (1-е локальной, 8-е генерализованной формой миастении), во всех случаях подтвердило наличие блока нервно-мышечной передачи.

У всех больных было исследовано состояние тимуса. 29 больным проводилась компьютерная томография средостения, 8 - медиастиноско-пия. Тимома выявлена у 1 (2,7 %) больного локальной формой миастении. У 2 (5,4 %) больных генерализованной формой миастении тимома обнаружена несколько лет назад. Больные были оперированы, но значительного улучшения в юс состоянии не отмечено.

При проведении иммунологического исследования крови оказалось, что у больных миастенией число специфичных ацетилхолину лимфоцитов (РОК) находится в пределах 16-70 %, составляя 25,9 ± 1,8, абсолютное их количество равно 429,0 ±31,0 лимфоцитов в 1 мкл крови. У здоровых лиц, больных первой и второй групп сравнения число лимфоцитов, специфичных ацетилхолину, колеблется в пределах 1-11 % и составляет в группе контроля 6,4 ± 0,7 % и 98 ± 10,2 в 1 мкл крови, у больных с патологией периферической нервной системы - 6,1 ± 0,6 % и 112 ± 13,5 в 1 мкл крови и у больных с имитирующими миастению заболеваниями 5,3 ± 0,6 % и 95,4 + 13,1 в 1 мкл крови (таблица 3). Таким образом, и процентное содержание специфичных ацетилхолину лимфоцитов, и абсолютное их число в 1 мкл крови во всех трёх группах практически одинаковы

(р > 0,05), в то время как у больных миастенией эти показатели достоверно (р< 0,001) выше.

Нами выявлено, что в крови больных миастенией циркулируют антиацетилхолиновые антитела (АТ) в титрах от 1 : 64 до 1 : 1024 (341,0 ± 52,7). У здоровых лиц, больных первой и второй групп сравнения титры антиацетилхолиновых АТ колеблются в пределах от 1 : 2 до 1 : 16 и составляют в группе контроля 8,9 ± 1,1, у больных первой группы сравнения 9,0 ± 1,3, во второй группе сравнения 8,8 ±1,3 (таблица 3). При сравнении величин титров АТ у здоровых и больных групп сравнения достоверного различия не получено (р > 0,05). В сыворотке крови больных миастенией титры антиацетилхолиновых АТ существенно (р< 0,001) выше.

Таблица 3.

Сравнительная характеристика фонового содержания РОК и АТ, специфичных ацетилхолину, в крови лиц группы контроля, больных миастенией, первой и второй групп сравнения

Число РОК и титр АТ, специфичных ацетилхолину, в крови Больные миастенией (п=37) Группа контроля (п=30) Первая группа сравнения (п=30) Вторая группа сравнения (п=20)

Число РОК, специфичных ацетилхолину ( М + т) % абс. число в 1 мкл крови 25,9 ± 1,8 Р1< 0,001 429,0 + 31,0 Р1< 0,001 6,4 ± 0,7 р2 > 0,05 98,0+10,2 р2 > 0,05 6,1 + 0,6 р2 > 0,05 112,0 ± 13,5 р2 > 0,05 5,3 ± 0,6 р2 > 0,05 95,4+13,1 Рз > 0,05

Титр антиацетилхолиновых АТ (М±т) - к^ 2 титра 341,0 ±52,7 7,8 ± 0,2 Р!< 0,001 8,9+1,1 2,9 + 0,2 Р2 > 0,05 9,0 ±1,3 2,8 + 0,3 Рг > 0,05 8,8 + 1,3 2,8 ± 0,3 р2 > 0,05

Примечание: р) - достоверность различий показателей больных миастенией и показателей групп контроля и сравнения; р2 - достоверность различий показателей групп контроля и сравнения между собой.

Анализ фонового содержания лимфоцитов и антител, специфичных ацетилхолину, показал, что у больных миастенией величина этих показателей зависит от продолжительности заболевания, степени генерализации, степени тяжести, типа течения миастенического процесса и не зависит от возраста больных и чувствительности их к прозерину. Число лимфоцитов и титр антител, специфичных ацетилхолину, повышены уже в дебюте заболевания и остаются изменёнными на всём его протяжении.

Таким образом, зарегистрированные нами у больных миастенией повышенное содержание РОК и АТ, специфичных ацетилхолину, являются своеобразными маркёрами миастении и их констатация может использоваться в качестве способов диагностики заболевания. На основе полученных данных нами и предложены два варианта (клеточный и гуморальный) "ацетилхолинового теста".

В ответ на введение прозерина в крови больных миастенией изначально повышенное число лимфоцитов, специфичных ацетилхолину, достоверно (р < 0,001) снижается и процент их становится равным 7,0 ± 0,5, а абсолютное число в 1 мкл крови -118,0 ± 9,6 (таблица 4).

У практически здоровых лиц их число, изначально довольно небольшое, наоборот, существенно (р < 0,001) возрастает и составляет 23,3 ± 1,4 %, а в абсолютных числах - 369,0 ± 29,0 в 1 мкл крови. Подобным же образом на изменение содержания эндогенного ацетилхолина реагируют и больные с патологией периферической нервной системы и больных с миастеноподобными синдромами: число специфичных ацетилхолину лимфоцитов достоверно (р < 0,001) увеличивается, составляя в среднем у первых соответственно - 22,4 ± 1,9 % и 436,0 ± 53,7 в 1 мкл крови, у вторых - 20,5 ± 1,3 % и 366,0 ± 24,6 в 1 мкл крови (таблица 4).

Таким образом, введение прозерина вызывает в обследованных группах противоположные сдвиги: рост числа лимфоцитов, специфичных

ацетилхолину, у здоровых и больных иной неврологической патологией, и наоборот, значительное его снижение у больных миастенией, что подтверждает результаты, полученные ранее (Быкова A.A., Гаришина-М.Ф., Юшкова Т.А., 1986).

Нами установлено, что в сыворотке крови больных миастенией после введения прозерина изначально повышенный титр антиацетилхоли-новых AT достоверно (р < 0,001) снижается и составляет в среднем 62,2 ± 11,5. У практически здоровых лиц, больных первой и второй групп сравнения после введения прозерина происходит увеличение титра анти-ацетилхолиновых AT - в группе контроля до 62,4 ± 8,4, у больных с заболеваниями периферической нервной системы - до 70,4 ± 7,2, у больных с миастеноподобными синдромами - до 86,1 ± 11,4 (таблица 4).

Сопоставив характер изменения показателей у лиц групп контроля и сравнения, установлено, что они не имеют достоверных различий (р > 0,05).

При сравнении характера изменения титра антиацетилхолиновых AT, наблюдающегося после введения прозерина, у больных миастенией и лиц сравниваемых групп определяются существенные (р < 0,001) различия: увеличение его в группах контроля и сравнения и, наоборот, значительное снижение у больных миастенией.

На основе различия характера изменения содержания РОК и AT, специфичных ацетилхолину, наблюдающегося после введения прозерина, в крови больных миастенией и здоровых лиц и разработана "прозериновая проба".

Таблица 4.

Число РОК и титр АТ, специфичных ацетилхолину, в *оови лиц группы контроля, больных миастенией, первой и второй Ггугш сравнения до и через 30 мин после введения прозерина

Группы обследованных Число РОК, специфичных ацетилхолину М ± ш Титр антиацетилхолиновых АТ М + т г титра)

до введь>ия прозерин. после введения прозерина ДО введения прозерина после введения прозерина

% абс. чисм в 1 мкл % абс. число в 1 мкл

Больные миастенией (п=37) 25,9+1,8 Р1< 0,001 429,0 ±31,0 рк 0,001 7,0 + 0,5 <0,001 Р4< 0,001 118,0 + 9,6 рз <0,001 р4< 0,001 341,0 ±52,7 (7,8 + 0,2) р!< 0,001 62,2+11,5 (5,1 + 0,3) рз < 0,001 Р5 > 0,05

Группа контроля (п-20) 6,4 ± 0,7 Р2 > 0,05 98,0+ 10,2 Р2 > 0,05 23,3+1,4 Рз< 0,0)1 369,0 + 29,0 рз < 0,001 8,9+1,1 (2,9 ± 0,2) р2 > 0,05 62,4 ± 8,4 (5,8 ± 0,2) рз < 0,001

I группа сравнения (п=20) 6,1 + 0,6 рг > 0,05 112,0+ 13,5 р2 > 0,05 22,4 ± ¡,9 рз < 0,001 436,0 + 53,7 рз <0,001 9,0+1,3 (2,8 ±0,3) Рг > 0,05 70,4 +7,2 (6,0 ±0,1) рз < 0,001

II группа сравнения (п=20) 5,3 ± 0,6 р2 > 0,05 95,4+13,1 рг > 0,05 20,5 ± 1,3 Рз< 0,001 ■566,0 + 24,6 рз < 0,001 8,8 ± 1,3 (2,8 ± 0,3) Рг > 0,05 86,1 + 11,4 (6,3 ± 0,2) рз < 0,001

Примечание: р! - достоверность различий фоновых показаний больных миастенией от показателей групп контроля и сравнения; р2 - достоверность различий показателей групп контроля и сравнения между собой; рз - достоверность изменений показателей до и после введения прозерина; р4 - достоверность различий числа ацетилхолиновых РОК у больных миастенией и лиц групп контроля и сравнения после введения -прозерина; Р5 - достоверность различий титров антиацетилхолиновых АТ у больных миастенией и лиц групп контроля и сравнения после введения прозерина.

Нами выявлено, что после приёма калимина в крови больных миастенией изначально высокое (24,7 ± 1,6 %) число специфичных ацетилхолину лимфоцитов значительно (р < 0,001) снижается и составляет всего 6,3 ± 0,9 %. Абсолютное их число также снижается с 412,0 ± 45,5 до 100,0 ± 12,3 в 1 мкл крови (р < 0,001). У лиц группы контроля и обеих групп сравнения после приёма калимина наблюдается однонаправленный и отличный от полученного у больных миастенией ответ: значительно

(р < 0,001) возрастает изначально невысокое во всех группах число специфичных ацетидхолину лимфоцитов. В частности, в контроле -с 5,8 ± 0,8 до 20,6 ± 1,7 %, в абсолютных числах - от 103,0 ± 13,3 до 355,0 + 26,9 в 1 мкл крови. У больных с патологией периферической нервной системы - с 6,6 ± 0,7 до 24,0 ± 2,0% и с 112,0 + 15,6 до 407,0 ± 50,0 в 1 мкл крови. У больных с имитирующими миастению заболеваниями -с 5,7 ± 0,6 до 20,5 ± 1,6 % и с 104,0 ± 14,1 до 363,0 ± 29,6 в 1 мкл крови (таблица 5). При сравнении показателей всех трёх групп значимых различий не выявлено (р > 0,05).

Таблица 5.

Число РОК и титр АТ, специфичных ацетидхолину, в крови лиц группы контроля, больных миастенией, первой и второй групп сравнения до и через 12 час после приёма калимина

Группы обследованных Число РОК, специфичных ацетилхолину М±т Титр антиацетилхолиновых АТ М±т (-1оя 2 титра)

до приёма калимина после приёма калимина до приёма калимина после приёма калимина

% абс. число в I мкл % абс. число в 1 мкл

Больные миастенией (п=12) 24,7 ± 1,6 р,< 0,001 412,0 ±45,5 Р1< 0,001 6,3 ± 0,9 рз < 0,001 р4 <0,001 100,0+12,3 рз <0,001 р4< 0,001 416,0 + 97,0 (8,2 ± 0,4) Р1< 0,001 77,7 ± 25,8 (5,4 + 0,5) рз <0,00! р5 > 0,05

Группа контроля (п=10) 5,8 + 0,8 р2 > 0,05 103,0 ± 13,3 Р2 > 0,05 20,6 + 1,7 рз < 0,001 355,0 + 26,9 рз < 0,001 9,2 ± 2,0 (2,8 + 0,4) Р2 > 0,05 56,0 ± 13,5 (5,4 ±0,4) р3< 0,001

I группа сравнения (п=10) 6,6 + 0,7 р2 > 0,05 112,0 ± 15,6 р2 > 0,05 24,0 ± 2,0 р3 < 0,00! 407,0 ± 50,0 рз <0,001 10,6 + 73,6 (3,2 + 0,3) р2 > 0,05 73,6 ± 12,7 (6,0 ± 0,3) Рз < 0,001

П группа сравнения (п=10) 5,7 + 0,6 рз > 0,05 104,0 ± 14,1 рг > 0,05 20,5 + 1,6 рз < 0,001 363,0 + 29,6 рз < 0,001 9,6 ±1,9 (2,9 ± 0,4) р2 > 0,05 106,0 ±20,3 (6,5 ±0,3) рз < 0,001

Примечание: р] - достоверность различий фоновых показателей больных миастенией и показателей групп контроля и сравнения; рг - достоверность различий показателей

групп контроля и сравнения между собой; рз - достоверность изменений показателей до и после приёма калимина; р4 - достоверность различий числа ацетилхолиновых РОК у больных миастенией и лиц групп контроля и сравнения после введения прозерина; Р5 - достоверность различий титров антиацетилхолияовых АГ у больных миастенией и лиц групп контроля и сравнения после приёма калимина.

Таким образом, имеются существенные различия в изменении числа РОК, специфичных ацетилхолину, наблюдающемся после приёма калимина у больных миастенией и лиц других сравниваемых групп. Происходит рост числа лимфоцитов, специфичных ацетилхолину, у здоровых и больных другой неврологической патологией и, наоборот, значительное его снижение у больных миастенией.

Аналогично после приёма калимина изменяется и титр антиацетилхолияовых АТ. У больных миастенией он достоверно (р < 0,001) снижается с 416,0 ± 97,0 до 77,7 ± 25,8. У практически здоровых лиц приём калимина вызывает достоверное (р < 0,001) увеличение исходно невысокого (9,2 ± 2,0) титра антиацетилхолиновых АТ, который становится равным 56,0 ± 13,5. Что касается титра АТ в сыворотке крови больных первой группы сравнения, после приёма калимина он также существенно (р < 0,001) возрастает - с исходного, равного 10,6 ± 1,9, до 73,6 ± 12,7. У больных второй группы сравнения после приёма калимина титр АТ также достоверно (р < 0,001) возрастает с 9,6 ± 1,9 до 106,0 ± 20,3 (таблица 5). Сопоставив эти данные в группах контроля и сравнения, можно утверждать, что достоверных отличий между показателями не существует (р > 0,05).

Таким образом, в изменении числа РОК, специфичных ацетилхолину, наблюдающемся после приёма калимина, у лиц групп контроля и сравнения - с одной стороны - и больных миастенией - с другой, - имеет место совершенно разнонаправленный характер с достоверной (р < 0,001) степенью отличия.

Проведённые исследования показали, что зарегистрированные у больных миастенией особенности реагирования лимфоцитов крови больных на введение в организм прозерина или калимина, нарушающих баланс эндогенного ацетилхолина, представляют собой своеобразную реакцию на медиатор. Подобная реакция не наблюдалась ни у здоровых лиц, ни у больных с патологией периферической нервной системы, ни у больных с миастеноподобными синдромами. Это служит основанием к утверждению, что данные показатели являются характерными для миастении и могут быть использованы в качестве специфических диагностических тестов. Нами показано, что механизм регуляции содержания эндогенного ацетилхолина у больных миастенией нарушен уже в дебюте заболевания. Он остаётся изменённым на всём протяжении заболевания и констатация этих изменений может использоваться для диагностики миастении в любом возрасте, при различном характере течения, разной степени тяжести, в любую фазу данной патологии.

Таким образом, в крови больных миастенией нами зарегистрированы повышенное число розеткообразующих лимфоцитов и исходно высокий титр антител, специфичных ацетилхолину. Также выявлены особенности реагирования лимфоцитов крови больных на введение в организм прозерина и калимина, нарушающих баланс эндогенного ацетилхолина, которые выражаются в значительном снижении исходных величин розеткообразующих лимфоцитов и титра антител, специфичных ацетилхолину. Таких изначально повышенных показателей, специфичных ацетилхолину, и подобной реакции на медиатор мы не наблюдали ни у здоровых, ни у больных с патологией периферической нервной системы, ни у больных с имитирующими миастению заболеваниями. Следовательно, полученные данные являются характерными для миастении и могут быть использованы в качестве диагностических тестов.

Предложенные нами клеточный и 17моральный варианты "ацетил-холинового теста", гуморальный вариант "прозериновой пробы", клеточный и гуморальный варианты "калиминовой пробы" и разработанный ранее клеточный вариант "прозериновой пробы" достаточно полно апробированы в условиях Пермской клиники неврологии. Можно утверждать, что они высокочувствительны, специфичны и могут использоваться в качестве дополнительных дифференциально-диагностических тестов при миастении и многочисленных миастеноподобных синдромах.

Выводы.

1. У практически здоровых лиц зарегистрировано присутствие в крови небольших количеств розеткообразующих лимфоцитов и антител, специфичных ацетилхолину, величина которых существенно возрастает после введения в организм антихолинэстеразных препаратов, нарушающих баланс эндогенного ацетилхолина (прозерин, калимин).

2. В крови больных миастенией зарегистрировано исходно высокое содержание розеткообразующих лимфоцитов, специфичных ацетилхолину, количество которых коррелирует с продолжительностью заболевания, степенью генерализации, степенью тяжести и типом течения миастениче-ского процесса.

3. В сыворотке крови больных миастенией впервые выявлены исходно высокие титры антиацетилхолиновых антител, величина которых зависит от. продолжительности заболевания, степени генерализации, степени тяжести и типа течения миастении.

4. Данные показатели являются маркёрами миастении, поскольку они повышены уже в дебюте заболевания и остаются таковыми на всём его протяжении. Констатация этих изменений может использоваться для

диагностики миастении в любом возрасте, при различном характере течения, разной степени тяжести, в любую фазу данной патологии.

5. На введение в организм антихолинэстеразных препаратов, нарушающих баланс эндогенного адетилхолина (прозерин, калимин) у больных миастенией наблюдается своеобразная, отличающаяся от таковой у здоровых и больных с другой патологией нервной системы, реакция, выражающаяся в значительном снижении числа розеткообразующих лимфоцитов и титров антител, специфичных ацетилхолину.

6. Специфическая реакция на медиатор наблюдается уже в дебюте миастении и не изменяет своего характера на всём протяжении заболевания, что может использоваться для диагностики различных форм миастении, в том числе и прозеринорезистентных её вариантов.

7. Иммунофармакологические способы диагностики миастении информативны в любом возрасте, при различном характере течения, разной степени тяжести, во все фазы данной патологии и могут быть использованы в качестве диагностических маркёров уже в дебюте заболевания.

Практические рекомендации.

1. Содержание в крови больного лимфоцитов, специфичных ацетилхолину, в количестве равном, и более 16 %, может служить диагностическим маркёром миастении.

2. Наличие в сыворотке крови больного антиацетилхолиновых антител в титре равном, и более 1:64, является характерным для миастении показателем и может также использоваться в качестве диагностического маркёра заболевания.

3. Новые способы диагностики - клеточный вариант "ацетилхолино-вого теста" и гуморальный вариант "ацетилхолинового теста" являются высокочувствительными и специфичными для миастении и могут исполь-

зовахься не только в качестве дифференциально-диагностических, но и для оценки степени тяжести миастенического процесса.

4. Клеточный вариант "прозериновой пробы" является высокоспецифичным диагностическим тестом при миастении и может использоваться для распознавания прозеринорезистентных форм заболевания.

5. Гуморальный вариант "прозериновой пробы" является высокочувствительным способом диагностики при миастении и может быть особенно полезен в случае его прозеринорезистентных форм.

6. Клеточный и гуморальный варианты "калиминовой пробы" могут служить надёжными и высокоинформативными дополнительными способами диагностики и могут быть использованы в качестве дифференциально-диагностических приёмов при миастении и заболеваниях, протекающих с миастеноподобными синдромами.

7. Разработанные и апробированные тесты целесообразно применять в качестве дифференциально-диагностических приёмов при многочисленных миастеноподобных синдромах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Новые иммунофармакологические способы диагностики в неврологии: Материалы. / Науч. конф. "Демиелинизирующие заболевания нервной системы". - Ярославль, 1995. - С. 51-52. (в соавт. с A.A. Быковой, Е.В. Володиной, М.Ф. Гаришиной, A.A. Шутовым).

2. Клинико-иммунологические параллели при миастении: Тез. докл. / Науч. сессии ПГМА. - Пермь, 1996. - № 66. (в соавт. с A.A. Быковой, A.A. Шутовым).

3. Immune shifts, typical for patients with myasthenia. Their diagnostic importance. // International journal on immunorehabilitation. - 1996. - № 2. - P. 153. (co-authors - A.A. Bykova, A.A. Shutov).

4. Immune Neostigmine test in diagnosis of myasthenia: Abstracts. / First International médical congress. - Izhevsk, Russia, 1996. - P. 42. (co-authors -A.A. Bykova, A.A. Shutov).

5. Новая иммунодиагностика в неврологии: Материалы. / Республ. конф. неврологов, нейрохирургов и медицинских генетиков "Современные методы диагностики и лечения заболеваний нервной системы". - Уфа,

1996. - С. 57-58. (в соавт. с А.А. Быковой, Е.В. Володиной, А.А. Шутовым).

6. Иммунофармакологические методы в диагностике миастении: Тез. докл. / Научно-практ. конф. молодых ученых ПГМА. - Пермь, 1996. - С. 26-27.

7. Приоритетная справка от 9.11. 96 г. А.А. Быкова, Е,Ф. Ольховская "Способ диагностики миастении" № гос. регистрации - 96122333.

8. Решение о выдаче патента РФ № 96105123/14 [008349] от 25.02.97г. "Способ диагностики миастении", А.А. Быкова, Е.Ф. Ольховская, А.А. Шутов.

9. Иммунодиагностика миастении: Тез. докл. / Науч. сессии ПГМА. -Пермь, 1997.-№229.

10. Новые способы диагностики миастении и рассеянного склероза: Материалы. / Науч. конф. "Проблемы здоровья семьи - 2000". - Турция,

1997. - № 99. (в соавт. с А.А. Быковой, Е.В. Володиной, К.Ф. Иззати-заде, А.А. Шутовым).

11. Иммунный вариант прозериновой пробы в диагностике миастении: Тез. докл. / IV Международной конф. молодых ученых и студентов. -Бишкек, Кыргызстан, 1997. - С. 32.