Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Иммунодиагностика синдрома приобретенного иммунодефицита в гематологии и трансфузиологии

РГБ ОД

На правах рукописи

з п №

ТУПОЛЕВА

Татьяна Алексеевна

ИММУНОДИАГНОСТИКА СИНДРОМА ПРИОБРЕТЕННОГО ИММУНОДЕФИЦИТА В ГЕМАТОЛОГИИ И ТРАНСФУЗИОЛОГИИ

14.00.29. - Гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МОСКВА 1995

Работа выполнена в Гематологическом научном центре РАМН.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ

доктор медицинских наук, профессор Т.В.ГОЛОСОВА ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

доктор медицинских наук,профессор В.Б.ХВАТОВ

доктор медицинских наук С.ДЛЬВОВ

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

Институт вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН

Защита диссертации состоится "_"_1995 г.

в "_" часов на заседании диссертационного совета Д.001.45.01

при Гематологическом научном центре РАМН по адресу: 125167, Москва, Новозыковский проезд, 4а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РАМН.

Автореферат разослан "_"_1995 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук,

старший научный сотрудник

В.Д.РЕУК

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Актуальность проблемы СПИДа в настоящее время не вызывает сомнений. С момента регистрации первых единичных случаев в США в 19S1 году СПИД уже к 1990 году превратился, в пандемию, охватившую .более 150 стран мира и унесшую жизни десятков тысяч больных. К 1994 году на Земле заражены или уже больны СПИДом более 14 млн.взрослых женщин и мужчин, и 1 млн. детей, а в России 831 человек инфицирован ВИЧ, из них 279 - дети. Ежедневно в мире заражаются ВИЧ-инфекцией 5000-6000 человек

Анализ многочисленных эпидемиологических данных показывает, что всего за несколько лет из "экзотической" болезни наркоманов и гомосексуалистов СПИД превратился в проблему, волнующую весь мир. В эпидемический процесс все шире вовлекались больные гемофилией, взрослые и дети, получавшие гемотрансфузии. В декабре 1982 года был зарегистрирован первый случай постгрансфузионного СПИД у ребенка, а с января 1983 года в США уже разработаны рекомендации для предупреждения возникновения СПИД в результате переливания крови и ее компонентов, введен строгий отбор доноров с обязательным их обследованием. В странах, где заболеваемость СПИДом, носит эндемический характер (США,Западная Европа и др. ), частота пост-трансфузионного СПИДа составляла 2-3% от всех случаев этого заболевания, а в России 1% инфицированных лиц заражены вследствии переливания крови. В США инфицировано ВИЧ в результате использования контаминированных вирусом препаратов крови 96 тысяч человек (на 10000 доноров приходилось 68 инфицированных), а из 27 млн. реципиентов крови с 1977 по 1985 годы 12000 инфицированы ВИЧ (по данным Американского центра по контролю заболеваний) . Присутствие вируса в крови объясняет возможность заражения ВИЧ при гемотрансфузиях и введении некоторых дериватов крови. В частности, вирус находили в цельной крови, отмытых эритроцитах, тромбоцитах, кровяной плазме и сыворотке. Убедительно доказана возможность передачи СПИД через дериваты крови: плазму и препараты факторов свертывания крови VIII и IX, применяемые при лечении гемофилии. Риск передачи ВИЧ через кровь составляет от 1 на 38000 до 1 на 300000 трансфузий. Большинство этих случаев объясняется тем, что доноры находились в "окне" - периоде между инфицированием и появлением определяемых антител к ВИЧ в сыворотке крови. Риск заражения медицинских работников в ходе профессиональной деятельности возбудителем СПИДа составляет менее 1% на каждый укол иглой, содержащей зараженную кровь. Широкие эпидемиологические исследования выявили общие черты,объединяющие ВИЧ-инфекцию и вирусные гепатиты В и С, цитомегаловирусную инфекцию , сифилис. Анализ ситуации, сложившийся с инфекцией ВИЧ, убеждает в том, что сегодня единственным относительно доступным способом борьбы с эпидемией заболевания является профилактика.

Выделение этиологического агента СПИД послужило стимулом для создания методов выявления антител к ВИЧ. Мировой науке понадобилось меньше года для разработки и налаживания серийного выпуска иммунофер-ментных тестов для детекции антител к ВИЧ. С 1985 года в США и странах Западной Европы введено обязательное обследование всей донорской крови на наличие анти-ВИЧ. В России такое обследование введено с конца 1987 года, а

Приказ МЗ СССР N91 "Об обязательном обследовании донорской крови на ВИЧ" датирован 10 февраля 1988 гола. Среди большого круга проблем, одной из наиболее важных, является, использование высоко чувствительных и специфичных иммунодиагностику МО в, позволяющих безошибочно выявлять 1111-фииированных лиц. Vie решены попроси выбора - какие тест-системы оптимальны доя Службы крови и диагностических лабораторий. Социально-экономические трудности последних лет привели к изменениям и структуре донорства, необходимость изучения данных изменении и влияния их на распространение ВИЧ-ннфекини гемотрансфузионным путем не вызывает сомнении.

Цель а задачи исследования.

Целью настоящей работы »пишется совершенствование мероприятий по профилактике посттрапсфузиониого СПИД.

В связи с 'лим были поставлены следующие задачи:

1. Срашшть качественные параметры отечественных и зарубежных тест-систем, предназначенных для выпадении антител к вирусу СПИД. Выбрать наиболее подходящие тесты для Службы крови.

2. Пронести серологически!! скрининг антител к ВИЧ среди групп доноров, реципиентов крови и и гемолеривагах. Определить частогу встречаемости в ряде исследуемых групп других инфекционных заболеваний, имеющих со СПИД общие эпидемиологические особенности.

3. Изучить изменения, произошедшие в структуре донорства, и их влияние на ннфнцмрогыннооь IS ИМ.

4. На основании арбитражных исследований ссропозитивных по антителам к ВИЧ образцов кропи установить процент подтверждении и выяснить причины ЛОЖНОПОЛОЖ1ПСЛЫ1МХ реакций.

5. 1'азработать алгоритм обследования доноров на антитела к вирусу СПИД в Службе крови.

Низшая шшичнп.

В результате выполнения настоящих исследований был получен ряд новых результат он,имеющих важное теоретическое и практическое значение.

1. На специально сформированных панелях контрольных сывороток определено, что наиболее чуионнгельными и специфичными среди зарубежных тест-систем, предназначен: .-у ляп определения антител к ВИЧ, являются "Vironostika", "VVellco/yinc', "hl.ivia", а среди отечественных иммунодиагнос-тикумов "Антиген" показал лучшее качество по сравнению с другими тестами.

2. Установлено отсутствие встречаемости антител к ВИЧ в обследованных группах доноров, гематологических бальных и медицинского персонала. Среди больных гемофилией антитела к вирусу СПИД выявлены н 0,40% случаев.

3. Ретроспективное исследование компонентов и препаратов крови показало отсутствие в них антител к вирусу СПИД.

4. Отмечены изменении о структуре донорства,произошедшие за последние 7 лет: - появилась новая группа доноры-родственники; - увеличилось относительное количество женщин-доноров; - преобладает старший возраст среди всех групп доноров. Иифицированность вирусом гепатита В за зги годы

снизилась в два раза срсди доноров, а возбудителем сифилиса возрасла в 40 раз.

5. При проведении верификации серопозитивных по антителам к ВИЧ образцов выяснены возможные причины ложноположительных и ложноотрица-тсльных реакций, определен процент подтверждаемости позитивных образцов на последующих этапах исследования.

6. Сформулирован алгоритм обследования доноров на антитела к ВИЧ, состоящий из четырех этапов. Применение данного алгоритма приводит к экономии средств.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Отсутствуют антитела к ВИЧ среди обследованных различных контингентов доноров, медицинского персонала и гематологических больных. Среди больных гемофилией антитела к ВИЧ обнаружены в одном случае. Ретроспективно исследованные препараты и компоненты крови свободны от антител к вирусу СПИД.

2. Отмечены изменения в структуре донорства за последние 7 лет. Увеличилось количество женщин в среднем по возрасным группам на 9,2% ¡преобладает возрастная группа 40-49 лет среди всех видов доноров;появилась новая группа - доноры-родственники. Инфицированность гепатитом В за истекший период снизилась в два раза, а сифилисом возрасла в 40 раз.

3. В результате сравнительных исследований на специально сформированных панелях контрольных сывороток выявлено, что лучшим качеством обладают тест-системы "Уцопо^ка", "\Vellcozyme", "Е1аут".

4. В ходе верификации серопозитивных в иммуноферментном анализе образцов крови установлено, что повторно в иммуноферментных тестах подтверждается 16,8%, а в реакции иммуноблотинга только 1% сывороток. Сформулированы причины ложных реакций в иммуноферментных тестах при исследовании антител к ВИЧ, такие как, неправильное хранение и разведение реагентов и исследуемых образцов или связанные с состоянием макроорганизма: наличие иммунизации, инфекиионно-воспалительных и аллепгчес-ких заболеваний.

5. Разработан алгоритм обследования доноров, включающий четыре этапа, что позволяет экономить средства, расходуемые на постановку подтверждающих тестов, на 26%.

Практическая значимость работы. Внедрение в практику.

Результаты сравнительных исследований иммунодиагностикумов для выявления ВИЧ-инфекции были направлены в Министерство здравоохранения СССР и способствовали подбору качественных тестов для апробации крови на наличие антител к ВИЧ для Службы крови.

■ Материалы диссертационной работы были использованы при обучении медицинского персонала диагностических лабораторий на семинарах, рабочих местах и декадниках.

Выявленная нецелесообразность применения тестирования сывороток крови в смеси на антитела к ВИЧ способствовала отмене рекомендаций МЗ СССР N28-6/6 от 6.02.87 г. " Определение антител к вирусу, вызывающему СПИД, методом иммуноферментного анализа (ИФА) в смеси нескольких исследуемых сывороток ".

Основные положения диссертационном работы внедрены в практику лабораторной деятельности ГНЦ с 1989 года.

Апробация работы.

Материалы, пошедшие п диссертацию, доложены на 60-ой научной сессии ЦНИИГПК ( Москва, 1988 ), на 11-oit республиканской конференции ли-1 омского республиканскою научного общества гематологов и трансфузиологов ( Вильнюс, 19Я9 ), на XV!!! съезде Всесоюзного общества эпидемиологов, микробиологов и нарлзитолоюн им.И.И.Мечникова (Алма-Ата, 19Ï9 ), на 3-ем съезде гематологов и трансфузиолотв Узбекистана ( Ташкент, 1990 ), на 3-ем Всесоюзном съезде гематологов и трансфузиологов ( Киров, 1991 ), на международном конференции но СПИД ( Санкт-Петербург, 199»! ).

иХШШШ'ШШ

Результаты исследовании опубликованы н 15 печатных работах, из них 6 - в центральных научных журналах.

Обьем а структура роботы.

Диссертация наложена на SS страницах и cocroirr из Введения, Обзора литературы, 4-х глав Собственных исследовании, Обсужден«!!, Выводов и указателя литературы ( 3-1 отечественных и Г/1 зарубежного источников ). Диссертация иллюстрирована 1S рисунками и 13 таблицам!!.

Автор выражает глубокую благодарность д.м.н., профессору Т.В.Голосовой за научную консультацию при подготовке диссертации, а также своим коллегам и соашор.ш проведенных исследований: А.Н.Марголинон, Д.В.Сомовой, А.А.Гуллевой, С. Ю.^агрянцевой, О.П.Плющ, К.Ь.Боеву, И.Л.Бондарепко.

MA THI'UAJlhl И МЕТОДЫ.

Материалом дли исследования служили 23474 образца сывороток крови:

- 15169 от доноров крови и плазмы. Это были жители Москвы; доноры резерва, активные доноры, доноры плазмы и доноры-родственники, сдававшие кровь на СП К при Г'ИЦ или непосредственно в П!Ц. Возраст доноров колебался от 18 до оО лег.

- 2071 or реципиентов препаратов крови. Среди этой группы 1867 составляли гематологические больные в возрасте от ! ! до 76 лет с диагозами: хронический лимфолеими ( 34% ), идиоматическая тробоцитопемия ( 27% ), лимфоаленомагпя .( 20% ), анемии неясного генеза ( 13% ), Неходжкинские лимфомы ( Ь"о ). Вольные 1емофилией в количестве 204 были и возрасте от 5 до 60 лет. Гемофилия Л оыда зарегистрирована в 85% случаен, гемофилии В -у 12,15% лиц, болезнь Внллебранла - у 2,15%, дефицит VîI фактора свертывающей системы у - 0,7%. Все больные находились в стационаре или под амбулаторным наблюдением и ГНЦ.

- 1879 от пациентов из 10 отделений ГНЦ: 21 - из отделения реанимации, 73 - из отделении трамсфузионно-зкефузиомной терапии, 577 - гематологии и интенсивном терапии, 132 - стерильного блока, 245 - отделения гематологии, 19Х - поликлиническою отделения, 257 - отделения хирургии, 169 - хирургического отделения реконструктивно-восстаночительиой ортопедии больных гемофилией, ¡36 - центра гемофилии, 71 - дневного стационара. Возраст больных колебхчея or 16 до 79 лет.

- 79 образцов получено от медицинского персонала ГНЦ в возрасте 1965 лет.

- 4044 образцов препаратов и компонентов крови : 1453 образца криоп-реципитата, 801 образец концентрированной плазмы, 13 свежемороженной плазмы были изготовлены на базе ГНЦ и исследованы на антитела к ВИЧ ретроспективно после трансфузий пациентам центра гемофилии; 317 серий иммуноглобулина были получены из различных регионов СНГ: городов Одесса, Москва, Минск, Рига, Киев, Ленинград, Таллин, Ташкент.

- 1979 образцов крови, присланных из различных учреждений Службы крови: СПК и ОПК городов Москвы, Смоленска, Элисты, Таллина, Калининграда, Сыктывкара, Пскова, Ростова, Набережные Челны, Тбилиси, Риги, Челябинска, Киева, Ташкента, Иркутска, Волгограда, Хабаровска. Образцы получены от следующих контингентов: доноров крови и плазмы, беременных женшин, реципиентов крови, иностранцев, больных, обследованных по клиническим показаниям, больных венерическими заболеваниями, наркоманов, лиц, вернувшихся из зарубежных командировок.

Сравнительные исследования проводили на специальных контрольных панелях, которые были сформированных следующим образом:

- 27 образцов составляли сыворотки, содержащие антитела кВИЧ-1 (п=25) и к ВИЧ-2 ( п=2 ). Кровь получена от инфицированных граждан России ( п=4 ) и иностранцев ( п=23 ). Все образцы были позитивны в иммуно-ферментном тесте "Vironostika" ( Голландия ), агглютинационном тесте "Serodia" ( Япония ) и иммуноблотге фирмы "Du Pont".

- 93 образца, были отрицательны в реакции иммуноблота по антителам к ВИЧ, а так же в иммунодиагностикумах "Vironostika" и "Serodia" , но положительны в тест-системе "Антиген" или другой иммуноферментной системе.

- 450 - сывороток крови доноров, негативных при двухкратном исследовании на антитела к вирусу СПИД в тест-системах "Vironostika" и "Serodia".

В работе были использованы 4 отечественных иммуноферментных тест-системы и 16 зарубежных, 2 агтлютинационных теста.

Список апробированных тест-систем:

1. "Антиген"

2. "Пептоскрин ВИЧ-1,экспериментальная серия

3. "Рекомбинант-ВИЧ"

4. "Вектор"

5. Recombinant HIV-l/HIV-2, Abbott

6. Anti-HIV-l/HIV-2 EIA "ДИАплюс"

7. Enzygnost anti HIV1+2 (Behring)

8. Pharmacia HIV1&2 Combi Ig G EIA • 9. Abbot Test Pack HIV-l/HIV-2

10. Clonatec Rapid HIV1-HIV2 AB

11.Rapid Elavia (Diagnostics Pasteur)

12.WelIcozyme anti-HTLV-III

13.Anti-HIV СП "ДИАплюс"

14. Recombigen-H IV-1 LA Test

15.Serodia-HIV(Fujirebio)

16.Enzygnost anti-HIV micro ( Belirihg)

17.Vironostika anti-HTLV-III(Organon Teknika)

18.Ortho ami-HTLV-III ELISA-Testsystem

19.Bioclirom HIV ELISA

20.Virgo HTLV-IM ELISA (Electro-Nucleonics)

21.HIV-1 ciiv peptide EIA (Labsystenis)

22.HIV EIA Tes! Kit (Labsystems)

В основу большинства иммуиоферментных систем положен классический принцип непрямого иммуноферментного анализа и только три теста основаны на принципе конкурентного ИФА и сэндвичреакции ( "Вектор", "Enzygnost", "Wcllcozyirie".

Созданные н нослелнее время экспресс иммуноферментные диагности-кумы "Clonatek" и "Test Pack" позволяют за 10 минут дать ответ о наличии антител к ВИЧ в исследуемой сыворотке и не требуют наличия оборудования, т.к. наборы укомплектованы всеми необходимыми реактивами и инструментами (пипетки). Инкубации предусмотрены при комнатной температуре на свету. Учет результатов визуальный. Проведение 90 исследований требует уже двух часов, а дальнейшее увеличение количества исследований влечет за собой значительное увеличение временных затрат.

Кроме иммуноферментных в работе использованы два агглютина-ционных теста. В тест-системе "Serodia-ВИЧ" (Япония) использованы желатиновые частицы, сенсибилизированные лизатом ВИЧ-1, а в тест-системе "Reconibigen-HIV-1 LA Test" (США) - латексные частицы. Проведение агглю-тинационных тестов: желатинового и латексного, также не требует никакого специального оборудования. Наборы укомплектованы всеми необходимыми реагентами. Они очень просты и удобны в работе, однако, значительное увеличение количества исследуемых образцов приводит к возрастанию временных затрат на порядок. Так на тестирование одного образца латексагглютинацни затрачивается около 6 мин, а 90 образцов - 1,5 часа.

В заключении следует отметить, что для подбора оптимальных иммуно-диагностикумов необходимо учитывать цель и объем исследования, требуемую быстроту проведения реакции, квалификацию персонала, наличие оборудования, электроэнергии, воды и многие другие факторы.

В качестве подтверждающего теста использован метод иммуноблота. Применены наборы фирм "Du Pont" и "Bioiad",a также отечественный имму-нодиагностикум,разработанный в институте вирусологии РАМН.Действующим началом этой тест-системы являются белки (антигены ВИЧ),предварительно фракционированные электрофорезом в полиамидном геле и в дальнейшем иммобилизированные на поверхности нитроцеллюлозной мембраны.В дальнейшем реакция аналогична непрямому классическому ИФА.При наличии в исследуемой сыворотке специфических антител к индивидуальным белкам ВИЧ образуется видимый преципитот.Полученные окрашенные полосы сравнивают с эталоном,на каюром нанесены характерные для ВИЧ белки.

Дополнительно были использованы:

- конфирмационный иммуноферментный тест фирмьГАЬЬоН" (США) для определения отдельно антител к ядерным и поверхностным антигенам ВИЧ;

- иммуноферментный тест фирмы "Abbott" (США),предназначенный для индикации антигена ВИЧ в исследуемой сыворотке.

В ходе сравнения различных тест-систем оценивали:

- чувствительность теста - по количеству выявленных позитивных по антителам к ВИЧ образцов крови;

- специфичность - по количеству обнаруженных негативных сывороток;

- воспроизводимость - по совпадению результатов реакции выбранных образцов при кратном тестировании.

: Результаты реакции учитывали в соотношении с "cut ofT'. Это коэффициент, который расчитывается согласно инструкции, прилагаемой к иммуно-диагностическому набору, относительно полученного показателя оптической плотности (ОП) негативного контроля, либо ОП позитивного контроля. В им-муноферментных тестах, основанных на принципе непрямого классического иммуноферментного анализа (ИФА), результат расценивался как положительный, если значение ОП исследуемого образца было выше "cut ofT. При использовании конкурентных тестов результат реакции считали позитивным, если оптическая плотность исследуемого образца была ниже значения "cut ofT'.

Кроме того, использовали "индекс" для сравнения различных тестов. Этот показатель расчитывался по отношению результата оптической плотности исследуемого образца к величине оптической плотности "cut ой" для классических иммуноферментных тест-систем. При использовании конкурентных тестов "индекс" считали по отношению величины "cut ofT' к результату оптической плотности образца.

Также применялось титрование ВИЧ-позитивных сывороток. Помимо предусмотренного инструкцией к набору, бьио произведено разведение исследуемых образцов буфером для разведения сывороток ( находящимся в составе набора ) 1:10; 1:20; 1:50; 1:100; 1:200; 1:400; 1:480; 1:600; 1:1000; 1:2000; 1:3000.

HBsAg и антитела к HCV определяли с помощью отечественных иммуноферментных тестов НПО "Аквапаст" и "Нижний Новгород". Были использованы следующие серологические реакции на сифилис: ТРНА и микрореакция преципитации с кардиолипиновым антигеном. Маркеры HBV тестировали с помощью иммуноферментных реагентов СП "ДИА плюс". Антитела к HTLV-I и цитомегаловирусу выявляли с помощью тестов фирмы "Labsystems".

Применяли замораживание образцов сывороток крови при -20 градусах С. Для тестирования однократно размораживали исследуемые сыворотки.

Статистическую обработку данных производили общепринятыми методиками, а также была применена методика сравнения по двум напрвлениям: -"грубо" с помощью ранжирования тест-систем по их точности; - "негрубо" с помощью функций чувствительности тест-систем.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. 1. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ОТЕЧЕСТВЕННЫХ И ЗАРУБЕЖНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИЧ

На первом этапе исследованы чувствительность и специфичность девяти иммуноферментных тест-систем, основанных на вирусных лизатах, две из которых были отечественного производства: "Антиген" и "Вектор" ; остальные -зарубежного. Анализ полученных результатов показал, что все положительные сыворотки были обнаружены в 8 тест-системах. В то же время отечественным тестом "Вектор" не выявлена сыворотка крови, подтвержденная как позитивная по анти-ВИЧ в иммуноблотинге, от больного гемофилией без клинических проявлений СПИДа. Высокие значения оптической плотности позитивных

результатов зарегистрированы при использовании тест-систем "Elavia" однако следует отметить, что и этой системе наблюдались небольшие колебании значении ОП (1908-2241 Ед). Самый большой разброс значений оптической плотности ti dull 11II) i !>! х результатов имел место н тест-системе "Антиген". С ли-агностикумами, основанными на конкурентном принципе ИФА, ("Вектор", "Enzygiiost", "Wcllcozymc" ) о наличии антител (положительном реакции) сулили по снижению оптического сигнала. При использовании таких диагностику-мов значения оптической плотности позитивных образцов были близкими, а в тест-системе "Вектор" приближались к контрольному у;ювню( при "Cut ofT=650 значении оптической плотности позитивных образцов были 140-600 Ед. ).

Результаты относительной специфичности вирусных тест-систем, полученные при параллельных тестированиях 450 отрицательных образцов сывороток крови донорок, показали, что при первичном скрининге антитела к ЬИЧ были выявлены н 0,22%г0,2?\% случаев и тест-системах "Антиген", "Вектор", "Ortlio", "Virgo" и "Enzygiiost", в 0,44%г0,31 \% - в тест-системе фирмы "Labsystems". При использовании иммунодиагностикумои "Vironostika", "Wellcozyme" и "Eiavia" анппелл к ВИЧ не были идентифицированы ни н одном случае. При повторном исследовании перничнопозигиинмх образцов в тех же тсст-системах количество положительных реакций снизилось до 0,22%з:0,221% в тест-системах "Антиген" и "Labsystems", и анти-ВИЧ не обнаруживались и остальных диагностических тест-системах. Один отрицательный образец сыворотки лапал положительную реакцию в тест-системах "Антиген" и "Labsystems" и при трехкратном ноыоре. Исследования, проведенные и имму-ноблотингс, свидетельствовали об отсутствии в данной сыворотке антител к специфическим белкам ЬИЧ.

Таким образом, из У тест-систем первого поколения наиболее специфичными были "Elavia", "Viroriosiika" и "We'lcozyme". При оценке воспроизводимости результатов в тест-системах первого поколении, было установлено, что 100% воспроизводимостью обладали три теста: "Vironostika", "Elavia", "Enzygiiost". Остальные шесть иммунодиагностикумои показали удовлетворительную воспроизводимость результатов ( 9Я'Л ).

В следующей серии опытов были изучены тест-системы, основанные на синтетических пептидах, отечественная - "I ¡ептоскрин" экспериментальная серия, и зарубежные - "Labsystems" и "Mioclirom". Апробации показала, что все 25 позитивных образцов были реактивными в двух нммунодиагностикумах "Пептоскрин" и "Labsystems". В то же время при использовании тест-системы "Biochroni" не был выявлен один серопозитивный образец от больного СПИДом с развернутой клинической картиной. В атой же тест-системе имел место наибольший разброс значений оптической плотности позитивных образцов (от 387 до 1404). Самые высокие значении оптической плотности были зарегистрированы и иммунолиагностикуме "Labsystems" (990-1603), а в тест-системе "Пептоскрин" положительные результаты располагались в зоне непосредственно над критическим (кошрольным) уровнем (рис.1). С точки зрения специфичности тсст-систсмы "I IcnrocKpini", "ÍJioclirom" и "Labsystems" были идентичны: зарегистрировано по одному первично позитивному образцу из 450 сывороток крови доноров.

§! ° с

з S

2200.

200С.

Значения оптических плотностей позитивных образцов в ИФА второго поколения

ИФА на основе лситндо»

Рехомбинаитпые ИФА

18а 1600 14001200-хооо 800 600 400

200

Тест-системы

Пептоскркн Biochrom Labsystems Рекомбинант Anti-HIV

-ВИЧ ОГДИАплюс"

[•] - значения оптической плотности.

Рис 1

Повторное исследование первично позитивных образцов во всех трех тест-системах дало отрицательный результат.

При оценке чувствительности рекомбинантных тест-систем "Рекомбинант ВИЧ" и "Anti-HIV" СП ДИАплюс были использованы 25 серо-позитивных образцов. Все позитивные по анти-ВИЧ сыворотки крови были выявлены во всех используемых тест-системах с высокими цифрами оптической плотности (рис.1). Наибольшие значения оптической плотности положительных образцов имели место при использовании тест-системы СП "ДИАплюс", где средний индекс составил 8,9, этот показатель в тест-системе "Рекомбинант-ВИЧ" составил 4,8. Кроме того, в тест-системе СП "ДИАплюс" различие между двумя значениями оптической плотности положительных об-

разцов при тестировании их в "дубле" составило от 0,9 до 6,8%, в то время как в иммунодиагностикуме "Рекомбинант-ВИЧ" от 3,3 до 12,3%. Специфичность рекомбинантных иммунодиагностикумов анализировали на панели, состоящей из негативных по анти-ВИЧ образцов крови доноров (450) и сомнительных в ИФА сывороток крови (62). В тест-системе "Рекобинант-ВИЧ" первично позитивные результаты среди негативных образцов были зарегистрированы в 2 случаях, а в тест-системс СП "ДИАплюс" в 3 случаях. Повторно положительные результаты не были отмечены. При тестировании сомнительных образцов в иммунодиагностикуме "Рекомбинант-ВИЧ" позитивные реакции дали два образца, а в тест-системе СП "ДИАплюс" - 4. Все 6 образцов сохранили позитивную реакцию и при трехкратном контроле. При исследовании этих сывороток в иммуноблотинге получен отрицательный результат.

Чувствительность тест-систем с классическим непрямым принципом ИФА оценивали при тестировании 8 серопозитивных сывороток, а также по индексу, определяемому отношением показателя оптической плотности в ИФА исследуемого образца к верхней границе отрицательного значения.

Средние титры серопозитивных образцов

1:3000

1:1000

1 - Аитгтн

2 - Пептоскрма

3 - Вектор

4 - Viroiioslika

5 - Elaru

t* - \Ytll(-<v)nif

7 - Елвдпго! »- Ortko

Рис 2

На рис 2 показано, что наибольшее разведение сывороток улавливалось в тест-системах "Elava" (1:3000) и "Ortho" (1:1000). Показатели титрования серопозитивных сывороток в тест-системах "Антиген" и "Vironostika" были идентичны (1:600). Среди конкурентных методов тест-система "Enzygnost" выявила серо-позитивные сыворотки со средним титром 1:480, тест-система "Wellcozyme" 1:400, а "Вектор" - 1:20. Наибольшие значения оптической плотности были получены также в тест-системе "Elavia", где средний индекс составил 9,9; этот показатель в тест-системах "Антиген" и "Пептоскрин" был ниже в 2,3 и 3,6 раза соответственно.(рис 3).

Чувствительность различных нммунофсрмснтных

t-ктвга.чл PKl'Mtf.l/l -ММТ/1 [-1ХГ.ЕУУ1 in |\1 ТЛ 12345678123456781234567812345678124 57

--средний кодекс 1 - 8 - номера сывороток

Рис 3

Рядом фирм разработаны и выпускаются комбинированные тест-системы для выявления антител к обоим видам вируса, в которых использованы в качестве антигенов сочетания ядерных и поверхностных пептидов ВИЧ-1 (р24 и gp41) и поверхностных белков, характерных для ВИЧ-2 (gp36). Располо-гая следующими тестами:

LAnti HrV-l/HIV-2 EIA "ДИАплюс" (Швейцария)

2.Phormacia HIV-1&2 Combi Ig G EIA (Швеция)

3.Enzygnost anti НГУ 1+2 "Behring" (ФРГ)

4.Abbott Recombinant HrV-l/HIV-2 EIA (США);

нами проведены сравнительные исследования их качественных параметров. Полученные данные свидетельствовали о высокой чувствительности испытуемых иммунодиагностикумов. Все 27 серопозитивных образцов ( из них 25 содержали антитела к ВИЧ-1, а 2 к ВИЧ-2) были расценены как четко положительные с высокими значениями оптической плотности. Индексы, показывающие, во сколько раз оптическая плотность позитивных сывороток превышает критический уровень, находились в пределах от 3,3 до 6,7 в 3-х исследуемых системах, в то же время в системе "ДИАплюс" этот показатель колебался от 8,6 до 19,что может бьггь объяснено низким значением критического уровня в данном тесте (рис 4). При исследовании этих же позитивных образцов в им-мунодиагностических системах "Рекомбинант-ВИЧ" и "Wellcozyme", основанных на рекомбинантных антигенах ВИЧ-1 были выявлены все 25 сывороток, содержащих антитела к первому вирусу иммунодефицита человека, а два образца, содержащие анти-ВИЧ-2 были отрицательными. Эти данные свидетельствуют об отсутствии перекрестной реактивности двух видов антител. Кроме того, испытуемые тест-системы не могут дифференцировать ВИЧ-1 и ВИЧ-2 инфекцию.Наличие одной или одновременно двух инфекций можно определить в подтверждающих тестах, которыми являются реакции иммуноблотинга или иммунопреципитации.

Сравнительная оценка чувствительности комплексных ВНЧ-1 /ВИЧ-2 систем в индексах

Pharmacia Anti-II IV Enzygnost Abbott

СТГДИАплюс"

У у/ / у' \ - эначевиа -икаехса

Рис 4

Результаты относительной специфичности четырех зарубежных комбинированных тест-систем,предназначенных для выявления антител как к ВИЧ-1, так и к ВИЧ-2 свидетельствуют, что из 93 сомнительных в ИФА образцов в системе "ДИАплюс" 22 были позитивными, в то время как в тест-системе фирмы "Enzygnost" и "Pharmacia" позитивные реакции были зарегистрированы только в одном из двух случаев, соответственно. Эти данные не претендуют на абсолютность, но требуют дополнительного изучения причин высокой неспецифической реактивности апробированных реагентов тест-сисгемы "ДИАплюс". Диагносггикум фирмы "Abbott" обладал наибольшей специфичностью, так как ложноположительные реакции не были зарегистрированы, ни в одном случае.

С точки зрения дифференцирования ВИЧ-1 и ВИЧ-2 инфекции на первом этапе исследования (скрининговом) интерес представляет ди-

агностический иммуноферментный набор "Clonatec" производства Франции. В данном тесте антигены ВИЧ-1 нанесены отдельно от антигенов, характерных только для ВИЧ-2, в форме точек, расположенных на разных полюсах диагностического поля. Таким образом, окрашивание верхней или нижней точки позволяет судить о наличии антител к ВИЧ-1 или ВИЧ-2, а одновременное окрашивание двух точек - антител к обоим вирусам. Чувствительность данного теста исследовалась в сравнении с аналогичным иммуноферментным экспресс-методом 'Test Pack" производства США, который не позволяет дифференцировать ВИЧ-1 и ВИЧ-2 инфекции, т.к. антигены двух вирусов нанесены вместе в форме полосы.Оказапось,что 10 позитивных образцов, из которых 8 содержали анпгтела к ВИЧ-1 и 2 - к ВИЧ-2, были четко позитивны, причем в тест-системе "Clonatec" представлен дифференцированный результат в отношении ВИЧ-1 и ВИЧ-2 позитивных сывороток.

Анализ специфичности иммуноферментных экспресс-методов для одновременного выявления анти ВИЧ-1 и анти-ВИЧ-2 был проведен на панели из 32 негативных сывороток крови доноров и 18 сомнительных в ИФА образцов. Все 32 донорских образца были расценены как негативные. В тест-системе 'Test Pack" были зарегистрированы две сыворотки крови с позитивной реакцией среди сомнительных, а при использовании иммунодиагностикума "Clonatec" все сомнительные образцы дали четко отрицательную реакцию.

При тестировании 10 серопозитивных образцов в двух агглюти-национных системах желатиновой "Serodia"(Hnomm) и латексной "Re-combigen"(CIIIA) 8 образцов, содержащих антитела к ВИЧ-1, зарегистрированы как резко положительные результаты, а 2 образца, содержащие анти-ВИЧ-2, дали отрицательную реакцию. Данный опыт свидетельствует об отсутствии перекрестной реактивности между анти-ВИЧ-1 и анти-ВИЧ-2 и в агтлю-тинационных тестах. Дополнительная оценка чувствительности данных агглю-тинационных тестов проведена с образцами сывороток крови от лиц с клинической картиной СПИД (п=14),причем 2 образца с низкими титрами антител к ВИЧ-1. Все 14 сывороток были позитивными как при использовании диаг-ностикума "Serodia", так и в латексагглютинации, однако в последней два образца с низкими титрами анти-ВИЧ-1 дали слабоположительную реакцию.

Высокой специфичностью характеризуется агтлютинационная тест-система "Serodia", так как из 60 негативных донорских образцов и 90 сомнительных в ИФА положительный результат не был зарегистрирован ни в одном случае. В то же время в латекс-агглютинационной системе 6 сомнительных образцов расценены как слабоположительные, но все 60 сывороток крови доноров - как отрицательные.

Из всех исследуемых тест-реагентов, наиболее просты и удобны агглю-тинационные и экспресс-ИФА. Стоит отметить, что применение их в лабораториях, где объем работы более 100 анализов в день, неоправдан, т.к. значительно возрастают затраты времени, частое повторение различных манипуляций требует от оператора повышенного внимания. Эти тесты оптимальны для использования в поликлиниках (стоматологических), стационарах (перед операциями и процедурами) и других лечебно-диагностических подразделениях, где необходим быстрый ответ о наличии ВИЧ-инфицированности, и количество ежедневно обследуемых не превышает несколько десятков.

Последние могут быть использованы для тестирования образцов крови, из которых приготовляют компоненты крови,требующие быстрой реализации (напримерлромбоконцентраты).

2. СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕРОПРИЯТИЙ ПО ПРОФИЛАКТИКЕ ПОСТТРАНСФУЗИОННОГО СПИД

2.1. Серологический скрининг антител к ВИЧ у донороспособного населения и в гелюдериватах.

В связи с дефицитом тест-реагентов в 1987 году согласно письму МЗ СССР "Определение антител к вирусу, вызывающему СПИД, методом имму-ноферментного анализа (ИФА) в смеси нескольких исследуемых сывороток"( утвержденным Главным управлением карантинных инфекций МЗ СССР 6.02.1987 г. N28-6/6 ) было рекомендовано проведение исследований на антитела к ВИЧ в смеси до 10 сывороток. Результаты работы по изучению выявляемое™ антител к ВИЧ в смеси сывороток с использованием отечественных и зарубежных тест-реагентов показали, что одномоментное тестирование десяти сывороток может приводить к ложнонегативным результатам. Так, значения оптической плотности позитивных образцов, исследованных в смеси с девятью негативными донорскими сыворотками крови снижались в ряде случаев более чем два раза, а при титровании таких образцов реагирующий титр смеси сывороток значительно возрастал, иногда, более чем на два порядка. Следовательно, при попадании в смесь из 10 образцов одной сыворотки, содержащей антитела к ВИЧ в низком титре, возможна интерпретация ее как негативной. Это положение было доказано использованием для исследования в смеси 10 сывороток образца крови от больного СПИД с низким титром антител, которой был расценен как негативный. Существенных различий при исследовании смеси сывороток в отечественных и зарубежных тест-системах отмечено не было.

Тестирование сывороток крови на наличие антител к ВИЧ в смеси, предполагающей объединение равных объемов не более пяти сывороток, показало, что все объединенные образцы, содержащие позитивные сыворотки, были правильно интерпретированы как положительные с незначительным снижением оптической плотности (не более 20% ). При исследовании положительного образца с низким титром антител к ВИЧ в смеси с 4 негативными сыворотками реакция была расценена как сомнительная, поскольку значения оптической плотности образца попали в так называемую "серую зону", составляющую промежуток от контрольного значения ОП до 10% ниже этого значения. Таким образом, опасно рекомндоватъ апробировать сыворотки на анти-ВИЧ в смеси.

Гарантированная безопасность гемотрансфузий от передачи ВИЧ и других сателлитаых вирусных инфекций, прежде всего, обеспечивается тщательным отбором донорских кадров и качественным серологическим скринингом их крови. Значительное увеличение в последнее время числа платных доноров по отношению к безвозмездным послужило основанием для изучения влияния изменений, произошедших в структуре донорства на частоту возможного инфицирования ВИЧ и вирусными гепатитами В и С. В обследование были включены кадровые доноры, доноры плазмы, доноры резерва, а также новая категория - так называемые доноры-родственники. Последние специально

подбираются для конкретных гематологических больных Центра и составляют около 10% относительно популяции доноров. Возрастной состав в этой группе напоминает состав доноров резерва в 1987 году. Высокий процент (29,9± 1.5%) приходится на мужчин до 20 лет. Это связано с тем, что основное количество лиц в данной группе приходится не на истинных доноров-родственников, а на военнослужащих, однократно или многократно сдающих кровь за материальное вознаграждение. Истинные родственники составляют только 6,6%±0,956% об общего числа этой категории доноров; 5,2%±0,845% приходится на медработников. Остальные - активные доноры (88,2%+1,229%) частным образом привлекаемые родными больных, или регулярно сдающие плазму лица "с ули-цьГ'.При скинируюшем тестировании 1593 образцов крови доноров-родственников ВИЧ-инфицированных не было зарсгистрировано.В то же время суммарная частота персистирования НВяЛв составляла 1,0%±0,249%,а ан-ти-НСУ-1,35% ±0,289%.

Существенных изменений ; 1987 по 1994 гг. п соотношении активных доноров, доноров плазмы и доноров резерва не наблюдается (3,2%»1,40%-4,8%±1,32%; 4,4%±1,19% - 6%±1,36%; 90,8%±0,42%,соответственно).0бращает внимание увеличение числа женщин в группах всех видов донорства (рис 5). Заметен прирост количества женщин среди активных доноров и доноров плазмы в возрасте от 20 до 49 лет,и,если ранее женщины отсутствовали в возрастных группах до 20 лет и 50-59 лет, то в 1994 году в возрасте до 20 лет они составляли 42%±2,85%-63%±2,79%, а в группе 50-59 лет - более 10%±1,73%.

Поменялся и возрастной состав доноров. Так, если в1987 году основную массу среди доноров резерва составляли лица в возрасте 20-29 лет, а среди активных - 30-39 лет, то в 1994 году преимущество принадлежит,примерно в равных долях.группам 30-39 лет и 40-49 лет. Обращает внимание прирост числа доноров в возрастной группе 40-49 лет среди всех видов донорства. Значительно увеличилось количество доноров в возрасте 50-59 лет среди доноров резерва и активных доноров. Среди доноров плазмы в данной возрастной группе изменения незначительны, что связано с тщательным отбором лиц для плаз-мофореза, однако, если в 1987 году возрастная группа 30-39 лет составляла 71%±2,61%, то в 1994 году этот показатель снизился до 48%±2,89%, а в возрастной группе 40-49 лет увеличился с 12%±1,87% до 33%±2,72%.

В 1994 году тестированию на антитела к ВИЧ подвергались 8326 доно-ров.Повторно позитивные реакции наблюдались в 0,54%+0,077% случаев, в подтверждающих тестах все образцы были серонегативны.

Что касается сателлитных вирусных инфекций,то инфицированностъ вирусом гепатита В популяции доноров в 1987 году составила 2,06%±0,170% доноров, а в 1994 году - 2,1%±0,158% среди доноров резерва, а в среднем по всем группам - 0,86%±0,10%. Частота выявления антител к вирусу гепатита С в среднем у доноров составила 1,89%±0,47%. Показатели инфицированное™ бледной трепонемой были ниже: 0,2%±0,045% среди доноров резерва и 0,12%±0,130% среди доноров родственников.Если сравнить эти данные с 1987 годом, когда этот показатель составлял 0,005%±0,0084%,' то вырисовывается резкое увеличение заражения сифилисом.

Возрастная структура донорства

%

1008060 40 204

I

I

%до 20л 20-29л 30-39л 40-4 9 л50-59л 100л

80604020

рг

й

100 80 H 60 40 20

до 20л 20-29л 30-39л 40-49л 50-59л

о

Й"

р:

р^

%

1008060 404 20

I

' до 20л 20-29л 30-39л 40-49л 50-59л

II

100 8060 40

20-

И

I

до 20л 20-29л 30-39л 40-49л 50-59л

III

□

до 20л 20-29л 30-39л 40-49л 50-59л

1987

п=12000

. I - доноры резерва

II - активные доноры

III - доноры плазмы

до 20л 20-29л 30-39л 4(М9л 50-59л

1994

п=12000 - мужчины I I - женщины

Рис 5

С целью оценки риска постгрансфузиоиного СПИДа ретроспективно были протестированы в ИФА на наличие антител к ВИЧ 4044 препаратов и компонентов крови. При исследовании криопреципитата (п=1453 ) , отмытых эритроцитов ( п= 52), свежезамороженной плазмы (п=13) в тест-системе "Антиген" положительных реакций выявлено не было. Из 801 образца концентрированной плазмы лишь один (0,12%±0,122%) показал однократно позитив-

ную реакцию.В то же время при исследовании 317 серий иммуноглобулина бымо получено S первично позитивных реакций (2,52%i0,8S0%) и 6 (l,S'9%sO,7M'/6) подтвердились при повторном тестировании. При разведении положительных серий иммуноглобулина в 10 раз буфером для разведения исследуемых образцов и гесгнронлнии их в И ФА нее реакции был отрицательны. !0 »i.ifjofiii'iin.ix серии иммуноглобулина » реакции иммупоблот.были негативны. Помученные данные свидетельствуют о необходимости разведения иммуноглобулинов и/или применения пептидных VI'PA, так как использование синтетических антигенных детерминант снижает риск возникновения неспе-пифнческич реакпнп за счет ne ИИЧ-антител я препарате иммуноглобулина. Такие ¡шипела при использовании вирусных или рекомбинантных И ФА реагируют с антигенами, оставшимися после очистки от клеток-продуцентов специфических белков ВИЧ.

2.2. Сс/ш.нк'и'нч'кш) скрининг антител к ВИЧ у гематологических больных.

!1 ре ivhi.üik; исследовании па анпигла к ВИЧ 1867 сывороток кропи больных хроническим лимфолейкозом, нлиопатической тромбоиитоленией, лимфоадепопатей, апеминмч различного генеза, лимфомами истинно положи гечьнык реакций отмечено не было. При тестировании 204 образцов от больных гемофилией антшела к 1Н1Ч были выявлены лишь в одном случае у больного гемофилией А, гражданина Болгарии, получавшего коммерческий коннешрат ангн-тсмофнлыюго фактора производства США. Клинических проявлении СПИДа У него не было. В реакции иммуноблота отмечена поло-жителмми реакция с g;> 120,160,41, р.64,55, 53,31,24,15/14. При обследовании лого больною ira маркеры гепапгга В обнаружены лптн-HBs и анти-НВс,лри oicyicininr HlisAg и 1цМ анти-НВс. Полученные данные свидетельствуют о перенесенной им в прошлом MRV пнфекпии.Принимая во внимание Этот случай и лии рщурные ланные о юн, что больные гемофилией относится к группе высокою риска инфицирования вирусами гепатита В, иммунодефицита человека, иитомп аловнпусом, так как и течение всей жизни получают гемоста-тическую терапто с нспогн.зопанпем препаратов плазмы,мы считали целесооб-р.иным изучить часюгу встречаемости маркеров HßV, CMV,n HTLV-1 и гак же состонпиг. факторов иммунитета ( ЦИК, активность системы комплемента, со.исрАапнс иммупог ■•чЛучштн ) у 121 больного гемофилией, находящихся под диспансерным наб'моденпем и гемофнлическом центре ГНЦ.

! 1оис|)чностный антиген гепатита В (HRsAg) был обнаружен в 4,9%* Iслучаен, антн-MBs - в 69,4%i4,19%. Суммарные антитела к ядерному анпнену были выявлены в 60,3%г4,45% и в ¿,13%±1,81/6, из них класса

свилетслг.с1иую!1!их о хронической репликации HBV. Лица, имеющие в крови одновременно oti.i пила антител к поверхностному и ядерному антигенам , н иммунные к ремнфекши составили 47,8%±4,54%. Антитела к CMV класса Ig M были выпилены у 90%±2,43% больных, анти-CMV !с,М- в 3,5%2:1,67/о и не в одном случае не было зарегистрировано антител к HTLV-1. Отмечена прима« зависимость между гяхестыо основного заболевания и присутствием маркепоп iIПV и CMV инфекций. При легкой форме гемофилии суммарная час го га выявления маркеров НВ-пируса составила 33,0%±4,27%. У больных со средним ч тяжелым течением гемофилии частота встречаемости маркером вируса гепатита !! била более, чем в ? раза выше и составила 75,2%± 3,93%, антшела к CMV обнаруживались у 60,3%i3,82% лиц.

Наличие широкого спектра антител к вирусным инфекциям у больных гемофилией послужило основанием для исследования некоторых факторов иммунного статуса. В 26,4%^4.01% случаев у больных гемофилией отмечалось увеличенное содержание ЦИК - в 1,5-2 раза, в то же время выявлена гипогам-маглобулинемия классов и ^М в 32,2%±4,25% и 12,4%±2,99% случаев соответственно, а ^С - в 4,9/о± 1,96%. Обнаружено достоверное снижение как общей комплементарной активности, так и отдельных компонентов комплемента С1-С5. Угнетение комплементарного статуса вплоть до нулевых значений выявлено у 52,8%г4,54% больных гемофилией.

Наибольшую опасность на сегодняшний день в гематологических стационарах представляют вирусные гепатиты,о чем свидетельствуют высокие цифры инфицированности их маркерами среди больных и медицинского персонала. HBsAg обнаружен у 87 больных и 2 сотрудников ГНЦ, причем самый высокий процент выявления НВзАй приходится на отделения реанимации (14,3% ± .7,82%), дневной стационар (9,9%±3,54%) и отделение гематологии и интенсивной терапии (ГИИТ) (б,8%±1,05%). Среди пациентов гемофилического центра и ХОРВОГ НВх^ обнаружен в 4,4%±1,76% и 1,8%±1,21%, соответственно.

При обследовании на анти-НСУ гематологических больных положительные реакции в среднем составляют 2б,4%±1,51%. Особенно велика се-ропозитивность по антителам к вирусу гепатита С у больных гемофилией; так, среди пациентов ХОРВОГ она составляет 78,4%±4,07%, а у наблюдаемых ге-мофилическим центром 49,б%г4,70%. Высок этот показатель и среди больных из хирургического отделения ( 41,2%±8,51%) , отделения реанимации ( 28,6%±18,45% ) , что связано так же с большим количеством инъекций, трансфузий и хирургических манипуляций. Вызывает опасения и процент положительных реакций по анти-НСУ у медицинских сотрудников ГНЦ ( 3,1%±3,06%).

Отсутствие антител к ВИЧ в популяции доноров и в препаратах и компонентах крови свидетельствуют, с наибольшей вероятностью, о подпороговом уровне инфицированности ВИЧ. Об этом же говорят данные по обследованию реципиентов препаратов крови,многократно получавших трансфузионную терапию. в ходе лечения.В то же время необходимо помнить,что в условиях гематологических стационаров любое нарушение противоэпидемического режима может привести к внугрибольничному распостранению не только вирусных гепатитов,но и ВИЧ-инфекции,имеющей аналогичные пути передачи.

3. ВЕРИФИКАЦИЯ ПОЗИТИВНЫХ В ИФА ОБРАЗЦОВ ПО АНТИТЕЛАМ К ВИЧ И ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНЫХ ПРИЧИН ЛОЖНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Арбитражному контролю подлежали 1979 образцов сывороток крови,первично положительных по анти-ВИЧ в отечественных иммунофермент-ных диагностикумах: "Антиген", "Пептоскрин", "Рекомбинант-ВИЧ". 47%*1,12% составили сыворотки от мужчин ( п=940 ) и'53%±1,12% - от жен-шин ( п=1039 ). Детей в возрасте до 1 года бьио 10 человек, из них 7 - мужского пола и 3 - женского. Основное количество тестируемых образцов (74,5%±0,98%) было от лиц в возрасте от 20 до 39 лет, (п=1475). Подобное преобладание лиц молодого возраста среди ИФА позитивных по антителам к

ВИЧ объясняется не особенностями эпидемиологии СПИДа, а тем, что среди обследованных преобладала донорская когорта (66,5%± 1,06%) к возрастной категории 20-39 лет.

В холе тестировании всех присланных образцов сывороток крови в отечественных иммунодиагностикумах было получено 332 (16,8%±0,Я4%) позитивных результата, ,42 (4,!%±0,45%)подтверднлись при использовании зарубежных тест-систем и только 20 (1,0%г0,22%) дали положительную реакцию в иммуноблоте и были расценены как содержавшие антитела к вирусу СПИДа. Ксли рассматривать подтверждаемое™, позитивности присланного образца поэтапно н отечественных, затем в зарубежных ИФА, то из 1317 сывороток крови доноров во всех иммуноферментных тестах дали позитивную реакцию только 6,-1% г 0,67%, а н иммуноблоте подтвердились лишь два образца ( 0,15%±0,1!%). Этот факт свидетельствует о низкой инфицироваиностн среди доноров, несмотря на преимущественное количество образцов сывороток этой группы на каждом этапе исследовании. Данные по поэтапной подтвервдаемос-ти образно» от различных контннгентов предстаалены в таблице 1.

Таблица 1

Поэтапное подтиерждение анти-ВИЧ позитивных образцов от различных контингентон.

Контингент Процент подтвердившихся позитивных результатов

В зарубежных ИФЛ Из них н иммуноблоте

Процент Средняя ошибка Процент Средня я ошибка

Доноры 6,4% | ±0,67% 0,15% ±0,!1%

вольные венерическими заболеваниями 5,6% ±3,10% 3,6% ±2,51%

Обследованные но клиническим показаниям 8,6% ±2,7% 2,0% - ±1,37%

Лина, находившиеся за рубежом более 1 мес. 30% ±15,27% 20% ±13,33%

Беременные 5,7% ±1,54% 0,4% ±0,42%

Решнтиеты препаратов кропи 11,4% ±5,37% 0% -

Иностранные граждане; из них: 28,5% ±10,09% 41% ±10,99%

-реципиенты препаратов кропи 100% - 100% -

-прибывшие на срок более 3 ИС(. 42,9% ±20,21% 42,9% ±20,21%

РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ВХЧ-ИНФИМРОВЛНаИ ЛШ.АРБХГГАДШЕ ИССШШВЛНИЯ.

[1979 образцов |

V

V У V V V V У V V V V

207 хек. Конго 207 иуд. ГМнея 207 ну*. Чад 21X1 лен. Франция 207 нуж. Эфиопия 210 нуж. НЫ> 207 ну». Танзания 207 муя. ХуОа 207 нуж. Уганда 207 *У». Уганда 207 муж. Уганда

Рис 6.

В реакции иммуноблота было получено 20 положительных результатов. В 10-ти случаях образцы сывороток оказались от лиц в возрасте от 20 до 29 лет и в 6-ти - от 30 до 39 лет, что является характерным признаком с точки зрения эпидемиологии СПИДа, так как данным заболеванием поражаются именно молодые и трудоспособные люди. Два образца были от детей из районов вспышек СПИДа и два от лиц в возрасте 40-49 лет. Иностранцы составили 55% (п=11). Распределение подтвержденных ВИЧ-инфицированных лиц по кодам, полу и месту жительства представлено на рисунке 6. 18 образцов показали позитивную реакцию со всеми белками оболочки вируса иммунодефицита человека ( Ёр160,120,41), в одном случае отсутствовали антитела к 41, и еще в одном образце не было антител к gp 160 и gpl20. У всех 20 образцов наблюдался широкий спектр антител к ядерным белкам ВИЧ и ферментам вируса.

Неопределенные результаты иммуноблота зарегистрированы в 21 случае,среди них: 20 образцов крови от доноров и 1 - от лица, обследованного по клиническим показаниям; 14 - от мужчин и 7 - женщин. В 8 случаях из 21 были выявлены антитела к р24 - единственному белку ВИЧ (п=2) и в комплексе с антителами к одному или нескольким ядерным белкам или ферментам вируса СПИДа ( п=6). У больного, обследованного по клиническим показаниям, выявлены антитела к р15,17,55.

Антител к пептидам ВИЧ-2 не было обнаружено ни в одном случае.

В связи с наличием ложноположительных реакций в иммуноферментных тестах по анти-ВИЧ,был проведен анализ возможных причин неспецифй-ческих реакций. Первично положительные реакции, не подтверждающиеся при повторных исследованиях, связаны, как правило, с техническими ошибками оператора при проведении ИФА и/или некачественностью тест-реагентов. Возможны следующие варианты:

- неправильное разведение исследуемой сыворотки ( менее предусмотренного инструкцией по применению иммунодиагностикума за счет погрешностей или неисправностей автомагических микропипеток и/или ошибок операюра )

- попадание в лунку планшета инородных частиц: пыли,высохших частиц крови или галька

- неправильное отмывание данной лунки планшета, приведшее к контакту остатков копьшгата и внесенного субстрата

- нелоспиочнос растворение субстрата и попадание кристалла ортофе-нилендиамнна в лунку

- заводской брак планшета.

Наличие же повторно положительной реакции одного образца можно объяснить наличием м нем неспецифнчгских антител или иммунных комплексов, реагирующие с антигенами, нанесенными в лунку планшета .

При анализе анкетных данных лиц, сыворотки крови которых давали дожнонозитишпаг реакции в НФЛ по анти-ЙИЧ, установлено, что ложнопо-ложптельние реакции наблюдались у 3 доноров, иммунизированных антнета-филококковым анатоксином. Неспепифические реакции имели место с образцами сывороток крови от больных аутоиммунными заболеваниями, такими, как геморрагическим васкулнт, системная красили волчанка, ревматоэдый по-лиа[чрит, калчномноплти;' и аллергический дерматит. Реактивными и МОЛ были и образцы крови от лиц, страдающих инкфекционпо-воспалнтельными заболеванними: стафилококковый сепсис, андометрит, тромбофлебит.Наличпе туберкулез.! у Н обследованных лиц линч, к одном случае привело к ложпоно-ложительной реакции. У одного больного с диагнозом лимфолейкоз, кроме iioiHiiHiHoii реакции 'i 11'1>Л, были отмечены и неспецифическне полосы а реакции нммунобшгга, однако, в другом случае у больного тем же недугом, ре-ly.Muar тест пронация в НФЛ на антитела к вирусу СПИД был четко отрицательный. Зарегистрированы ложнопозшивные в V'OA образцы от больных с осгеомпелофиорозом, неснепмфнческми язвенным колитом, 0пух0Л!.!0 головного мозга. Такие заооленанпя, как рецидивирующая герпетическая инфекция, лихор.цжа невского leneta, псориаз, часто »шшющиеся возможной причиной иеенснифнчгхкнч реакций но литературным данным, ь наших исследованиях не приводили к н'ош кипой реакции и иммуноферментном анализе.

Ги.ти нроанатыиронаны результаты тестирования на наличие антител к ИМ"! н ¡!ФА 2 IV образцов от доноров крови, присланных на арбитражные исследовании из различных учреждений Служб!.! крови страны. Существенных различий между реакциями полученными с образцами первой, второй, третьей и чеi вер!о!i групп крочн отмечено не было, так количество позитивных образ-ион оыло 2-V/ií-í,-1S'íó, I.S%i4,2'1?á, 21%*7,20%, !2%±6,63%, соответственно по |рунпам or otniicro числа исследований. Положительные реакции чаще регист-рнронавнсь с образцами резус положительной кропи ( 21,5%»2,94%), чем с резус OfpHHaiem.HOH кровью ( 1 К%), но подобное утверждение недостаточно правомерно, ык как проанализировано значительно меньше образцов резус о1ринагельной кропи ( п—24), по сравнению с резус положительными образцами (n—19.S)

Учитывая,чго образны,поступающие на верификацию, подвергаются замораживанию и последующему оггаиванию, была произведена оценка влияния

замораживания на воспроизводимость и ложнопозитивность образцов. Среди негативных сывороток только 3,2%±3,16% образцов дали ложноположитель-ную реакцию после однократного размораживания, однако, среди сомнительных в ИФА сывороток крови 80%^ 13,33% оказались позитивными и 20%г 13,33% переместились в разряд негативных.- Положительные образцы после однократного размораживания сохранили свою реактивность только в 54,5%±7,51%. Таким образом, замораживание образцов сывороток крови при -20 °С, ранее позитивных в ИФА по антителам к вирусу СПИД, приводит к существенному снижению реактивности, а ранее негативных по анти-ВИЧ - к небольшому приросту ложнопозитивности.

В ходе анализа результатов арбитражного контроля был сформирован алгоритм исследования донорской крови на наличие ВИЧ-инфекции. Однократно позитивная реакция в ИФА по антителам к вирусу СПИДа ведет к задержанию данной порции крови до момента верификации образца. После повторного двухкратного исследования в той же тест-системе в случае негативной реакции кровь возможно использовать (например : для приготовления препаратов, подвергающихся термической обработке). Если образец оказался позитивным дважды, то новую порцию крови исследуют в альтернативном иммунодиагностикуме ( т.е. в ИФА, где использован другой тип антигенной насадки). В случае положительной реакции кровь бракуют, а образец идет на последующее исследование в подтверждающем тесте ( иммуноблоте). Наличие в тестируемой сыворотке антител, специфичных к белкам ВИЧ в реакции им-муноблота свидетельствует об инфицированности вирусом СПИДа данного донора.За ним устанавливается динамическое наблюдение, его снимают с донорства и проводят разъяснительную работу о дальнейшем социальном поведении. Если образец был дважды отрицателен в альтернативном тесте, то его не считают содержащим антитела к ВИЧ, но необходимо последующее контрольное обследование донора через три месяца.

Подобный 4-х этапный алгоритм обследования позволяет экономить средства, затрачиваемые на подтверждение образца на 26,7%. Так, одно обследование на антитела к ВИЧ в иммуноферментном тесте стоит 15,625 тысяч рублей, а исследование в иммуноблотинге - 81 тысячу. Если заменить 3 этап подтверждения иммуноферментным альтернативным диагностикумом, то вместо 127,875 тысяч рублей можно затратить 93,75 тыс.'. Учитывая, что в иммуноблотинге подтверждается ( согласно нашим данным ) 1% образцов, серопо-зитивных по антителам к ВИЧ только в одном иммуноферментном тесте и 24,4% - положительных в двух разных иммуноферментных диагностикумах, то можно говорить о существенной экономии денежных средств, так как 74,6% двухкратно позитивных образцов только в одном скрининговом тесте не будут нуждаться в последующем подтверждении их в иммуноблотинге, поскольку окажутся негативными на третьем этапе исследования.

Для избежания ложноотрицательных реакций и снижения ложнопо-ложительных результатов лучше тестировать каждый образец в дубле в одной тест-системе, а, при возможности, в двух альтернативных тест-системах одновременно с разными видами иммобилизированных антигенов.

В настоящее время радикального средства лечения СПИДа и эффективной вакцины против этого заболевания не существует, между тем эпидемия продолжает распространяться, несмотря на подпороговый уровень ВИЧ-

ннфнпированностн среди населения СНГ. Поэтому в борьбе со СПИДом особенно важны профилактические меры, предупреждающие заражение ВИЧ,в частности, своевременная диагностика ВИЧ-инфекции. Эффективная ранняя диагностика ВИЧ-инфекции позволяет контролировать распространение инфекции среди населении и целом или отдельных групп (проводить скрининг), предотвратить распостранение инфекции с препаратами крови , донорской спермой « при пересадке органов и тканей, необходима в клинической практике для подтверждении инфнциронанности ВИЧ. Для выявления ВИЧ-ннфекиии испочыуются ра нюобразные тест-системы , но оптимальными являются П'Г>Л-аес ты, сочепиошие высокую чувствительность и специфичность с возможностью проведения массовых определении.

выпады

1. Зафиксировано отсутствие антител к ВИЧ среди обследованных групп доноров, медицинского песонала и гематологических больных, среди больных гемофилией антитела к вирусу СПИД обнаружены в 0,49%.

2. В результате ретроспективных исследований показано, что препараты и компоненты кроки свободны о г ВИЧ-ннфекции.

3. Отмечены следующие изменения в структуре донорства:

• появилась новая групп;! - доноры-родственники,составляющая 10% от общего числа всех видов донорства;

• увгличинос!, опюсительнос количество женщин-доноров в среднем по полисным »руппам на 9,2%;

• нрег.олачает «партий возраст среди всех групп доноров - 40-49 лет.

4. Частота встречаемости маркера гепатита В - НГкЛд среди гематологических больных составляет - ■!,')%, а анппел к вирусу гепатита С - 26,4%. В группах доноров Ш^Л;; встречался в 0,.Х6% случаем, аптн-НСУ обнаружены в 1,89%. '.'.пачи|е;!ыю увеличилось число доноров, инфицированных сифилом с 0,0(15% в 1').Ч7 Iоду до 0,2-0,12% в 1994 году.

5. При анализе результатов верификации серопозитнвных в иммунофермент-ном анализе п^мзцлч криви обнаружено,1чю при повторных исследованиях в отечеоиенник тестах подтверждено 16,2%, в зарубежных - 4,1%. 3 реакции иммупчОлопшга сепонозитивность по анти-ВИЧ наблюдалась в 1% случаев.

6. На ененналыю сформированных панелях контрольных сывороток выявлено, что среди 22 апробированных тест-систем, предназначенных для выявления антител к НИЧ в сыворотках кропи, наиболее чувствительными и специфичными иичямти "Уиопо^ка", "Е!ау1а", 'ЛУеПсогуте", а среди отечественных имчуиодиагностику.мов - "Антиген".

7. Усыновлены следующие причины, приводящие к ложным результатам, при проведении нммуноферментнот анализа:

тгхнп'нч мор

• неправильное хранение и разведение реагентон-н исследуемых Ci.iP.o-роп>к,

• не соплюление времени инкубации,

• неправильное о'мывание гпа'ичета

• заводской брак,

•-.исследование смеси сывороток;

связанные с состоянием обследуемого макрооргаиизма:

• наличие аутоиммунных и инфекционно-воспалительных заболеваний,

• иммунизации.

8. Разработан алгоритм обследования доноров,включающий четыре этапа:

• скрининг сывороток в иммуноферментном анализе

• повторное исследование серопозитивных образцов в том же тесте

• повторно-позитивные образцы тестируют в альтернативных иммуно-ферментных тестах

• подтверждение в иммуноблоте.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Голосова Т.В., Марголина А.Н., Туполева Т.А.,Кашуба Н.Л. Серодиагностика HIV у доноров крови.Материалы 60-ой научной сессии ЦНИИГПК.-Москва, 1988 г.- С.16-17.

2. Голосова Т.В., Марголина А.Н., Туполева Т.А. Оценка тест-систем для выявления антител к HIV в ИФА.- Фундаментальные и прикладные вопросы проблемы СПИД. Сборник научных учных трудов института вирусологии им.Д.И.Ивановского АМН СССР.- Москва, 1988 г.-с.147-149

3. Голосова Т.В., Марголина А.Н., Туполева Т.А. Серологический скрининг на антитела к HIV доноров крови и контингентов повышенного риска,- Фундаментальные и прикладные вопросы проблемы СПИД: Сборник научных трудов (Памяти В.М.Жданова).- Москва, 1988.-С.35-38.

4. Голосова Т.В., Марголина А.Н., Туполева Т.А. Антитела к вирусу иммунодефицита человека в препаратах крови.- Материалы II республиканской конференции литовского республиканского общества гематологов и транс-фузиологов,- Вильнюс, 1989 г.- С. 31.

5. Голосова Т.В., Марголина А.Н., Туполева Т.А. Сравнительная оценка имму-ноферментных тест-систем для выявления антител к вирусу иммунодефицита человека.- Гематология и трансфузиология.1989.-1^о5.-С.49-52.

6. Голосова Т.В., Плющ О.П., Марголина А.Н., Сомова A.B., Туполева Т.А., Вавилова J1.M. и др. Маркеры вирусов иммунодефицита человека, гепатита В, цитомегалии у больных'гемофилией.Тезисы XVIII съезда Всесоюзного общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И.И.Мечникова.- Алма-Ата, 1989.- С. 203-205.

7. Голосова Т.В., Марголина А.Н., Туполева Т.А. Антитела к вирусу иммунодефицита человека (HIV) у доноров крови.-Гематология и трансфузиоло-гия.- 1991 .-No 10.-С735-37.

8. Голосова Т.В., Марголина А.Н., Сомова A.B., Туполева Т.А. Частота выявления серологических маркеров вирусных инфекций у больных гемофилией.- Тезисы докладов 3 съезда гематологов и трансфузиологов Узбекистана.-Ташкент, 1990.-Ч.2.-С.З-4.

9. Голосова Т.В., Марголина А.Н., Туполева Т.А., Гуляева A.A. Иммунодиагностика ВИЧ- инфекции в трансфузиологической службе,- Гематология и трансфузиология.- 1991.- No5.- С.34-36.