Автореферат и диссертация по медицине (14.01.16) на тему:Иммунодиагностика различных проявлений туберкулезной инфекции у детей

На правах рукописи

Лхмерова Татьяна Ефимовна

ИММУНОДИАГНОСТИКА РАЗЛИЧНЫХ ПРОЯВЛЕНИЙ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ У ДЕТЕЙ

14.01.16 - фтизиатрия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

25 СЕН 2014

Москва — 2014

005552734

005552734

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения России

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Бородулина Елена Александровна Официальные оппоненты:

Овсянкина Елена Сергеевна доктор медицинских наук, профессор, заведующая детско-подростковым отделением ФГБУ Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН

Ставицкая Наталия Васильевна доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора по научной работе НИИ фтизиопульмонологии ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М.Сеченова Минздрава России

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения России

Защита состоится /¿^^2014 года в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.040.06 в ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова по адресу: 119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр.2

С диссертацией можно ознакомиться в ГЦНМБ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им И.М.Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д.49 и на сайте организации: www.mma.ru

Автореферат разослан »

2014 года.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

Доктор медицинский наук, профессор

М.П. Грачева

Актуальность проблемы

Заболеваемость туберкулезом в России среди детей, возросшая в 90-х годах прошлого столетия, продолжает оставаться напряженной и составляет около 20 на 100 тыс. детского населения (Шилова М.В., 2011г, Аксенова В А., 2012, Овсянкина Е.С., 2012). Одним из основных диагностических критериев туберкулеза у детей, по-прежнему, остается инфекционный характер туберкулиновой чувствительности по пробе Манту 2ТЕ.

В последние годы в России применяется препарат Диаскинтест® (Diaskintest (DST)), который представляет собой рекомбинантный белок CFP-10 - ESAT-6, продуцируемый Escherichia coli BL21 (DE3)/pCFP - ESAT. При внутрикожном введении Диаскинтест® вызывает у лиц с туберкулезной инфекцией специфическую кожную реакцию; у лиц с поствакцинальной аллергией реакция на препарат Диаскинтест® отсутствует (Аксенова В.А., 2010, Овсянкина Е.С., 2011г.).

Сравнительная характеристика результатов пробы с препаратом Диаскинтест® с ранее известными туберкулиновыми пробами у детей с туберкулезной инфекцией находится в стадии изучения. Особую проблему составляют данные о наличии отрицательного результата Диаскинтест® при активном туберкулезе, что обуславливает актуальность данного исследования.

Цель исследования Повышение эффективности диагностики различных форм туберкулезной инфекции у детей с учетом результатов кожных туберкулиновых тестов и особенностей реагирования иммунной системы.

Задачи исследования Изучить клинические формы туберкулеза у детей, поступивших на стационарное лечение и результаты туберкулиновой чувствительности по пробе

Манту 2 ТЕ и пробе Диаскинтест^. Определить корреляционную связь проб Манту 2 ТЕ и Диаскинтест® при диагностике туберкулезной инфекции у детей.

Изучить противотуберкулезную активность иммунной системы и уровень стимулированной продукции IFN-y в системе противотуберкулезного иммунитета у детей с впервые выявленной туберкулезной инфекцией и ее значение для прогноза заболевания.

Выявить особенности реагирования иммунной системы при различных формах и фазах туберкулезной инфекции у детей, а также у детей с отрицательным результатом Диаскинтест®.

Научная новизна исследования

Иммунодиагностика туберкулезной инфекции у детей выявила особенности реагирования как кожных проб Манту 2 ТЕ и с препаратом Диаскинтест так и иммунологических показателей сыворотки крови CD4+ -, CD16+ - лимфоцитов, IgE и уровень сывороточного IFN-y. Выявлена корреляционная связь всех изучаемых показателей, как при локальных формах туберкулеза, так и при конверсии туберкулиновых проб.

Впервые, при диагностике туберкулеза у детей, изучен уровень стимулированной продукции IFN-y в тест - системе с препаратом Диаскинтест ® in vitro и определена его роль в иммунодиагностике туберкулезной инфекции.

Определены значения иммунологических показателей CD4+ -, CD16+ -лимфоцитов, IgE в периферической крови и уровень продукции стимулированного IFN-y в тест - системе с ФГА и с препаратом Диаскинтест ® in vitro, позволяющие прогнозировать развитие туберкулезной инфекции у детей.

Выявлены особенности реагирования иммунной системы у детей с отрицательным результатом Диаскинтест® при локальных формах туберкулеза и с конверсией туберкулиновых проб. Для детей, с подозрением на туберкулезную

инфекцию, но с отрицательным результатом пробы с препаратом Диаскинтест", разработан алгоритм диагностики.

Практическая значимость работы Полученные результаты могут быть использованы в практической работе врачей фтизиатров и врачей общей практики при проведении ранней диагностики туберкулеза у детей.

В случае выявления «виража» туберкулиновой пробы Манту 2ТЕ, наличия факторов риска по туберкулезу (контакт, ВИЧ-инфекция, неэффективная вакцинация и др.), но, при этом, отрицательной реакции на Диаскинтест®, рекомендовано дообследование на состояние противотуберкулезного иммунитета.

Предлагаемый комплекс методов дополнительного лабораторного обследования, включающий определение уровней CD4+ CD16+ - лимфоцитов, IgE в периферической крови и уровень продукции стимулированного IFN-y в тест - системе как с ФГА, так и с препаратом Диаскинтест 15 in vitro, предоставляет возможность не только повысить качество диагностики туберкулезной инфекции, но и оценить состояние противотуберкулезной активности иммунитета.

Положения, выносимые на защиту У детей, впервые поступивших на стационарное лечение в противотуберкулезное отделение, выявляются локальные формы как первичного, так и вторичного генеза. При оценке туберкулиновых проб установлена прямая корреляционная связь пробы Манту 2ТЕ и Диаскинтест®.

Комплекс методов дополнительного лабораторного обследования, включающий определение уровня CD4+ -, CD16+ - лимфоцитов, IgE в периферической крови и уровень продукции стимулированного IFN-y в тест -системе с препаратом Диаскинтест ® in vitro, предоставит возможность оценить противотуберкулезную активность иммунной системы у детей и прогноз развития туберкулезной инфекции.

Дети с различными проявлениями туберкулезной инфекции, как при локальных формах туберкулеза, так и при конверсии пробы Манту 2 ТЕ, в равной степени могут иметь отрицательный результат на препарат Диаскинтест®, связанный с особенностями реагирования иммунной системы.

Апробация работы По теме проведенных исследований опубликована 21 научная работа, в том числе 4 в журналах, рекомендованных для опубликования ВАК, 2 патента. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 9 съезде фтизиатров России (1-3 июня 2011г.), на аспирантских чтениях Поволжья, (2012г.), на межрегиональной научно-практической конференции с международным участием, посвященной 130-летию доклада Р.Коха о возбудителе туберкулеза, Тверь, (2012г.), на 1 съезде ассоциации фтизиатров (Санкт-Петербург, 2012г.), на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием по актуальным вопросам профилактики, диагностики и лечения туберкулеза у детей и подростков, (Москва, 28-29 марта 2013г.), Национальном конгрессе по заболеваниям легких (Казань, 2013г.), докладывались на научно -практических конференциях в Самарской области (2011г., 2012г., 2013г.).

Публикации

По теме диссертации опубликована 21 научная работа, в том числе 4 в журналах, рекомендованных для опубликования ВАК, 2 патента.

Внедрение результатов в практику Материалы исследования и вытекающие из них рекомендации по вопросам диагностики туберкулезной инфекции применяются в ГБУЗ «СОКПТД» г. Самара, ГБУЗ «ТГПТД» г. Тольятти. Результаты исследования применяются на лекциях для студентов, врачей, на практических занятиях для студентов педиатрического факультета Самарского государственного медицинского университета.

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участили на всех этапах исследования: от постановки задач до обсуждения результатов в научных публикациях.

Объем и структура работы Диссертационная работа представлена на 129 страницах, содержит 32 таблицы, 7 рисунков, в том числе алгоргам, 1 клинический пример. Структура работы включает введение, обзор литературы, главу по характеристике пациентов в изучаемых группах и применяемых методов исследования, собственных результатов, представленных в 6 разделах, обсуждения полученных результатов, алгоритма диагностики, выводов и практических рекомендаций. В списке литературы представлены 190 источников, в том числе 121 из которых отечественных авторов.

Содержание работы Характеристика изучаемых групп пациеш-ов и методы исследования

Для решения поставленных цели и задач методом сплошной выборки обследовали 145 детей и подростков, больных туберкулезом и детей с «виражом» туберкулиновых проб, находившихся на стационарном лечении. Сформировано 2 группы: группа 1 - 100 детей с локальными формами туберкулеза, группа 2-45 детей с конверсией туберкулиновых проб. Группу кохпроля составили 85 здоровых детей, не инфицированных МБТ (табл. 1).

Таблица 1

Возрастно-иоловая характеристика изучаемых групп

группа Возраст пол Всего:

М Ж

(М ± т)года Абс. / % Абс. / % Абс. / %

1 группа 9,75±1,75 51/22,2 49/21,3 100/43,5

2 группа 6,53±2,25 21/9,2 24/ 10,4 45/19,6

Контроль 7,32±2,05 42/18,2 43/18,7 85 /36,9

Всего 114/49,6 116/50,4 230/ 100

Обследование пациентов проводилось в соответствие с протоколом исследования принятым и одобренным этическим комитетом СамГМУ и включало в себя: клиническое обследование, инструментальные, лабораторные и иммунологические методы. У всех детей были исследованы а) возрастно - половые, б) социальные, в) эпидемиологические, г) медико - биологические (неспецифические), д) медико-биологические (специфические) факторы. Выделены факторы, значимые по инфицированию микобактериями туберкулеза и заболеванию туберкулезом по сравнению с группой контроля. Для каждого ребенка была разработана оригинальная анкета сбора данных, содержащая основные результаты обследования. Всем детям проводилась проба Манту 2ТЕ согласно приказа МЗ РФ № 109 от 21 марта 2003г. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации» (на правой руке) и кожная проба с препаратом Диаскинтест® согласно приказу № 855 от 29.10.2009 «О внесении изменения в приложение №4 к приказу Минздрава России от 21 марта 2003г» (на левой руке). Оценка результатов проводилась в соответствии с инструкцией к препарату.

Иммунологические исследования выполнены в Самарском диагностическом центре. Иммунологическими методами определяли процентное содержание субпопуляций лимфоцитов (CD4+, CD16+) с помощью меченых ФИТЦ и фикоэритрином МКАТ серии LT ("Сорбент", Москва). Иммунофлюоресценция клеток оценивалась на лазерном проточном цитофлюориметре "Calibur" ("BD" USA) в режиме CellQuest Pro. Проводили клинический анализ крови для определения абсолютного количества лейкоцитов (WBC) с помощью гематологического анализатора Medonic (Швеция).

Оценку неспецифической и специфической функциональной активности клеток иммунной системы проводили путем определения уровня продукции IFN-y

после инкубации цельной гепаринизированной периферической крови с ФГА и ДСТ, соответственно, в течение 12 часов при 37С°. Уровень IFN-y определяли в супернатанте с использованием ИФТС (НПО "Вектор-Бест", Новосибирск). Статистическую обработку числового материала проводили с использованием программы Statistica 5.5 с заданной надежностью Р = 95% или уровнем значимости р = 0,5.

Результаты собственных исследований

В группе детей с локальными формами туберкулеза диагностированы: туберкулез внутригрудных лимфатических узлов (п=50), первичный туберкулезный комплекс (п=2); очаговый туберкулез (п=15), инфильтративный туберкулез легких (п=22), экссудативный плеврит туберкулезной этиологии (п=6), внелегочный туберкулез (п=5). Среди форм внелегочного туберкулеза 2 случая туберкулеза периферических лимфатических узлов и 3 случая туберкулеза костей. Локальные формы туберкулеза одинаково часто выявлялись у мальчиков и девочек. При сравнении по возрасту наиболее часто туберкулез выявлялся в возрасте 4-7 лет (26%) и в возрасте 15-18 лет (30%). При профилактических осмотрах заболевание выявлено: во время массовой туберкулинодиагностики в 51%; при флюорографическом обследовании у подростков в 25%; при обращении с жалобами из общей лечебной сети в 17%; при обследования контактных лиц из очага туберкулеза - в 7% (при дальнейшем, более тщательном, изучении эшщемиологического анамнеза, установлен контакт в 45%).

В нашей работе показано, что метод туберкулинодиагностики, по-прежнему, остается ведущим в выявлении туберкулеза у детей. По результатам кожных проб выявлено, что по пробам Манту 2ТЕ и Диаскинтест4 большинство детей имели положительные реакции 10-16 мм: 62% по пробе Манту 2ТЕ и 31% по пробе Диаскинтест® (р<0,05), умеренно выраженные реакции (папула 5-9 мм) 18% и 26% (р<0,05), гиперергические реакции 16% и 17% (р>0,05); отрицательные 1% и 16%

(р<0,05) соответственно; сомнительные 3% при пробе Манту 2 ТЕ. У детей с положительной реакцией на Диаскинтест® в 10% случаев папула до 5мм. Отрицательные пробы Манту 2 ТЕ и Диаскинтест® отмечались у ВИЧ-инфицированного ребенка с ТВГЛУ. У детей, положительно реагирующих на пробу Манту 2 ТЕ, отрицательный результат на Диаскинтест® был среди детей с ТВГЛУ в 12% (п=6) (р<0,05); с первичным туберкулезным комплексом в 50% (п=1), с инфильтративным туберкулезом легких в 4,5% (п=1); с очаговым туберкулезом легких в 26,7% (п=4) (р<0,05); с внелегочным туберкулезом в 60% (п=3) (р<0,05). Положительными обе пробы (Диаскинтест® и проба Манту 2ТЕ) были у всех 6 детей с экссудативным плевритом — 100%.

У детей, с впервые выявленным туберкулезом в фазе инфильтрации, чувствительность туберкулиновых проб более выражена: при оценке реакции Манту 2ТЕ положительные пробы средней степени выраженности были в 43%, гиперергические в 16%; по пробе Диаскинтест® 31% и 17% соответственно. При обследовании детей с отрицательным результатом на пробу Диаскинтест® установлено, что среди детей с ТВГЛУ в 5 случаях процесс был выявлен в фазе кальцинации, в одном случае в фазе начинающегося уплотнения и один ребенок с ТВГЛУ в фазе инфильтации имел сопутствующий диагноз ВИЧ - инфекция IVA стадия (реакция Манту 2 ТЕ и Диаскинтест® отрицательные). Один ребенок с первичным туберкулезным комплексом и отрицательным результатом на Диаскинтест" был выявлен в фазе начинающего уплотнения. При анализе фазы процесса у детей с вторичными формами туберкулеза с отрицательным результатом на пробу Диаскинтест® , было установлено, что в 4 случаях это были дети с очаговым туберкулезом легких (продуктивное воспаление) и в одном случае с инфильтративным туберкулезом легких.

На следующем этапе изучена группа детей с «виражом» туберкулиновой пробы (п=45). При сравнительном анализе с группой детей с локальными формами туберкулеза отмечается, что по полу также распределение примерно одинаковое, но возраст меньше на 3,2 года. Это, прежде всего, объясняется тем, что в этом возрасте наиболее вероятен риск инфицирования и это соответствует литературным данным. Большинство детей (42,2%) имели положительные пробы 10-14 мм, гиперергические пробы были в 24,4% (р< 0,05). По результатам оценки пробы Диаскинтест6 в 84,4% (п=38) отмечался положительный, в 15,6% (п=7) отрицательный и сомнительный результат. Дети данной группы находились на стационарном лечении, так как помимо впервые положительной реакции Манту 2ТЕ, имели факторы риска развития туберкулеза (контакт с больным туберкулезом (п=13), отсутствие вакцмнации ВСО (п=6), неэффективная вакцинация (п=10), перинатальный контакт по ВИЧ - инфекции (п=6)).

Формирование эффективной иммунологической защиты от микобактерии туберкулеза определяется взаимодействием лимфоцитов, участвующих в реализации клеточно-опосредованного иммунитета. Ведущая роль принадлежит СВ4+-лимфоцитам. При инфекционном процессе, индуцированном агентами, имеющими внутриклеточную реализацию, основная роль на ранних этапах противоинфекционной защиты принадлежит МС-клеткам. Нами были изучены значения СВ16+-лимфоцитов. В процессе иммунного ответа, как защитной реакции организма, основная роль принадлежит ГЗТ, но разнообразие клинических проявлений и возможностей реагирования иммунной системы при туберкулезной инфекции, позволяет предполагать и участие реакций немедленного типа. Одним из основных показателей, характеризующих аллергические реакции, является 1§Е. Антиген-специфическая индукция интерферона — 1Р>1-у Т-лимфоцитами СВ4+ является одним из ключевых факторов иммунной защиты при туберкулезной инфекции. В результате воздействия ГЕЫ-у

на инфицированные клетки, они становятся более доступными для атаки клетками иммунитета и распознавания клетками киллерами. Кроме того, интерфероны повышают активность CD-16+ клеток и этим можно объяснить положительное влияние интерферонов при инфекциях, сопровождающихся внутриклеточным персистированием возбудителя (Игнатов П.Е., 2002). У IFN-y особенно выражены иммунорегуляторные эффекты. Он является одним из основных цитокинов клеточного иммунного ответа и ингибитором гуморального. В работе нами был изучен показатель IFN-y с ФГА, как показатель общего противоинфекционного иммунитета, так и, впервые, мы провели изучение его при воздействии Диаскинтест8, причем в качестве антигена использовали препарат Диаскинтест®, используемый для постановки кожных проб.

В результате проведенного сравнительного анализа иммунологических показателей детей с ЛФТ относительно 1руппы контроля было отмечено снижение содержания С04+-лимфоцитов на 23,37% (р < 0,05); повышение содержания CD16+ - лимфоцитов на 35,0%, (р < 0,05), повышение IgE общего на 40 МЕ/мл. Выброс IFN-y клетками периферической крови в тест-системе с ФГА достигал меньших значений по сравнению с группой контроля, в среднем, на 400,0 пг/мл, среднее значение IFN-y в тест-системе с ДСТ in vitro составило 38,8 ± 10,9 пг/мл.

Таблица 2

Распределение показателей IFN^Jo в тест - системе с ДСТ по формам

туберкулеза

Формы туберкулеза Показатель IFN-y в тест - системе с ДСТ

До 18,0 пг/мл Более 18,0 пг/мл

(средний 10,8 пг/мл ± (средний 166,7 пг/мл ±

6,1) 68,8)

ТВГЛУ 6 44

фаза инфильтрации 1 44

фаза уплотнения 5 0

ПТК 1 1

Инфильтративный туберкулез 2 20

Экссудативный плеврит 0 6

Очаговый туберкулез 10 5

Внелегочный туберкулез 3 2

Всего 22 78

Изучение показателей IFN-y в тест - системе с препаратом ДСТ in vitro по формам туберкулеза показало, что для фазы инфильтрации с выраженным экссудативным компонентом характерны более высокие уровни, во всех случаях показатель был более 18 пг/мл. Для форм туберкулеза в фазе уплотнения и обратного развития характерны более низкие показатели (табл.2).

В группе детей с ЛФТ отмечались значительные отклонения в уровне функциональной активности лимфоцитов при стимуляции ФГА в тест - системе in vitro. В данной группе наблюдался сниженный в 1,74 раза выброс IFN-y (ФГА), что может свидетельствовать об угнетении общей функциональной активности клеток иммунной системы. Данный феномен подтверждается и характером корреляционных связей, анализ которых показал, что у детей с ЛФТ размер папулы при постановке пробы Манту 2ТЕ обратно коррелирует с уровнем CD4a6c, (К = - 0,59) и прямо коррелирует с IFN-y (ДСТ) (К = 0,31). Размер папулы при постановке ДСТ обратно коррелирует с CD4a6c (К = - 0,46).

В результате сравнительного анализа иммунологических показателей детей с «виражом» туберкулиновых проб относительно группы контроля было отмечено снижение содержания CD4+- лимфоцитов на 11,3% (р<0,05); повышение содержания CD16+ - лимфоцитов почти в 2 раза (р < 0,05), повышение IgE общего на 5 МЕ/мл. Выброс IFN-y клетками периферической крови в тест-системе с ФГА достигал меньших значений по сравнению с группой контроля, в среднем, на 400,0 пг/мл; при изучении продукции IFN-y в тест - системе с ДСТ у детей с «виражом» туберкулиновых проб, нами зарегистрировано повышение, в среднем по группе до 41,2 пг/мл, по сравнению с нулевым показателем группы контроля.

В соответствии с проведенными исследованиями в группе с ЛФТ, провели аналогичное разделение уровня с ДСТ в группе детей с «виражом»

туберкулиновых проб и его оценку в соотношении с результатами кожных проб. Для проведения сравнительного анализа критерии разделения уровня №N-7 с ДСТ оставили прежними (табл.3).

Таблица 3

Распределение показателей 1Р№)э в тест - системе с ДСТ в зависимости

от результата пробы Манту 2ТЕ.

Размер папулы показатель И-Т^-у в тест — системе с ДСТ

До 18пг/мл 1 Более 18 пг/мл (средний 106,7 (средний 6,1 пг/мл ±4,7) | пг/мл ±52,4)

По размеру папулы при пробе Манту 2ТЕ

5-9 мм 3 0

10-14 мм 8 11

15-16 мм 0 12

17 мм и более 0 11

всего 11 (24,4%) 34 (75,6%)

Уровень №N-7 в тест-системе с ДСТ, отражает специфический иммунный ответ на инфицирование МБТ и наличие туберкулезной инфекции в организме. Данный феномен может использоваться в диагностике туберкулезной инфекции в сложных диагностических случаях.

Количественные характеристики иммунологических показателей в сравнительном анализе показали, что содержание СЭ4+- лимфоцитов было минимальным в группе с ЛФТ, при «вираже» туберкулиновых проб несколько выше, а в контрольной группе выше, чем в группе с ЛФТ и «виражом» туберкулиновых проб; количество СЕ)16+ - лимфоцитов повышалось по сравнению с контролем (8,9%) на 5% у детей с «виражом» туберкулиновых проб и на 7% по сравнению с ЛФТ. Уровень ^Е максимально высокий при ЛФТ. При «вираже» туберкулиновых проб ^Е был ниже по сравнению с ЛФТ и практически не

отличался от здоровых детей, имея незначительно большие показатели.

14

Уровень продукции IFN-y в тест-системе с ФГА и ДСГ также имеют определенные закономерности. IFN-y в тест системе с ФГА имеет максимальное значение в группе контроля, в группах детей с туберкулезной инфекцией имеет практически одинаковое значение и по сравнению с контролем снижен, в среднем, на 400 пг/мл. Повышенный выброс IFN-y в тест-системе in vitro с ДСГ, в среднем, по группе регистрируется как у детей с «виражом» туберкулиновых проб (41Д пг/мл) так и у детей с ЛФТ (38,8 пг/мл) и не наблюдается в группе здоровых детей.

Резюмируя результаты данного этапа исследования можно заключить, что у детей, инфицированных МЕГ, как с диагнозом ЛФТ, так и с «виражом» туберкулиновых проб относительно группы здоровых детей наблюдаются аналогичные изменения как количественных иммунологических показателей: снижение уровня CD4+ - лимфоцитов, повышение уровня CD164" - лимфоцитов, повышение уровня IgE, так и показателей функциональной акшвносш клеток системы иммунитета (снижение стимулированной продукции IFN-y в тест- системе in vitro с ФГА и повышение таковой в тест- системе с ДСГ).

По результатам иммунодиагностики, по пробе с препаратом Диаскингесг® сформировано две группы: 1 группа 23 человека с отрицательным результатом кожной пробы на препарат Диаскингесг®, 2 группа - 122 человека с положительными результатами кожной пробы на препарат Диаскшггесг®. Анализ результатов обследования показал, что исследованные нами показатели содержания CD4+ - и CD16+ - лимфоцитов в группах пракшчески не отличались друг от друга. Уровни стимулированной продукции IFN-y в тест -системе с ФГА in vitro во второй группе (в среднем 424,5 пг/мл ± 39,6) ниже, чем у детей 1 группы (в среднем 584,4пг/мл ± 139,6). По результатам предыдущих этапов исследований, у детей, инфицированных МБТ, отмечается угнетение общей функциональной акшвносш иммунитета, что особенно выражено в случаях положительных кожных проб на Диаскинтест®, которые могут свидетельствовать, в частности, и о более длительном присутствии МБТ в организме.

При оценке уровней стимулированной продукции IFN-y в тест-системе с ДСТ in vitro, нами отмечена обратная ситуация. Уровни продукции IFN-y в тест -системе с ДСТ in vitro у детей 2 группы, составившие, в среднем, 144,7 ± 34,5 пг/мл, в целом, превышают таковые у детей 1 группы (детей с отрицательными Диаскинтест®), составившие в среднем 36,75 пг/мл± 27,5.

100 90 80 70 60 % 50 40 30 20 10 0

J

ДСТ+

дст-

_ >18 пг/мл

□ <18пг/мл

Рис. 1. Распределение показателей уровня продукции IFN-y в тест - системе с ДСТ in vitro у детей в зависимости от результата кожной пробы с препаратом Диаскинтест® (по вертикали -показатели в пг/мл).

Уровень выброса IFN-y в тест - системе с ДСТ in vitro в группе с положительными кожными пробами на Диаскинтест® в 92,6% случаях поднимался выше 18,0 пг/мл и, в среднем, составил 166,7 пг/мл ± 34,5. В оставшихся 7,4% случаях отмечался невысокий выброс IFN-y в тест - системе с ДСТ in vitro (до 18 пг/мл) и составлял, в среднем, 10,8 пг/мл ± 4,2. Уровень выброса IFN-y в тест -системе с ДСТ in vitro в группе 1 в 56,5% случаях поднимался выше 18,0 пг/мл и, в среднем, составил 42,7 пг/мл ± 14,5. В остальных 43,5% случаях отмечается

невысокий выброс IFN-y в тест - системе с ДСТ in vitro (до 18 пг/мл) и составил, в среднем, 11,2 пг/мл ± 4,2 (рис. 1).

Принимая во внимание, что продукция IFN-y в тест-системе с ДСТ in vitro может являться показателем противотуберкулезной активности системы иммунитета, можно заключить, что продукция IFN-y в тест-системе с ДСТ in vitro более 18,0 пг/мл может подтверждать наличие активной туберкулезной инфекции в случае отрицательного

результата кожной пробы с препаратом Диаскинтест®.

АЛГОРИТМ ДИАГНОСТИКИ Проба Манту положительная

Диаскинтест

Обследование у фтизиатра

Не выявлены клинико-

Выявлены Клинико-

клинико- рентгенологические

IFN-y (ДСТ) выше 18 пг/мл

IFN-y (ДСТ) ниже 18 пг/мл

Лечение у фтизиатра

Превентивное лечение у фтизиатра

Выводы

1. Дети и подростки, поступившие в детский противотуберкулезный стационар, были выявлены при проверочных осмотрах по реакции Манту 2ТЕ и Диаскинтест® в 51%; при флюорографическом обследовании в 25%; при обращении с жалобами из общей лечебной сети 17%; из очагов туберкулеза по контакту в 7%. Среди клинических форм преобладал первичный туберкулез -52%, из них в 50 % диагностирован туберкулез внутригрудных лимфатических узлов. Вторичные формы туберкулеза (очаговый и инфильтративный туберкулез легких) были в 37% случаев. Бактериовыделителями были 12% детей с локальными формами туберкулеза.

2. У детей при локальных формах туберкулеза, находящихся в фазе экссудативного воспаления, отмечалась более высокая чувствительность кожных проб: по реакции Манту 2ТЕ выраженные положительные пробы выявлены у 43%, гиперергические в 16%; по пробе Диаскинтест® - 31% и 17% соответственно. Корреляционная связь прямая (0,3), средней степени выраженности.

3. У детей с локальными формами туберкулеза в 16% и у детей с «виражом» туберкулиновых проб в 15,6% результат на пробу с препаратом Диаскинтест® был отрицательный; при этом они имели сниженную чувствительность при пробе Манту 2 ТЕ (средний размер папулы 10,3 ± 2,3 мм). При отрицательном результате пробы на препарат Диаскинтест5 были чаще выявлены внелегочные формы, ограниченные процессы, процессы в фазе продуктивного воспаления и обратного развития.

4. Выявлены особенности реагирования иммунной системы при туберкулезной инфекции, отличающиеся снижением СБ4+-лимфоцитов, повышением СИ 16+-лимфоцитов, повышением уровня ^Е в периферической крови, снижением уровня продукции стимулированного ШЫ-у в тест - системе с ФГА, повышением с

препаратом Диаскинтест e in vitro. Степень выраженности изменений зависела от активности туберкулезного процесса.

5. Уровень стимулированной продукции IFN-y в тест - системе in vitro выявил его снижение в 1,8 раз с ФГА у детей с локальными формами туберкулеза, и в тоже время, повышение с препаратом Диаскинтест® как у детей с «виражом» туберкулиновых проб (41,2 пг/мл), так и у детей с локальными формами туберкулеза (38,8 пг/мл), при отсутствии его в группе здоровых.

6. Отрицательные результаты на пробу Диаскинтест® при положительной реакции Манту 2ТЕ и определение феномена выброса IFN-y в тест - системе с ДСТ in vitro более 18 пг/мл свидетельствует об активности туберкулезного процесса.

Практические рекомендации

1. У детей при обследовании у фтизиатра рекомендовано оценивать комплекс

диагностических данных, как результаты кожных проб, так и факторы риска, и прежде всего, поиск возможного контакта с больным туберкулезом в окружении ребенка.

2. Для улучшения качества диагностики туберкулезной инфекции у детей можно применять алгоритм, включающий определение в сыворотке крови уровня CD4+, CD16+ - лимфоцитов, IgE и уровень продукции стимулированного IFN-y в тест - системе с препаратом Диаскинтест® in vitro.

3. В случае выявления «виража» туберкулиновой пробы Манту 2ТЕ у детей, наличия факторов риска по туберкулезу (контакт, ВИЧ-инфекция, неэффективная вакцинация и др.), но при этом, отрицательной реакции на препарат Диаскинтест®, рекомендовано дообследование с определением уровня продукции IFN-y в тест -системе с препаратом Диаскинтест® in vitro. Определение выброса IFN-y в

системе с ДСТ in vitro более 18 пг/мл, оценивать как признак активной туберкулезной инфекции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ахмерова Т.Е. Диагностика туберкулеза у детей и подростков с применением компьютерной томографии // Актуальные проблемы фтизиатрии и пульмонологии (сборник научных трудов). - Самара. - 2009.- С.24 - 26.

2. Амосова Е.А., Крюкова A.M., Козлова О.С., Ахмерова Т.Е, Бородулина Е.А. Факторы риска инфицирования детей микобактериями туберкулеза // Туберкулез и болезни легких (9 съезд фтизиатров России 1-3 июня 2011).- № 4. -2011.-С. 33.

3. Бородулин Б.Е., Галилей М.В., Гасилина Е. С., Ахмерова Т.Е. Иммунологический статус у детей, инфицированных микобактериями туберкулеза на фоне персистирующих инфекций (статья) // Туберкулез и болезни легких (9 съезд фтизиатров России 1-3 июня 2011).- № 4. 2011. -С. 65.

4. Бородулина Е.А, Амосова Е.А, Козлова О.С., Ахмерова Т.Е. Прик-тест при массовой туберкулинодиагностике (статья) // Туберкулез и болезни легких (9 съезд фтизиатров России 1-3 июня 2011).- № 4.- 2011. - С. 66-67.

5. Галилей М.В., Бородулин Б.Е., Ахмерова Т.Е., Факторы риска инфицирования микобактериями туберкулеза у детей с персистирующими инфекциями (статья) // Туберкулез и болезни легких (9 съезд фтизиатров России 13 июня 2011).- № 4. - 2011,- С. 97-98.

6. Козлова О.С., Королев В.В., Бородулина Е.А., Пятин В.Ф., Ахмерова Т.Е. Особенности психофизиологических реакций организма детей при различных способах постановки туберкулиновых проб (статья) // Туберкулез и болезни легких (9 съезд фтизиатров России 1-3 июня 2011).- № 4. - 2011,- С. 197.

7. Титова С.С., Амосова Е.А., Ахмерова Т.Е., Козлова О.С., Бородулина Е.А. Инфицирование микобактериями туберкулеза у детей с синдромом диспепсии

(статья) // Туберкулез и болезни легких (9 съезд фтизиатров России 1-3 июня 2011).- №5,- 2011.-С. 187- 188.

8. Лебедева Н.О., Бородулин Б.Е., Ахмерова Т.Е., Еремеев А.Е. Правовой и этический статус пациента больного туберкулезом и противотуберкулезная служба // Туберкулез и болезни легких (9 съезд фтизиатров России 1-3 июня 2011).-№5.. 2011.-C.22.

9. Бородулин Б.Е., Ахмерова Т.Е., Козлова О.С., Бородулина Е.А, Амосова Е.А. Диагностика инфицирования Mycobacterium tuberculosis и туберкулиновая чувствительность у детей с персистирующими инфекциями (статья) // Аллергология и иммунология в педиатрии №2 (25). - 2011,- С. 34-39.

10. Бородулина Е.А, Ахмерова Т.Е., Козлова О.С., Бородулин Б.Е., Амосова Е.А. Функциональное состояние иммунной системы у детей с персистирующими инфекциями при инфицировании Mycobacterium tuberculosis (статья) // Аллергология и иммунология в педиатрии № 4(27). - 2011. - С.28-33

11. Ахмерова Т.Е. Туберкулиновая чувствительность при активных формах туберкулеза по пробе Манту с 2ТЕ и Диаскинтест (статья) // Аспирантский вестник Поволжья №1-2. - 2012. - С. 236-238.

12. Ахмерова Т.Е., Бородулина Е.А. Проба Манту и Диаскинтест в диагностике туберкулеза у детей (статья) // Актуальные проблемы туберкулеза и оздоровительного питания (Межрегиональная научно-практическая конференция с международным участием, посвященная 130-летию доклада Р.Коха о возбудителе туберкулеза, Тверь).- 2012,- С. 20-23.

13. Ахмерова Т.Е.,Бородулина Е.А., Амосова Е.А. Проба Манту и Диаскинтест в диагностике туберкулеза у детей (статья) // Актуальные проблемы фтизиатрии и пульмонологии (Сборник научных трудов), Самара. -2012. - С.17-21.

14. Ахмерова Т.Е., Петров В.Н., Крюкова А.М. Компьютерная томография в диагностике туберкулеза (статья) // Актуальные проблемы фтизиатрии и пульмонологии (Сборник научных трудов), Самара. - 2012. - С.22-26.

15. Ахмерова Т.Е., Бородулина ЕА., Титугина АЮ. Проба Машу и Диаскшггест в диагностике туберкулеза у детей // Материалы 1-го конгресса Ассоциации «Национальная ассоциация фтизиатров». Санкт-Петербург, 2012 - С.71-73.

16. Бородулин Б.Е., Васнева ЖЛ, Ахмерова ТЖ. Субпопуияционная структура и функциональные особенности СШ+лимфошггов у детей с положительными кожными туберкулиновыми пробами (статья) // Туберкулез и болезни легких. -№6 - 2013. - С.19-20.

17. Самсонова Е.П., Бородулина Е.А, Ахмерова Т.Е. Инфицирование микобактериями туберкулеза у детей с ВИЧ-инфекцией в городе с неблагоприятной эпидемиологической ситуацией (статья) Туберкулез и болезни легких, -№6 - 2013.-.76-77.

18. Васнева Ж.П., Бородулин Б.Е., Ахмерова Т.Е. СЮ4+лимфоицш и продукция у-ингерферона у детей с локальными формами туберкулеза // Клиническая Лабораторная Диагностика.- 2013.- №9. - С.73-74.

19. Ахмерова Т.Е., Бородулина ЕА, Самсонова ЕЛ., Титова СА Инфицирование микобактериями туберкулеза детей, рожденных больными ВИЧ - инфекцией женщинами (статья) // Проблемы туберкулеза у больных ВИЧ - инфекцией (Под общей редакцией Фроловой ОН - Бюллетень№12. - М. -Тверь. - 2013. - С.51 - 52.

20. Устройство для постановки кожных проб с аллергенами. Патент на полезную модель № 110993 от 1 февраля 2011 г. Бородулина ЕА, Бородулин Б.Е., Козлова О.С., Амосова Е.А., Ахмерова Т.Е., Бородулин Б.Б., Еремеев А.Е.

21. Способ видовой идентификации микобактерий туберкулеза у лиц, инфицированных микобактериями туберкулеза (1Ш 2491551). Патент на изобретение от 27.08. 2013г. Бородулин Б.Е., Васнева Ж. П., Бородулина Е. А., Ахмерова Т.Е., Амосова Е.А.

Список сокращений и обозначений

Абс. — абсолютное количество пациентов

БЦ>,£ (BCG) - вакцинный штамм микобактерии туберкулеза

ДСТ - Диаскинтест® (Diaskintest (DST))

ЛФТ - локальные формы туберкулеза

МБТ - микобактерии туберкулеза

ПМ - проба Манту;

ППД-Л (Purified protein derivative) - очищенный белковый дериват М.А.Линниковой

СОЭ - скорость оседания эритроцитов Thl - Т-хелперы 1-го типа Th2 - Т-хелперы 2-го типа ТЕ - туберкулиновые единицы ФГА - фитогемагглютинин ФИТЦ - флюороизоцианат IgE - иммуноглобулин Е общий IFN-y- гамма - интерферон

IFN-y (ДСТ) - выброс гамма - интерферона в тест - системе с Диаскинтест® i vitro

IFN-y (ФГА) -выброс гамма-интерферона в тест-системе с ФГА in vitro

ТВГЛУ - туберкулез внутригрудных лимфатических узлов р - уровень достоверности

Отпечатано в ООО «ТАйП» Тираж 100 Заказ № 579 1 печ. лист. Принято в печать 17.09.2014 г. Отпечатано 18.09.2014 г.