Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммуно-нейтропные эффекты секреторных продуктов нейтрофилов в норме, при экспериментальной стафилококковой инфекции и механической травме

На правах рукописи %

РГБ ОД

ЗУРОЧКА - 8 т

Ирина Юрьевна ""*'"

ИММУНО-НЕЙРОТРОПНЫЕ ЭФФЕКТЫ СЕКРЕТОРНЫХ ПРОДУКТОВ НЕЙТРОФИЛОВ В НОРМЕ, ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ СТАФИЛОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ И МЕХАНИЧЕСКОЙ ТРАВМЕ

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2002

Работа выполнена в Челябинской государственной медицинской академии в Научно-исследовательском институте иммунологии.

Научный руководитель:

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук,

профессор Долгушин И.И.

Научный консультант:

заслуженный работник Высшей школы РФ, доктор медицинских наук,

профессор Шамуров Ю.С.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Аклеев A.B. доктор медицинских наук,

профессор Вельская Г.Н.

Ведущая организация: ГНЦ Институт иммунологии Минздрава РФ, Москва.

Защита состоится «_»_2002г. в «_» часов на

заседании Диссертационного Совета Д-208.117.03 Челябинской государственной медицинской академии. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан «/¿у> ¿¿U/lBc-Ic£- 2002 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета,

доктор медицинских наук, профессор A.B. Зурочка

ffbfyt-f- zPO

PZ/tt S/, ~ 2.<~nr

Общая характеристика работы.

Актуальность исследования

Изучение процессов кооперации между иммунной и другими системами организма является одной из актуальных проблем современной аллергологии и иммунологии (И Г. Акмаев, 1998). Необходимость медиаторных взаимодействий доказана не только для различных субпопуляций лимфоцитов, моноцитов/макрофагов и нейтрофилов и не только на клеточном, но и на межклеточном и межсистемном уровнях (С. А. Кетлинский и соавт., 1992; Н.В. Медуницын и соавт., 1980; A.C. Симбирцев, 1997;Н.М. Бережная, 1988;Е.А. Корнева, 1988,1993; Р.В. Петров и соавт., 1981; ЛИ. Долгушин, О.В. Бухарин, 2001 и ДР-)-

При оценке межсистемных взаимодействий наиболее изученными являются влияния центральной нервной и эндокринной систем на функции клеток иммунологического надзора(В.И. Горбунов, 1998; Г.Н. Кассиль, 1963; Е.А. Корнева, Э.К. Шхинек, 1988; ГН. Крыжановский, С.В. Магаева, 1998; Ю.А. Малашхия, 1986;З.Г. Надиришвили,Ю.А. Малашхия, 1989; С. Немечек, 1978; P. Turrini, L. Aloe, 1999). В то же время, обратная связь, а именно, влияние клеток иммунной системы и их продуктов на нейроэндокрин-ную систему, остается наименее изученной (A.C. Симбирцев, 1998; А.Н. Чередеев, JI.B. Ковальчук, 1989; Z. Boyu, J.P. Schwartz, 1998; Ai J. Dunn, 1998; C.H. Lang, J. Fan, 1998). Большинство исследований в этом направлении связано с наиболее известными про-воспалительными и регуляторными цитокинами(интерлейкин-1,2,8, ФНО и др.) (A.C. Симбирцев, 1989; А.Н. Чередеев, Л.В. Ковальчук, 1989; Н. Kita et al, 1991; К. Zeman, 1993; A. Yoshimura et al, 1997; A.J. Dunn, 1998; Z. Boyu, J.P. Schwartz, 1998; C.I. Jiang et al, 1998; Т. Tada et al, 1997).

Необходимо отметить, что эти исследования являются немногочисленными и не охватывают всего многообразия взаимосвязей между иммунной и другими системами организма в норме и при типовых патологических процессах. Так, практически не оценена способность нейтрофилов к секреции иммуно-нейротропных продуктов и значения этой дисфункции клеток при гнойной инфекционной травме. В то же время, известно, что при этих процессах происходит нарушение функционирования не только иммунной, но и центральной нервной систем (И.И. Долгушин и соавт., 1998, 1986, 1997; И.И. Долгушин,

0.В. Бухарин, 2001; A.B. Зурочка, 1991; A.B. Зурочка, A.B. Чукичев, 1991; A.B. Оки-шор, 1992; A.B. Чукичев, 1996; Л.В. Скородумова, 2001).

Все эти данные свидетельствуют о том, что определение роли нейтрофилов и их продуктов во взаимодействиях между иммунной и нервной системами является одной из актуальных задач современной иммунологии. В то же время, роль низкомолекулярных секреторных продуктов нейтрофилов (нейтрофилокинов) в регуляции центральной нервной системы, как в норме, так и в условиях воспаления остается во многом нерешенной.

Цель исследования

Изучение роли секреторных продуктов нейтрофилов в процессах регуляции поведенческих реакций животных и их взаимосвязи с иммунным ответом в норме, при развитии гнойного воспаления и травматической болезни.

Задачи исследования

1. Изучить имму но-нейротропную активность секреторных продуктов' нейтрофилов в

норме.

2. Исследовать изменения активности иммуно-нейротропных продуктов секреции ней-трофилов при развитии экспериментальной стафилококковой инфекции.

3. Определить характер нарушения иммуно-нейротропной активности нейтрофилоки-нов при механической травме у мышей.

4. Разработать и обосновать подходы к коррекции дефекта иммуно-нейротропной активности нейтрофилокинов при развитии гнойного и травматического процесса.

' Положения, выносимые на защиту

Нейтрофилы при их культивировании in vitro выделяют регуляторные низкомолекулярные пептиды, обладающие иммуно- и нейротропным действием, при этом активированные латексом нейтрофилы выделяют продукты, обладающие свойствами стимулировать поведенческие реакции животных.

Развитие локальной стафилококковой инфекции у мышей, сопровождается нарушением секреторной функции нейтрофилов, проявляющееся не только в снижении иммуностимулирующей их активности, но и в практическом отсутствии нейростимулирую-щего воздействия на организм интактных животных.

Травматический процесс у мышей характеризуется, также как и гнойное воспаление, одновременным снижением иммунной и нейростимулирующей активности нейтрофилокинов.

Введение в организм секреторных продуктов и очищенных пептидных факторов восстанавливает не только активность иммунной системы инфицированных или травмированных животных, но и одновременно восстанавливает поведенческие реакции мышей и повышает их устойчивость к дополнительным стресс-воздействиям.

Научная новизна

В работе впервые получены данные о том, что нейтрофилокины обладают выраженной иммуно-нейротропной активностью, причем продукты секреции нейтрофилов, активированных полистирольным монодисперстным латексом, вызывают стимуляцию активности одновременно иммунной и нервной систем. Выделение и очистка пептидных факторов не снижает, а, наоборот, усиливает иммуно-нейростимулирующую активность нейтрофилокинов.

Впервые выявлено, что развитие гнойной стафилококковой инфекции и травматической болезни сопровождается нарушением не только иммунного ответа, но и дефектом секреторной функции нейтрофилов, проявляющимся в угнетении ориентировочной и двигательной активности животных.

Восполнение дефицита иммуностимулирующих нейтрофилокинов при стафилококковой инфекции и механической травме восстанавливает не только иммунный ответ животных, но и приводит к восстановлению ориентировочно-двигательных поведенческих реакций животных, повышают их устойчивость к инфекции и дополнительным стресс-воздействиям в целом.

Практическая значимость работы и внедрение полученных результатов

Несмотря на то, что предлагаемая работа относится к фундаментальным исследованиям проблем регуляции между иммунной и нервной системами, разработанные подходы к исследованию иммуно-нейротропной активности секреторных продуктов нейтрофилов, позволяют оценить не только иммунологическую направленность дефекта сек-

реторной функции нейтрофилов, но и изучать их нейротропную активность. Нарушение же иммуно-нейротропных взаимодействий при развитии патологических процессов, требует поиска методов их коррекции. Разработанный способ коррекции иммуно-нейротропных нарушений, возникающих при развитии гнойного воспаления и при механической травме, может послужить основой для создания препаратов с направленной иммуно-нейростимулирующей активностью.

Результаты исследования внедрены в работу кафедр микробиологии с курсом клинической лабораторной диагностики ЧелГМА, НИИ иммунологии ЧелГМА и ЦНИЛ ЧелГМА.

Апробация работы

Основные положения работы доложены и обсуждены на Зональных и Российских конференциях «Факторы гуморального и клеточного иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях» (Челябинск, 1995,1997), Международной национальной конференции «Новые технологии в медицине» (Трехгорный, 1998), Всероссийская конференция «Нейроиммунология» (Москва, 1999).

Публикации

По теме диссертации - опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем работы

Диссертация изложена 151 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 113 отечественных и 93 иностранных работ. Диссертация иллюстрирована 27 таблицами и 13 рисунками.

Материалы и методы исследований

Экспериментальный раздел исследования выполнен на мышах линий СВА, С57В1, С}НА, гибридах Fj(CBAxC57Bl), а также беспородных белых мышах весом от 18 до 25 г. Животные были получены из питомников АН РФ "Столбовая", "Светлые горы", "Рап-полово" и г.Снежинска Челябинской области. Всего в экспериментах было использовано 6430 животных. Условия содержания мышей были стационарные. Пищевой рацион и режим кормления был стандартным. Все манипуляции, связанные с болевым воздействием, осуществляли у животных под эфирным наркозом. Из эксперимента мышей выводили путем трансцервикальной дислокации. Экспериментальную модель острой инфекции воспроизводили у мышей путем однократного введения суточной культуры золотистого стафилококка «Covan 209» под апоневроз задней лапки в дозе 4x10® микробных клеток на мышь в 0,1 мл физиологического раствора. При этом отмечалось развитие флегмоны задней лапы, распространяющейся в подкаленную, а у части мышей в паховую, области. Для получения экспериментальной генерализованной стафилококковой инфекции мы использовали модель, разработанную A.B. Чукичевым (1996). С этой целью мышам однократно, но уже внутрибрюшинно вводили взвесь суточной культуры того же штамма стафилококка в дозе 2-4х 109 бактерий на мышь. Экспериментальную модель травматической болезни воспроизводили путем закрытого перелома средней трети костей обеих голеней между браншами пинцетов (A.B. Чукичев, 1996). Нейтрофилы получали методом (М. Wong, R.D. Wilson, 1975). В интерфазе между двумя слоями градиентов располагается слой гранулоцитов, содержащий 98=100% нейтрофилов. Клетки аккуратно соби-

рали и переносили в снликонизированные центрифужные пробирки и трижды отмывали средой 199.

Супернатанты интактных и активированных нейтрофилов получали методом, разработанным научным коллективом, возглавляемым профессором И.И. Долгушиным и опубликованным в различных работах (1984-1992). Пептидсодержащие фракции секреторных продуктов нейтрофилов выделяли из суммарных супернатантов, полученных от 25 доноров методом жидкостной хроматографии (Долгушин И.И. и соавт. 1987).

С целью дальнейшей очистки выделенную А5-фракцию, обладающую, по данным И.И. Долгушина и соавт. (1989), наибольшей иммунотропной активностью, подвергали обращенно-фазовой хроматографии высокого давления для выделения очищенного пептида (A.B.Зурочка, 1998; И.И. Долгушин,О.В.Бухарин, 2001).

Перитонеальные нейтрофилы мышей получали из брюшной полости после введения в нее 4 мл 1,2% раствора казеина, разведенного в среде 199. Через 6-8 часов клетки перитонеального экссудата (ПЭ) выделяли путем трехкратного промывания брюшной полости средой 199, охлажденной до 4°С. Клеточную взвесь ПЭ трижды отмывали средой 199 при 4° С и 1500 об./мин в течение 10 минут.

Для выделения супернатантов перитонеальных нейтрофилов брали популяции клеток с чистотой не менее 96%. Использовались "неактивированные" и активированные частицами латекса нейтрофилы.

Для выделения секреторных продуктов нейтрофилов мышей использовали взвесь гранулоцитов в бессывороточной среде 199 в концентрации 5х106 клеток/мл. Полученную клеточную суспензию делили на две части. Одну часть нейтрофилов помещали на 1 час в термостат при 37°С для получения супернатантов "неактивированных" нейтрофилов (СНН). Другую часть клеток инкубировали в аналогичных условиях, но после добавления микросфер монодисперсного полистирольного латекса диаметром 1,7 мкм из расчета 50 частиц на 1 нейтрофил с целью выделения супернатантов активированных нейтрофилов (САН) (А.В.Зурочка, 1991).

■ После окончания инкубации из каждой пробы отбирали часть нейтрофилов в концентрации 106клеток/мл для определения их жизнеспособности и функциональной активности. Оставшуюся клеточную взвесь осаждали путем центрифугирования при 3000 об./мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость дополнительно центрифугировали в течение 5 минут при 8000 об./мин и фильтровали через мембранные фильтры с диаметром 0,24 мкм (Millipore, USA) с целью удаления неосевших частиц латекса. Секреторные продукты нейтрофилов интактных мышей, полученные в среднем от 10-15 животных суммировали и применяли в исследованиях как стандартные.

О состоянии нейтрофилов периферической крови и перитонеального экссудата мышей судили по уровню поглотительной способности частиц латекса, интенсивности восстановления клетками нитросинего тетразолия (HCT) в диформазанилизосомаль-ной активности определяемым методами И.С. Фрейдлин с соавт. (1976), А.Н. Маянско-го, М.Е. Виксмана(1979).

Способность животных к гуморальному иммунному ответу изучали по количеству антителообразующих клеток к эритроцитам барана (АОК-ЭБ) методом локального гемолиза в геле (N.H. Jerne, A.A. Nordin, 1975).

Тестирование нейротропной активности нейтрофилокинов человека и мышей, полученных в норме и после развития инфекции или травматического процесса, проводили на

группах интактных и опытньк животных. Мышам вводили супернатанты, пептидсодер-жащие фракции нейтрофил'окинов в различных дозах в перерасчете на мл супернатанга или мг активного вещества.'' ; 1 '

Супернатанты нейтрофилов и пептидсодержащие фракции, выделенные из САН и СНН доноров, вводили в брюшную полость через каждые 24 часа.. Схема введения и доза секреторных продуктов нейтрофилов у интактных и опытных животных была аналогичной. В контрольную группу входили интактные мыши, которым вводили физиологический раствор или среду 199 по той же схеме.

Нейротропные эффекты нейтрофилокинов оценивали путем изучения влияния последних на поведение мышей в "открытом поле" по M.L. Weisher (1976). Для оценки двигательно-ориентировочных реакций мышь помещали на дно камеры. Исследование проводили в течение 5 минут. Двигательную активность животного изучали по количеству пересеченных мышью секторов, а ориентировочно-исследовательские реакции - по числу вертикальных стоек и выглядываний мыши в окна актографа.

Дм оценки двигательной активности животных, атакже ихустойчивости к стрессу, была использована модель «принудительного плавания». Животных помещали в пластмассовые емкости объемом 20л с водой (высота водного столба была 40 см), нагретой до 24-25°С, и определяли время плавания мышей до летального исхода в минутах (A.B. Зурочка, 1991). '

Действие нейтрофилов на латентность к болевой реакции определяли в тесте «горячей пластины» по времени облизывали лапки животным, помещенным на медную поверхность, нагретую до 5б°С (Goldstein A., Sheehan Р., 1969).

Полученные результаты исследований были подвергнуты статистической обработке общепринятыми методами вариационной статистики с определением средней арифметической вариационного ряда (М), среднеквадратичного отклонения (о) и ошибки средней арифметической (ш). О достоверности различий средних величин судили по критерию Стькэдента (t) с использованием таблиц граничных значений по Вебер. В тех случаях, когда вероятность попадала в диапазон 0,05<Р<0,25, дополнительно использовался критерий непараметрической статистики В ил ко ксо на-Ман н а- Уитн и. Сопоставление связанных различий устанавливали по критерию Вилкоксона (Т). О различиях судили также по критерию Колмогорова-Смирнова! Достоверность качественных различий выявляли методом Фишера (ТМФ) (Медик В. А. и соаэт., 2000).

Статистическая обработка полученных данных проведена на персональном компьютере IBM PC Pentium 120/16 с использованием программы "Statistica for Windows 5.00" (БоровиковВ., 2001).

Результаты и обсуждение

В первую очередь мы поставили перед собой задачу изучить нейротропную активность суммарных продуктов секреции нейтрофилов доноров. Однако, прежде чем приступить к исследованию нейротропных свойств выделенных супернатантов активированных и неактивированных нейтрофилов доноров необходимо было определить их иммунотропную активность для того, чтобы в дальнейшем исследовать степень взаимосвязи действия этих продуктов на иммунную и нервную системы.

Учитывая, что суммарные продукты нейтрофилов обладают разнонаправленным им-мунотропным действием на активность клеток иммунной системы и эти данные весьма широко представлены в литературе (И.И. Долгушин и соавт., 1985-2001; A.B. Зурочка и

соавт., 199!; Л.В. Чукичев и соавт., 1996; А.В. Власов, 1989 и др.) мы сочли возможным остановиться на одном из наиболее интегральных показателей активности иммунной системы - способности нейтрофилокинов влиять на продукцию антителобразующих клеток, секретирующих Ig М против эритроцитов барана (АОК-ЭБ). Здесь и во всех последующих экспериментах именно этот критерий служил точкой отсчета иммуно-тропного действия различных нейтрофилокинов, полученных от человека или животных, в норме и при патологии. С этой целью САН и СНН доноров вводили внутрибрю-шинно трехкратно с интервалом 24 часа в дозах 5, 20,50, 200 и 1000 мкл/мышь, после чего определялся уровень антителообразующих клеток к эритроцитам барана (АОК-ЭБ).

В результате экспериментов было выявлено, что САН доноров при трехкратном введении усиливают продукцию числа АОК-ЭБ в селезенках мышей практически во всех изучаемых дозах. Максимум стимулирующей активности приходился на дозы 20-50 мкл/ мышь. Увеличение количества вводимых САН приводило к некоторому снижению их иммуностимулирующего действия. Введение же СНН, наоборот, практически во всех дозах вызывало снижение способности клеток селезенки животных синтезировать Ig М против ЭБ, при этом пик супрессорной активности СНН также находился в дозах 2050 мкл/мышь.

Таким образом, оптимальная доза супернатантов при трехкратном введении, позволяющая получить максимальный иммунотропный эффект, соответствует 20-50 мкл/ мышь.

Для исследования нейротропной активности супернатантов донорских нейтрофи-лов нами были выбраны дозы с наиболее выраженным иммунотропным эффектом.

Активность животных в «открытом поле» учитывали в течение 5 минут через 30 минут после однократного и на 10 сутки после трехкратного введения САН и СНН в дозе 20 мкл/мышь. В контроле животные получали среду 199 в той же дозировке.

Оценка нейротропной активности супернатантов показала, что только продукты секреции активированных нейтрофилов усиливали двигательную активность животных. Наблюдаемое усиление условно-ориентировочной деятельности животных отмечалось как сразу после однократного, так и после трехкратного введения САН. Этот эффект сохранялся до 10 суток. Наряду с усилением двигательной активности, у животных отмечалась значительная активация собственно ориентировочно-исследовательских рефлексов (стойки и выглядывания в окна актографа), которые также увеличивались как сразу после однократного введения САН, так и на 10 сутки после трехкратного введения. СНН - не оказывали нейротропного действия, как при однократном, так и при трехкратном введении.

Таким образом, САН, обладающие иммуностимулирующей активностью, способны вызывать активацию деятельности центральной нервной системы у животных in vivo. Тогда как, СНН, вызывающие депрессию иммунного ответа, не влияют на поведенческие реакции интакгных животных. При определении корреляционной зависимости между влиянием супернатантов нейтрофилов доноров на иммунный ответ, и на суммарные показатели психомоторной активности животных, нами была выявлена достоверная высокая прямая связь только для САН (г = 0,81 при р <0,05), что свидетельствует о комбинированном влиянии супернатантов активированных нейтрофилов на иммунную и нервную системы.

Известно, что нейтрофилы секретируют продукты пептидной природы с различной молекулярной массой, из которых только низкомолекулярные способны преодолевать гематоэнцефалический барьер. В этой связи логично было предложено, что наблюдаемые нами нейротропные эффекты супернатантов нейтрофилов могут быть обусловлены действием именно их низкомолекулярных пептидных фракций.

Учитывая, что супернатанты активированных и неактивированных нейтрофилов доноров содержат несколько иммунотропных низкомолекулярных пептидсодержащих фракций (И И. Долгушин и соавт., 1985-1998, A.B. Зурочка, 1991 и др.), представляло интерес выяснить с какой из них наиболее тесно связана нейротропная активность суммарных секреторных продуктов нейтрофилов. Поэтому, в дальнейшем нами было изучено влияние различных пептидсодержащих фракций нейтрофшюкинов на иммунный ответ и двигательно-ориентировочные реакции мышей-реципиентов.

Учитывая наличие тесной корреляционной связи между иммуно- и нейростимули-рующим влиянием супернатантов активированных нейтрофилов, можно было предположить, что наибольшей нейротропной активностью обладают низкомолекулярные пеп-тидсодержащие фракции с наиболее выраженной иммуностимулирующей активностью, а именно AI и А5-фракции из супернатантов активированных нейтрофилов. В связи с этим нами были первоначально исследованы дозозависимые эффекты этих фракций на иммунный ответ к ЭБ (АОК-ЭБ).

Для этого мышам линии СВА внутрибрюшинно животным трехкратно) с интервалом 24 часа вводили раствор пептидных фракций в концентрациях 10"2,2х10"3, 4x10"", 4х10"5,4x10"6,4x10"7 мг/мышь. Через сутки после последнего введения животных иммунизировали ЭБ в дозе 108 клеток на мышь. Контролем служили животные, которым вводили физиологический раствор в том же объеме и в те же сроки, что и фракции нейтрофшюкинов. Исследования показали, что иммуностимулирующей активностью А5-фракция обладала только в дозах 2x10 3,4x10"4,4x1О"5 мг/мышь. При этом наиболее интенсивный иммунный ответ на ЭБ был отмечен после введения фракции А5 в концентрации 4x10"5 мг/ мышь. В разведении 4х 1 Cr6 и 4x10'7 мг/мышь она не оказывала существенного влияние на иммунный ответ животных на ЭБ. В то время как, фракция А1 в высоких концентрациях (до, 4x10"4 мг/мышь), наоборот, вызывала достоверную супрессию продукции АОК клетками селезенки мышей. Максимальный же рост количества АОК-ЭБ был отмечен только после введения AI-фракции в дозе 4x10"4 мг/мышь.

Поведенческие реакции животных в «открытом поле» учитывали втечение 5 минут через 30 минут после однократного и на 10 сутки после трехкратного (интервал 24 часа) введения пептидсодержащих фракций AI, А5. Контролем служили интактные мыши, которым, в те:же сроки и в том же объеме вводили физиологический раствор.. Оценка нейротропной активности пептидных фракций показала, что только однократное введение пептидсодержащей фракции А5 в дозе 4х10"5 мг/мышь усиливало через 30 минут ориентировочно-исследовательскую реакцию мышей по числу выглядываний в окна актографа, несколько стимулируя двигательные реакции животных. В то же время AI-фракция не оказывает существенного влияния на двигательно-ориентировочную активность животных.

Несколько иной эффект наблюдался при оценке нейротропного действия пептидсодержащих фракций нейтрофшюкинов при трехкратном введении. К 10 суткам фракция А5 оказывала выраженное нейростимулирующее действие на все изучаемые показатели

психомоторной активности животных. Между тем, фракция А1 достоверно стимулировала лишь ориентировочную реакцию животных, повышая количество выглядываний почти в два раза, и незначительно повышала их двигательную активность (табл. 1).

Таблица 1. Двигательно-ориентировонные реакции у мышей линии СВА в «открытом поле» на 10 сутки после введения пептвдсодержащих фракций А1,

А5 (п=10).

Показатели

Группы животных Статистические показатели Двигательная активность (смена секторов) Ориентировочная реакция (стойки) Исследовательское поведение (выглядывания через отверстия)

Интактные мыши (контроль) М± т 48,1 ±3,8 12,8+2,0 4,1 ±0,76

Введение А1-фракции ней-трофилокинов М±т Р.. 56,5 ± 3,19 18,0 + 1,95 8,6 ± 1,23 <0,02

Ведение А5-фракции ней-трофилокинов М±т Р 64,9 + 3,81 <0,02 21,8 + 2,06 <0,02 11,5 ±3,19 <0,05

Примечание: р - достоверность различия средних исследуемых показателей в сравнении с группой интактных животных.

При определении корреляционной зависимости между влиянием А5-фракции супер-натантов активированных нейтрофилов доноров на иммунный ответ и на суммарные показатели двигательно-ориентировочных рефлексов животных нами была выявлена достоверная высокая прямая связь (г=0,84, при р<0,02), что свидетельствует о сохранении комбинированного влияния А5-фракции супернатантов активированных нейтрофилов и даже некоторого его усиления на иммунную и нервную системы.

Исходя из того, что наибольшей нейротропной активностью обладала А5-фракция, мы сочли необходимым в своих дальнейших исследованиях сконцентрировать внимание на изучении влияния на центральную нервную систему пептидного вещества с М.М. около 1500 Д, выделенного из А5-фракции супернатантов активированных нейтрофилов.

Прежде чем приступить к исследованию нейротропной активности нейтрофилоки-на, выделенного из А5-фракции активированных нейтрофилов, важно было определить дозы этого препарата, обладающие максимальной иммуностимулирующей активностью.

Препарат вводился внутрибрюшинно в дозах 10"3,10"4, 10"5, 10"6, 10"7,10"8 мг/мышь однократно и трехкратно с интервалом 24 часа. В контроле вводился физиологический раствор в том же объеме и в те же сроки, что и нейтрофилокин. ЭБ вводили на следующий день после последней инъекции препаратов. Однократное введение вещества, вы-

деленного из А5-фракции САН доноров, не вызывало достоверного усиления именного ответа на ЭБ. Трехкратная инъекция стимулировала иммунную реакцию животных на ЭБ в очень широком диапазоне доз (10"М08 мг/мышь). Максимально иммуностимулирующим действием обладала доза -10"7 мг/мышь.

Учитывая, что однократное введение вещества не вызывало значительной стимуляции иммунного ответа, из-за, по-видимому, его быстрой утилизации протео- и пепто-литическими ферментами тканей, мы сочли возможным исследовать нейротропную активность пептида только на 10 сутки после многократного введения препарата. Вещество вводили в максимально иммуностимулирующих дозах 10"6, 10'7, 10'8 мг/мышь внутрибрюшинно трехкратно с интервалом 24 часа.

Исследование показало, что пептидное вещество на 10 сутки после трехкратного введения во всех дозах оказывает выраженное нейротропное действие (табл. 2).

Таблица 2. Двнгательно-ориентировочные реакции у мышей лтпш СВА в «открытом поле» на 10 сутки после введения вещества, полученного из А5 пептндсодержащей фракции (п=10).

Группы животных Статистические показатели Показатели

Двигательная активность (смена секторов) Ориентировочная реакция (стойки) Исследовательское поведение (выглядывания через отверстия)

Интакт-ные мыши (контроль) М ± m 87,7 ± 7,39 31,0 + 2,69 14,2 ± 2,43

10'6 мг/мышь М±ш Р 145,7 ± 11,13 <0,01 41,2 ± 1,44 <0,01 25,6 ±2,16 <0,05

ю-7 мг/мышь М±ш Р 107,9 + 4,64 <0,05 36,9 + 2,78 27,7 ±3,09 <0,01

10"8 мг/мышь М±ш Р 95,7 ± 9,58 36,2 +2,47 27,0 + 3,4 <0,01

Примечание: р - достоверность различия средних исследуемых показателей в сравнении с группой интактяых животных.

Анализируя полученные результаты необходимо обратить внимание на тот факт, что максимальный пик иммуно- и нейростимулирующей активности наблюдался при введении препарата в дозе -10"7 мг/мышь.

При этом, его максимальное действие проявлялось в значительно меньшей концентрации по сравнению с фракцией, из которой он был выделен, а между иммуно- и нейро-тропным действием препарата прослеживалась высокая прямая корреляционная зависимость (г = 0,92 при р<0,05).

Аналгезирующий эффект пептида в последующем был оценен в тесте «горячей пластины» по времени облизывания лапки животного находящегося на термостатном столике

при температуре 56°С.

Исследование выявило, что трехкратное введение вещества в дозах 10"6 и 10"7 мг/ мышь не только не снижало болевой чувствительности животных на 10 сутки, но и даже несколько сокращало латентность их реакции на боль. Этот факт свидетельствует о том, что изучаемы» нейтрофилокин не является опиатоподобным веществом и не оказывает влияния на эндогенные механизмы активации опиатоподобных регуляторов.

Учитывая, что нейтрофилокины обладают достаточно выраженным действием на нервную систему, которая играет решающую роль в обеспечении механизмов адаптации к внешним воздействиям, в том числе и к стрессу, важно было установить обладает ли вещество, выделенное из А5-фракции САН доноров, антистрессовым действием.

Влияние нейтрофилокина на устойчивость к экстремальным воздействиям изучали на модели «принудительного плавания» до летального исхода. Препарат вводили внут-рибрюшинно трехкратно через 24 часа в дозе 10"6 и 10'7 мг/мышь, а продолжительность плавания животных до их гибели определяли через 10 суток после начала введения препарата.

Результаты показали, что трехкратное введение нейтрофилокина в обеих изучаемых дозах увеличивало продолжительность плавания мышей более чем в 1,5 раза, что свидетельствовало о возрастании адаптационных возможностей организма животных.

Таким образом, подводя итог проведенным исследованиям, можно констатировать ряд фактов:

1. В норме выраженным нейротропным действием обладают только иммуностимулирующие нейтрофилокины как в нативном, так и в очищенном виде. При этом по мере их очистки степень нейро- и иммуностимулирующей активности возрастет.

2. Иммуносупрессивные факторы нейтрофилов не обладают нейротропными эффектами.

3. Пептиды нейтрофилов, обладающие нейростимулирующей активностью, по-видимому, являются одним из важных звеньев механизма взаимодействия иммунной и нервной систем, которые в норме ведут к повышению устойчивости организма к стресс-воздействиям.

Известно, что различные патологические состояния, как правило, сопровождаются нарушением функции нейтрофилов. Исходя из этого, можно было предположить, что и способность гранулоцитов продуцировать иммуно- и нейростимулирующие факторы будет страдать в процессе развития патологического процесса. Это обстоятельство и определило задачу следующего этапа исследования - определить иммуно- и нейротроп-ные свойства продуктов, секретируемых нейтрофилами, при гнойном воспалении и механической травме.

Учитывая, что между иммуно- и нейротропной активностью нейтрофилов в норме существует тесная корреляционная взаимосвязь можно было предположить, что при развитии воспаления изменяется не только иммуно-, но и нейротропные свойства продуктов секреции нейтрофилов.

Для подтверждения этого предположения нам было необходимо выяснить, в первую очередь, нарушается ли иммунный ответ при гнойном воспалении или травме, насколько изменяются поведенческие реакции параметры животных и как эти изменения сочетаются с иммунной депрессией, а также изменяется ли иммуно- и нейротропные свойства продуктов секреции нейтрофилов у животных при развитии экспериментального

воспаления (инфекция, механическая травма) и насколько зависит исход патологического состояния от нарушения иммуно-нейротропных связей, обусловленных регуляторной функцией нейтрофилов.

На первом этапе нами было проведено изучение состояния иммунной системы животных в условиях гнойного воспаления. Однако, прежде чем приступить к исследованию изменения иммуно-нейротропной активности супернатантов нейтрофилов инфицированных мышей, необходимо было выяснить снижается ли у таких животных активность нейтрофилов и способность к иммунному ответу и как изменяются их поведенческие реакции в различные периоды заболевания. С этой целью животных на 3 и 7 сутки после введения стафилококков иммунизировали ЭБ и определяли количество АОК-ЭБ в их селезенках и функциональную активность перитонеальных нейтрофилов.

Исследования показали, что у животных к 3 суткам нарушались не только функции перитонеальных нейтрофилов, но и способность мышей к иммунному ответу в целом. К 7 суткам данная способность животных частично восстанавливалась, но не доходила до контрольных цифр, хотя и была достоверно выше по сравнению с третьими сутками после заражения.

Эти данные свидетельствуют о том, что помимо нарушения функций нейтрофилов, при стафилококковой инфекции уже в ранние сроки формируется депрессивное состояние иммунной системы. Учитывая системный характер изменений различный звеньев иммунитета можно было предположить, что при локальной гнойной инфекции будет меняться и состояние активности нервной системы.

С целью проверки этого нами были изучены поведенческие реакции животных в условиях развившегося гнойного воспалительного процесса. Изучение выявило, что у животных на фоне иммунодепрессивного состояния, отмечалось и некоторое угнетение поведенческих реакций. На фоне незначительного падения двигательной активности животных, было отмечено снижение ориентировочного рефлекса мышей к третьим суткам после заражения стафилококком. Эти данные свидетельствуют о формировании нарушений не только на уровне взаимодействия микроорганизм - иммунная система, но и на уровне центральной регуляции воспалительной реакции в целом.

Следующим этапом исследований важно было определить наличие параллелизма между изменениями активности иммунной и центральной нервной систем, с одной стороны, и способностью нейтрофилов секретировать иммуно-нейростимулирующие продукты с другой. Важно было также оценить влияние продуктов секреции нейтрофилов здоровых и инфицированных мышей.

Супернатанты активированных нейтрофилов мышей, полученные от интактных и инфицированных животных на 3 и 7 сутки после заражения, вводили трехкратно в дозе 50 мкл/мышь. Через сутки после последнего введения мышей иммунизировали ЭБ и оценивали продукцию АОК-ЭБ в селезенках животных-реципиентов.

Исследование показало, что супернатанты интактных животных, как СНН, так и САН стимулировали иммунный ответ мышей-реципиентов. Введение САН и СНН инфицированных мышей, полученных на 3 сутки после заражения, либо снижали (САН), либо не влияли (СНН) на способность клеток селезенок мышей-реципиентов супернатантов продуцировать АОК-ЭБ. К 7 суткам способность супернатантов стимулировать иммунный ответ на ЭБ мышей-реципиентов восстанавливалась до нормы. Таким образом, в ранние сроки воспалительного процесса стафилококковой этиологии снижается не только

• иммунный ответ и функциональная активность фагоцитов, но и способность нейтрофи-•, шов секретировать иммуностимулирующие продукты.

Эти данные свидетельствуют о том, что при развитии гнойного воспаления нейтро-филы утрачивали способность секретировать иммуностимулирующие факторы, что, возможно, ведет к изменениям и их нейротропной активности.

С целью проверки этого предположения нами было изучено влияние САН инфицированных стафилококком мышей, полученных на 3 сутки после заражения, на поведенческие реакции мышей-реципиентов. САН вводили трехкратно через 24 часа в дозе 50 мкл/мышь (контролем служили САН интактных мышей). Оценка нейротропной активности выявила, что САН интактных мышей в целом стимулировали условно-ориентировочные реакции животных, что согласуется с ранее полученными данными по действию су-пернатантов активированных нейтрофилов доноров и их пептидсодержащих фракций. Наоборот, САН мышей с локальной гнойной инфекцией не вызывала стимуляцию ориен-тировочно-двигагельных рефлексов мышей-реципиентов и даже несколько снижало ориентировочно-исследовательскую активность (особенно стойки и частично выглядывания в окна актографа).

:. i; Таким образом, развитие гнойного воспалительного очага сопровождается не только депрессией иммунной системы, но и снижением поведенческих реакций животных. Такое состояние может воспроизводиться у интактных животных путем введения супер-натантов активированных латексом нейтрофилов, полученных от мышей в разгар гнойного воспаления.

Полученные данные поставили перед нами ряд вопросов, которые необходимо было бы прояснить. Во-первых, описанная выше реакция нейтрофилов на развитие локаль-. ной стафилококковой инфекции характерна только для микробного воспаления или же это общебиологическая закономерность, характеризующая и другие типы воспалительной реакции, связанной, в частности, с травматическим повреждением. Во-вторых, насколько восполнение дефекта иммуностимулирующих нейтрофилокинов будет способствовать восстановлению функции иммунной системы и психомоторной активности животных. Исследованию этих вопросов и были посвящены следующие серии экспериментов. .. |

Прежде чем приступить к изучению влияния супернатантов животных, полученных в условиях асептического воспаления, необходимо было выбрать экспериментальную модель такого воспаления. Выбор механической травмы, как модели асептического воспаления был обусловлен несколькими причинами. Одна из них - воспроизводимость модели, другая - создание очага длительного воспаления (по аналогии с локальной гнойной инфекцией) без повреждения целостности наружных тканей, и, в-третьих, по данным A.B. Чукичева (1996), механическая травма конечностей сопровождается развитием депрессии иммунного ответа животных, с выраженным нарушением функций нейтрофилов, в том числе и их секреторной функции, что, собственно, и служило предметом наших исследований. Все это обусловило выбор метода локального травматического воспаления.

Однако, прежде чем приступить к решению данной задачи, необходимо было выяснить, какое действие оказывает множественная механическая травма на функции перито-неальных нейтрофилов, которые впоследствии служили нам как источник получения нейтрофилокинов.

Как показали исследования, у животных отмечались выраженные нарушения фагоцитарной активности перитонеапьных нейтрофилов в различные сроки после травмы. Наиболее выраженное угнетение фагоцитарной активности нейтрофилов перитонеального экссудата (ПЭ) отмечапосьу животных с множественной травмой наЗ и 7 сутки посгграв-матического периода. К 14 суткам отмечалась четкая тенденция к нормализации показателей фагоцитоза перитонеальных нейтрофилов.

В отличие от фагоцитарной реакции перитонеальных нейтрофилов, их кислородо-зависимый метаболизм на 3 сутки после повреждения у животных с множественной травмой достоверно повышался в сравнении с группой интактных мышей. К 7 и 14 суткам после травмы способность перитонеальных нейтрофилов восстанавливать нит-росиний тетразолий в диформазан у мышей с множественной травмой оставалась на высоком уровне, но в то же время имела тенденцию к снижению.

Все это поставило перед нами вопрос о том, как изменялась способность этих животных к иммунному ответу на ЭБ в различные сроки развития травматического процесса.

Исследования показали, что уже на 3 сутки после травмы у животных резко снижалась способность продуцировать АОК-ЭБ, к 7 суткам отмечен некоторый рост этой способности, а к 14-21 суткам полное восстановление ее до нормы.

В то же время оставался неясным вопрос об изменении характера ориентировочно-двигательных реакций животного после травмы. Исследования выявили, что двигатель-но-ориентировочная деятельность животных нарушалась сразу после травмы. При этом если в первые минуты после перелома костей конечностей визуально отмечалось резкое возбуждение животного, то в дальнейшем оно быстро сменялось торможением поведенческих реакций. Последнее имело стойкий характер и достигало максимального значения к 7 суткам постгравматического периода. По мере превалирования восстановительных процессов у травмированных животных наблюдалась нормализация двигательной активности (к 14 суткам) и ориентировочно-исследовательского поведения (к 21 суткам после травмы).

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что у животных с травмой, так же как и у мышей с инфекцией развивается аналогичное состояние, характеризующееся нарушением ориентировочно-двигательных рефлексов. Логично было предположить, что как в случае с инфекционным повреждением, так и при механической травме супер-натанты нейтрофилов мышей будут также обладать несколько иной иммуно-нейротроп-ной активностью по сравнению с интактными мышами. Поэтому на следующем этапе наших исследований мы провели изучение влияния супернатантов мышей на способность интактных животных-реципентов секреторных продуктов отвечать иммунной реакцией на введение ЭБ.

Проведенное тестирование иммунотропных свойств секреторных продуктов перитонеальных нейтрофилов мышей с механической травмой, показали, что они также как и супернатанты животных с инфекцией снижают способность к иммунному ответу после введения здоровым животным на 3 и 7 сутки после травмы. Учитывая, что продукты секреции нейтрофилов животных с инфекцией обладали либо депрессивным действием, либо не изменяли поведенческие реакции животных-реципиентов, в отличие от нейт-рофилокинов доноров и здоровых мышей, представляло интерес выяснить каким образом и насколько изменяется влияние супернатантов нейтрофилов ПЭ травмированных жнвотных на поведенческие реакции мышёй-реципнентов в зависимости от времени про-

шедшего после травматического повреждения.

Секреторные продукты активированных нейтрофшгов, выделенные на 3 и 7 сутки после травмы, практически не влияли на двигательную активность мышей-реципиентов. Только САН, полученные на 14 сутки посттравматического периода достоверно увеличивали количество пересечений секторов опытными животными. На этом фоне данные продукты секреции не оказывали стимулирующего действия на ориентировочно-исследовательские реакции мышей-реципиентов, мало того на 7 сутки после травмы они достоверно понижали число выглядываний животных по сравнению с нормой.

Таким образом, формирование гнойного воспаления и травматического процесса сопровождается нарушением функциональной активности нейтрофилов, способности к полноценному иммунному ответу и все это протекает на фоне развития депрессии активности поведенческих реакций животных. Наряду с этим у мышей формировался дефект продукции иммуностимулирующих секреторных факторов нейтрофилам, в результате чего последние утрачивали способность стимулировать иммунные реакции ин-тактного организма. Одновременно у этих продуктов секреции значительно снижалась способность активировать двигательно-ориентировочные рефлексы животных в «открытом поле». Возможно, отсутствие нормальных нейроиммунных и иммуно-нейро-тропных связей способствует формированию более тяжелого патологического процесса, чем состояния, при которых таких нарушений не выявляется.

Полученные данные ставят перед нами вопрос о коррекции выявленных нарушений. подход к компенсации нарушенных функций клеток иммунной системы, в данной ситуации, на наш взгляд, должен сочетаться с подбором средств одновременно влияющих и на состояние нервной системы организма.

Иммуностимулирующие нейтрофилокины, как мы показали ранее, обладают не только иммунотропным, но и нейротропным действием. Именно исследованию этих вопросов и были посвящены следующие наши исследования.

В предыдущих экспериментах нами было выявлено, что развитие гнойного воспаления и травматического процесса сопровождается нарушением функционирования иммунной и нервных систем, причем это состояние во многом связано с дефектом секреции иммуно-нейростимулирующих нейтрофилокинов, который развивался при данной патологии. Логично было бы предположить, что компенсация дефекта иммуностимулирующих нейтрофилокинов, приведет и к нормализации активности иммунной и нервной систем организма животных с инфекцией и механической травмой. Такими свойствами могут обладать несколько разновидностей нейтрофилокинов, различающихся по степени очистки от различных примесей а именно, САН и СНН здоровых мышей, САН и СНН доноров, пептидсодержащие фракции А5 и Н1, нейтрофилокин из А5-фракции секреторных продуктов активированных нейтрофилов. Прежде чем приступить к коррекции нейротропных нарушений необходимо было выявить влияние этих веществ на иммунную реактивность животных, измененную вследствие травмы и инфекционного процесса.

На первом этапе исследований мы изучили иммунокорригирующие влияние супер-натантов нейтрофилов здоровых животных на способность к иммунному ответу мышей с локальной гнойной стафилококковой инфекцией и механическойтравмой. САН здоровых мышей вводили инфицированным животным в дозе 50 мкл/мышь трехкратно с интервалом 24 часа начиная с первых суток после заражения. Контрольным животным вводили

по 50 мкл физиологического раствора в те же самые сроки. После последнего введения препарата животных иммунизировали ЭБ, и определяли способность к иммунному ответу на 5 сутки после иммунизации. Исследования показали, что введение САН интактных мышей животным зараженным стафилококком стимулирует их способность к иммунному ответу (АОК-ЭБ), хотя и не восстанавливает иммунные реакции до нормы.

Как было показано в предыдущих исследованиях, в ранний период после механической травмы развивается вторичный иммунодефицит. Исходя из этого, перед нами стояла задача - выяснить будет ли восстанавливаться иммунологическая реактивность мышей с множественными переломами костей скелета после введения им иммуностимулирующих секреторных продуктов нейтрофилов.

Супернатанты вводили в дозе 50 мкл/мышь внутрибрюшинно мышам с множественными переломами трижды с интервалом 24 часа после нанесения повреждения. Первую инъекцию производили через час после травмы. Контролем служили интактные (контроль 1) и травмированные животные, которым аналогичным образом вводили 0,05 мл физиологического раствора (контроль 2). Иммунологическую реактивность оценивали по уровню иммунного ответа на 3,7,14 и 21 сутки. Мышей внутрибрюшинно иммунизировали 2х 108 ЭБ/мышь, а через пять дней определяли способность к формированию АОК-ЭБ в селезенке.

В результате проведенных исследований было установлено, что уже на 3 сутки после травмы введение САН приводило к повышению числа АОК-ЭБ в селезенке мышей с множественными переломами костей скелета, которое не достигало уровня нормы, но было достоверно выше, чем у животных с аналогичной травмой, которым вводили среду 199. У последних в этот период наблюдалось почти двукратное снижение количества селезеночных АОК-ЭБ. На 7 сутки после травмы, в то время когда введение САН прекращалось, уровень АОК-ЭБ в селезенках травмированных мышей достигал максимального значения и достоверно превышал их содержание как у интактных, так и контрольных травмированных животных. В последующие сроки (14 и 21 сутки) иммунная реакция у всех групп опытных мышей восстанавливалась, но даже в эти периоды число АОК-ЭБ в селезенках животных, получавших САН доноров, был несколько выше, чем во этором контроле.

Следующим этапом исследования мы изучили влияние САН и СНН доноров на иммунный ответ инфицированных мышей. Супернатанты доноров вводили по 50 мкл/ мышь трехкратно через 24 часа. Иммунизация ЭБ и сроки забора клеток для исследований были теми же, что и при использовании САН мышей: Контролями служили интак-тные и инфицированные мыши, которым вводили среду 199 в тех же дозах и в те же сроки.

Результаты исследований показали, что супернатанты интактных и активированных латексом нейтрофилов доноров обладали разнонаправленным действием на иммунную систему инфицированных мышей. Так, изучение действия САН и СНН доноров выявило, что заражение стафилококком приводило к снижению иммунного ответа на ЭБ, введение СНН еще более достоверно снижало количество АОК-ЭБ в селезенках инфицированных мышей. Наоборот, введение САН стимулировало способность мышей с гнойным воспалением к иммунному ответу и восстанавливало его до нормы.

Таким образом, как аллогенные, так и ксеногенные супернатанты активированных нейтрофилов стимулировали иммунный ответ инфицированных Мышей, а супернатанты неактивированных нейтрофилов донора, наоборот, угнетали способность клеток селезен-

ки больных животных синтезировать % М против ЭБ. Поэтому, мы предположили, что А5 и Н1 фракции нейтрофилокинов будут обладать сходным разнонаправленным действием. Препараты вводили инфицированным мышам сразу после заражения трехкратно с интервалом через каждые 24' часа в дозе 4x10"* мг/мышь, В контроле вводили физиологический раствор в том же объеме и в те же сроки, что и в опыте.

Как показали исследования, А5-фракция нейтрофйлбкйнов, так же как САН доноров восстанавливали способность мышей к иммунному ответу, а фракция Н1 так же как и СЫН, наоборот, снижали способность клеток селезенки формировать иммунную реакцию инфицированных животных на ЭБ. Все эти данные подтвердили предположение о том, что компенсация только иммуностимулирующими нейтрофилокинами восстанавливает иммунореактивность животных с инфекцией и значительно стимулирует активность мышей с механической травмой.

Логично было бы предположить, что применение нейтрофилокина из А5-фракции супернатантов активированных нейтрофилов будет обладать действием, аналогичным САН и А5 пептидсодержащей фракции.

Учитывая высокую эффективность иммунотропного действия нейтрофилокина, мы исследовали его влияние на иммунный ответ при механической травме. Интактным и травмированным животным нейтрофилокин вводили трехкратно через 24 часа в дозе 10"7 мг/мышь и определяли иммунный ответ в динамике травматического процесса иммунизируя животных ЭБ на 3, 7,14 и 21 сутки после травмы.

Как показали исследования, уровень иммунного ответа у обеих групп мышей с травмой в течение посттравматического периода восстанавливался. Однако, у травмированных животных-реципиентов нейтрофилокина процесс нормализации образования АОК-ЭБ происходил быстрее и отмечался уже на 7 сутки после перелома костей. К 14 суткам уровень этих клеток достигал достоверного различия в сравнении не только с контрольной группой травмированных мышей, но и с нормой. В дальнейшем количество АОК-ЭБ у этих групп животных в одинаковой степени нормализовался. Аналогичное повышение содержания этих клеток наблюдалось и у здоровых мышей-реципиентов А5-вещества. У них максимальный иммунный ответ отмечался на 14 сутки после введения вещества.

Как видно из полученных результатов, введение нейтрофилокинов, полученных из активированных латексом нейтрофилов восстанавливает иммунный ответ инфицированных животных и значительно стимулирует иммунореактивность мышей с механической травмой. Более позднее восстановление иммунного ответа мышей с травмой объясняется, по-видимому, тяжестью процесса и более длительным сроком репарации поврежденной ткани. Но и втом, и в другом случае восполнение дефекта секреторной функции нейтрофилов ведет к значительно более быстрому восстановлению иммунного ответа животных. Исходя из этого, можно было предположить, что введение нейтрофилокинов благоприятно скажется и на состоянии центральной нервной системы животных с инфекцией и травмой.

Как мы показали в предыдущих исследованиях, только иммуностимулирующие ней-трофилокины обладали нейротропным действием. Поэтому, для коррекции нейротроп-ных нарушений, которые развиваются у животных при инфекции и травме мы применяли только иммуностимулирующие нейтрофилокины.

Исходя из полученных результатов, мы изучили нейротропное влияние нейтрофило-

кина на поведенческие реакции животных в «открытом поле» в условиях локальной гнойной стафилококковой инфекции. Исследования показали, что трехкратное введение нейтрофилокина в дозе 10'7 мг/мышь с интервалом в 24 часа приводило не только к восстановлению условно-ориентировочных реакций инфицированных животных, но и стимулировало их двигательную активность по сравнению с нормой.

Таким образом, восполнение дефекта иммуностимулирующих пептидных факторов нейтрофилов, путем введения нейтрофилокина при гнойном воспалении полностью восстанавливает нервную систему животных, отвечающую за поведенческие реакции. Исходя из этого, было необходимо определить, как будут вести себя животные в «открытом поле» в условиях механической травмы.

Двигателыго-ориентировочные реакции у подопытных животных изучали, как и в предыдущих исследованиях, на 3, 7, 14 и 21 сутки после травмы и введения нейтрофилокина, который вводился трехкратно в дозе 10"7 мг/мышь.

В результате проведенного эксперимента установлено, что если в первые дни после перелома костей у животных, которым вводили физиологический раствор, наблюдалось резкое угнетение условно-ориентировочной деятельности в «открытом поле», то у реципиентов А5-вещества на 3 сутки количество стоек оставалось в пределах номы, а число выглядываний было почти в 2 раза выше. В дальнейшем же уровень ориентировочной активности животных с множественной травмой постепенно повышался. Однако, если у мышей-реципиентов нейтрофилокина все показатели ориентировочно-исследовательской деятельности нормализовались к 21 суткам после травмы, то у травмированных животных контрольной группы число выглядываний в окна актографа оставалось достоверно сниженным по сравнению с нормой. В меньшей степени изменялась под влиянием нейтрофилокина двигательная активность мышей с переломами костей. Животные данной группы пересекали сектора актографа значительно реже, чем в норме. При этом достоверное снижение их двигательной активности наблюдалось в течение двух недель после травмы. Однако, надо отметить, что на 7 сутки количество пересечений секторов, совершаемых мышами-реципиентами нейтрофилокина, было достоверно выше, чем у травмированных животных, которым вводили физиологический раствор. К 21 суткам двигательная активность обеих групп мышей с множественной травмой восстанавливалась и по уровню мало чем отличалась.

Таким образом, и при механической травме, несмотря на наличие переломов нижних конечностей, уже в ранние сроки (3-7 сутки) введение нейтрофилокина стимулирует деятельность центральной нервной системы животных, способствуя ее более быстрому восстановлению до нормы (21 сутки).

Итак, нейтрофилокины, полученные из супернатантов активированных латексом нейтрофилов, обладают иммуно-нейростимулирующим действием в условиях не только нормы, но и при развитии воспалительного гнойного процесса и травмы. Такую активность эти цитокины проявляют в большей степени при развитии гнойного воспаления, однако, и в условиях травматического процесса они сохраняют свои иммуно- и нейро-стимулирующие свойства.

Возникает вопрос, а в чем биологический смысл такого механизма обратной связи существующего между клетками, первыми реагирующими на внешнее воздействие (ней-трофилы) и центральной нервной системы? По-видимому, ответ находится на поверхности - повышение резистентности к внешним воздействиям. Чтобы проверить данное пред-

положение мы провели следующей эксперимент на беспородных мышах. Животным вводили САН, А5-фракцию нейтрофилокинов и нейтрофилокин из этой фракции, соответственно в дозах 50 мкл/мышь, 2x10"4 мг/мышь, 10;7 мг/мышь трехкратно с интервалом 24 часа. После введения нейтрофилокинов мышам внугрибрюшинно вводили стафилококк в дозе 2x109 бактерий/мышь, для создания генерализованной формы инфекции, с сублетальным течением.

Как показали исследования, все виды нейтрофилокинов значительно снижали острую летальность мышей с генерализованной инфекцией. Необходимо, отметить, что чем большей степени очистки был препарат, тем более эффективной была защита от инфекции. По-видимому, столь выраженный протективный эффект был связан с повышением уровня иммуно-нейроустойчивости к внешним воздействиям.

При исследовании летальности при механической травме в аналогичном эксперименте были получены практически идентичные данные. Так, введение нейтрофилокина из А5-фракции активированных нейтрофилов, значительно снижает летальность животных с механическойтравмой. Эти данные тоже подтверждают наше предположение о том, что нейтрофилокины в целом повышают устойчивость животных к внешним воздействиям.

Учитывая полученные данные, мы предположили, что нейтрофилокины будут оказывать свое положительное действие и в условиях дополнительного воздействия на инфицированный организм животных. С этой целью мышей с инфекцией подвергали принудительному плаванию.

Экспериментальные исследования показали, что нейтрофилокин при трехкратном введении в дозе 10"7 мг/мышь вызывал значительное увеличение времени плавания животных до летального исхода не только интактных животных, но и мышей с гнойной инфекцией, что, по-видимому, напрямую связано с его нейротропным действием, повышая устойчивость животных к дополнительному стресс-врздействию.

Исходя из полученных данных, важно было определить как дополнительное воздействие скажется на выносливости мышей при «принудительном плавании» в условиях травматического процесса.

Животных с механической множественной травмой нижних конечностей после введения нейтрофилокина по той же схеме, что и в предыдущих опытах подвергали плавательному стрессу на 3, 7 и 14 сутки после повреждения.

Оценка нейротропной активности показала, что, начиная с 7 суток после травмы Iфодолжи гелыюсть плавания мышей вплоть до летального исхода в группе травмированных мышей, получавших нейтрофилокин, была практически в два раза выше, чем в группе, ще животные получали физиологический раствор.

Получив эти данные, мы решили еще более усложнить воздействие на организм животных. С этой целью мы провели следующий эксперимент. Животным с механической травмой голени ввели стафилококк в дозе 2x109 бактерий/мышь под апоневроз задней лапы, тем самым создав комбинированную модель травмы, осложненной инфекцией. Животные были разбиты на две группы. Первой вводили физиологический раствор, а второй - нейтрофилокин в дозе 10"7 мг/мышь трехкратно с интервалом 24 часа, после чего животных подвергали принудительному плаванию до летального исхода.

Исследования показали, что такое комбинированное воздействие приводит к значительно более быстрой гибели животных при плавательном стрессе.

Введение же нейтрофилокина, даже в таких условиях, практически в полтора раза увеличивало длительность плавания травмированных животных. : , - .

Таким образом, наличие у продуктов секреции активированных нейтрофидов имму-но-нейротропной активности является одним из важнейших механизмов адаптации организма к экстремальным воздействиям. При этом, такой механизм повышения общей резистентности срабатывает не только в условиях воздействий микробного, травматического генеза, но при дополнительных стресс-воздействиях, в том числе и несовместимых с жизнью.

Итак, нейтрофилокины обладают уникальными свойствами и способны активировать иммунную и нервную систему в норме, восстанавливая нарушенные функции организма при локальных и генерализованных формах инфекции, при травме. Иммуно-нейротроп-ная активность нейтрофилокинов является одним из важнейших механизмов повышения резистентности организма к тяжелым стресс- и дистресс- воздействиям, и ведет к снижению летальности животных при развитии различных вариантов воспалительных и травматических процессов, в том числе и несовместимых с жизнью. И, наконец, пептидные факторы, полученные из активированных продуктов нейтрофилов, могут служить основой для получения лекарственных препаратов, обладающих комбинированным иммуно-нейростимулнрующим действием на организм, которые можно применять при лечении различных воспалительных заболеваний, стресс-воздействиях и травмах. •

Выводы

1. Секреторные продукты нейтрофилов обладают не только иммунотропной, но и нейротропной активностью.

2. Нейтрофилокины стимулируют поведенческие реакции животных, причем очистка суммарных секреторных продуктов до пептидов усиливает не только их иммуностимулирующее действие, но и нейротропное.

3. Развитие гнойной стафилококковой инфекции сопровождается снижением иммуно- и нейростимулирующей активности супернатантов нейтрофилов зараженных животных.

4. Механическая травма приводит к нарушению секреторной функции нейтрофилов травмированных мышей, проявляющиеся в значительном снижении как иммуностимулирующей, так и нейротропной активности нейтрофилокинов.

5. Введение животным со стафилококковой инфекцией или с механической травмой как суммарных продуктов секреции активированных латексом нейтрофилов, так и пептидов, полученных из этих продуктов, восстанавливает иммунный ответ и двигательно-ориентировочные реакции инфицированных и травмированных животных.

6. Иммуномодулирующие и нейротропные свойства секреторных продуктов нейтрофилов в норме и патологии полностью взаимосвязаны и проявляются синергично и взаимонаправлено, при снижении иммуностимулирующей активности нейростимули-рующая также снижается, а при иммуностимуляции, нейротропная активность восстанавливается, что свидетельствует о тесной взаимосвязи, существующей между иммунной и нервной системами в рамках кооперации «нейтрофил - центральная нервная система».

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Психотропные эффекты нейтрофилокинов в норме и патологии// Факторы гуморального и клеточного иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях: Тез. докл. - Челябинск, 1995 - С. 48 (соавт: А.В.Чукичев, Д.В. Попов).

2. Низкомолекулярные пептиды нейтрофилов //Актуальные вопросы практической меди-

цины: Сб. тр.- Челябинск, 1995. - С. 54 (соавг.: A.B. Зурочка, A.B. Чукичев, С.И. Марачев, В. Д. Попов).

3. Определение секреторной активности нейтрофилов как метод диагностики иммунодефицита при различных патологических состояниях // Тр Л Международной конференции. -Витебск, 1995. - С. 32-33 (соавт.: И.И. Долгушин, A.B. Зурочка, O.JI. Ко. лесников, С.И. Марачев, A.B. Чукичев, A.B. Власов, Л.В. Скородумова).

4. Получение и изучение биологических свойств пептидных продуктов нейтрофилов// Новые технологии в медицине. - Трехгорный, 1996. - С. 82-83 (соавт.: И.И.Долгушин, A.B. Зурочка, С.И. Марачев, A.B. Чукичев, Л.В. Скородумова, Б.Г. Яровинс-

,, кий)

5. Влияние A-5-пептидосодержащей фракции нейтрофилов на двигательно-ориентиро-

вочные реакции животных с экспериментальной травмой и инфекцией // Факторы гуморадьного и клеточного иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях: Тез. докл. -Челябинск, 1997.-С. 181-182.(соавт.: А.В.Чукичев, А.В.Зурочка, Л.С. Борисова, М.И. Карпова).

6. Новые технологии для диагностики и лечения воспалительных заболеваний, основанные на изучении функции фагоцитов 11 Новые технологии в медицине. - Трехгорный, 1998.-С.62-64 (соавт.:И.И.Долгушин,А.В.Чукичев,А.В.Зурочка,С.И.Мара-чев, Ю.В.Горсткова, В. А.Яковенко, Л.В.Скородумова, М.ИКарпова).

7. Нейротропные эффекты нейтрофилокинов в норме и при воспалении // Всероссийская конференция «Нейроиммунология». -М., 1999. - С. 30-30 (соавт.: И.И.Долгушин, А.В.Чукичев, А.В.Зурочка, С.И.Марачев, М.И.Карпова, Л.В.Скородумова).

ЗУРОЧКА Ирина Юрьевна

ИММУНО-НЕЙРОТРОПНЫЕ ЭФФЕКТЫ СЕКРЕТОРНЫХ ПРОДУКТОВ НЕЙТРОФИЛОВ В НОРМЕ, ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ СТАФИЛОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ И МЕХАНИЧЕСКОЙ

ТРАВМЕ

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 2002

Отпечатано в издательстве "Челябинская государственная медицинская академия". Лицензия № 01906. Подписано в печать 09.04.02г. Объем 1 п.л. Формат 64x84. Гарнитура "Times New Roman суг". Бумага для офисной техники, 80 мг/ м2. Тираж 100 экз.