Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Иммунный статус больных с некоторыми формами злокачественных лимфом

На правах рукописи

ДОЛГОПОЛОВА Евгения Владимировна

ИММУННЫЙ СТАТУС БОЛЬНЫХ С НЕКОТОРЫМИ ФОРМАМИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ЛИМФОМ

14.00.36 - аллергология и иммунология 14.00.29 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2004

Работа выполнена в Военно-медицинской академии им. СМ. Кирова

Научные руководители:

доктор медицинских наук профессор

доктор медицинских наук профессор

Цыган Василий Николаевич Богданов Александр Николаевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор доктор медицинских наук профессор

Нечеткий Александр Викторович Васильев Андрей Глебович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»

Защита состоится «_» декабря 2004 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 215.002.08 в Военно-медицинской академии (194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Военно-медицинской академии СМ. Кирова

Автореферат разослан «_» ноября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук профессор В.Л. Пастушенков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Злокачественные лимфомы (ЗЛ) являются широкораспространенной гетерогенной группой опухолей, происходящих из лимфоидной ткани (А.А. Новик, 2000). На их долю приходится около 2,7% от всех других регистрируемых неоплазий в России (В.И. Чиссов с соавт., 2002). В странах Европы наиболее распространенными являются такие виды опухолей, как фолликулярная, диффузная крупноклеточная В-клеточная, хронический В-клеточный лимфоцитарный лейкоз, лимфома Ходжкина. Частота их встречаемости превышает 70% порог в общем количестве ЗЛ (А.А. Новик, 2000), а уровень смертности один из самых высоких среди онкологических больных молодого возраста (R. Hoffman et al., 2000). Поэтому диагностика и лечение лимфом представляет важную медицинскую и социальную проблему.

Изучению патогенеза ЗЛ и характера иммунного ответа на формирование малигнизированных клеток посвящены многочисленные исследования (Е. Monsterrat, 1997; A. Van den Berg, 2000). Однако их результаты весьма фрагментарны и противоречивы. Доказано (А.А. Ярилин, 1999; V. De Vita, 1982; М.М. Bartik, 1998), что защитные иммунные механизмы включаются в организме задолго до появления клинически определяемых признаков опухоли. На стадии инициализации иммунная система адекватно реагирует на появление трансформированных лимфоцитов, формируя полномасштабный иммунный ответ с включением всех звеньев. Однако в дальнейшем он, как правило, оказывается малоэффективным. На стадиях промоции и прогрессии происходит трансформация иммунитгта, характеризующаяся полиморфизмом откликов со стороны его различных звеньев, а дисбаланс между ними сохраняется даже после достижения ремиссии (V. De Vita, 1982; P.M. Mauchetal., 1999).

Сложный характер реакций, разнородность исследований и методических подходов являются причинами отсутствия до настоящего времени достоверного банка данных о патогенезе заболевания, его динамике, общих закономерностях и особенностей каждой формы ЗЛ, что является необходимым условием для разработки адекватных методов терапии опухолей, в том числе и вышеуказанных. Более того, как отмечают некоторые исследователи (Е. Monsterrat et al., 1997; S.S. Merkar et al., 2000), до сих пор не обоснованы наиболее информативные количественные показатели, характеризующие изменения иммунитета у онкологических пациентов, что не позволяет однозначно определить вклад нарушений иммунной системы в патогенез заболевания, осуществлять правильную диагностику и лечение.

В связи с указанными обстоятельствами проблема комплексной оценки иммунного статуса с помощью у

I 'библиотека I

! íwj

больных с наиболее часто встречающимися в странах Европы видами ЗЛ является чрезвычайно актуальной.

Цель исследования

Установить наиболее типичные нарушения иммунного статуса у больных некоторыми формами злокачественных лимфом и определить их диагностическую значимость.

Задачи исследования

1. Выявить особенности иммунного статуса первичных больных фолликулярной лимфомой 1-2, 3 типов, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомой, хроническим В-клеточным лимфоцитарным лейкозом и лимфомой Ходжкина.

2. Провести сравнительные исследования субпопуляционного состава лимфоцитов крови первичных больных с фолликулярной лимфомой разных типов, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомой, хроническим В-клеточным лимфоцитарным лейкозом и лимфомой Ходжкина.

3. Выявить характерные изменения иммунного статуса больных лимфомой Ходжкина при наличии у них В-симптомов.

4. Изучить динамику изменений иммунного статуса больных лимфомой Ходжкина в разные сроки лечения и в период ремиссии.

Научная новизна

Впервые с использованием проточной цитометрии и иммуноферментного анализа у больных фолликулярной лимфомой разных типов, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомой, хроническим В-клеточным лимфоцитарным лейкозом, лимфомой Ходжкина проведено комплексное иммунологическое исследование, в ходе которого выявлены особенности иммунного статуса больных отдельными формами злокачественных лимфом.

Впервые изучено содержание Т-киллеров (CD3+CD16+56+), Т- и В-лимфоцитов, экспрессирующих молекулы активации CD25 и HLA-DR, компонентов системы комплемента, средне- и низкомолекулярных циркулирующих иммунных комплексов в крови больных лимфомой Ходжкина, что позволяет уточнить иммунопатогенез заболевания.

На основании сравнительного анализа комплекса иммунологических показателей обоснованы дополнительные критерии для дифференциальной диагностики фолликулярных лимфом 1-2 и 3 типов.

В результате мониторинга иммунного статуса больных лимфомой Ходжкина (до, во время лечения и в период ремиссии) впервые уточнены скорость и полнота восстановления показателей иммунного статуса пациентов лосле комбинированной полихимиотерапии.

Практическая значимость работы

На основе изученных показателей иммунного статуса разработаны и предложены для применения в клинической практике дополнительные иммунологические критерии по определению активности иммунопатологического процесса при фолликулярных лимфомах разных типов и их дифференциальной диагностике. Это должно способствовать выбору правильной стратегии лечения фолликулярных лимфом 1-2 и 3 типов.

С учетом полученных данных, свидетельствующих о длительном нарушении (даже в период ремиссии) показателей иммунного статуса больных лимфомой Ходжкина, рекомендовано проводить его оценку в процессе планового обследования, предусмотренного международным протоколом R4.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Нарушения иммунной системы, являющиеся важным звеном патогенеза злокачественных лимфом, характеризуются полиморфизмом, но при этом имеются как общие, так и патогномоничные для каждого вида лимфом признаки.

2. Для лимфом из зрелых В-клеток и лимфомы Ходжкина характерно снижение численности субпопуляций Т-лимфоцитов. Особенностью лимфомы Ходжкина является уменьшение количества В-клеток, увеличение содержания моноцитов, уровней иммуноглобулинов основных классов, ЦИК, компонентов комплемента и IFN-a в крови. Общими признаками диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы фолликулярных лимфом разных типов, хронического В-клеточного лимфоцитарного лейкоза являются увеличение числа В-лимфоцитов и CD25*-, HLA-DR+- лимфоцитов в крови.

3. Полихимиотерапия оказывает иммуносупрессивное влияние на количество и функциональные возможности субпопуляций Т- и В-лимфоцитов у больных лимфомой Ходжкина. Динамика восстановления составляющих иммунной системы в период ремиссии различна: показатели гуморального звена иммунитета и факторы неспецифической резистентности достигают нормы значительно раньше, чем Т-клеточные.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации доложены на 5-й Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2001), на 5-й научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001» (Санкт-Петербург, 2001), на 2-й международной научно-практической конференции «Болезнь Ходжкина» (Петрозаводск, 2001), на Российско-Голландской конференции «Диагностика и лечение

лимфом» (Санкт-Петербург, 2002), на 6-й Всероссийской научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2002» (Санкт-Петербург, 2002), на 7-м Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003), на 8-м Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004), на Юбилейной научной конференции молодых ученых северо-западного региона, посвященной 60-летию Российской академии медицинских наук (Санкт-Петербург, 2004). По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 177 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 247 источника (из них 59 отечественных и 188 иностранных авторов). Текст иллюстрирован 40 таблицами и 3 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Исследование выполнено в 1999-2003 г.г. в г. Санкт-Петербурге в НИЛ иммунологии (начальник НИЛ иммунологии - доктор медицинских наук профессор В.Н. Цыган) при кафедре гематологии и клинической иммунологии (ВРИО начальника кафедры гематологии и клинической иммунологии - доктор медицинских наук профессор А.Н. Богданов)

ВМедА.

Обследовано 110 пациентов с злокачественными лимфомами: 30 больных лимфомой Ходжкина (ЛХ) и 80 - с неходжкинскими лимфомами из зрелых В-клеток (В-НХЛ: 29 человек с фолликулярными лимфомами 12, 3 типов, 25 - с диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомой, 26 - с хроническим В-клеточным лимфоцитарным лейкозом) (табл. 1).

Большинство обследованных являлись лицами мужского пола: 74 мужчины (67,2%) и 36 женщин (32,7 %). Возраст больных находился в пределах от 18 до 74 лет и составил в среднем по В-НХЛ 50±2,1 года, а по ЛХ 27,9±2,5 лет.

Клинический диагноз больным устанавливали на основании морфологических исследований согласно критериям классификации ВОЗ опухолей лимфоидной ткани 2001 г. (N.L. Harris et al., 2001). Стадия заболевания определялась согласно классификации, принятой в Ann-Arbor (P. Carbone et al., 1971), а для больных хроническим В-клеточным

лимфоцитарным лейкозом (В-ХЛЛ) согласно классификации Rai (K.R. Rai et al., 1975).

Таблица 1

Распределение больн ых злокачественными лимфомами по группам

Показатели ЛХ В-НХЛ

ДККЛ ФЛ1-2 типа ФЛ 3 типа В-ХЛЛ

Количество 30 25 11 18 26

Средний 27,9+2,5 46,5±2,8 56,8+3,2 48,9±4,9 64,3±5,2

возраст

Пол: М 22 13 7 13 19

Ж 8 12 4 5 7

В-симптомы 14(47%) 16(64%) 6 (54%) 13(72%) -

Стадия: ¡¡ 18 5 3 4 0,1 и II

III 12 18 7 11 стадии - 22

¡У 2 1 3 III стадия - 4

Деление на подгруппы "А" и "В", обследование и лечение больных лимфомой Ходжкина проводилось в соответствии с общепринятым международным протоколом R4 (Протокол R4, 1999). Так подгруппы "А" и "В" выделяли в зависимости от отсутствия или наличия общих симптомов опухолевой интоксикации (лихорадка свыше 38° С, профузные ночные поты, потеря массы тела более 10% за последние 6 месяцев). Лечение при ЛХ осуществлялось по схемам полихимиотерапии СОРР, СОРР-ЛБУ без или с радиотерапией (РТ). Обследование пациентов проводилось после 4 курса полихимиотерапии (ПХТ), после 6 (8) курса ПХТ без или с РТ, а также спустя 3, 6, 9, 12, 18, 24 месяца после проводимого лечения. Были оценены результаты химиотерапии первой линии.

Контрольную группу составили 32 практически здоровых донора, из них 20 мужчин и 12 женщин. Средний возраст составил 35,2±7,5 лет.

Обследование пациентов включало: исследование периферической крови (количества лейкоцитов и лейкоцитарной формулы) и изучение иммунного статуса больных.

Комплексное иммунопогическое исследование крови состояло из определения показателей Т-клеточного (CD3, CD3+CD4+, CD3+CD8\ CD3+CD47CD3+CD8+, CD34CD16+56\ CD3+CD25+, CD3+HLA-DR+, РТМЛ-тест) и гуморального ^19, CD3,CD25+, CD3*HLЛ-DR+, ¡яМ, ¡яО, ¡яЛ, ¡яЕ, ЦИК) иммунитета, а также факторов неспецифической зашиты организма (СВЗ"СБ16+56\ НСТ-тест, ЛКТ, СЗ, С4, С5, СЗа, С5а, С1-инг. общий 1Ш, 1Ш-о,1ЬЬр, 1Ь-4ДЬ-6/ШР-а).

Изучение количественного состава субпопуляций лимфоцитов в периферической крови (ПК) выполнялось на проточном цитометре Расвсап

фирмы «Becton Dickinson» (США) с использованием двойных и тройных комбинаций прямых моноклональных антител (CD4/CD8/CD3, CD3/CD19, CD16'567CD3, CD25/HLA-DR/CD3, CD25/HLA-DR) и изотопических контролен (CD45/CD14, IgGl/IgG2) той же фирмы. Контроль качества определения различных субпопуляций лимфоцитов на проточном цитометре проводится в рамках центральной Европейской программы по контролю качества иммунологических исследований (CEQUAL), получен сертификат № 299 от 27.09.02 и от 2.04.04 гг.

Сывороточные IgE, компоненты системы комплемента С1-инг, СЗ, СЗа, С4, С5 и С5а, а также цитокины IL-1 (3, IL-4, IL-6,TNF-a, общий IFN, IFN-ct определяли методом ИФА с использованием отечественных диагностикумов ЗАО «Вектор-Бест-Балтика», НПО «Протеиновый контур», ООО «Стибиум плюс» и зарубежных коммерческих тест-систем «Boehringer Mannheim» (Австрия). Спонтанную (сп.) и индуцированную (инд.) продукцию клетками крови цитокинов IL-1 (3 и TNF- а определяли методом ИФА с использованием отечественных диагностикумов (ТОО «Цитокин», «Протеиновый контур»). Определение сывороточных иммуноглобулинов классов М, G и А проводили методом простой радиальной иммунодифузии (G. Mancini et al., 1965). Реакцию торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ-тест) с Т-клеточными митогенами фитогемагглютинином (ФГА) и конканавалином А (Кон А) проводили по методике Дж. Бендиксен с соавт. (1980) в модификации В.Г. Морозова и В.Х. Хавинсона (1980). Определение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) проводили методом, предложенным Ю.А. Гриневичем и А.Н. Алферовым (1981). Определение параметров фагоцитарной реакции нейтрофилов крови проводили по методу Васильева Н.В. с соавт. (1972) в модификации В.Г. Морозова и В.Х. Хавинсона (1980); учитывали фагоцитарный показатель (ФП), фагоцитарное число (ФЧ) и показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ). Оценку функциональной активности нейтрофилов также изучали с помощью лизосомально-катионного теста с прочным зеленым (ЛКТ) по методике В.Е. Пигаревского с соавт. (1981) и теста восстановления нитросинего тетразолия (НСТ спонт. и стим. варианты) (М.Е. Виксман, А.Н. Маянский, 1979).

Исходные данные накапливались и подвергались статистической обработке на персональном компьютере Pentium II с помощью пакета прикладных программ Excel для Windows (B.M. Зайцев, В.Г. Лифляндский, 2000). При этом использовались следующие математико-статистические методы: расчет числовых характеристик иммунологических показателей; оценка значимости различий средних значений показателей с помощью t-критерия Стьюдента; корреляционный анализ для оценки направления, силы и значимости связи между различными признаками, и отбора наиболее информативных из них.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Иммунный статус больных с некоторыми формами злокачественных лимфом.

1.1. Фолликулярная лимфома (ФЛ) является гетерогенной опухолью. Согласно степени гистопатологической дифференцировки опухолевого субстрата ее подразделяют на три типа. В клинической практике наиболее часто встречается ФЛ 1-2 типов (90%), реже ФЛ 3 типа (10%) (А.А. Новик, 2000). Для ФЛ 1-2 типа характерно индолентное течение болезни, а для ФЛ 3 типа - агрессивное. В последнем случае чаще наблюдаются рецидивы заболевания, ниже показатель безрецидивной выживаемости (Т. LШiemark et я1., 1997). Соответственно схемы лечения ФЛ разных типов имеют свои особенности.

Сравнение иммунологических показателей больных ФЛ разных типов с данными практически здоровых лиц (КГ) позволило выделить характерные особенности каждого типа этой опухоли. ФЛ 1 типа может переходить в ФЛ 2 типа, между ними нет ярко выраженных различий в морфологии, клинической картине, подходах к лечению и показателях выживаемости (А.А. Новик, 2000), поэтому лица с ФЛ 1 и 2 типа были объединены в одну группу.

При изучении иммунного статуса больных ФЛ разных типов достоверных различий в содержании лейкоцитов, лимфоцитов и нейтрофилов по сравнению с КГ не выявлено. Однако отмечено достоверно более высокое относительное и абсолютное содержание моноцитов в крови у больных ФЛ 3 типа (10,912,2% и 0,62±0,1х109/л, при норме 6,6±0,2% и 0,34±0,1х109/л) (р<0,05) по сравнению с КГ и ФЛ 1-2 типа (количество моноцитов было в пределах КГ).

Из представленных в табл. 2 данных следует, что для больных ФЛ разных типов характерно достоверно более низкое относительное содержание Т-лимфоцитов, за счет снижения числа CD3+CD4+-лимфоцитов. При этом ФЛ 3 типа дополнительно характеризуется уменьшением количества CD3+CD8+-клеток ф<0,05).

При ФЛ разных типов также наблюдается достоверно более высокое содержание CD19+- ф<0,01), CD25+- и НLA-DR+-лимфоцитов (р<0,05) относительно КГ. Наиболее выраженная экспрессия CD 19 и CD25 отмечается у больных ФЛ 3 типа, у них же выявлено более высокое относительное число естественных киллеров (р<0,05) (табл. 2).

При ФЛ 3 типа обнаружена прямая корреляционная связь между содержанием CD25+- и СО19+-клеток (г=0,75; р<0,01), а также между числом HLA-DR+- и СО 19+-лимфоцитов (г=0,55; р<0,05), HLA-DR+-клетками и количеством NK (г=0,57; р<0,05). При ФЛ 1-2 типа была выявлена взаимосвязь между числом CD25+- и СD19+-лимфоцитов (г=0,59; р<0,05).

Таблица 2

Субпопуляционный состав лимфоцитов крови первичных больных с

CD КГ (n=32) JIX (n=20) В-ХЛЛ (n=16) II ФЛ 3 типа (n=18) ФЛ 1-2 типа (n=ll)

1 2 3 4 5

CD3 65.0±1,8 55,6±0,1** 12,3±3,3" 56.9±2,9* 54,6+2,7** 53.3+3,9*

P 2-1.3.4. <<0.01

CD4 37.9+1.2 30.1 ±2.6«* 4,68±1,0" 25,9±2,8** 32,9±2.8** 30+3.5*

P !.,.,. 4. 5<0.01 p 3-2.4<0.05

CD8 27.3±1 20,3±1,5** 3,9±U" 19.2±1,3** 19,4+1,8* 26,5±3,5

Pm.3.4^<0,01 p5.|.2.3.4<0,05

CD 19 I0,1±0,1 7,8±0,9* 81,3±3,6" 18,2±2,2** 28,9±5,5** 17,8±1,3*

Pl-2.3.4.5<0,05 PM.3.4.5<0.01 P 4-1.2.3 $<0,05

CD 16*56* !6,8±1,6 19.3±1.9 3,7±0,9** 22,5+1.9* 23,1±2.2* 18,9+3.8

PM.J.4.5<0.01

CD25 9,1 ±0,3 8,7±2,4 34,0±I1* 15.6+3.1* 24,2±3,3* 16,1±1,7*

P 1-2.1.4. 5<0,05 p M. 3. <0,05 p 4.1. 2.3. j<0,05

HLA-DR 11,7±0,5 13,8±3,9 71±8** 35,3±5.8** 29,7+4* 29,6±2,3*

P l-2.3.4.5<0.05 P M.J.«<0.05

* и **- достоверные различия (р<0,05; р<0,01) по сравнению с КГ; полужирный шрифт - наиболее выраженные изменения одного вида ЗЛ по сравнению с показателями других видов ЗЛ

Полученные результаты свидетельствуют о возможном повышении содержания в крови активированных лимфоцитов, особенно В-клеток с маркером CD25. Это позволяет предположить, что часть В-лимфоцитов находятся в стадии пролиферации. В отличие от ФЛ 1-2 типа для ФЛ 3 типа характерна экспрессия маркера HLA-DR на СD19+-клетках, по-видимому, они активированы на стадии представления антигена Т-хелперам. Следовательно, у этих больных Т-хелперы скорее всего "склоняются" к дифференцировке в Th2, которые вырабатывают цитокины необходимые для дальнейшего развития В-клеток (P.M. Хаитов, 2000).

Для уточнения функционального состояния Т-лимфоцитов был проведен РТМЛ-тест, результаты которого свидетельствовали о их неадекватной реакции на Т-митогены, так при воздействии ФГА - Т-клетки больных ФЛ разных типов не отвечали на стимуляцию, а при воздействии КонА начинали вырабатывать цитокины, усиливающие миграцию лейкоцитов, что косвенно свидетельствует о нарушении механизмов активации Т-лимфоцитов.

Помимо повышенного количества В-клеток для обследуемых пациентов характерны высокие уровни IgG, IgA и высокомолекулярных

ЦИК, что указывает на активацию гуморального звена иммунитета (табл. 3).

Таблица 3

Показатели функциональной активности нейтрофилов, уровни ^ А, М, О и

ЦИК в сыворотке крови больных ФЛ 1-2 и 3 типов, М±т

Показатели КГ (n=32) ФЛ З типа(п=18) ФЛ 1-2 типа (п=11)

IgM (г/л) 1,1±0,05 1,64±0,2* 1,0610,13***

IgG (г/л) 11,6810,2 16,8±1,4* 14,411,1*

IgAfr/л) 1,79±0,07 2,4±0,3* 2,610,3*

ЦИК вые. (отн.ед.) 20,4±1,9 59113,5* 48,4115*

ФП (%) 85,1±1,3 91,3±1,5* 8415,3

ФЧ(у.ед.) 14,8810,6 21,2±4,6* 14,711,2

НСТ спонт. (у.ед.) 0,1410,01 0,2710,04** 0,1610,03***

ЛКТ(у.ед.) 1,54+0,01 1,5810,01** 1,5610,08

* и **- достоверные различия (р<0,05 и р<0,01) по сравнению с КГ;

*** - достоверные различия (р<0,05) по сравнению с ФЛ 3 типа

У пациентов с ФЛ 3 типа также обнаружен достоверно более высокий уровень IgM по сравнению с КГ (табл. 3), что указывает на поликлональную активацию В-лимфоцитов.

При ФЛ 1-2 типа изменения в функциональной активности нейтрофилов не обнаружены. У лиц с ФЛ 3 типа происходит активация поглотительной способности нейтрофилов (высокие ФП и ФЧ) и их бактерицидной активности за счет кислороднезависимого (высокий ЛКТ) и кислородзависимого механизмов функционирования клеток (высокий НСТ спонт.). Эти данные указывают на наличие у больных сопутствующего основному заболеванию воспалительного процесса (табл. 3).

При исследовании цитокинового статуса у больных ФЛ разных типов обнаружено: ФЛ 3 типа характеризуется достоверно более высокими уровнями IL- ip и TNF-a (агрессивное течение заболевания), а при ФЛ 1-2 отмечаются высокие концентрации IL-4 и TNF-a (индолентное течение) (р<0,05) относительно КГ (рис. 1). При сравнении показателей обеих групп выявлены достоверно более высокие уровни IL- 1 (5 и IFN (общий) при ФЛ 3 типа. Эти данные не противоречат имеющимся в литературе (М. Gorschluter et al., 1995). Так, например, повышенная концентрация IL-1P встречается, как правило при более агрессивном течении болезни и нередко сочетается с неблагоприятным прогнозом. Доказано (А.А. Ярилин, 1999), что IL- вырабатывается в основном активированными моноцитами/макрофагами и часто становится одной из причин появления у больных В-симптомов (P.M. Mauch et al., 1999). Так при ФЛ 1-2 типа отмечалось достоверно более низкое количество моноцитов по сравнению с ФЛ 3 типа (р<0,05), а В-симптомы присутствовали только в 54% случаях.

При ФЛ 3 типа В-симптомы обнаруживались в 72%. Таким образом, при ФЛ 1-2 типа проявления иммунопатологического процесса выражены в меньшей степени.

Рис. 1. Продукция цитокинов клетками крови и их содержание в сыворотке больных ФЛ разных типов по отношению к КГ (%) * и ** - достоверные различия (р<0,05 и р<0,01) по сравнению с КГ; Цифрами обозначены: 1 - КГ, 2 - ФЛ 3 типа, 3 - ФЛ 1-2 типа

При изучении способности клеток крови к продукции обнаружено, что у пациентов с ФЛ разных типов только спонтанная выработка ТОТ-а была достоверно выше показателей КГ (р<0,01), причем существенно ниже, чем его уровень в сыворотке (рис. 1). Вероятно, что при этих заболеваниях ТКБ-а продуцируется не только клетками крови, но и другими популяциями клеток (возможно трансформированными лимфоцитами). Выработка ТОТ-а и 1Ь- 1(3 клетками крови больных двух групп в ответ на стимуляцию продигиозаном была крайне низкой по сравнению с КГ, причем при ФЛ 1-2 типа более существенно (рис. 1).

Таким образом, для больных ФЛ 3 типа в отличие от пациентов с ФЛ 1-2 типа характерны: более низкое количество Т-ЦТЛ, более высокий процент В-клеток и КК, а также, лимфоцитов, "экспрессирующих СБ25; повышенное количество моноцитов, а также более высокие уровни 1Ир, 11К (общий) в сыворотке крови.

1.2. Для диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы (ДККЛ) характерны агрессивное течение и минимальные сроки выживаемости при отсутствии адекватной терапии (К. Реагсе, 1992). Сравнение иммунного статуса первичных больных ДККЛ с данными КГ позволило выявить характерные для этого заболевания иммунологические нарушения.

Для пациентов с ДККЛ характерно достоверное увеличение абсолютного и относительного числа моноцитов (0,65±0,09х109/л и

9,2±1,3%) в крови по сравнению с КГ (6,6±0,2х109/л и 0,34±0,1%) (р<0,05) на фоне неизмененного количества лейкоцитов, лимфоцитов и нейтрофилов.

При ДККЛ наблюдалось снижение относительного числа Т-лимфоцитов по сравнению с КГ, за счет уменьшения количества Т-хелперов и Т-ЦТЛ (табл. 2, см. стр. 8). Данные РТМЛ-теста свидетельствовали о нарушении их функционального состояния (отсутствие реакции Т-клеток на ФГА и выработка ими цитокинов, усиливающих миграцию лейкоцитов, на КонА). Эти результаты можно трактовать как нарушение механизмов активации Т-лимфоцитов, что подтверждается исследованиями О.Е. Молчанова (2001).

Кроме того, у больных отмечалось достоверно более высокое относительное содержание СО19+-клеток и лимфоцитов, экспрессирующих CD25 и HLA-DR, в крови по сравнению с КГ (р<0,05) (табл. 2).

С помощью корреляционного анализа выявлены прямые связи между относительным числом CD25+- и СОЗ+С04+-лимфоцитами (r=0,64; р<0,05), CD25+- и СО19+-клетками (r=0,62; р<0,05), CD25+- и CD3+CD8+-лимфоцитами (r=0,85; р<0,01), свидетельствующие о повышенном содержании в крови активированных В- и Т-клеток. Возможно, что часть В-лимфоцитов находится в стадии пролиферации. Это является косвенным свидетельством развития Th2 ответа, который не эффективен при элиминации трансформированных клеток. Для ДККЛ также была характерна экспрессия маркера CD25 на CD3+CD4+- и CD3+CD8+-лимфоцитах, что тоже указывает на активацию Т-клеточного звена иммунитета. Необходимо отметить, что хотя Т-лимфоциты и могут быть активированы, однако это не означает, что они полноценно способны выполнять свои функции.

При исследовании содержания иммуноглобулинов основных классов и ЦИК было выявлено достоверное повышение уровней только IgM и G (рис. 2), указывающее на активацию гуморального звена иммунитета при данном заболевании (О.Е. Молчанов, 2001).

150 -**■

50 О

1{1М г/л ДОг/л ФП% ФЧ у.ед. ЛКТу.сд.

Рис. 2. Показатели функциональной активности нейтрофилов, уровни IgM, G в сыворотке крови больных ДККЛ по отношению к КГ (%) * и ** - достоверные различия (р<0,05 и р<0,01) по сравнению с КГ

Изучение факторов неспецифической резистентности позволило обнаружить повышенное содержание -лимфоцитов в крови при

ДККЛ по сравнению с КГ (р<0,05) (табл. 2, см. стр. 8). Хотя изменений со стороны численности нейтрофилов не регистрировалось, однако отмечались высокие ФП и ФЧ, указывающие на высокую поглотительную способность этих клеток. В комплексе с показателем ЛКТ-теста (рис. 2) эти данные свидетельствуют о наличии иммунопатологического процесса в организме обследуемых.

При определении содержания 1Ь- 1р, 1Ь-4,1Ь-6,ТМР-а, общего 1НЧ в сыворотке крови обнаружено достоверное повышение уровней 1Ь- 1Р, 1Ь-6, ТОТ-Х относительно КГ (рис. 3). Совместног повышение 1Ь-6 и 1Ь-1р может быть одной из причин образования В-симптомов у 64% больных ДККЛ и увеличения бактерицидной активности нейтрофилов (высокие показатели ФП, ФЧ, ЛКТ) (рис. 2), в связи с участием этих цитокинов в формировании подобных процессов (Л.А. Грачева, 1996). Кроме того, высокая концентрация 1Ь- 1Р является прогностическим показателем, так как встречается при более агрессивном течении заболевания и нередко сочетается с неблагоприятным прогнозом (М. ОогесЪМег, 1995).

11.-6* Ед/мл 1ЫЬпг/мл И-1 Ь инд. ТЫГ-а пг/мл ТЫР-а инд.

пг/мл пг/мл

Рис. 3. Продукция клетками крови и уровни в сыворотке крови некоторых цитокинов у больных ДККЛ по отношению к КГ (%) * и ** - достоверные различия (р<0,05 и р<0,01) по сравнению с КГ

Необходимо отметить, что спонтанная продукция 1Ь- 1р и ТОТ-а клетками крови была в пределах КГ, однако их содержание в сыворотке было более высоким, что является косвенным свидетельством их выработки другими клетками организма (возможно трансформированными лимфоцитами). Индуцированная продукция 1Ь- 1 р и ТМБа клетками крови была крайне низкой относительно КГ, что указывает на нарушение их способности отвечать на антигенную стимуляцию (рис. 3).

Таким образом, для больных ДККЛ характерны недостаточность Т-клеточного звена иммунитета, активация гуморального звена, системы 1ЧК и фагоцитов, повышенные уровни 1Ь-1Р, 1Ь-6, ТОТа в сыворотке крови.

1.3. Исследования иммунного статуса пациентов с хроническим В-клеточным лимфоцитарным лейкозом 0-Н стадий, также относящимся к В-НХЛ, выявили следующее: абсолютный лейкоцитоз (в 90% случаях, при среднем количестве лейкоцитов 21,8±4,4х109/л; N=6,28±0,2xl0%), в 100% случаях - абсолютный и относительный лимфоцитоз, а также относительная нейтропения в 90%. Эти данные подтверждают результаты, полученные С.А. Луговской (1999) и М.А. Волковой (2001).

Иммунофенотипическое исследование субпопуляций лимфоцитов крови обнаружило достоверно высокий процент лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности CD 19 и маркеры активации HLA-DR, CD25. Параллельно регистрировалось низкое содержание CD3-, CD3+CD4+-, CD3+CD8+- СО16+56+-клеток относительно КГ (р<0,01) (табл. 2, см. стр. 8). Наиболее вероятно, что эти изменения отражают вытеснение субпопуляций NK и Т-клеток лейкозным клоном (L.E. Van den Nove et al., 1998).

При корреляционном анализе выявлены прямые связи между содержанием HLA-DR и CD19 (r=0,87; р<0,01), а также между CD25 и CD 19 (r=0,65; р<0,05). Эти данные могут косвенно указывать на то, что при В-ХЛЛ преимущественно активированы, клетки, экспрессирующие CD19.

По результатам исследований РТМЛ-теста установлено, что у пациентов происходила выработка факторов, способствующих усилению миграции лейкоцитов под влиянием Т-митогенов и свидетельствующих о нарушении механизмов активации Т-лимфоцитов при В-ХЛЛ. Полученные результаты и их интерпретация не противоречат исследованиям других авторов (N. Porakishvili et al., 2001).

Достоверных различий в содержании IgM, G, А и ЦИК в сыворотке крови больных и КГ не выявлено, за исключением более высокого уровня высокомолекулярных ЦИК (табл. 4), что не совпадает с данными S. Karfa (1990), отмечавшего снижение уровней этих иммуноглобулинов.

Таблица 4

Уровни IgA, M, G и ЦИК в сыворотке крови больных В-ХЛЛ, М±т

Показатели 18 (г/л) ЦИК(отн.ед.)

М G А выс. сред. низ.

КГ 1,1 ±0,05 11,6810,2 1,79+0,1 20,4±1,9 76,1 ±4,4 156±7,4

В-ХЛЛ 1,45±0,2 11,54+0,7 2+0,2 34,7±6* 109,2±27,5 196,8±43

* - достоверные различия (р<0,05) по сравнению с КГ

Следует предположить, что количество нормальных В-лимфоцитов, плазматических клеток и их функциональная активность не претерпевают заметных изменений на ранних стадиях В-ХЛЛ, лейкозные клетки еще не способны оказывать выраженного влияния на лимфопоэз, а

взаимодействие между Т-хелперами и В-клетками в ходе иммунного ответа на 0-11 стадиях не нарушено.

В 90% случаев у пациентов показатели функциональной активности находились в пределах нормы. Сравнение средних величин больных с КГ позволяет, несмотря на нарушение переваривающей способности нейтрофилов (ПЗФ: 25,09+1,8%; N=30,611,5% при р<0,05), отметить активацию кислородзависимого механизма (НСТ спонт.: 0,2+0,02 у.ед.; N=0,1410,01 у.ед. при р<0,05).

Таким образом, уже на ранних стадиях В-ХЛЛ имеется ярко выраженный Т-клеточный иммунодефицит при отсутствии выраженных изменений со стороны показателей гуморального звена иммунитета и функциональной активности нейтрофилов.

1.4. Исследование иммунного статуса больных лимфомой Ходжкина показало достоверное повышение содержания лейкоцитов за счет фракции нейтрофилов (р<0,05). Абсолютное число лимфоцитов колебалось в пределах нормы (2,1610,19x10%; N=2,07±0,08xl0s», однако их процентное содержание было достоверно ниже КГ (23,5+1,6%; N=34,7+0,8%).

При обследовании зарегистрировано также достоверное снижение относительного числа СОЗ+-лимфоцитов, происходящего за счет снижения Т-хелперов и Т-ЦТЛ (табл. 2, см. стр. 3). Полученные результаты совпадают с данными О. Tullgren (1991), однако противоречат более ранним исследованиям (B.W. Hancock, 1982), в которых отмечалось снижение численности Т-клеток только на последних стадиях ЛХ. С помощью метода РТМЛ выявлено нарушение функциональной активности Т-лимфоцитов в процессе развития болезни, отмечена их неадекватная реакция на Т-митогены.

У больных наблюдалось достоверное уменьшение численности CD19+-клеток (p<0,05) (табл. 2) на фоне повышения уровней IgA, M, G и Е, что указывает на поликлональную стимуляцию В-лимфоцитов. Следствием чего, по всей вероятности, являются высокие концентрации высоко- и низкомолекулярных ЦИК (табл. 5).

Из данных представленных в табл. 2 видно, что отсутствуют достоверные различия по количеству лимфоцитов, экспрессирующих маркеры активации CD25 и HLA-DR, у больных ЛХ по сравнению с КГ. При определении активационных молекул на поверхности Т- и В-лимфоцитов и NK также не выявлено достоверных различий относительно КГ, хотя отмечено повышенное число СВЗ+СЕ)25+-клеток.

При проведении корреляционного анализа установлены положительные достоверные связи между количеством активированных клеток (CD25) и содержанием Т-лимфоцитов (r=0,7; р<0,01). Число CD25+-лимфоцитов также коррелировало с СDЗ+СD4+-клетками (r=0,77; р<0,01). Кроме того, обнаружена прямая связь между содержанием HLA-DR+- и

СБ19+-лимфоцитами (г=0,83; р<0,01), и прямая связь между Н1А-БК.+- и СОЗ+сБ8--клетками (г=0,47; р<0,05). Комплекс полученных результатов можно расценивать как свидетельство активации В-лимфоцитов, Т-хелперов и Т-ЦТЛ в ходе иммунного ответа при ЛХ.

Таблица 5

Показатели функциональной активности нейтрофилов, уровни IgA, М, G, Е, ЦИК, компонентов комплемента. IFN-q в сыворотке больных ЛХ. М±т

Показатели КГ(п=32) Больные ЛХ (п=30)

^М (г/л) 1,1 ±0,05 1.810,1**

ДО (г/л) 11.68+0,2 14,8+0,7**

1&А (г/л) 1,79+0,07 2,4510,2**

^Б (г/л) (ИФА) 64,2+12,1 91,9+6,4*

ЦИК вые. (отн.ед.) 20,4+1,9 57,518,7**

ЦИК низ. (отн.ед.) 156t7,4 204.8112,7**

НСТ спонт. (у.ед.). 0,14+0,008 0,1910.02*

ЛКТ(у.ед.) 1,54+0,01 1,5810,01*

СЗ (в сыворотке) (мг/мл) 0,91+0,05 1,65+0,06* •

С4 (в сыворотке) (мг/мл) 0,4510,03 0,57+0,03**

С5 (в сыворотке) (мг/мл) 0,098+0,01 0,0510,01**

1Ш-сс (пг/мл) 34,79+5,1 54,4+1,5**

* и ** - достоверные различия (р<0,05 и р<0,01) по сравнению с КГ

В ходе исследования факторов неспецифической резистентности не было выявлено достоверных различий в содержании CD16+56+-лимфоцитов (NK- и Т-клетки) по сравнению с КГ (табл. 2, см. стр. 8). При более детальном изучении этой субпопуляции установлено, что количество СВЗ+СБ16+56+-к:леток находится на уровне КГ (14,711,4%; N=12,21+1,0%), однако имеется достоверно более высокое содержание CD3+CD16+56+ (8,82+1,6%; N= 4,2310,5% при р<0,05), которые, как известно (R. Mendes, 2001), также обладают противоопухолевыми свойствами.

Нарушений со стороны функциональной активности нейтрофилов у больных не наблюдалось. Наоборот, отмечалась некоторая активация как кислородзависимых, так и кислороднезависимых механизмов бактерицидности нейтрофилов (высокие НСТ спонт. и ЛКТ) (табл. 5).

Система комплемента, роль которой в процессах онкогенеза еще не ясна (О.А. Kniazeva et al., 2000), является важнейшим звеном в устранении ЦИК, накопление которых может вызвать развитие иммунопатологических реакций. В ходе наших исследований установлено, что средние значения концентраций СЗа, С5а, С1-ингибитора между больными и КГ не имели достоверных различий. Однако при этом отмечалось достоверное повышение содержания СЗ, С4 и пониженное С5 (табл. 5), что совпадает с

опубликованными ранее результатами J.L. Lichtenfeld et al. (1976). Повышение уровней СЗ и С4 предположительно связано с ростом в их потребности для элиминации ЦИК. Тем не менее, у больных ЛХ отмечается повышенное содержание высоко- и низкомолекулярных ЦИК. Вероятной причиной данного явления может быть превышение скорости образования ЦИК над скоростью их удаления, так как явных дефектов со стороны функциональной активности нейтрофилов не выявлено. Наблюдаемое снижение концентрации С5 происходит, по-видимому, в результате его перехода в С5а.

Во многих случаях обнаружены высокие концентрации IFN-a (в 76% случаях) и TNF-a (в 40%) в сыворотке крови. Средний уровень IFN-a достоверно превосходил показатели КГ (р<0,01) (табл. 5), что частично обусловлено повышенным содержанием моноцитов и нейтрофилов в крови (А.А Ярилин, 1999), а также активацией их состояния. В пользу данного положения свидетельствуют повышенные показатели НСТ спонт. и ЛКТ.

Оценивая в комплексе результаты обследования больных ЛХ необходимо выделить следующие наиболее выраженные нарушения со стороны Т-клеточного звена иммунитета: низкая экспрессия молекул CD3, CD4, CD8 на поверхности лимфоцитов; неадекватная реакция Т-клеток на КонА и ФГА. Несмотря на пониженное содержание В-лимфоцитов в крови, у большинства пациентов проявлялись признаки поликлональной активации В-клеток: высокие концентрации IgA, M, G, Е и, соответственно, ЦИК. Повышенные уровни СЗ, С4, IFN-a в сыворотке крови также косвенно указывают на высокую активность иммунопатологического процесса в организме.

1.4.1. Исходной посылкой для проведения сравнительной оценки показателей иммунного статуса больных ЛХ с В-симптомами и пациентов с ЛХ без В-симптомов послужило следующие обстоятельство. Иммунная система оказывает существенное влияние на формирование В-симптомов, при них заболевание протекает более тяжело и его прогноз хуже, чем у пациентов без В-симптомов (H.J. Gruss 1996; P.M. Mauch et al., 1999).

Обнаружено, что при отсутствии В-симптомов для больных характерно достоверное повышение CD3+CD8+- и С0194-лимфоцитов в крови (24,05±2,5% и 9,65±0,5%) относительно к показателям пациентов с В-симптомами (16,4±0,8% и 6,37±0,8%). Полученные результаты косвенно свидетельствуют о более благоприятном состоянии иммунной системы. У этих же лиц без В-симптомов отмечалось достоверно низкое содержание высокомолекулярных ЦИК (41,12±5,1 отн.ед.), по сравнению с другой группой пациентов (81,8117,8 отн. ед.). Вероятнее всего это связано с повышенной функциональной активностью нейтрофилов (высокий НСТ спонт.), которые, как известно, тоже принимают участие в их элиминации из организма (В.Т. Долгих, 1998).

2. Сравнительные исследования (табл. 2, см. стр. 8) субпопуляционного состава лимфоцитов ПК больных ЗЛ позволило выявить следующее:

a). Для ЛХ, В-ХЛЛ, ДККЛ и ФЛ трех типов характерно достоверно более низкое относительное содержание СБ3+-, СБ3+СБ4+-, СБ3ТБ8+-лимфоцитов в ПК по сравнению с КГ. Самая низкая экспрессия СБ3-, СБ4-и СШ-антигенов наблюдается при В-ХЛЛ. Значительно снижена экспрессия СБ4 при ДККЛ. При ФЛ 1-2 типа достоверно отмечается самое высокое содержание СБ3+СБ8+-клеток.

b). Больные с В-ХЛЛ, ДККЛ и ФЛ трех типов по сравнению с КГ и ЛХ достоверно характеризуются более высоким содержанием СБ19+-клеток, а также лимфоцитов, экспрессирующих активационные маркеры СБ25 и Ы1А-БК. Наиболее выраженная экспрессия СБ25 среди вышеуказанных лимфом наблюдалась при В-ХЛЛ и ДККЛ, а Ы1А-БК - при В-ХЛЛ.

c). Лимфомы с агрессивным течением заболевания (ДККЛ и ФЛ 3 типа) достоверно характеризуются более высоким процентом лимфоцитов, экспрессирующих маркер СБ16+56+, по сравнению с КГ и другими видами лимфом. Самая низкая экспрессия молекул СБ 16+56+ относительно КГ и других видов ЗЛ выявляется при В-ХЛЛ.

3. Оценка изменений иммунного статуса пациентов с ЛХ осуществлялась в процессе лечения (после 4 и 8 курсов ПХТ), а также после его окончания в период ремиссии на протяжении двух лет. Схема лечения и сроки наблюдения соответствовали требованиям международного протокола Я4.

Данные обследованных пациентов ЛХ были разделены на три группы по времени наблюдения: первая - период 3-6 месяцев (33 пациента), вторая - 9-12 месяцев (10), третья -18-24 месяца (10).

Исследования показали, что после лечения в крови больных ЛХ наблюдалось достоверное снижение численности клеток лейкоцитарного ряда. Наиболее выраженные изменения наблюдались после 4 курса ПХТ по сравнению с исходными показателями (табл. 6).

Спустя 6 мес. после окончания терапии содержание лейкоцитов и нейтрофилов восстанавливалось, а к концу 24 мес. их количество незначительно превышало показатели КГ, однако полного восстановления численности лимфоцитов не выявлено (р<0,05) (табл. 6).

Из представленных на рис. 4 результатов видно, что после окончания 8 курса ПХТ отмечалось снижение общего содержания Т-лимфоцитов и Т-хелперов и рост числа Т-ЦТЛ (наиболее выраженное снижение численности всех субпопуляций Т-клеток наблюдалось после 4 курса ПХТ).

Исследованные показатели клеточного состава крови разные периоды времени, М±т

Таблица 6 больных ЛХ в

Увеличение количества СБ3+-, СВ3+СБ4+-клеток происходило только на 24 мес. наблюдения, тем не менее, полного восстановления до уровня КГ не происходило, за исключением СОЗ+СБ8+-лимфоцитов (рис. 4). На основании данных оценки функциональной активности Т-лимфоцитов по РТМЛ сделан предварительный вывод, что она восстанавливалась до уровня КГ только спустя 24 мес. после окончания терапии.

1 2 3 4 5 1

Рис. 4. Относительное содержание субпопуляций Т-лимфоцитов в крови больных ЛХ в разные периоды времени

Цифрами указаны сроки наблюдения: 1- до лечения, 2 - после завершения 8 курса ПХТ, 3 - через 6 мес. после лечения, 4 - через 12 мес, 5 - через 24 мес; * - достоверные различия между иммунологическими показателями в разные периоды времени при р<0,05

В первые 6 мес. после лечения отмечался временный дисбаланс в соотношении Т-хелперов и Т-ЦТЛ (выраженное превалирование

последних). Возможной причиной этого могло быть, то, что ПХТ «уничтожила» большинство опухолевых клеток, продуцировавших цитокины, которые оказывали регулирующие влияние на численность Т-хелперов и Т-ЦТЛ, и на их перераспределение между опухолевым субстратом и кровью, а также могли индуцировать апоптоз в последних.

Заметное снижение относительного числа В-лимфоцитов наблюдалось в крови 90% больных ЛХ после 4 курса ПХТ. В последующий период лечения содержание CD19+-лимфоцитов незначительно возрастало, а полное восстановление наступало уже спустя 6 мес. после окончания терапии (рис. 5).

Рис. 5. Относительное содержание CD19+-, СВ25+-лимфоцитов и NK в крови больных ЛХ в разные периоды времени (обозначения см. рис. 4.)

ПХТ также оказала влияние на продукцию IgM, G, А, Е плазматическими клетками, уровни которых заметно снижались после 8 курса ПХТ по сравнению с данными до лечения (р<0,05). В связи с более низкой продукцией антител у больных отмечалось снижение концентраций всех ЦИК в сыворотке крови, однако, достоверные различия были получены только для высоко- и низкомолекулярных (р<0,01). В период ремиссии концентрации вышеуказанных иммуноглобулинов и ЦИК варьировали в пределах нормы. Как исключение - к концу 24 мес. наблюдения уровни IgA, средне- и низкомолекулярных ЦИК возрастали и достоверно превышали данные КГ.

Количество СD25+-лимфоцитов после окончания 8 курса ПХТ также заметно снижалось и оставалось практически неизменным на протяжении первых 6 мес. наблюдения. В последующем наблюдалась тенденция к их увеличению, а к 12 мес. - происходило полное восстановление (рис. 5).

При исследовании показателей неспецифической резистентности обнаружено снижение численности СD16+56+-лимфоцитов в процессе лечения. В течение 12 мес. после его окончания содержание NK резко возрастало (превышало данные КГ), тем не менее, к концу 24 мес. наблюдения восстанавливалось до нормы (рис. 5). Выраженных

нарушений со стороны большинства показателей функциональной активности нейтрофилов, на всем протяжении периода мониторирования, не отмечалось. Однако обращает на себя внимание тот факт, что на 24 мес. наблюдения выявлено снижение переваривающей способности нейтрофилов (низкий ПЗФ: 17,6±2,9%; N=30,611,5% при р<0,05).

Оценивая в комплексе результаты исследования иммунного статуса больных ЛХ на протяжении периодов лечения и ремиссии, выделены следующие наиболее значимые моменты: ПХТ оказывает супрессивное влияние практически на все составляющие иммунной системы. Показатели гуморального звена иммунитета и факторы неспецифической резистентности организма восстанавливаются быстрее после окончания лечения, чем Т-клеточного звена.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе выполнения сравнительных исследований состояния иммунного статуса первичных больных ЗЛ (ФЛ, ДККЛЮ В-ХЛЛ, ЛХ) и изучения его динамики у лиц с ЛХ получены результаты, отражающие общие закономерности и особенности изменения показателей различных звеньев иммунитета.

Установлено, что все исследованные формы ЗЛ характеризуются пониженным относительным содержанием Т-лимфоцитов в ПК. Помимо этого пациенты с В-НХЛ обладают достоверно более высоким количеством В-клеток и СБ25+-, НЬА-БК+-лимфоцитов в крови, что является их отличительным признаком от ЛХ. Лимфомы с агрессивным течением заболевания (ДККЛ и ФЛ 3 типа) имеют более высокий процент СБ16+56+-лимфоцитов относительно КГ. Иммунный статус больных ДККЛ характеризуется недостаточностью Т-клеточного звена иммунитета, активацией гуморального звена, системы NK, нейтрофилов и повышением уровней 1Ь- 1Р, 1Ь-6, TNF- а в крови.

При ЛХ типичными являются уменьшение количества субпопуляций Т- и В-лимфоцитов, повышение уровней иммуноглобулинов основных классов, ЦИК, компонентов комплемента, в ПК. ПХТ оказывает

иммуносупрессивное влияние на количество и функциональные возможности субпопуляций Т- и В-клеток у пациентов с ЛХ. При этом динамика восстановления показателей Т-клеточного и гуморального звеньев иммунитета, факторов неспецифической резистентности после лечения различна.

Комплекс результатов иммунологических исследований отражает не только общие характеристики, но и особенности исследованных ЗЛ, дополняя банк клинических данных. Полученные данные могут быть использованы как дополнительные критерии при дифференциальной диагностике.

выводы

1. Иммунный статус больных злокачественными лимфомами характеризуется полиморфизмом показателей состояния иммунной системы. Для первичных больных с лимфомами из зрелых В-клеток и лимфомой Ходжкина характерно низкое относительное содержание СБ3+-, СБ3+СБ4+-, СОЗ+СО8+-лимфоцитов в крови, за исключением фолликулярной лимфомы 1-2 типа. Лимфомы из зрелых В-клеток характеризуются достоверно более высоким содержанием СБ19+-клеток, а также СБ25+- и ЫЬА-БК+-лимфоцитов по сравнению с лимфомой Ходжкина.

2. Компенсаторной реакцией на недостаточность Т-клеточного звена иммунитета у первичных больных диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомой является активация гуморального звена, системы КК и нейтрофилов, а также повышенные уровни 1Ь- 1р, 1Ь-6,ТМР- а в сыворотке крови.

3. В отличие от фолликулярной лимфомы 1-2 типа для 3 типа характерно более высокое содержание СБ19+-, СО25+-лимфоцитов, моноцитов, 1Ь-1Р в крови на фоне низкого числа СБ3+СБ8+-клеток.

4. Ранние стадии хронического В-клеточного лимфоцитарного лейкоза характеризуются выраженным Т-клеточным иммунодефицитом на фоне нормального состояния гуморального звена иммунитета и функциональной активности нейтрофилов.

5. Для первичных больных лимфомой Ходжкина характерно наличие иммунодефицита смешанного типа, проявляющегося в изменении спектра показателей Т-клеточного (количественные и качественные изменения субпопуляций Т-клеток) и гуморального (пониженное содержание СБ9+-лимфоцитов, поликлональная активация В-клеток) звеньев иммунитета, и факторов неспецифической резистентности; при наличии В-симптомов уменьшение количества Т-ЦТЛ и В-лимфоцитов в крови имеет более выраженный характер.

6. У больных лимфомой Ходжкина в ходе полихимиотерапии происходит временное усугубление имеющихся нарушений Т- и В-звеньев иммунитета. При этом показатели гуморального звена иммунитета и факторов неспецифической резистентности восстанавливаются в течение первого года после терапии, а признаки недостаточности Т-клеточного звена иммунитета сохраняются на протяжении двух лет.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Изменения ряда иммунологических показателей, исследованных в ходе выполнения работы, у первичных больных фолликулярными лимфомами могут служить дополнительными критериями для

дифференцировки этой лимфомы на 3 и 1-2 типы: так более высокое содержание СБ19+-, СБ25+-лимфоцитов, моноцитов и 1Ь-1р в крови на фоне более низкого количества СБЗ~С08+-лимфоцитов характерны для фолликулярной лимфомы 3 типа.

2. Отличительными признаками лимфом из зрелых В-клеток от лимфомы Ходжкина являются: высокое относительное содержание СБ 19-лимфоцитов, а также лимфоцитов, экспрессирующих маркеры активации СБ25 и ША-БИ, в крови, что может служить дополнительными критериями для их дифференциальной диагностики.

3. Более низкое относительное содержание СБ3+СБ8+- и СБ19+-лимфоцитов в крови характерно для больных лимфомой Ходжкина с В-симптомами, в отличие от больных лимфомой Ходжкина без В-симптомов. Изменения этих иммунологических показателей могут служить косвенным показателем более неблагоприятного течения заболевания.

4. В связи с тем, что полихимиотерапия усугубляет имеющиеся нарушения иммунного статуса у больных лимфомой Ходжкина, а иммуносупрессия сохраняется длительное время, необходимо между курсами лечения и на протяжении нескольких лет после их окончания контролировать состояние иммунный системы, проводить профилактику инфекций вирусной и бактериальной этиологии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Долгополова Е.В. ДНК-шюидия и пролиферативная активность иммунокомпетентных клеток в прогнозе течения лимфопролиферативных заболеваний / Е.В. Долгополова, В.Ю. Никитин, В.Н. Цыган, Т.Ю. Майорова // Проблемы окружающей среды и природных ресурсов. - 2000. - № 8. - С. 49-68.

2.Долгополова Е.В. Основные принципы и диагностические возможности проточной цитометрии в онкогематологии / Е.В. Долгополова, А.А. Новик, В.Ю. Никитин, В.Н. Цыган // Медицина, ветеринария, фармакология. - 2000. - № 1.- С. 8-14.

3.Долгополова Е.В. Особенности иммунитета у больных лимфогранулематозом в процессе химиотерапии / Е.В. Долгополова, А.А. Новик, В.Ю. Никитин, В.Н. Цыган // Гедеок Рихтер в СНГ. - 2001. - Т. 5, № 1.-С. 45-48.

4.Долгополова Е.В. Иммунологический статус больных лимфогранулематозом / Е.В. Долгополова, А.А. Новик, В.Ю. Никитин, В.Н. Цыган // Болезнь Ходжкина (лимфогранулематоз): Тез. докл. междунар. науч.-практ. конф. - Петрозаводск, 2001. - С. 20-21.

5.Долгополова Е.В. Состояние иммунного статуса больных лимфогранулематозом, включенных в протокол Я-4 / Е.В. Долгополова,

АА. Новик, В.Ю. Никитин // Мед. иммунология. - 2001. - Т. 3, № 2. - С. 273.

6.Долгополова Е.В. Влияние комбинированной полихимиотерапии на иммунный статус больных лимфогранулематозом / Е.В. Долгополова,

A.А. Новик, В.Ю. Никитин, В.Н. Цыган // Диагностика и лечение лимфом: Тез. Рос.-Голландской конф. - СПб., 2001. - С. 312-314.

7.Долгополова Е.В. Проточная цитометрия в диагностике лимфопролиферативных заболеваний / Е.В. Долгополова, А.А. Новик,

B.Ю. Никитин, В.Н. Цыган // Диагностика и лечение лимфом: Материалы Рос. -Голландской конф. - СПб., 2001. - С. 151 -174.

8.Долгополова Е.В. Иммунный статус при болезни Ходжкина / Е.В. Долгополова, А.А. Новик, В.Ю. Никитин, В.Н. Цыган // Диагностика и лечение лимфом: Тез. Рос.-Голландской конф. - СПб., 2002. - С. 212-215.

9.Долгополова Е.В. Состояние иммунного статуса больных болезнью Ходжкина в разные периоды заболевания / Е.В. Долгополова, А.А. Новик, В.Ю. Никитин, В.Н. Цыган // Мед. иммунология. - 2002. - Т. 4, № 2.-С. 294.

10. Долгополова Е.В. Клинико-диагностическое значение иммунологических показателей при болезни Ходжкина / Е.В. Долгополова, А.А. Новик., В.Ю. Никитин, В.Н. Цыган // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии. - СПб., 2002. - С. 130.

11. Долгополова Е.В. Сравнительная характеристика показателей иммунного статуса больных неходжкинскими лимфомами / Е.В. Долгополова, В.Ю. Никитин, В.Н. Цыган // Мед. иммунология. - 2003. -Т. 5,№3/4.-С. 354.

12. Долгополова Е.В. Иммунный статус больных фолликулярными лимфомами разных типов / Е.В. Долгополова, В.Ю. Никитин, В.Н. Цыган // Мед. иммунология. - 2004. - Т. 6, № 3/5. - С. 351.

Подписано в печать jOMQ'i Формат 60x84 '/|6.

Объем 1 '/г пл._Тираж jpg экз._Заказ № НИ

Типография ВМедА, 194044, СПб., ул. Академика Лебедева, 6

»22 2 9 1

РНБ Русский фонд

2005-4 18886

Злокачественные лимфомы (3JI) являются широкораспространенной гетерогенной группой опухолей, происходящих из лимфоидной ткани [39]. На их долю приходится около 2,7% от всех других регистрируемых неоплазий в России [54]. В странах Европы наиболее распространенными являются такие виды опухолей, как фолликулярная, диффузная крупноклеточная В-клеточная, хронический В-клеточный лимфоцитарный лейкоз, лимфома Ходжкина. Частота их встречаемости превышает 70% порог в общем количестве 3JT [39], а уровень смертности один из самых высоких среди онкологических больных молодого возраста [126]. Поэтому диагностика и лечение лимфом представляет важную медицинскую и социальную проблему.

Изучению патогенеза 3JI и характера иммунного ответа на формирование малигнизированных клеток посвящены многочисленные исследования [178, 235]. Однако их результаты весьма фрагментарны и противоречивы. Доказано [59, 77, 93], что защитные иммунные механизмы включаются в организме задолго до появления клинически определяемых признаков опухоли. На стадии инициализации иммунная система адекватно реагирует на появление трансформированных лимфоцитов, формируя полномасштабный иммунный ответ с включением всех звеньев. Однако в дальнейшем он, как правило, оказывается малоэффективным. На стадиях промоции и прогрессии происходит трансформация иммунитета, характеризующаяся полиморфизмом откликов со стороны его различных звеньев, а дисбаланс между ними сохраняется даже после достижения ремиссии [93, 171].

Сложный характер реакций, разнородность исследований и методических подходов являются причинами отсутствия до настоящего времени достоверного банка данных о патогенезе заболевания, его динамике, общих закономерностях и особенностей каждой формы 3JI, что является необходимым условием для разработки адекватных методов терапии опухолей, в том числе и вышеуказанных. Более того, как отмечают некоторые исследователи [174, 178], до сих пор не обоснованы наиболее информативные количественные показатели, характеризующие изменения иммунитета у онкологических пациентов, что не позволяет однозначно определить вклад нарушений иммунной системы в патогенез заболевания, осуществлять правильную диагностику и лечение.

В связи с указанными обстоятельствами проблема комплексной оценки иммунного статуса с помощью количественных критериев у больных с наиболее часто встречающимися в странах Европы видами ЗЛ является чрезвычайно актуальной.

Цель исследования - установить наиболее типичные нарушения иммунного статуса у больных некоторыми формами злокачественных лимфом и определить их диагностическую значимость.

Задачи исследования:

1. Выявить особенности иммунного статуса первичных больных фолликулярной лимфомой 1-2, 3 типов, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомой, хроническим В-клеточным лимфоцитарным лейкозом и лимфомой Ходжкина.

2. Провести сравнительные исследования субпопуляционного состава лимфоцитов крови первичных больных с фолликулярной лимфомой разных типов, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомой, хроническим В-клеточным лимфоцитарным лейкозом и лимфомой Ходжкина.

3. Выявить характерные изменения иммунного статуса больных лимфомой Ходжкина при наличии у них В-симптомов.

4. Изучить динамику изменений иммунного статуса больных лимфомой Ходжкина в разные сроки лечения и в период ремиссии.

Научная новизна:

Впервые с использованием проточной цитометрии и иммуноферментного анализа у больных фолликулярной лимфомой разных типов, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомой, хроническим В-клеточным лимфоцитарным лейкозом, лимфомой Ходжкина проведено комплексное иммунологическое исследование, в ходе которого- выявлены особенности иммунного статуса больных отдельными формами злокачественных лимфом.

Впервые изучено содержание Т-киллеров (CD3+CD16+56+), Т- и В-лимфоцитов, экспрессирующих молекулы активации CD25 и HLA-DR, компонентов системы комплемента, средне- и низкомолекулярных циркулирующих иммунных комплексов в крови больных лимфомой Ходжкина, что позволяет уточнить иммунопатогенез заболевания.

На основании сравнительного анализа комплекса иммунологических показателей обоснованы дополнительные критерии для дифференциальной диагностики фолликулярных лимфом 1-2 и 3 типов.

В результате мониторинга иммунного статуса больных лимфомой Ходжкина (до, во время лечения и в период ремиссии) впервые уточнены скорость и полнота восстановления показателей иммунного статуса пациентов после комбинированной полихимиотерапии. Практическая значимость работы:

На основе изученных показателей иммунного статуса разработаны и предложены для применения в клинической практике дополнительные иммунологические критерии по определению активности иммунопатологического процесса при фолликулярных лимфомах разных типов и их дифференциальной диагностике. Это должно способствовать выбору правильной стратегии лечения фолликулярных лимфом 1 -2 и 3 типов.

С учетом полученных данных, свидетельствующих о длительном-нарушении (даже в период ремиссии) показателей иммунного статуса больных I I лимфомой Ходжкина, рекомендовано проводить его оценку в процессе планового обследования; предусмотренного международным протоколом R4.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1". Нарушения иммунной системы, являющиеся важным звеном патогенеза злокачественных лимфом, характеризуются полиморфизмом, но при этом имеются как общие, так и патогномоничные для каждого вида лимфом признаки.

2. Для лимфом из зрелых В-клеток и лимфомы Ходжкина характерно снижение численности субпопуляций Т-лимфоцитов. Особенностью лимфомы Ходжкина является уменьшение количества В-клеток, увеличение содержания моноцитов, уровней иммуноглобулинов; основных классов^ ЦИК, компонентов комплемента и IFN-a в крови. Общими признаками диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы фолликулярных лимфом разных типов, хронического В-клеточного лимфоцитарного лейкоза являются увеличение числа В-лимфоцитов и CD25+-, HLA-DR+- лимфоцитов в крови.

3". Полихимиотерапия оказывает иммуносупрессивное влияние на количество и функциональные возможности субпопуляций Т- и В-лимфоцитов у больных лимфомой Ходжкина. Динамика восстановления составляющих иммунной системы в- период ремиссии различна: показатели гуморального звена иммунитета и факторы неспецифической резистентности достигают нормы значительно раньше, чем Т-клеточные.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на 5-й Всероссийской научно-практической конференции1 «Актуальные вопросы диагностики и лечения в многопрофильном лечебном учреждении» (Санкт-Петербург, 2001), на 5-й научной.конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2001» (Санкт-Петербург, 2001), на 2-й международной научнопрактической конференции «Болезнь Ходжкина» (Петрозаводск, 2001), на Российско-Голландской конференции «Диагностика и лечение лимфом» (Санкт-Петербург, 2002), на 6-й Всероссийской научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2002» (Санкт-Петербург, 2002), на 7-м Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003), на 8-м Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004), на Юбилейной научной конференции молодых ученых северо-западного региона, посвященной 60-летию Российской академии медицинских наук (Санкт-Петербург, 2004).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 177 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 247 источника (из них 59 отечественных и 188 иностранных авторов). Текст иллюстрирован 40 таблицами и 3 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. Иммунный статус больных злокачественными лимфомами характеризуется полиморфизмом показателей состояния иммунной системы. Для первичных больных с лимфомами из зрелых В-клеток и лимфомой Ходжкина характерно низкое относительное содержание CD3+-, CD3+CD4+-, СВЗ+СБ8+-лимфоцитов в крови, за исключением фолликулярной лимфомы 1-2 типа. Лимфомы из зрелых В-клеток характеризуются достоверно более высоким содержанием CD 19+-клеток, а также CD25+- и HLA-DR+-лимфоцитов по сравнению с лимфомой Ходжкина.

2. Компенсаторной реакцией на недостаточность Т-клеточного звена иммунитета у первичных больных диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомой является активация гуморального звена, системы NK и нейтрофилов, а также повышенные уровни IL-1 (3, IL-6, TNF-a в сыворотке крови.

3. В отличие от фолликулярной лимфомы 1-2 типа для 3 типа характерно более высокое содержание CD19+-, CD25+-лимфоцитов, моноцитов, IL-1 (3 в крови на фоне низкого числа СОЗ+С08+-клеток.

4. Ранние стадии хронического В-клеточного лимфоцитарного лейкоза характеризуются выраженным Т-клеточным иммунодефицитом на фоне нормального состояния гуморального звена иммунитета и функциональной активности нейтрофилов.

5. Для первичных больных лимфомой Ходжкина характерно наличие иммунодефицита смешанного типа, проявляющегося в изменении спектра показателей Т-клеточного (количественные и качественные изменения субпопуляций Т-клеток) и гуморального (пониженное содержание CD19+-лимфоцитов, поликлональная активация В-клеток) звеньев иммунитета, и факторов неспецифической резистентности; при наличии В-симптомов уменьшение количества Т-ЦТЛ и В-лимфоцитов в крови имеет более выраженный характер.

6. У больных лимфомой Ходжкина в ходе полихимиотерапии происходит временное усугубление имеющихся нарушений Т- и В-звеньев иммунитета. При этом показатели гуморального звена иммунитета и факторов неспецифической резистентности восстанавливаются в течение первого года после терапии, а признаки недостаточности Т-клеточного звена иммунитета сохраняются на протяжении двух лет.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Изменения ряда иммунологических показателей, исследованных в ходе выполнения работы, у первичных больных фолликулярными лимфомами могут служить дополнительными критериями для дифференцировки этой лимфомы на 3 и 1-2 типы: так более высокое содержание CD19+-, CD25+-лимфоцитов, моноцитов и IL-ip в крови на фоне более низкого количества CD3+CD8+-лимфоцитов характерны для фолликулярной лимфомы 3 типа.

2. Отличительными признаками лимфом из зрелых В-клеток от лимфомы Ходжкина являются: высокое относительное содержание CD19+-лимфоцитов, а также лимфоцитов, экспрессирующих маркеры активации CD25 и HLA-DR, в крови, что может служить дополнительными критериями для их дифференциальной диагностики.

3. Более низкое относительное содержание CD3+CD8+- и CD 19+-лимфоцитов в крови характерно для больных лимфомой Ходжкина с В-симптомами, в отличие от больных лимфомой Ходжкина без В-симптомов. Изменения этих иммунологических показателей могут служить косвенным показателем более неблагоприятного течения заболевания.

4. В связи с тем, что полихимиотерапия усугубляет имеющиеся нарушения иммунного статуса у больных лимфомой Ходжкина, а иммуносупрессия сохраняется длительное время, необходимо между курсами лечения и на протяжении нескольких лет после их окончания контролировать состояние иммунный системы, проводить профилактику инфекций вирусной и бактериальной этиологии.