Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Дифференциальная диагностика лимфопролиферативного синдрома у детей

На правах рукописи

Дмитриева Виктория Викторовна

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА ЛИМФОПРОЛИФЕРАТИВНОГО СИНДРОМА У ДЕТЕЙ

14.00.14 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ростов-на-Дону 2004

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В РОСТОВСКОМ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОМ ОНКОЛОГИЧЕСКОМ ИНСТИТУТЕ МЗиСР РФ

(директор института - академик РАМН Ю.С.Сидоренко)

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Т.И. Моисеенко

Научный консультант: доктор медицинских наук

Е.М. Непомнящая

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Ю.В. Пржедецкий

доктор медицинских наук, профессор И.И. Бабич

Ведущая организация: Ставропольская государственная

медицинская академия

Защита состоится 24.12. 2004 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.083.01 при Ростовском научно-исследовательском онкологическом институте МЗиСР РФ (344037, г. Ростов-на- Дону, ул. 14-линия, 63)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского научно-исследовательского института МЗиСР РФ.

Автореферат разослан 23.11. 2004 г.

/

Ученый секретарь Диссертационного совета, /

доктор медицинских наук, профессор Г.А. Неродо

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования Злокачественные лимфомы занимают третье место в структуре заболеваемости детского населения России злокачественными новообразованиями, составляя 18,8% у мальчиков и 12,7% у девочек (Аксель Е.М., Дурнов Л.А., Горбачева И.А., 2002). Среди злокачественных лимфом болезнь Ходжкина или лимфогранулематоз (ЛГМ) наблюдается в 35-40%, оставшаяся часть представлена неходжкинскими лимфомами (НХЛ).

В последние десятилетия отмечены значительные успехи в терапии лимфом, связанные с разработкой рациональных программ комплексного, хи-миолучевого и сопроводительного лечения. Так, по данным, американских исследователей 5-летняя выживаемость за период с 1976 по 1997 гг. увеличилась с 44% до 80% при НХЛ и с 78% до 92% при лимфоме Ходжкина (ЛХ) (Am. Cancer j for Clinicians, 2002). Аналогичные результаты лечения достигнуты в ведущих отечественных онкологических детских центрах (Гордина Г.А., 2001; Пунаиов Ю.А., 2002; Махонова Л.А. и соавт., 2004).

Очевидно, что успехи лечения и прогноз заболевания, прежде всего, зависят от раннего выявления и своевременно начатой терапии. Однако, несмотря на совершенствование методов диагностики, от 41% до 70% пациентов с лимфомой Ходжкина и от 54 до 80% больных детей с неходжкинскими лим-фомами поступают для первичного лечения с распространенными и генерализованными - III и IV стадиями заболевания (Беликова Л.Ю. и соавт., 1994; Дурнов Л.А. и соавт., 2001; Кочурова Н.В. и соавт., 2003; Пунанов Ю.А., 2003; Pizzo P. A., Poplak D.J., 2003).

Актуальность избранной темы исследования обусловлена многообразием нозологии, сопровождающихся лимфопролиферативным синдромом у де-

женностью врачей педиатров. Предлагаемые алгоритмы дифференциальной диагностики лимфаденопатий многокомпонентны, дорогостоящи и трудно выполнимы в условиях общей педиатрической сети (Беликова Л.Ю. и соавт., 1994). Последнее обстоятельство ведет к выбору широким кругом врачей наблюдательной тактики, назначению неадекватной, а следовательно неэффективной терапии.

Главным диагностическим критерием для проведения программной терапии злокачественных лимфом у детей является морфологическая верификация процесса с иммунофенотипированием. При этом необходимо подчеркнуть, что даже при достаточном количестве исследуемого биопсийного материала морфологический диагноз заболевания нередко затруднен (Вылков И.Н., 1980). Таким образом, биопсия лимфатического узла была и остается завершающим этапом дифференциальной диагностики злокачественных лимфом, специфических гранулематозных заболеваний лимфоузлов и неспецифических лимфаденопатий, но показания к ее своевременному выполнению не определены и устанавливаются или эмпирически или при развернутой клинической картине заболевания.

На основании вышеизложенного, нам представляется актуальным научное исследование по совершенствованию методов дифференциальной диагностики лимфопролиферативного синдрома у детей.

Цель работы: разработать критерии дифференциальной диагностики лимфаденопатий различного генеза у детей с учетом особенностей клинического течения.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. дать оценку клинического течения доброкачественных и злокачественных видов лимфаденопатий у детей.

2. исследовать показатели цитохимических реакций в клетках периферической крови при лимфаденопатиях различного генеза.

3. изучить эхосёмиотику лимфаденопатий с учетом цветового и энергетического картирования.

4. Провести сравнительный анализ биохимических маркеров, перекис-ного окисления липидов, состояния антиоксидантных и гидролитических систем в клетках периферической крови и ткани лимфоузлов у больных детей.

5. Исследовать иммунный статус детей с доброкачественными и злокачественными лимфаденопатиями.

6. Разработать дифференциально-диагностический алгоритм клинико-лабораторного обследования пациентов с лимфоиролиферативным синдромом.

Научная новизна работы

Впервые на основании сравнительного анализа ряда ультрасонографиче-ских, цитохимических и биохимических показателей разработан алгоритм дифференциальной диагностики лимфопролиферативного синдрома для раннего выявления злокачественных лимфом у детей.

Впервые исследованы дифференциально-диагностические критерии пе-рекисного окисления липидов и цитохимических реакций.

Впервые разработана карта комплексного применения УЗ-исследования, которая позволяет индивидуализировать схемы дальнейшей тактики ведения больных.

Практическая значимость работы

Разработан алгоритм дифференциальной диагностики доброкачественных лимфаденопатий и злокачественных лимфом на основании комплекса ультрасонографических, цитохимических, биохимических критериев, который позволяет:

1. сократить сроки обследования детей с лимфаденопатиями различного генеза;

2. определить показания к своевременному выполнению эксцизион-ной биопсии лимфоузлов в целях морфологической верификации диагноза;

3. обеспечить максимально раннюю диагностику злокачественных лимфопролиферативных заболеваний у детей.

Внедрение результатов исследования .

Результаты исследования внедрены в повседневную клиническую практику работы отделения детской онкологии Ростовского научно-исследовательского онкологического института.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Использование разработанного дифференциально-диагностического комплекса в качестве рабочего алгоритма позволяет своевременно определить показания к выполнению эксцизионной биопсии периферических лимфатических узлов.

2. Целесообразность применения УЗИ с цветовым энергетическим картированием, цитохимических и биохимических методов для дифференциальной диагностики периферических лимфаденопатий.

Апробация работы

Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета Ростовского научно-исследовательского онкологического института 21 октября 2004 года.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

Структура и объем диссертации I

Диссертация изложена на 206 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы» клинической характеристики материала и методов исследования, 4 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 162 отечественных и 139 зарубежных источников. Работа содержит 51 таблицу и 19 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

В основу клинического исследования положены наблюдения за 100 пациентами с лимфопролиферативным синдромом: 50 де>ей с доброкачественными лимфаденопатиями (дЛАП) и 50 больных со злокачественными лимфо-

мами (35 с лимфомой Ходжкина, 15 с неходжкинскими лимфомами), находившихся на лечении в отделении детской онколоши Ростовского научно-исследовательского онкологического инсштута с 2001 по 2004 гг. Контрольную группу составили 50 практически здоровых детей в возрасте от 3-х дб 17 лет.

В исследуемой группе с лимфомой Ходжкина мальчиков было 24 (69%), девочек - 11 (31 %), соотношение по полу - 2,1:1.

В группе с неходжкинскими лимфомами мальчиков было 11 (73%), девочек - 4 (27%), соотношение по полу - 2,8:1.

В группе с доброкачественными лимфаденопатиями мальчиков было 39 (78%), девочек- 11 (22%), соотношение по полу- 3,5:1 (рис.1).

ЛХ НХЛ дПАП

□ девочки ■ мальчики

Рис. 1. Распределение детей исследуемых групп по полу.

Средний возраст пациентов с лимфомой Ходжкина составил 13 лет, с неходжкинскими лимфомами — 7,5 лет, с доброкачественными лимфаденопа-тиями — 10,5 лет.

Средняя длительность клинических проявлений до установления диагноза при лимфоме Ходжкина составляет 8 месяцев, при неходжкинских лим-фомах — 3,2 месяца, при доброкачественных лимфаденопатиях — 2,5 месяца.

При первичном осмотре при лимфоме Ходжкина наиболее часто выявлено одностороннее поражение шейно-надключичных лимфатических узлов у 23 (66%) пациентов, при неходжкинских лимфомах - шейно-надключичных

лимфатических узлов с двух сторон у 9 (60%) больных, при доброкачественных лимфаденопатиях - шейных с одной стороны у 35 (70%) пациентов.

Таким образом, клиническая картина доброкачественных и злокачественных лимфаденопатий ранних стадий не имеет специфических, патогномо-ничных симптомов. По мере прогрессирования злокачественных лимфом в клинической картине превалировало сочетание развернутого лимфопролифе-ративного синдрома с симптомами общей интоксикации.

Для стадирования лимфомы Ходжкина использовалась Ann Arbon -классификация (1971): I стадия диагностирована у 4 (11%) больных, II стадия у 15 (43%), III стадия - у 9 (26%), IV стадия - 7 (20%) больных (рис.2 а).

Для стадирования неходжкинских лимфом использовалась классификация S. Murphy (1980): II стадия диагностирована у 4 (27%) больных, III стадия - у 11 (73%) больных, пациентов с I и IV стадиями в исследовании не было (рис.2 б).

Всем детям проведен единый комплекс диагностических мероприятий: ультразвуковое исследование лимфатических узлов, цитохимическое и биохимическое исследование крови, выполнена иммунограмма.

Ультразвуковое исследование периферических лимфатических узлов проводилось на аппаратах: «HDI 1500», «HDI 4000» (USA), «Logic 400 MD» (USA), «Megas» (ItaL), датчиками: конвексным 3,5-5 МГц и линейным 7-12

МГц с использованием следующих режимов сканирования: стандартного (В-режим), доплерографии (цветное картирование - ЦДК и энергетическое кодирование - ЭДК) и доплерометрии. В В-режиме оценивали: размеры, форму, капсулу, окружающие ткани, ворота лимфатического узла, контуры. Доплеро-графические признаки позволили оценить качественные характеристики вас-куляризации: количество сосудистых локусов, тип кровоснабжения (центральный, периферический, смешанный), интенсивность картограммы, тип кровотока. Доплерометрические признаки позволили оценить количественные характеристики васкуляризации: V max (максимальную скорость), Vmin (минимальную скорость) кровотока и индекс периферического сосудистого сопротивления (RI). Вычисления индекса резистентности проводилось по формуле (Гуч А. А., Дынник О. Б. и соавт., 2000):

В качестве объекта цитохимического исследования использован лей-коконцентрат, в клетках которого: в нейтрофилах, лимфоцитах и моноцитах изучен ряд химических веществ: гликоген, кислая фосфатаза, фосфолипиды, неспецифическая эстераза. Получение лейкоконцентрата проводили по методу Р.А. Поспеловой (1967).

Определение гликогена осуществляли ШИК (PAS) — реакцией по методу McManus(1961).

Механизм реакции основан на окислении йодной кислотой гликолевых групп или их амино- или алкиланамино- производных до альдегидой. Альдегидные группировки при взаимодействии с реактивом Шиффа образуют продукт красного цвета.

Цитохимическое исследование активности кислой фосфатазы (КФ) проводили методом двойного азосочетания по М. Берстону (1965) в модификации Ю.Ф. Руденса (1969) и И.М. Буйкиса (1969).

В основе принципа реакции лежит метод Кеплоу, заключающийся в расщеплении кислой фосфатазой альфа-нафтол- AS- фосфата с освобождением альфа-нафтола, образующий с солями диазония нерастворимый, окрашенный в

коричневый цвет осадок в местах локализации фермента (Kaplow L., 1955; Astaldi G., 1957).

Фосфолипиды определялись с помощью окраски Суданом черным Б -метод Гольдмана (Роскин Г.И., Левинсон Л.Б., 1957).

Принцип реакции основан на применении липофильных красителей, растворяющихся и избирательно концентрирующихся во внутриклеточных липидах (Sheehan., Storey., 1974).

Неспецифическую эстеразу определяли методом Лёффлера (Loffler H., Klin. Wschr., 1961).

Принцип реакции: альфа-нафтилацетат под воздействием неспецифической эстеразы гидролизуется с образованием свободного нафтола, который с солями диазония образует красное или буро-коричневое окрашивание, нерастворимое в воде.

Оценка результатов цитохимических реакций осуществляли следующим образом:

I степень реакции - наличие в цитоплазме небольшого окрашенного участка, составляющего примерно 'А часть всей цитоплазмы (низкая степень интенсивности реакции);

II степень реакции - исследуемое вещество заполняет 8/10 цитоплазмы (нормальная степень интенсивности реакции);

III степень реакции - интенсивно окрашенные зёрна заполняют всю цитоплазму полностью, не оставляя в ней неокрашенных участков, иногда покрывая и ядро (высокая или максимальная степень интенсивности реакции).

Материалом биохимического исследования служили плазма, лимфоциты, нейтрофилы, эритроциты и ткань лимфатических узлов больных лимфомой Ходжкина, неходжкинскими лимфомами, доброкачественными лимфаденитами до лечения. Забор крови производили из локтевой вены в утреннее время натощак. Её собирали в стеклянные пробирки, содержащие раствор гепарина (1000ЕД/мл) из расчета 0,05мл раствора на 1мл крови. Ткань лимфатических узлов получали при помощи эксцизионной биопсии.

Применялись Следующие биохимические методы: определение активности каталазы (Королюк М.А. и соавт., 1988), определение суммарной перокси-дазной активности (Покровский А.А., 1969) в модификации В.В. Внукова (1979), определение активности суиероксиддисмутазы по восстановлению тет-разолиевого нитросинего в системе аэробного окисления ксантина ксантинок-сидазой (Beauchamp, Fridovich, 1971), одновременное флуорометрическое определение концентрации витаминов А и Е в сыворотке крови (Черняускене Р.Ч. и соавт., 1984), определение гемоглобинолитической активности катепсина Д (Оглоблина О.Г. и соавт., 1981), определение общей антитриптической активности (АТА) и активности кислотостабильных ингибиторов протеиназ (КСИ) (Веремеенко К.Н. и соавт., 1988).

Оксидазную активность церулоплазмина (ЦП) определяли по В.Г. Колбу, B.C. Камышникову (1982), активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) кинетическим методом с использованием стандартного набора реагентов «Ольвекс-Диагностикум».

Для оценки состояния Т- и В-лимфоцитов проводили их выделение из периферической крови по A.Boyum (1968) в градиенте фиккол-верографина (плотность 1,077-1,078) с последующим трехкратным осаждением средой 199. Жизнеспособность лимфоцитов оценивали по проценту неокрашенных клеток после добавления к взвеси 0,2% раствора трипанового синего. Количество погибших клеток не превышало 2-3%.

Состояние Т-клеток изучали в ряде количественных и функциональных тестов. Общее содержание Т-лимфоцитов в крови определяли в реакции спонтанного розеткообразования (РСРО) с эритроцитами барана (Jondal M. et al., 1972), отдельно подсчитывали процент лимфоцитов, образующих «активные» (многорецепторные) розетки. Субпопуляционный состав оценивали иммуноф-люоресцентным методом с использованием моноклональных антител против рецепторов CD4 и CD8 (Фримель X., 1987; Хаитов P.M. и соавт., 1995). Учет проводили с помощью люминесцентного микроскопа путем подсчета процента клеток с мембранной флюоресценцией.

Функциональную активность Т-лимфоцитов оценивали в реакции бла-стной трансформации лимфоцитов (РБТЛ) с добавлением Т-митогенов (ФГА в дозе 5 мкг/мл и КонА в дозе 10 мкг/мл) (Новиков Д.К., Новикова В.И., 1979). Параллельно оценивали спонтанную бласттрансформацию, для чего вместо митогена в пробу добавляли равный объем культуральной среды.

Состояние В-клеточного звена иммунной системы определяли по содержанию В-лимфоцитов в крови в РСРО с эритроцитами мыши (Хаитов P.M. и соавт., 1995). Функциональную активность В-клеток изучали в РБТЛ с ЛПС, аналогом которого является пирогенал, в дозе 50 ЕД/мл при тех же условиях, что и РБТЛ с Т-клеточными митогенами.

Состояние NK-клеточного звена оценивали по содержанию в крови больших гранулярных лимфоцитов - БГЛ (Киндзельский Л.П., Бутенко А.К., 1983). Кроме того, определяли количество лимфоцитов, экспрессирующих CD 16+ рецепторы, в непрямом иммунофлюоресцентном тесте; результаты выражали в процентах от общего числа лимфоцитов.

Для статистической обработки клинических и лабораторных данных проводили с помощью критерия Стьюдента-Вилкоксона-Манна-Уитни (Гублер Е.В. и соавт., 1978). Различия считались статистически достоверными при вероятности безошибочного прогноза

Результаты исследования

В нашем исследовании была разработана карта ультрасонографической диагностики периферических лимфатических узлов, в которой учитывались следующие параметры: локализация лимфатических узлов, количество, размеры, форма, выраженность капсулы, ворота лимфоузла, контуры, эхоструктура лимфоузла, эхогенность, гиперэхогениые включения, доплерографические признаки, состояние окружающих тканей.

Обследовано 50 первичных детей с доброкачественными лимфаденопа тиями и 45 больных со злокачественными лимфомами.

На основании проведенного УЗ-исследования лимфатических узлов были получены разные характеристики доброкачественных и злокачественных процессов.

Ультразвуковая картина неспецифического лимфаденита характеризуется увеличением размеров, овальной формой, не выраженностью капсулы, утолщением ворот лимфоузлов, четкостью и ровностью контуров, а также неоднородностью эхоструктуры, наличием гаперэхогенных включений и пониженной эхоген-ностью, кровоснабжение лимфатического узла не регистрируется.

Ультразвуковая картина злокачественного поражения лимфатических узлов характеризуется увеличением размеров лимфатического узла, неправильной формой, утолщением капсулы, количество - множественные, часто сливающиеся в конгломерат, уплотнением окружающих тканей, ворота лимфатического узла не определяются, бугристыми контурами, однородностью эхоструктуры, пониженной эхогенностью, отсутствием гаперэхогенных включений.

В схеме ультрасонографического исследования периферических лимфоузлов нами использовано определение доплерографических и доплерометри-ческих параметров. Доплерографическое исследование проводили в режиме цветового и энергетического доплеровского картирования. Доплерометриче-ские признаки позволили оценить: максимальную и минимальную скорость кровотока и индекс периферического сосудистого сопротивления.

На основании доплерометрических данных выявлены высокие показатели индекса резистентности при доброкачественных лимфаденопатиях -0,76±0,08), а при злокачественных процессах отмечены низкие цифры индекса резистентности - 0,54±0,06 при ЛХ, 0,59±0,03 при НХЛ) (рис. За), точность метода составляет 91%, чувствительность - 92%, специфичность - 90%.

В лимфатических узлах с доброкачественной патологией кровоток регистрируется редко, у 11 (22%) пациентов, при злокачественных лимфомах кровоток регистрируется часто, у 21 (66 %) больного с лимфомой Ходжкина и у 9 (69%) больных с неходжкинскими лимфомами (рис 36).

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 О

0,8-1 0 76

ш

0 54

а)

дЛАП

ЛХ

НХЛ

б) дЛАП ЛХ НХЛ

* - статистически достоверные отличия от показателей детей с дЛАП (р<0,05)

Рис 3 (а, б) Доплерометрические УЗ-признаки (а - индекс резистентности, б - частота регистрации кровотока)

Таким образом можно сделать заключение, что точность и специфич-географии, а также большой плацдарм лимфатической системы, доступной визуализации, позволяет рекомендовать УЗИ как скрининг-тест при первичном обследовании больных с лимфопролиферативными заболеваниями.

Исследование цитохимических показателей, было проведено 40 пациентам с доброкачественными лимфаденопатиями и 35 больным со злокачественными лимфомами.

При оценке данных о характере цитохимических реакций на кислую фосфатазу нами выявлено, что при обнаружении положительной реакции на фермент в более чем 40 % клеток в каждой из трёх исследуемых клеточных линий (нейтрофилах, лимфоцитах, моноцитах), свидетельствует о доброкачественном характере заболевания. На наш взгляд, усиление интенсивности реакции на кислую фосфатазу обусловлено активацией лизосомального аппарата клеток и свидетельствует об отсутствии серьезных нарушений, что не свойственно злокачественному процессу.

Отсутствие реакции на кислую фосфатазу в нейтрофилах и моноцитах и высокой ферментативной активности в лимфоцитах может свидетельствовать о злокачественной природе заболевания и, в частности, о неходжкинской лимфоме

Полученные нами сведения о цитохимической реакции на судан показали, что повышение концентрации липидов в нейтрофилах при полном их отсутствии в лимфоцитах и моноцитах, свидетельствует о доброкачественном характере заболевания. Однако, при обнаружении даже слабо положительной реакции в лимфоцитах и значительном, более чем в 4 раза, снижении концентрации липидов в нейтрофилах рекомендуется продолжить дифференциальную диагностику между НХЛ и ЛХ. Учитывая отсутствие суданофилии в лимфоцитах у здоровых людей и наличие у больных со злокачественным процессом, можно предположить, что суданофилия цитоплазмы свойственна клеткам ростка кроветворения, вовлеченного в патологический процесс. Наши данные подтверждают это и свидетельствуют об изменении метаболизма клеток крови у больных злокачественными лимфомами. Вместе с тем, выявленная тенденция к снижению содержания фосфолипидов в нейтрофилах может быть обусловлена нарушением структуры клеточных мембран и клеточных органелл, что не противоречит общепринятому мнению, согласно которому процессы малигнизации сопровождаются качественными изменениями структуры и проницаемости клеточных мембран.

Анализ данных цитохимических реакций на гликоген показал, что резкое снижение концентрации гликогена в нейтрофилах, выраженное повышение - в лимфоцитах и полное отсутствие - в моноцитах свидетельствует в пользу НХЛ. Вместе с тем, различия в выраженности реакции на гликоген в нейтрофильных лейкоцитах и лимфоцитах, а именно: более чем в 5 раз повышение содержания углевода в нейтрофилах и 4-х кратное снижение - в лим-фоидных элементах может, в свою очередь, служить критерием, позволяющим дифференцировать НХЛ от ЛХ. Наличие большого числа клеток с положительной реакцией на гликоген, а также высокое содержание гликогена в самих клетках можег являться, на наш взгляд, следствием специфической активации метаболической активности клеток и пролиферативных процессов. Таким образом, избыточное содержание гликогена в клетках служит признаком злокачественности.

Результаты цитохимических реакций на неспецифическую эстеразу позволяю! заключить, что при полном отсу1ствии реакции на фермент в лимфо-

цитах и значительном (в 4,1 раза) снижении ферментативной активности в моноцитах можно предположить наличие у больною НХЛ. Напротив, увеличение активности фермента в лимфоцитах более, чем в 2,5 раза, а также повышение таковой в моноцитах, характерные для больных ЛХ, может помочь, наряду с другими данными и, в частности, с результатами исследования гликогена, в дифференциальной диагностике между НХЛ и ЛХ.

На основании анализа всей совокупности полученных при цитохимическом исследовании данных мы пришли к выводу о наиболее целесообразном использовании в дифференциально-диагностических целях следующих критериев: определение активности кислой фосфатазы, гликогена и фосфолипидов в лимфоцитах лейкоконцентрата.

Таким образом, включенные в скрининг цитохимические исследования расширяют возможности дифференциальной диагностики лимфопролифера-тивных заболеваний, при этом они достаточно доступны, легко выполняемы и являются щадящими по отношению к ребенку.

Определенный интерес представляло изучение динамики содержания церулоплазмина (ЦП) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) при злокачественных лимфомах и доброкачественных лимфаденопатиях. С этой целью в исследование включены 90 детей с лимфопролиферативным синдромом.

Результаты показали, что у 82% пациентов с доброкачественными ЛАП активность ЛДГ была в пределах нормы, в то время как при ЛХ и НХЛ этот показатель был выше в 90% и 86% наблюдений соответственно (рис. 4).

Проведенный анализ позволяет утверждать, что повышение уровня активности ЛДГ в сыворотке крови свидетельствует о злокачественной природе лимфаденопатий.

Исследование активности церулоплазмина показало достоверное повышение его уровней у 80% больных ЛХ, у 67% больных НХЛ и у 55% пациентов с доброкачественными ЛАП (рис. 5) Морфологическое исследование лимфоузлов у детей с доброкачественными ЛАП и повышенной активностью церулоплазмина выявило изменения, характерные для воспаления бактериального генеза.

Анализ полученных результатов позволяет рекомендовать использование определения активности лактатдегидрогеназы и церулоплазмина в сыворотке крови для дифференциальной диагностики лимфопролиферативного синдрома у детей, достоверное повышение (более 300 МЕ/л) активности лак-татдегидрогеназы, а тем более в сочетании с повышением активности церуло-плазмина (выше 1 мкМ/л), считать показанием для выполнения биопсии периферических лимфатических узлов

* - статистически достоверные' отчичия от показателей детей с дЛАП (р<0 05)

Рис 5 Результаты биохимического определения церулопланиина у детей с различными видами лимфаденопатии

При исследовании гидролитической активности плазмы крови, определено, что у больных ЛХ и НХЛ активность катепсина Д была в 3,3 и 5,9 раза соответс1венно выше, чем в крови детей с доброкачественными лимфа-денопатиями.

Коэффициенты катепсинД/антитриптическая активность и катепсин Д/кислотостабильные ингибиторы при ЛХ были в 3,6 и 3,9 раза соответственно выше, чем аналогичные показатели при дЛАП, при НХЛ эти же коэффици-ентыбыли выше в 7,6 и 6,7 раз соответственно.

Таким образом, плазма крови больных детей со злокачественными лим-фомами характеризуется повышенным уровнем активности катепсина Д и дисбалансом в системе протеиназа - ингибитор.

Аналогичные данные были получены при исследовании гидролитической активности гомогенатов ткани лимфоузлов.

Изучение состояния антиокислительной системы проведено в плазме крови при лимфаденопатиях различного генеза. Определено, что содержание витаминов А и Е у больных ЛХ было снижено в 3,6 и 2,7 раза соответственно, а при НХЛ - в 3,9 и 5,9 раза относительно показателей в плазме крови детей с дЛАП.

Найдено практически одинаковое падение активности каталазы - в среднем на 16%. Суммарная пероксидазная активность (СПА) у детей с ЛХ и НХЛ была повышена на 59% и 86% соответственно.

Состояние антиокислительных систем в ткани лимфоузлов со злокачественными лимфомами в целом соответствовало аналогичному в плазме.

Таким образом, изучение активности гидролитической системы и свободно-радикальных процессов в плазме больных со злокачественными и доброкачественными лимфопролиферативными процессами выявило ряд параметров, прежде всего, концентрации катепсина Д и суммарной пероксидазной активности, которые необходимо использовать в качестве дифференциально-диагностического теста в спорных клинических наблюдениях на этапе, предшествующем проведению эксцизионной биопсии лимфоузлов.

Кроме того, нами проведен сравнительный анализ показателей клеточного и гуморального иммунитета у больных с различными видами лим-фаденопатий.

У всех пациентов различных возрастных групп был вычислен средний показатель.

Выявлено, что в группе детей с доброкачественными лимфаденопатия-ми: снижено содержание Т-общих лимфоцитов, Т-«активных» лимфоцитов, также снижена функциональная активность в РБТЛ с ЛПС и уровень больших гранулярных лимфоцитов (БГЛ).

В группе детей со злокачественными лимфомами: снижено содержание Т-общих лимфоцитов, Т-«активных» лимфоцитов, CD 4+, CD 8+, также снижена функциональная активность в реакции бластной трансформации лимфоцитов с ФГА и с ЛПС и уровень больших гранулярных лимфоцитов.

Следует отметить, что статистически значимых отличий между группой злокачественных лимфом и доброкачественными лимфаденопатиями не наблюдалось.

Таким образом, проведенные нами иммунологические исследования позволяют сделать вывод о том, что изменение большинства показателей на ранних стадиях лимфопролиферативного синдрома у детей не имеют достоверной значимости в дифференциальной диагностике злокачественных и доброкачественных лимфаденопатий.

На основании вышеприведенных данных нами разработан трехэтапный алгоритм дифференциальной диагностики лимфопролиферативного синдрома у детей (рис. 6).

На первом этапе необходимо собрать анамнез, провести клинический осмотр больного и выполнить общий анализ крови.

При выявлении множественных, мелких лимфатических узлов -генерализованной микролимфаденопатии, чаще всего свидетельствующей о первичной тубинфицированности, необходимо направить больного к фтизиатру.

Рис. 6. Алгоритм дифференциальной диагностики лимфопролиферативного синдрома у детей.

V

л. " ^

Продолжение рис. 6.

III этап

Пункция лимфатического узла

Цитохимическое исследование лимфоцитов; биохимическое исследование ЛДГ, ЦП, СПА, катепсин Д

Гной (+) Гной (-)

1 г

Г \

Гнойный лимфаденит

(разрез, вскрытие,

дренирование гнойника)

Гликоген 20+0,4 и ниже общ. активность; кислая фосфатаза 20+0,2 и ниже;

фосфолипиды реакция отрицательная; ЛДГ 120-

240 МЕ/л; ЦП менее 1мкМ/л; СПА 2+0,2 ед. и ниже; катепсин Д 30+2,8 нМ/мг белка и ниже

Гликоген 30+0,4 и выше общ.. активность; кислая фосфатаза 40+0,44 и выше; фосфолипиды 20+0,3 и выше; ЛДГ больше 260 МЕ/л; ЦП более 1мкМ/л; СПА 4+0,4 ед. и выше; катепсин Д 160+1,1 нМ/мг белка

Дообследование с целью установления этиологического фактора, э^иотропная терапия

Неотложная эксцизионная биопсия лимфатического узла

Если при осмотре больного выявлено увеличение одной группы лимфатических узлов, необходимо перейти ко второму этапу обследования и провести ультразвуковое исследование лимфатических узлов

После проведения ультразвукового исследования лимфатических узлов нами выделены три основных варианта УЗИ - изображения:

1) одиночный лимфатический узел, размером более 2 см, неоднородной эхоструктуры, пониженной эхогенности, ворота лимфатического узла не определяются, уплотнение капсулы и окружающих тканей, регистрируется периферический кровоток; *

2) единичные или множественные лимфатические узлы, размерами более 1 см, неоднородной эхоструктуры, пониженной эхогенности с четкими, ровными контурами, овальной формы, кровоток регистрируется редко;

3) множественные лимфоузлы, размером более 2 см, нередко с образованием конгломератов, однородной эхоструктуры с бугристыми контурами и интранодулярным кровотоком.

При первом варианте ультразвуковой картины лимфатических узлов необходима тонкоигольная пункция лимфатического узла. При наличии гноя -вскрытие и дренирование гнойника. При отсутствии гнойного содержимого в пунктате переходим к третьему этапу диагностики, также как и при втором варианте УЗ-картины: нами рекомендуется выполнить цитохимическое и биохимическое исследование крови больного по следующим параметрам: цитохимическое исследование гликогена, кислой фосфатазы, фосфолипидов в лимфоцитах лейкоконцентрата и биохимическое исследование лактатдегидрогена-зы, церулоплазмина, суммарной пероксидазной активности и катепсина Д в плазме крови больных.

При третьем варианте ультразвуковой картины лимфатических узлов нами сразу ставятся показания к выполнению эксцизионной биопсии лимфоузла с целью верификации патологического процесса, так как именно такая УЗ-картинй наиболее характерна, практически патогномонична для злокачественного поражения лимфатических узлов.

Если при цитохимическом исследовании лейкоконцентрата в лимфоцитах крови общая активность гликогена составляет 20±0,4 Ед и ниже, кислой фосфатазы 20±0,2 Ед и ниже, реакция на фосфолипиды отрицательная, биохимическое исследование в плазме крови выявило лактатдегидрогеназа 120-240 МЕ/л, церулоплазмин менее 1 мкМ/л, суммарная пероксидазная активность 2±0,2 ед и ниже, катепсин Д 30±2,8 нМ/мг белка и ниже диагностируется доброкачественный характер заболевания, что диктует необходимость дообследования больного с целью установления этиологического фактора и назначения этиотропной терапии.

Если при цитохимическом исследовании лейкоконцентрата в лимфоцитах крови общая активность гликогена составляет 30±0,4 Ед и выше, кислой фосфатазы 40±0,44 Ед и выше, фосфолипидов 20±0,3 Ед и выше, биохимическое исследование в плазме крови выявило лактатдегидрогеназа больше 260 МЕ/л, церулоплазмин более 1 мкМ/л, суммарная пероксидазная активность 4±0,4 ед и выше, катепсин Д 160±1,1 нМ/мг белка и выше необходима неотложная эксцизионная биопсия лимфатического узла в целях морфологической верификации патологического процесса.

Таким образом, предложенный алгоритм дифференциальной диагностики лимфопролиферативного синдрома позволит сократить сроки обследования детей с лимфаденопатиями различного генеза, определить показания к своевременному выполнению эксцизионной биопсии лимфатических узлов в целях морфологической верификации диагноза, обеспечит раннюю диагностику злокачественных лимфом у детей.

ВЫВОДЫ

1. Анализ клинических наблюдений лимфопролиферативного синдрома у детей на ранних стадиях показал отсутствие патогномоничных симптомов. Средние сроки установления диагноза от момента первых проявлений заболевания составили: при неходжкинских лимфомах 3 месяца и 8 месяцев при болезни Ходжкина.

2. Ультразвуковое исследование с использованием цветового допле-ровскою картирования является высокоинформативным методом дифференциальной диагностики лимфопролиферативного синдрома у детей. Обнаружение интранодулярного кровотока с низким индексом периферического сопротивления (с диапазоном 0,54-0,59) является патогномоничным УЗ- симптомом злокачественных лимфаденопатий. Точность метода - 91%, чувствительность - 92%, специфичность - 90%.

3. Уровни гликогена выше 30 Ед, фосфолипидов выше 20 Ед и кислой фосфатазы выше 40 Ед, определяемые при цитохимическом исследовании лимфоцитов, являются дифференциально-диагностическими признаками злокачественного лимфопролиферативного синдрома у детей.

4. Биохимическое исследование плазмы крови больных злокачественными лимфомами выявили повышение суммарной пероксидазной активности в 2 раза и активности катепсина Д в 5,5 раз по сравнению с их уровнем у пациентов с доброкачественными лимфаденопатиями.

5. Достоверное повышение активности лактатдегидрогеназы более 300 МЕ/л в сочетании с повышением активности церулоплазмина более 1 мкМ/л в плазме крови является характерным для злокачественного лимфопро-лиферативного синдрома у детей.

6. Исследование 'иммунного статуса детей показало отсутствие достоверно значимых иммунологических критериев для дифференциальной диагностики лимфопролиферативного синдрома.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные результаты позволяют рекомендовать применение ультразвукового исследования периферических лимфатических узлов, цитохимического исследования лейкоконцентрата и биохимического исследования плазмы крови для ранней дифференциальной диагностики злокачественных и доброкачественных лимфаденопатий у детей.

2. Предложенный алгоритм рекомендуется использовать для проведения дифференциальной диагностики различных видов лимфаденопатий в практической работе врачей-онкологов, гематологов, педиатров.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Биохимические критерии в дифференциальной диагностике периферических лимфаденопатий у подростков // Проблемы гематологии и переливания крови. Москва, 2003. №2. С.38 (соавт. Лазутин Ю.Н., Нестерова Ю.А., Старжецкая М.В., Козель Ю.Ю., Иваненко Е.С.).

2. Дифференциально-диагностическая значимость определения лактатде-гидрогеназы и церулоплазмина у детей с лимфаденопатиями // V конгресс с международным участием «Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении». Египет, 2003. №4. С. 98 (соавт. Горошинская И.А., Лазутин Ю.Н., Нестерова Ю.А., Старжецкая МБ., Козель Ю.Ю.).

3. Способ дифференциальной диагностики лимфаденопатий // 57-ая итоговая научная конференция молодых ученых. Ростов-на-Дону, 2003. С.79-80 (соавт. Шалашная Е.В., Козель Ю.Ю., Лысенко Е.Б.).

4. Биохимические критерии в дифференциальной диагностике периферических лимфаденопатий у детей // В сб. материалов IV Всерос. конф. молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной онкологии». Москва, 2003. С. 47-48 (соавт. Нестерова Ю.А., Старжецкая М.В., Козель Ю.Ю., Иваненко Е.С., Шалашная Е.В.).

5. К вопросу о дифференциальной диагностике доброкачественных и злокачественных лимфаденопатий у детей // Материалы III съезда онкологов и радиологов стран СНГ. Минск, 2004. С. 389 (соавт. Лазутин Ю.Н., Нестерова Ю.А., Старжецкая М.В., Козель Ю.Ю., Сугак Е.Ю.).

6. Диагностика и лечение лимфомы Ходжкина у подростков // Тезисы III съезда детских онкологов России. Москва, 2004. Электронная версия (соавт. Лазутин Ю.Н., Лысенко И.Б., Нестерова Ю.А., Старжецкая М.В., Козель Ю.Ю., Джабаров Ф.Р.).

7. Ультрасонографическая картина лимфатических узлов у детей с лимфо-пролиферативным синдромом // 58-я итоговая научная конференция молодых ученых. Ростов-на-Дону, 2004. С.85 (соавт. Нестерова Ю.А., Алексеев К.Э.).

8. Significance of detection of Catepsin D and its inhibitor for the differential diagnostic of lymphadenopathy in childrens // Die Materialien der wissenschaftlichen Konferenz in Rahmen des 21 wissenschaftlichen-praktischen Seminares «Die aktuellen Probleme der Kinderhamatoonkologie» Mainz/Frankfurt am Main,'2004. P.8-11 (Lazutin Y. N., Lisenko I.B., Franci-anc E. M.).

ЛР №04779 от 18.05.01. В набор П Я-01 В печать20.11.04 Объем 1,0 усл.п.л., О, "уч.-изд.л. Офсет. Бумага тип №3. Формат 60x84/16. Заказ № УЯКТираж 100

Издательский центр ДГТУ

Адрес университета и полиграфического предприятия: 344010, г.Ростов-на-Дону, пл.ГагаринаД.

Злокачественные лимфомы занимают третье место в структуре заболеваемости детского населения России злокачественными новообразованиями, составляя 18,8% у мальчиков и 12,7% у девочек (Аксель Е.М., Дурнов JI.A., Горбачева И.А., 2002). Среди злокачественных лимфом болезнь Ходжкина или лимфогранулематоз (ЛГМ) наблюдается в 35-40%, оставшаяся часть представлена неходжкинскими лимфомами (HXJ1).

В последние десятилетия отмечены значительные успехи в терапии лимфом, связанные с разработкой рациональных программ комплексного, химиолучевого и сопроводительного лечения. Так, по данным, американских исследователей 5-летняя выживаемость за период с 1976 по 1997 гг. увеличилась с 44% до 80% при HXJI и с 78% до 92% при ЛГМ (Am. Cancer j for Clinicians, 2002). Аналогичные результаты лечения достигнуты в ведущих отечественных онкологических детских центрах (Гершанович М.Л., 2002; Демина Е.А., 2002).

Очевидно, что успехи лечения и прогноз заболевания, прежде всего, зависят от раннего выявления и своевременно начатой терапии. Однако, несмотря, на совершенствование методов диагностики от 41% до 70% пациентов с ЛГМ, и от 54 до 80% больных детей с НХЛ поступают для первичного лечения с распространенными и генерализованными - III и IV стадиями заболевания (Беликова ЛЛО. и соавт., 1994; Дурнов Л.А. и соавт., 2002 и др.).

Актуальность избранной темы исследования обусловлена многообразием нозологий,- сопровождающихся лимфопролиферативным синдромом у детей, сложностью дифференциальной диагностики доброкачественных и злокачественных лимфаденопатий ранних стадий, низкой онкологической настороженностью врачей педиатров. Предлагаемые алгоритмы дифференциальной диагностики лимфаденопатий многокомпонентны, дорогостоящи и трудно выполнимы в условиях общей педиатрической • сети (Беликова ЛЛО. и соавт., 1994). Последнее обстоятельство ведет к выбору широким кругом врачей наблюдательной тактики, назначению неадекватной, а следовательно неэффективной терапии.

Главным диагностическим критерием для проведения программной терапии злокачественных лимфом у детей является морфологическая верификация процесса с иммунофенотипированием. При этом, необходимо подчеркнуть, что даже при достаточном количестве исследуемого биопсийного материала морфологический диагноз заболевания нередко затруднен (Вылков И.Н., 1980). Таким образом, биопсия лимфатического узла была и остается завершающим этапом дифференциальной диагностики злокачественных лимфом, специфических гранулематозных заболеваний лимфоузлов и неспецифических лимфаденопатий, но показания к ее своевременному выполнению не определены и устанавливаются или эмпирически, или при развернутой клинической картине заболевания.

На основании вышеизложенного, нам представляется актуальным научное исследование по совершенствованию методов дифференциальной диагностики лимфопролиферативного синдрома у детей.

Цель работы: разработать критерии дифференциальной диагностики лимфаденопатий различного генеза у детей с учетом особенностей клинического течения.

Задачи исследовании:

1. Дать оценку клинического течения доброкачественных и злокачественных видов лимфаденопатий у детей.

2. Исследовать показатели цитохимических реакций в клетках периферической крови при лимфаденопатиях различного генеза.

3. Изучить эхосемиотику лимфаденопатий с учетом цветового и энергетического картирования.

4. Провести сравнительный анализ биохимических маркеров, перекисного окисления липидов, состояния антиоксидантных и гидролитических систем в клетках периферической крови и ткани лимфоузлов у больных детей.

5. Исследовать иммунологический статус детей с доброкачественными и злокачественными лимфаденопатиями.

6. Разработать дифференциально-диагностический алгоритм клинико-лабораторного обследования пациентов с лимфопролиферативным синдромом.

Новизна исследования

В диссертационной работе впервые: • на основании сравнительного анализа ряда ультрасонографических, цитохимических и биохимических показателей разработан алгоритм дифференциальной диагностики лимфопролиферативного синдрома для раннего выявления злокачественных лимфом у детей;

• исследованы дифференциально-диагностические критерии перекисного окисления липидов и цитохимических реакций;

• разработана карта комплексного применения УЗИ, которая позволяет индивидуализировать схемы дальнейшей тактики ведения больных. Практическая значимость работы

Разработан алгоритм дифференциальной диагностики доброкачественных лимфаденопатий и злокачественных лимфом на основании комплекса ультрасонографических, цитохимических, биохимических критериев, который позволяет: сократить сроки обследования детей с лимфаденопатиями различного генеза; определить показания к своевременному выполнению эксцизионной биопсии лимфоузлов в целях морфологической верификации диагноза; обеспечить максимально раннюю диагностику злокачественных лимфопролиферативных заболеваний у детей.

Внсдрсппе результатов исследования в практику здравоохранения

Результаты исследования внедрены в повседневную клиническую практику работы отделения детской онкологии Ростовского научно-исследовательского онкологического института. Основные положения, выносимые па защиту

1. Использование разработанного дифференциально-диагностического комплекса в качестве рабочего алгоритма позволяет своевременно определить показания к выполнению эксцизионной биопсии периферических лимфатическихузлов.

2. Целесообразность применения УЗИ с цветовым энергетическим картированием, цитохимических и биохимических методов для дифференциальной диагностики периферических лимфаденопатий. Апробация

Диссертация ^пробирована на заседании Ученого Совета Ростовского научно-исследовательского онкологического института 21 октября 2004 года. Публикации

Материалы диссертации опубликованы в 8 научных работах. Объем н структура диссертации

Диссертация написана на 206 страницах, состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов и списка литературы, используемой при изучении материала. В диссертационной работе имеется 19 рисунков и 52 таблицы.

180 Выводы

1. Анализ клинических наблюдений лимфопролиферативного синдрома у детей на ранних стадиях показал отсутствие патогномоничных симптомов. Средние сроки установления диагноза от момента первых проявлений заболевания составили: при неходжкинских лимфомах 3 месяца и 8 месяцев при болезни Ходжкина.

2. Ультразвуковое исследование с использованием цветового доплеровского картирования является высокоинформативным методом дифференциальной диагностики лимфопролиферативного синдрома у детей. Обнаружение интранодулярного кровотока с низким индексом периферического сопротивления (с диапозоном 0,54-0,59) является патогномоничным УЗ-симптомом злокачественных лимфаденопатий. Точность метода - 91%, чувствительность - 92%, специфичность — 90%.

3. Уровни гликогена выше 30 Ед, фосфолипидов выше 20 Ед и кислой фосфатазы выше 40 Ед, определяемые при цитохимическом исследовании лимфоцитов, являются дифференциально-диагностическими признаками злокачественного лимфопролиферативного синдрома у детей.

4. Биохимическое исследование плазмы крови больных злокачественными лимфомами выявили повышение суммарной пероксидазной активности в 2 раза и активности катепсина Д в 5,5 раз по сравнению с их уровнем у пациентов с доброкачественными лимфаденопатиями.

5. Достоверное повышение активности лактатдегидрогеназы более 300 МЕ/л в сочетании с повышением активности церулоплазмина более 1 мкМ/л в плазме крови является характерным для злокачественного лимфопролиферативного синдрома у детей.

6. Исследование иммунного статуса детей показало отсутствие достоверно значимых иммунологических критериев для дифференциальной диагностики лимфопролиферативного синдрома.

Практические рекомендации

1. Предложено для ранней дифференциальной диагностики злокачественных и доброкачественных лимфаденопатий использовать ультразвуковое исследование периферических лимфатических узлов, цитохимическое исследование лейкоконцентрата и биохимическое исследование плазмы крови.

2. Предложенный алгоритм рекомендуется использовать для проведения дифференциальной диагностики различных видов лимфаденопатий в практической работе врачей-онкологов, гематологов, педиатров.