Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Иммунные механизмы компенсации гипергомоцистеинемии (клинико-экспериментальное исследование)

На правах рукописи

Изместьев Сергей Валерьевич

ИММУННЫЕ МЕХАНИЗМЫ КОМПЕНСАЦИИ

ГИПЕРГОМОЦИСТЕ1ШЕМИИ (Клиннко-экспериментальное исследование)

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

005539991

г 0 моя 2013

Чита-2013

005539991

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Читинская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель

доктор медицинских наук, профессор Цыбиков Намжил Нанзатович Официальные оппоненты:

Ефремов Анатолий Васильевич, доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, Заслуженный деятель науки РФ, ГБОУ ВПО "Новосибирский государственный медицинский университет", заведующий кафедрой патологической физиологии и клинической патофизиологии

Семинский Игорь Жанович, доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО "Иркутский государственный медицинский университет", заведующий кафедрой патологии с курсом клинической иммунологии и аллергологии

Ведущая организация: ГБОУ ВПО "Алтайский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Барнаул

Защита состоится 2013 г. в 9.00 на заседании

диссертационного совета Д 208.118.01 при ГБОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения России, 672090, г.Чита, ул. Горького, 39 а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автореферат разослан Н-ШраЬ? 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 208.118.01 ^ 0

д.м.н., профессор и! И.Н. Гаймоленко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Согласно современным представлениям, одним из независимых факторов риска атеросклероза и тромбоза коронарных, церебральных и других сосудов является повышение уровня в плазме крови гомоцисте-ина, который инициирует повреждение эндотелиальных клеток и тем самым запускает процесс образования атеросклеротической бляшки, активирует систему гемокоагуляции, тромбоцитарнкй гемостаз (Шмелева В.М., 2010; Цыбиков H.H., 2007; Смирнова O.A., 2008).

Метаболизм гомоцистеина протекает преимущественно в печени и почках двумя основными путями: реметилирование с образованием метионина (при участии ферментов: метионинсинтетазы и метилентет-рагидрофолатредуктазы) и транссульфирование с превращением в цис-теин (фермент - цистатионин-р-синтетаза). В основе гипергомоцисте-инемии лежит наследственная или приобретенная недостаточная активность ферментов, осуществляющих его метаболизм.

В последнее время появились сведения о том, что действие гомоцистеина не ограничивается повреждением эндотелия с запуском ате-ротромбоза. Описана способность этого аминотиола связываться с особой группой глутаматных рецепторов (NMDA-рецепторов), имеющихся на мембранах нейронов, кардиомиоцитов, лейкоцитов, эритроцитов, мегакариоцитов и других клеток (Арзуманян Е.С., 2008; Машкина А.П., 2010; Болдырев A.A., 2012; Gill S., 2007), при этом развиваются окислительный стресс, повреждение и гибель клетки.

В настоящее время актуален вопрос об эффективном и своевременном выявлении гипергомоцистеинемии, которую делят на явную и скрытую (Selbum J., 1992). Приблизительно у 50% обследуемых лиц с нормальным уровнем гомоцистеина натощак существуют скрытые нарушения его метаболизма. Для диагностики скрытой гипергомоцистеинемии используют нагрузочный метиониновый тест (Гуржий A.A., 2008). Данная проба предполагает многократный забор венозной крови в течение суток: до, через 4, 6, 24 часа после,перорального приема метионина. В связи с этим представляются актуальными исследования для создания неинвазивной технологии проведения метионинового теста с исследованием уровня гомоцистеина в ротовой жидкости.

В циркуляции гомоцистеин присутствует в свободной форме, в виде дисульфидов, но большая его часть образует связь с белками, особенно, с альбумином (Блашко Э.Л., 2007). Суммарное количество этих форм составляет общий гомоцистеин. Конъюгаты с белками плазмы крови

образует и гомоцистеин-тиолактон. Комплексы альбумина с гомоцис-теином и альбумина с гомоцистеин-тиолактоном обладают аутоанти-генными свойствами и вызывают образование аутоантител (Jakubowski

H., 2005; Undas А. 2007). Сформированные иммунные комплексы могут явиться как фактором повреждения эндотелия, так и дополнительным механизмом элиминации гомоцистеина. Данный вопрос в доступной нам литературе до настоящего времени освещен не достаточно.

Целью исследования явилось изучение иммунных механизмов элиминации гомоцистеина при гипергомоцистеинемических состояниях.

В связи со сказанным решались следующие задачи:

I. Получить конъюгат сывороточного альбумина человека и крысы с гомоцистеином и гомоцистеин-тиолактоном (модифицированный альбумин).

2. Определить уровень гомоцистеина и аутоантител к альбумину, модифицированному гомоцистеином и гомоцистеин-тиолактоном у интакт-ных крыс и животных с экспериментальным иммунодефицитом.

3. Изучить морфологические изменения миокарда и количественные показатели гемограммы у крыс на фоне гипергомоцистеинемии. Оценить экспрессию тканевого фактора у животных при высокой концентрации гомоцистеина.

4. Определить содержание гомоцистеина и аутоантител к модифицированному альбумину в сыворотке крови и смешанной слюне у здоровых лиц и больных сердечно-сосудистой патологией.

5. Изучить уровень циркулирующих иммунных комплексов у экспериментальных животных и человека.

6. Исследовать динамику концентрации гомоцистеина в сыворотке крови и ротовой жидкости при проведении метионинового нагрузочного теста.

Научная новизна

Получен комплекс сывороточного альбумина крысы и человека с гомоцистеином и гомоцистеин-тиолактоном в условиях in vitro.

Впервые установлено, что у животных при введении в организм экзогенного гомоцистеина и гомоцистеин-тиолактона уровень общего гомоцистеина плазмы крови остается на исходном уровне на фоне резкого повышения титра аутоантител к модифицированному альбумину. При моделировании гуморального иммунодефицита у крыс выявлено резкое увеличение как исходного уровня общего гомоцистеина в плазме крови, так и после введения в организм экзогенного гомоцистеина и гомоцис-теин-тиолактона.

Впервые выполнен анализ уровня гомоцистеина в ротовой жидкости пациентов при проведении метионинового нагрузочного теста, что позволяет избежать многократного инвазивного вмешательства, связанного с забором крови.

Теоретическая ценность работы

Описанный механизм элиминации гомоцистеина при повышении его уровня в организме путем развития гуморального иммунного ответа с образованием аутоантител к белкам, модифицированным гомоцистеи-ном и гомоцистеин-тиолактоном, расширяет представления о регуля-торной роли иммунной системы.

Внедрение результатов работы

Теоретические положения, раскрываемые в диссертации, внедрены в учебный процесс кафедр патологической физиологии, нормальной физиологии ГБОУ ВПО "Читинская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения РФ.

Положения, выносимые на защиту

1. Иммунная система способна регулировать уровень общего гомоцистеина в плазме крови в пределах физиологических значений путем образования аутоантител против комплекса гомоцистеина с сывороточным альбумином.

2. При физиологических значениях уровня гомоцистеина и гипергомо-цистеинемии происходит сенсибилизация к модифицированным гомо-цистеином белкам, образованные антитела класса S-IgA поступают в секреты, в том числе, в ротовую жидкость, что обеспечивает быструю элиминацию гомоцистеина и может быть зарегистрировано при проведении нагрузочного метионинового теста.

3. Гомоцистеин оказывает токсическое действие на клетки и структуры организма, несущие на поверхности NMDA-рецепторы, через активацию последних и усиление экспрессии тканевого фактора в эндо-телиоцитах, но не в фибробластах и нейтрофилах.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых "Сибирский медико-биологический конгресс" г. Барнаул, 2011 г.; III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Вопросы патогенеза типовых патологических процессов" г. Новосибирск, 2011 г.; IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Вопросы патогенеза типовых патологических процессов" г. Новосибирск, 2012 г.; Научно-практической конференции "I

Съезд терапевтов Забайкальского края" г. Чита, 2013 г.; V Международной научно-практической конференции "Экология. Здоровье. Спорт" г. Чита, 2013 г.; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 60-летию ЧГМА "Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины" г. Чита, 2013 г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 3 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, включает введение, 4 главы: "Обзор литературы", "Материалы и методы", ' Результаты собственных исследований", "Обсуждение полученных результатов", выводы, список литературы. Диссертация содержит 18 таблиц и 9 рисунков. Список литературы включает 50 отечественных и 114 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе с обследуемыми людьми соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинской Декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Médical Association Déclaration of Helsinki 1964,2000 ред.). Экспериментальные исследования проводились в соответствии с требованиями "Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются в исследовательских и других научных целях" (Strasburg, 1986).

На первом этапе работы получали модифицированный крысиный и человеческий альбумин: гомоцистеин в концентрации 150 мкмоль/л ("Fluco", Германия) инкубировали с 5% раствором сывороточного альбумина в течение 24 ч при 4°С и 1 ч при 37°С. Полученную смесь центрифугировали (15 мин при 14000 g) с ультрафильтрацией при помощи микрофильтров AmiconUltra с порогом разделения 50 кДа(Millipore, USA) с целью отделить свободный гомоцистеин от образовавшего связь с белком, после чего методом ВЭЖХ определяли концентрацию гомо-цистеина в образцах до, после фильтрации и в фильтрате. Полученный белок использовали в качестве тест-системы для определения аутоан-тител.

Экспериментальная часть работы

Изучение аутоантител к комплексу крысиного альбумина с гомоцистеином, гомоцистеина, циркулирующих иммунных комплексов

В эксперименте использовано 40 беспородных крыс-самцов, средней массой 150 г. У 20 животных вызывали иммунодефицит, 20 составили контрольную группу. Модель иммунодефицита получали путем внутрибрюшинного введения раствора циклофосфана (ООО "ЛЭНС-фарм") в дозе 100 мг/м2 3 раза в неделю в течение 2 недель. Расчет площади поверхности тела животных производили по формуле: S (см2) = K3Vm2 (г), где К - коэффициент, равный для крысы - 9,13-11,05. Наличие иммунодефицита подтверждали иммунограммой методом проточной цитофлюориметрии. После контрольного забора крови 10 животным из каждой группы вводили гомоцистеин в дозе 100 мкмоль на 1 мл ОЦК, другим 10 крысам из каждой группы - гомоцистеия-тиолактон в той же концентрации (расчет ОЦК крысы осуществляли в соответствии с соотношением 6 мл/100 г). Через 6 ч кровь забирали вновь, затем ежедневно в течение 9 суток вводили указанные аминотиолы, после чего осуществляли последний забор крови.

Аутоантитела к комплексу альбумина с гомоцистеином в сыворотке крови иммунодефектных и интактных крыс определяли методом реакции пассивной гемагглютинации (РПГА). Сыворотку делили на 2 части: к одной части добавляли раствор цистеина для определения IgG (согласно методическим рекомендациям по постановке РПГА с цисте-иновой пробой); в другой части (без цистеина) определяли все классы иммуноглобулинов.

Трижды отмытый физиологическим раствором осадок эритроцитов фиксировали глутаровым альдегидом 30 мин при 0°С при периодическом перемешивании. Фиксированные эритроциты отмывали 5 раз 0,15 М NaCl и 5 раз дистиллированной водой. К отмытому осадку фиксированных эритроцитов добавляли полученный комплекс альбумина с гомоцистеином. Смесь инкубировали 1 ч при комнатной температуре. После трехкратной отмывки эритроциты, сенсибилизированные комплексом крысиного альбумина с гомоцистеином, использовали для проведения РПГА, в качестве контроля - эритроциты, сенсибилизированные нативным крысиным альбумином и несенсибилизированные эритроциты.

Уровень гомоцистеина в сыворотке крови крыс оценивали с помощью ВЭЖХ по методу Дутова A.A. (2010 г.). Концентрацию ЦИК в сыворотке крови крыс определяли методом преципитации с раствора-

ми полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) в концентрации 3,5%, 7% и 10% с последующей спектрофотометрической детекцией плотности раствора. Иммунный статус у экспериментальных животных определяли методом проточной цитофлюориметрии с использованием моноклональных антител CD3-FITC, CD4-PC7, CD8-APC, CD45RA-PC7, CD161a-APC (Beckman Coulter, USA).

Изучение морфологических изменений миокарда, периферической крови, экспрессии тканевого фактора крыс на фоне ги-пергомоцистеинемии

Эксперимент поставлен на 40 беспородных крысах, которых разделили на 4 группы по 10 животных. Крысам 1 и 2 групп вводили физиологический раствор, а животным 3 и 4 групп - гомоцистеин в концентрации 0,001 мг на 1 мл ОЦК. С целью сопоставить динамику изменений животных 1 и 3 групп вывели из эксперимента на седьмые сутки, а крыс 2 и 4 групп - на четырнадцатые.

Микроскопию миокарда крыс осуществляли с окрашиванием препаратов гематоксилин-эозином и по Ван Г'изону с оценкой морфологических изменений в 10 полях зрения. Общий анализ крови экспериментальных животных выполнен с помощью автоматического анализатора PENTRA 120 Retic. Оценка экспрессии тканевого фактора в миокарде крыс проведена иммуногистохимическим методом с использованием моноклональных антител TF9-10H10 (Santa Cruz biotechnology, USA). Результат оценивали как отрицательный, если окрашенных клеток определялось менее 10%; в остальных случаях положительный результат оценивался по шкале от 1 до 4 баллов (1 балл - 10-25% окрашенных клеток; 2 балла - 25-50%; 3 балла - 50-75%; 4 балла - более 75%). Подсчет клеток осуществляли в 10 полях зрения.

Клинические исследования

Обследовано 77 лиц (средний возраст 61,2±9,7 лет), находившихся на лечении в отделении кардиологии НУЗ "Дорожная клиническая больница на станции Чита-2 ОАО "РЖД", с диагнозами: гипертоническая болезнь I стадии, 1-2 степени, риск 2 (10 человек); гипертоническая болезнь II стадии, 2-3 степени, риск 3 (33 человек); ИБС: стабильная стенокардия III ФК, НК II А, III ФК (12 человек); ИБС: прогрессирующая стенокардия, НК II А, III ФК (12 человек); ИБС: Q-инфаркт миокарда, острая стадия (10 человек). Контрольную группу составили 22 человека без выявленной сердечно-сосудистой патологии, сопоставимые по полу и возрасту. Материалом исследования явились сыворотка крови и ротовая жидкость.

Аутоантитела к комплексу альбумина с гомоцистеином в сыворотке крови и ротовой жидкости человека определяли методом ИФА с использованием анти-^О-антител для образцов сыворотки крови и анти-S-IgA-антител для образцов ротовой жидкости ("Вектор-бест", Новосибирск). Уровень гомоцистеина в сыворотке крови и ротовой жидкости человека оценивали с помощью ВЭЖХ по методу Дутова A.A. (2010 г.). Концентрацию ЦИК в сыворотке крови и ротовой жидкости определяли методом преципитации с раствором полиэтиленгликоля со спект-рофотометрической детекцией плотности раствора.

Метиониновый нагрузочный тест проведен с оценкой уровня гомоцистеина в сыворотке крови и ротовой жидкости до и через 4 часа после перорального приема таблетированного метионина в дозе 100 мг/кг.

Статистическая обработка

Полученные данные обработаны с помощью программы STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc., USA). Статистическую значимость различий в группах оценивали с помощью критерия Манна-Уитни для сравнения двух независимых переменных и Уилкоксона для двух зависимых переменных. Корреляционный анализ проведен по методу Спирмена. Значимыми считали различия при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Результаты экспериментального исследования Получение комплекса альбумина с гомоцистеином

При инкубации гомоцистеина с раствором сывороточного альбумина получен следующий результат: содержание гомоцистеина в образце до фильтрации составило 189,3 нг/мкл, после фильтрации и десорбции с фильтра - 74,3 нг/мкл, в фильтрате - 120 нг/мкл. Таким образом, 40% гомоцистеина комплексировалось с альбумином в условиях in vitro. В условиях in vivo, как известно из литературных источников, около 70% гомоцистеина в плазме крови образует связь с альбумином (Блашко Э.Л., 2007).

Титр аутоантитсл и уровень гомоцистеина у интактных крыс

Как видно из табл. 1 у интактных крыс до нагрузки гомоцистеином и гомоцистен-тиолактоном обнаруживаются аутоантитела IgG и других классов к комплексу альбумина с гомоцистеином. Через 6 ч после введения аминотиолов титр аутоантител возрастает. Спустя 9 суток титр аутоантител выше исходного у крыс, получавших гомоцистеин.

Таблица 1

Титр аутоантител к комплексу альбумина с гомоцистеином у интактных крыс (Ме (25-й; 75-й))

До нагрузки Через 6 ч после введения После 9 дней введения

гомоцистеина гомоцистеин-тиолакгсна гомоцистеина гомоцистеин-тиолактона

ДО Все классы Ч № Все классы Ч № Все классы ч № Все классы ч № Все классы ч

130 (0; 1:30) 1Й0 (1:15; 1:60) 1:480* (1:480; 1:480) 1:720* (1:480; 1560) 1:480* (1:480; 1:480) 1960* (1960; I .-960) 1:480* (1:480; 1960) 1960* (1:480; 1960) 0 (0; 0) 1:480 (1:60; 1960)

Примечание: *р<0,05 в сравнении с уровнем до нагрузки.

Наличие аутоантител к альбумину, модифицированному гомоцистеином, у интактных крыс до введения им экзогенного тиола говорит о том, что этот комплекс вызывает иммунизацию при физиологических концентрациях гомоцистеина. Сформировавшийся гуморальный иммунный ответ сопровождается сохранением В-клеток памяти, которые при последующей антигенной стимуляции обеспечивают вторичный иммунный ответ. Этим можно объяснить возрастание титра аутоантител у интактных крыс через 6 ч после поступления в организм экзогенного гомоцистеина и гомоцистеин-тиолактона.

Через 6 ч после инъекции гомоцистеина и гомоцистеин-тиолактона и после девятидневного их введения уровень эндогенного гомоцистеина у интактных крыс не отличался от значений, зарегистрированных при заборе крови до нагрузки экзогенными тиолами (табл. 2).

Таблица 2

Уровень гомоцистеина в сыворотке крови интактных крыс (мкмоль/л) (Ме (25-й; 75-й))

До нагрузки Через 6 ч после введения После 9 дней введения

гомоцистеина гомоцистеи 11-ти олакгоиа гомоцистеина гомоцистеин-тиолактона

3,81 (3,03; 4,38) 2,92 (2,02; 2,99) 3,90 (3,57; 4,54) 4,24 (3,74; 5,52) 4,48 (3,73; 5,25)

Ожидаемого увеличения уровня общего гомоцистеина в сыворотке крови после введения экзогенных тиолов не происходит, это может быть связано с повышением титра аутоантител к комплексу сывороточного

альбумина с гомоцистеином, что свидетельствует об их регуляторной функции, направленной на поддержание концентрации гомоцистеина в пределах физиологических значений.

Уровень аутоантител и гомоцистеина у крыс с ИДС У животных, получавших циклофосфан, в сравнении с показателями интактных крыс, отмечалось снижение абсолютного количества В-лим-фоцитов на 30%; увеличение процентного содержания Т-лимфоцитов на 34%; уменьшение соотношения Т-хелперы/Т-киллеры в 5 раз со снижением Т-хелперов на 39% и увеличением количества Т-киллеров на 42%.

Титр аутоантител к комплексу альбумина с гомоцистеином у крыс с ИДС до введения экзогенных тиолов сопоставим с данными у интактных животных (табл. 3). Спустя 6 ч после введения как гомоцистеина, так и тиолактона содержание иммуноглобулинов значимо ниже по сравнению с интактными крысами, у которых на этом сроке эксперимента наблюдается подъем титра аутоантител. После девятидневного введения гомоцистеина и гомоцистеин-тиолактона содержание аутоантител также значимо меньше, чем у интактных крыс на том же сроке эксперимента.

Таблица 3

Титр аутоантител к комплексу альбумина с гомоцистеином

у крыс с ИДС (Ме (25-й; 75-й))

До нагрузки Через 6 ч после введения После 9 дней введения

гомоцистеина гомоцистеин-тиолактона гомоцистеина гомоцистеин-тиолактона

№ Все классы & № Все классы ч Все классы 1ё № Все классы ч № Все классы к

0 (0;0) 1:30 (1:30; 1:60) 1:30* (130; 1:30) 1:60* (1:60; 1:60) 130* (1:30; 130) 1:60* (1:60; 1:60) 1:15* (0; 130) 130* (0; 1:60) 0 (0; 1:30) 1:60* (0; 1:60)

Примечание: *р<0,05 в сравнении с показателями у интактных крыс.

У крыс с ИДС уровень общего гомоцистеина в сыворотке крови почти в 2 раза выше, чем у интактных крыс при заборе крови до введения экзогенного гомоцистеина (табл. 4).

Изначально высокая концентрация этого вещества у животных с ИДС может подтверждать регуляторную роль иммунной системы. Значимо большее содержание общего гомоцистеина в сыворотке крови крыс с ИДС по сравнению с уровнем у интактных сохраняется на всех сроках эксперимента. Через 6 ч после введения гомоцистеина наблюда-

лось повышение его уровня в сыворотке крови в сравнении с уровнем до инъекции, чего не отмечалось у животных с интактной иммунной системой. После 9 дней введения тиолов концентрация гомоцистеина у крыс с НДС возвращалась к исходному значению (до нагрузки), что, возможно, объясняется работой известных механизмов элиминации гомоцистеина (реметилирование и транссульфирование).

Таблица 4

Уровень гомоцистеина в сыворотке крови крыс с НДС (мкмоль/л) (Ме (25-й; 75-й))

До нагрузки Через 6 ч после введения После 9 дней введения

шмоцнетеина гомоцистеин-тиолактона гомоцистеина гомоцистеин-тиолактона

7,18* (6,61; 7,59) 9,38 *д (7,65; 12,1) 6,20* (4,92; 10,2) 7,50* (6,05; 9,29) 8,67* (6,73; 9,50)

Примечание: *р<0,05 в сравнении с показателями группы контроля; р<0,05 в сравнении с уровнем до нагрузки.

Уровень циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови крыс

Наиболее значимые различия между группами зарегистрированы при определении ЦИК низкой молекулярной массы (табл. 5)

Таблица 5

Уровень ЦИК у экспериментальных крыс (ед. оп. пл. СЮ450) (Ме (25-й; 75-й))

Группа До нагрузки Через 6 ч после введения После 9 дней введения

гомоцистеина гомоцистеин-тиолактона гомоцистеина гомоцистеин-тиолактона

Интакгные крысы 0,338 (0,178; 0,629) 0,184 (0,05; 0,328) 0,093 (0,025; 0,347) 0,792 (0,581; 1,041) 0,535 (0,005; 0,781)

Крысы с ИДС 0,142 (0,007; 0,775) 0,627* (0,303; 1,133) 0,765* (0,647; 0,978) 0,168* (0,128; 0,24) 0,154 (0,028; 0,275)

Примечание: *р<0,05 в сравнении с показателями контрольной группы

Возрастание количества ЦИК после введения экзогенных гомоцистеина и гомоцистеин-тиолактона у крыс с ИДС, возможно, указывает на связывание последних аутоантителами к модифицированному аль-

бумину. Тот факт, что у интактных животных увеличения уровня ЦИК не происходит, объясняется, по-видимому, более быстрой элиминацией иммунных комплексов из кровотока путем фагоцитоза, который нарушен у животных, получавших цитостатик.

Изменения в морфологии миокарда и периферической крови у животных на фоне гипергомоцистеинемин Содержание гомоцистеина в сыворотке крови животных с экспериментальной гипергомоцистеинемией (третья группа) составило 4,46 (3,9; 4,81) мкмоль/л (Ме (25-й; 75-й)), что не отличалось от концентрации в контроле. У крыс четвертой группы - 14,6 (10,5; 16,2) мкмоль/л (Ме (25-й; 75-й)), что значимо выше по сравнению с уровнем у крыс, получавших физиологический раствор.

При изучении гистологического строения миокарда в обеих группах крыс, получавших гомоцистеин, зафиксировано уменьшение диаметра кардиомиоцитов, снижение числа одноядерных клеток с соответствующим изменением соотношения одноядерных к многоядерным кардиомиоцитам (табл. 6).

Таблица 6

Морфометрические показатели миокарда левого желудочка крыс

(Ме (25-й; 75-й))

Показатель 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа

Диаметр кардиомиоцитов (мкм) 12,2 (11,5; 13,0) 12,7 (12,0; 14,0) 9,75* (9,0; 10,5) 8,5* (7,0; 10,0)

Количество клеток (%)

одноэдерных 16,5 (15,0; 18,0) 17,0 (16,0; 18,5) 12,2* (12,0; 13,0) 9,5* (8,0; 11,0)

двух- и многоддерных 83,5 (82,0; 85,0) 83,0 (81,5; 84,0) 88,0* (87,0; 88,5) 90,5* (89,0; 92,0)

соотношение одноядерных к многоядерным 0,2 (0,18; 0,22) 0,2 (0,19; 0,23) 0,14* (0,14; 0,15) 0,1* (0,09; 0,12)

Примечание: *р<0,05 в сравнении с показателями контрольной группы.

Гистоморфологически миокард экспериментальных животных характеризовался межклеточным отеком, белковой дистрофией основной массы кардиомиоцитов наряду с неравномерной диффузно-очаговой гипертрофией части мышечных волокон и диффузным перимускуляр-ным кардиосклерозом. Причем дистрофические и склеротические про-

цессы в миокарде четвертой группы животных были выражены резче, чем в тканях животных третьей группы. Так же в ряде случаев, на четырнадцатые сутки, в строме были отмечены формирование диффузных лимфогистиоцитарных инфильтратов с примесью плазматических клеток, фибриноидное набухание периваскулярной стромы и признаки васкулитов и капилляритов.

Структура молекулы гомоцистеина и продукта его аутоокисления -гомоцистеиновой кислоты имеет сходство с N-метил-О-аспартатом (NMDA). Описано наличие в кардиомиоцитах NMDA-рецепторов (Gill S., 2007). Исходя из этого, в основе токсического эффекта гомоцистеина на миокард лежит способность самого гомоцистеина и гомоцистеиновой кислоты активировать NMDA-рецепторы, создавая в клетках повышенный уровень ионов кальция и активных форм кислорода, что приводит к повреждению и гибели клеток. Окислительный стресс считается основным механизмом патогенного действия гомоцистеина. В нашей работе мы получили подтверждение этого: количество кардиомиоцитов уменьшалось, в тканях миокарда появлялись признаки воспаления, репаративные процессы снижались, развилась рабочая гипертрофия кардиомиоцитов.

При исследовании периферической крови отличия с данными ин-тактных животных обнаружены у крыс четвертой группы (т.е. с гипер-гомоцистеинемией). Изменения заключаются в трехкратном снижении числа тромбоцитов, снижении количества эритроцитов и уровня гемоглобина, уменьшении относительного числа лимфоцитов и эозинофилов, повышении количества моноцитов и нейтрофилов (табл. 7).

Таблица 7

Показатели периферической крови крыс (Ме (25-й; 75-й))

Показатель 2 группа 4 группа

Гемоглобин (г/л) 149 (144; 156) 138* (136; 140)

Эритроциты (хЮ12/л) 7,8(7,7; 8,1) 6,99* (6,5; 7,1)

Тромбоциты (х 109/л) 718 (627; 760) 238* (200; 248)

Леймэциты (х 10'/л) 7,45(5,15; 9,75) 6,45 (4,4; 8,7)

Лимфоциты (%) 69,7 (66; 74,1) 54,4* (43; 60,1)

Моноциты (%) 5,4 (4,2; 6,6) 12,1* (11,6; 16,7)

Нейтрофилы (%) 18,9 (16,9; 21,2) 27,3* (25,6; 29,8)

Эозинофилы (%) 7,4(6,65; 8,15) 1,65* (0,3; 2,2)

Базофилы (%) 1 (0,95; 1,05) 1,2 (0,9; 2,3)

Примечание: *р<0,05 в сравнении с показателями интактных крыс.

Выявленные нами сдвиги в количественных показателях периферической крови согласуются с литературными данными, из которых известно, что при инкубации эритроцитов с гомоцистеиновой кислотой усиливается их гемолиз, вызываемый различными факторами (Арзуманян Е.С., 2008). На мембране эритроцитов обнаружен белок, реагирующий с антителами к NMDA-рецепторам. Этот протеин вызывает поступление кальция в эритроциты после их инкубации с №метил-0-аспартатом (Болдырев A.A., 2009). Сказанное позволяет предположить, что данный белок является молекулярной мишенью токсического действия гомоцистеина, так как большая часть несвязанного с белками гомоцистеина в плазме крови подвергается окислению с образованием гомоцистеиновой кислоты.

NMDA-рецепторы имеются на мегакариоцитах (Болдырев A.A., 2009), исходя из этого можно предположить токсическое действие гомоцистеина на предшественники тромбоцитов в костном мозге.

Зарегистрированная лимфоцитопения также может объясняться действием гомоцистеина на NMDA-рецепторы лимфоцитов (Владычен-ская Е.А., 2006; Машкина А.П., 2010), что вызывает вход ионов кальция в клетку с последующей индукцией апоптоза, а также рост содержания активных форм кислорода в цитоплазме и гибель клеток.

Таким образом, в этой серии экспериментов получено подтверждение токсичного влияния гомоцистеина на кардиомиоциты, эритроциты, тромбоциты и лимфоциты, связанное с воздействием тиола на NMDA-рецепторы, экспрессируемые этими клетками.

Экспрессия тканевого фактора у экспериментальных животных У интактных крыс (первой группы) средний балл экспрессии тканевого фактора эндотелиоцитами соответствует 1 (10 - 25% окрашенных клеток), в то время как у животных с гипергомоцистеинемией (четвертой группы) - 2 баллам (25 - 50% окрашенных клеток). Интенсивность экспрессии тканевого фактора фибробластами у крыс обеих групп одинакова и соответствует 1 баллу. При оценке окрашивания нейтрофилов и фиброцитов в обеих группах получен отрицательный результат (менее 10% окрашенных клеток).

Результаты исследования больных сердечно-сосудистой патологией Гомоцистеин и аутоантитела к модифицированному альбумину По результатам проведенного ИФА следует отметить наличие ауто-антител к комплексу сывороточного альбумина человека с гомоцистеи-ном в сыворотке крови и ротовой жидкости здоровых лиц, что указывает

на сенсибилизацию организма к данному антигену в физиологических условиях (табл. 8). Известно, что сывороточный альбумин человека содержится в смешанной слюне в количестве 0,05 - 0,3 г/л (ДапЮпеп Р., 2000) и также комплексируется с гомоцистеином, приобретая иммуногенные свойства. Уровень аутоантител к комплексу альбумина с гомоцистеином в сыворотке крови максимален у больных стабильной и прогрессирующей стенокардией. В то же время у таких больных отмечается минимальный уровень аутоантител в ротовой жидкости в сравнении с содержанием в группе контроля. У пациентов с острым инфарктом миокарда уровень аутоантител в сыворотке крови не отличался от значения контрольной группы (табл. 8), несмотря на высокую концентрацию гсмоцис-теина у этих больных (табл. 9), что можно объяснить наличием вторичного иммунодефицитного состояния на фоне данной патологии.

Таблица 8

Содержание аутоантител к комплексу гомоцистеин-альбумин (ед. оп. пл.) (Ме (25-й; 75-й))

Группа в сыворотке крови в ротовой жидкости

Контрольная группа (п=12) 0,026 (0,010; 0,038) 0,014 (0,010; 0,057)

Стабильная стенокардия (п=12) 0,075* (0,000; 0,076) 0,010 (0,000; 0,057)

Прогрессирующая стенокардия (п=12) 0,066* (0,039; 0,111) 0,012* (0,001; 0,020)

Острый инфаркт миокарда (п=10) 0,043 (0,026; 0,049) 0,023* (0,007; 0,038)

Примечание: *р<0,05 в сравнении с показателями контрольной группы.

В сыворотке крови лиц контрольной группы и страдающих гипертонической болезнью уровень гомоцистеина находился в пределах нормы (табл. 9). У больных стабильной стенокардией концентрация гомоцистеина также не выходила за пределы верхней границы нормы (15 мкмоль/ л), однако регистрировалось повышение этого показателя по сравнению с данными здоровых лиц. У пациентов с прогрессирующей стенокардией и острым инфарктом миокарда, как в момент поступления в стационар, так и по прошествии 7 суток лечения уровень гомоцистеина в сыворотке крови можно было расценивать как умеренную гипергомо-цистеинемию. В ротовой жидкости, в связи с большим размахом значений концентрации гомоцистеина, значимых отличий среди показателей исследованных групп не выявлено.

Таблица 9

Содержание гомоцистеина (мкмоль/л) (Ме (25-й; 75-й)).

Группа Сыворотка крови Ротовая жидкость

Контрольная 1руппа (п=12) 5,99 (5,08; 7,88) 0,23 (0,08; 0,28)

Гипертоническая болезнь I - П ст. (п=22) 8,11 (7,08; 10,82) 0,23 (0,15; 0,51)

Стабильная стенокардия (п=12) 10,21* (9,06; 12,01) 0,37 (0,2; 0,45)

Прогрессируюиия стенокардия (п=12) 17,13* (12,28; 27,86) 0,11 (0,04; 0,17)

Острый инфаркт миокарда (п=10) 24,91* (23,68; 28,45) 0,26 (0,21; 0,3)

Инфаркт миокарда 7 суток (п=10) 28,94* (27,27; 31,13) 0,13 (0,1; 0,17)

Примечание: *р<0,05 в сравнении с содержанием в группе контроля.

Уровень ЦИК у исследованных лнц

Содержание ЦИК средней и низкой молекулярной массы в сыворотке крови значимо возрастало у лиц со стабильной и прогрессирующей стенокардией (табл. 10), следует отметить, что в этих же группах отмечается максимальный уровень аутоантител (табл. 8). У пациентов с острым инфарктом миокарда концентрация ЦИК значимо ниже, чем в группе контроля, что можно объяснить активной элиминацией их путем фагоцитоза на фоне имеющегося при данной патологии нейтрофильного лейкоцитоза.

Таблица 10

Уровень ЦИК в сыворотке крови (ед. оп. пл. СЮ450) (Ме (25-й; 75-й))

Группа Контроль (п=12) ГБ I ст. (п=10) ГБ II ст. (п=12) ИБС: стабильная стенокард. (п=12) ИБС: прогресс. Стенокард. (п=12) Острый инфаркт миокарда (п=10) Острый инфаркт миокарда 7 суток (п=10)

Средней молек. массы 0,206 (0,112; 0,255) 0,223 (0,144; 0,293) 0,214 (0,147; 0,341) 0,284* (0,197; 0,312) 0,282* (0,169; 0,324) 0,125* (0,075; 0,16) 0,184 (0,113; 0,221)

Низюй молек. массы 0,236 (0,1; 0,267) 0,209 (0,123; 0,273) 0,151 (0,137; 0,283) 0,275* (0,275; 0,383) 0,174 (0,138; 0,266) 0,1* (0,07; 0,11) 0,118 (0,114; 0,18)

Примечание: *р<0,05 в сравнении с уровнем в группе контроля.

Метиониновый нагрузочный тест

У здоровых лиц после проведения метиониновой нагрузки в сыворотке крови наблюдалось повышение уровня общего гомоцистеина на 60% от исходного. В смешанной слюне при этом, напротив, отмечалось снижение концентрации гомоцистеина на 30% (табл. 11).

Таблица 11

Динамика уровня гомоцистеина (мкмоль/л) (Ме (25-й; 75-й)).

Группа Сыворотка Ротовая жидкость

До нагрузки После нагрузки До нагрузки После нагрузки

Контроль (п-10) 4,25 (3,33; 4,81) 6,95* (5,56; 8,89) 0,04 (0,01; 0,08) 0,03* (0,01; 0,03)

Гипертоническая болезнь (п=20) 5,96л (5; 6,7) 7,77 (5,56; 9,41) 0,92Л (0,33; 2,42) 0,78*Л (0,37; 1,22)

Примечание: *р<0,05 в сравнении с уровнем до нагрузки;

др<0,05 в сравнении с показателями контрольной группы.

У пациентов с гипертонической болезнью исходный уровень общего гомоцистеина в сыворотке крови выше на 50%, чем у лиц контрольной группы. В ротовой жидкости исходный уровень гомоцистеина у больных гипертонической болезнью более чем в 20 раз выше, чем у лиц контрольной группы. Этот факт позволяет предполагать, что один из возможных механизмов компенсации гипергомоцистеинемии может быть связан со "сбросом" избытка этого метаболита в различные секреты, в том числе в ротовую жидкость.

После метионинового теста у гипертоников также отмечалось повышение уровня сывороточного гомоцистеина. В слюне, аналогично данным контрольной группы имело место снижение концентрации гомоцистеина на 20%, при этом его уровень, по прежнему, более чем в 20 раз превышал таковой у здоровых лиц.

выводы

1. Инкубация сывороточного альбумина с гомоцистеином in vitro сопровождается образованием комплекса, в котором 40% гомоцистеина конъюгирует с белком.

2. У интактных крыс уровень общего гомоцистеина в сыворотке крови остается в пределах нормальных значений как до, так и после введения высоких доз экзогенных аминотиолов на фоне увеличения титра аутоантител к модифицированному гомоцистеином альбумину. У животных с иммунодефицитом увеличивается как исходный уровень гомоцистеина, так и его содержание после введения экзогенных аминотиолов при отсутствии динамики со стороны аутоантител.

3. На фоне высокой концентрации гомоцистеина отмечаются структурные нарушения миокарда, уменьшение количества клеток и форменных элементов периферической крови и увеличение экспрессии тканевого фактора эндотелиоцитами, но не фибробластами и нейтрофилами.

4. Наличие аутоантител к комплексу гомоцистеина с альбумином у здоровых лиц свидетельствует о сенсибилизации данным антигеном при нормальных значениях гомоцистеина. У больных сердечно-сосудистой патологией наибольший уровень гомоцистеина в сыворотке крови зарегистрирован при остром инфаркте миокарда, аутоантител - при прогрессирующей стенокардии.

5. У крыс с иммунодефицитом, в отличие от интактных, отмечается увеличение концентрации ЦИК средней и низкой молекулярной массы через 6 часов после введения гомоцистеина и снижение - спустя 9 суток. Среди больных сердечно-сосудистой патологией уровень ЦИК средней и низкой молекулярной массы наибольший при стабильной стенокардии.

6. При проведении метионинового нагрузочного теста наблюдается повышение концентрации гомоцистеина в сыворотке крови и снижение - в ротовой жидкости через 4 часа после перорального приема метионина.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Исследование уровня аутоантител к модифицированному сывороточному альбумину и тромбину [электронный ресурс] / C.B. Изместьев [и др.] // Забайкальский медицинский вестник. -2012. - №2. - С. 112-115. - Режим доступа: http://medacadem. chita.ru/zmv

2. Аутоантитела к альбумину, модифицированному гомоцистеи-ном в эксперименте [электронный ресурс] / C.B. Изместьев [и др.] // Забайкальский медицинский вестник. - 2013. - №1. -С. 136-140. - Режим доступа: http://medacadem.chita.ru/zmv

3. Уровень гомоцистеина в крови и смешанной слюне после ме-тиониновой нагрузки у больных гипертонической болезнью / C.B. Изместьев [и др.] // Кубанский научный меднцннский вестник. - 2013. - №1. - С. 88-91.

4. Изместьев C.B. Определение гомоцистеина и цистеина в слюне ВЭЖХ методом при проведении теста с метиоииновой наргузкой / C.B. Изместьев, A.A. Дутов, H.H. Цыбиков // Тюменский медицинский журнал. - 2011. - №2. - С. 57-58.

5. Изместьев C.B. Исследование содержания гомоцистеина в слюне и сыворотке крови / C.B. Изместьев // Материалы I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых "Сибирский медико-биологический конгресс" (сборник статей). - Барнаул, 2011. - С. 31-32.

6. Изместьев C.B. Исследование содержания гомоцистеина и цистеина в ротовой жидкости методом ВЭЖХ при проведении теста с метиоииновой нагрузкой / C.B. Изместьев, A.A. Дутов, H.H. Цыбиков // Вопросы патогенеза типовых патологических процессов: Труды III Всероссийской научно-практической конференцией с международным участием. - Новосибирск, 2011. - С. 106-109.

7. Эксперимент по конъюгированию гомоцистеина с человеческим сывороточным альбумином / C.B. Изместьев [и др.] Н Вопросы патогенеза типовых патологических процессов: Труды IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Новосибирск, 2012.- С. 97-100.

8. Исследование уровня аутоантител к модифицированному сывороточному альбумину и тромбину у пациентов с сердечно-сосудистой патологией / C.B. Изместьев [и др.] // Материалы научно-практической конференции "I Съезд терапевтов Забайкальского края". - Чита, 2013. - С. 127-128.

9. Фефелова E.B. Динамика уровня гомоцистеина, интерлейкина 2 и интерферона гамма у больных артериальной гипертензией в зависимости от тяжести заболевания / Е.В. Фефелова, C.B. Изместьев, H.H. Цыбиков // Материалы V Международной научно-практической конференции "Экология. Здоровье. Спорт". - Чита, 2013. - С. 53-55.

10. Уровень гомоцистеина и аутоантител к модифицированному гомо-цистеином сывороточному альбумину человека/ Е.В. Фефелова, C.B. Изместьев [и др.] // Материалы V Международной научно-практической конференции "Экология. Здоровье. Спорт". - Чита, 2013. -С. 55-59.

11. Морфологические изменения миокарда на фоне действия гомоцистеина / Е.В. Фефелова, C.B. Изместьев [и др.] // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 60-летию ЧГМА "Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины". - Чита, 2013. - С. 189-190.

12. Уровень циркулирующих иммунных комплексов у больных гипертонической болезнью / C.B. Изместьев [и др.] // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 60-летию ЧГМА "Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины". - Чита, 2013. - С. 50-51.

Список сокращений

вэжх - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГБ - гипертоническая болезнь

ИБС - ишемическая болезнь сердца

идс - иммунодефицитное состояние

ИФА - иммуноферментный анализ

кДа - килодальтон

ОЦК - объем циркулирующей крови

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РПГА - реакция пассивной гемагглютинации

ЦИК - циркулирующий иммунный комплекс

ИМЭА - К-метил-О-аспартат

- иммуноглобулин класса в

- секреторный иммуноглобулин класса А

Лицензия ИД №03077 от 23.10.00. Подписано в печать 12.11.2013. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman Формат 60 х 84 V|6. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100. Заказ № 146/2013.

Отпечатано в редакциопно-издательском центре ЧГМА 672090, Чита, ул. Горького, 39-а.