Автореферат и диссертация по медицине (14.00.39) на тему:Иммобилизированные гранулированные препараты с магнитными свойствами на основе коллагена и типа как лечебные иммуносорбенты при ревматоидном артрите

РГБ ОД 1 5 ДНК 1983

На правая рукописи

АБДЕЛЬ КАРИМ Д /X А Л А Я

ИММОВИЛИЗИРОВАННЫЕ ГРАНУЛИРОВАННЫЕ ПРЕПАРАТЫ С МАП1ИТНЫМИ СВОЙСТВАМИ НА ОСНОВЕ КОЛЛАГЕНА П ТИПА . КАК ЛЕЧЕБНЫЕ ИММУНО СОРБЕНТЫ ПРИ РЕВМАТОИДНОМ АРТРИТА

(клтшпсо-з!«;перииепталы1ое исследование)

14.00.39 - ревматология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских паук

Волгоград .19%

Работа выполнена в Волгоградской медицинской академии в НИИ Клинической и Экспериментальной Ревматологии РАМН.

Научный руководитель: Академик РАМН

А.Б.ЗБОРОВСКИЙ

Научный консультант: кандидат медицинских наук,

старший научный сотрудник

И.П.ГОНТАРБ

-Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор А .А. Давыдов

Кандидат медицинских наук А. Р. Бабаева

Ведущее учреждение: Ярославская государственная медицинг-ая академия.

Защита состоится "_" _ 1996 г. в _

часов на заседании Специализированного Совета Д 084.54.01 Волгоградской медицинской академии по адресу: 400066, г.Волгоград, гш.Павших борцов, I.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Волгоградской медицинской академии.

Автореферат разослан "_"_ 1996 г

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат медицинских наук, доцент

Ю.К.Филимонова

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Среди ревматических заболеваний наиболее неблагоприятными в прогносг ческом плане являются диффузные болезни соединительной ткани, а в числе них одно из ведущих мест занимает ревматоидный артрит. Значение этого заболевания возрастает в связи с выраженными социально-экономическими последствиями, к которым привод, it ревматоидный артрит из-за преимущественного поражения лиц трудоспособного возраста и прогрессирующего течения, ведущего к тяжелым осложнениям и инвалидности больных (Насонова В.А., 1994).

Самой частой причиной летальности и развития стойкой нетрудоспособности при данной патологии являются множественные поражения, внутренних органов - висцериты. В основе развития этих процессов лежит повреждение тканей циркулирующими антителами и иммунными комплексами разной специфичности (Higakj Y., 1993). Ведущую роль в иммунопатологии ревматоидного артрита большинство исследователей отводят коллагену II тапа, преимущественно содержащемуся в суставной ткани. Антитела к нему обнаруживаются у большинства больных ревматоидным артритом на ранних стадиях развития болезни (Зборовский А.Б., 1994), отмечена корреляция титра этих антител с активностью процесса, доказана возможность индукции артрита введением коллагена II типа и пассивным переносом сыворотки больных, содержащей антиколлагеновые антитела (Morgan К., 1989).

Терапия ревматоидного артрита является важнейшей проблемой ревматологии, поскольку применение современных антиревматических препаратов часто не дает положительных результатов и имеет много побочных эффектов (Насонова В.А., Сигидин Я.А., 1994).

г-

Это диктует необходимость поиска новых, средств и методов патогенетической терапии. Перспективным направлением в лечении РА и других иммунокомплексных заболеваний является непосредственное удаление из кровеносного русла антител и циркулирующих иммунных комплексов с помощью экстракорпоральных методов: плазмафереза, геыосорбции и др. Кроме специфического действия, заключающегося в удалении перечисленных выше компонентов, эти методы активируют клетей различных органов и ,кансй: кроветворные, стромаль-ные, иммунокомпетентные, положительно влияют на реологические свойства крови, повышают чувствительность организма к лекарственным препаратам (Лопухин Ю.М., 1988).

Однако, эти методы имеют ряд существенных недостатков. При плазмаферезе, например, вместе с плазмой удаляются многие жизненно важные компоненты: белки, аминогчелоты, витамины, ферменты, гормоны, лекарственные препараты. Требуются значительн е объемы замещающей плазмы,которая приводит к сенсибилизации организма. Гемосорбция более проста и безопасна по сравнению с плазмаферезом, но большинство используемых гемосорбентов низкоспецифичны, травмируют форменные элементы крови, не обладают достаточной емкостью (Шишкина Н.П., 1986).

Поэтому в последнее время большое значение уделяется соз— данию иммуносорбентов, позволяющих с очень высокой степенью селективности очищать биологические жидкости от антител различной специфичности (Чучалин А.Г., 1990). Метод оказался высокоэффективным и дал возможность добиться клинического эффекта при осложненных формах РА и безуспешности обычной терапии.

Разработка и внедрение новых селективных иммуносорбентов на основе полимеров, используя метод микрогранулирования, с включением в гранулы магнитного материала, позволяет повысить эффек-

тшшость, специфичность сорбционных процессов, улучшить реологические свойства сорбента, уменьшить частоту побочных явлений и снизить себестоимость за счет регенерации и многократного использования.

Таким образом, задача создания селективных иммуносорбентов для лечения больных РА экстракорпоральным методом является сегодня актуальной.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Целыо настоящего исследования является разработка метода удаления антител к коллагену II типа, имеющих патогенетическое значение в развитии РА, с помощью иммобилизнрованных гранулированных антигенных препаратов с магнитными свойствами. .

Для достижения поставлешюй цели были поставлены следующие задачи:

1. Создать гемосовместнмые высокоспецифичные антигенные имму-носорбенты для удаления антител к коллагену II типа:

2. Вызвать коллагешшдуцированный артрит у лабораторных животных;

3. Оценить эффективность иммуносорбентов на лабораторных животных in vivo.

4. Оценить травматичность иммуносорбентов на лабораторных животных in vivo.

5. Оценить эффективность и травматичность магнитосорбентов на цельной крови и плазме крови больных PA in vitro в зависимости от стадии, формы, течения заболевания.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

Впервые разработаны методы извлечения антител к коллагену II типа из крови больных РА с помощью биосовместимых, малотравматичных иммуносорбентов с магнитными свойствами. Исполь-

зование магнитного поля и соответствующих технических устройств в процессе иммуносорбции позволило улучшить гидродинамические свойства, снизить утечку гранул за пределы экстракорпорального контура, уменьшить частоту тромбообразования в колоше и тем самым повысить эффективность иммуносорбции. Специфическое удаление антител к коллагену II типа является важным звеном в комплексном лечении больных РА и может улучшить прогноз при этом заболевании.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ.

Практическая ценность данной работы состоит в том, что разработаны новые иммуносорбенты, позволяющие эффективно удалять антитела к коллагену II типа, не вызывающие деструкцию форменных элементов крови и обладающие высокой сорбционной емкостью. Данные сорбенты могут регенерироваться, неоднократно использоваться и обладают длительным сроком хранения.

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСИТСЯ ПОЛОЖЕНИЕ об использовании метода эффективного и'селективного удалении антител к коллагену II тихи из крови больных РА с помощью иммобилизированных гранулированных антигенных препаратов с магнитными свойствами.

ПУБЛИКАЦИИ.

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том-

числе 1 в международной, 2 в центральной, 2 в местной печати, I в сборнике трудов Рязанского мединститута.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Основные положения диссертации доложены на годичных научных сессиях Волгоградской Медицинской Академии (1995г), на Юбилейной научной конференции, посвященной столетию со дня рождения академика А.И. Нестерова (Москва, 1995 г.), на XXVI

Скандинавском Конгрессе ревматологов (Рекьявик, 1996г.), на III Российском конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1996 г.).

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация изложена на 119 страницах, состоит из введения, 7 глав, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложения. Работа проиллюстрирована 7 рисунками, 13 таблицами. Указатель литературы содержит 136 отечественных и 97 иностранных источников.

КЛИ НИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ.

Г_)д нашим наблюдением находилось 120 больных Р/ (88 женщин и 32 мужчины) в возрасте от 20 до 68 лет. В состав контрольной группы входило 30 практически здоровых людей.

Больных РА в возрасте до 30 лет было 11 человек (9,2%), от 30 до 39-21 (17,5%), от 40 до 49 - 31(25,8%), от 50 до 59 - 34 (28,3%), свыше 60 лет - 23 человека (19,2%). Большинство больных РА - 97 человек (80,8%) - лица трудоспособного возраста (от 20 до 59 лет).

Средняя длительность заболевания у больных составила 6,8±1,3, причем у 38 (31,6%) из них продолжительность - до 5 лет, у 64 (53,4%) -5-10 лет, у 18 (15%) - более 10 лет.

Среди больных, находившихся под наблюдением, минимальную степень активности имели 35 человек (29,2%), умеренную - 62 (51,6%), максимальную - 23 (19,2%). Причем, среди больных с II-III степенью активности было 62(73%) женщины.

Медленнопрогрессирующее течение диагностировано у 86. ъ быстропрогрессирующее у 34 больных, среди которых мужчины составили 26,5%, женщины - 73.5%.

Неотъемлемой частью РА является поражение суставов. Среда находящихся под нашим наблюдением больных у 105 (87,5%) патологический процесс развивался по типу полиартрита, а у 15 (12,5%) -ыоно-олигоартрита. Частота вовлечения в патологический процесс различных суставов в группе обследованных была неодинакова (см. рис. 1); поражение суставов кистей наблюдалось у 80,8% больных, лучезапястных - у 55,8%, локтевых - у 55%, плечевых - у 89,2%, стопы -у35,8%, голеностопных - у 65%, к оле. лых у 75,8%.

80

ео

30

Ь'.Г-. «

г-ч .-«) ■

Ь

о с

•з

с

с о

б

с £

В мужчины □ женщины Рис. I. Частота поражения различных суставов в зависимости от

пола.

Степень поражения суставов определялась рентгенологически с выделением стадий по Штейнброкеру. Среди наблюдавшихся больных I стадия выявлена у 35 человек, II - у 47, III - у 33, IV - у 5.

В группе больных, находившихся под нашим наблюдением, функциональная недостаточность суставов (ФНС) 0 отмечалась у 0,8% больных, ФНС I - у 20%, ФНС 2 - у 63,3%, ФНС 3 - у 15,9%.

Учитывая анамнестические, лабораторные и клинические данные, а также сопоставления продолжительности заболевания с выраженностью рентгенологических изменений в суставах и степенью ФНС,

все больные РА были разделены па группу с медленнопрогрес-сирующим течением - 86 человек (71,6%) и на группу с быстропрогрес-сирующим течением - 34 (28,4%)человека.

В гр» -пе больных, находившихся под нашим наблюдением, у 91 (75,8%) диагностирована суставная форма, а у 29 (24,2%) - суставно-висцеральная.

Серопочитивная форма РА имела место у 74 (61,2%) больных, срс,л них было 22 мужчины (29,2%) и 52 женщины (70,8%); у 46 человек днагносцировалн серонегативную форму РА.

РА известен как заболевание, которому свойственна высокая ин-валидизация. Среда наблюдавшихся нами больных первую или вторую группу инвалидности имели 32 человека (26,7%), из них ,14 мужчин (43,7%) и 18 женщин (56,3%).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Антитела к Коллагену II типа определялись непрямым твердофазным иммумоферментным методом исследования с использованием иммобилизированных гранулированных антигенных препаратов с магнитными свойствами (И.П.Гонтарь, 1991; С.И.Чернова, 1993).

В качестве антигенов использовались коммерческий препарат коллагена И типа фирмы "ЗроГа" (Чехословакия), а также коллаген II типа, выделенный из хрящевой ткани грудины эмбрионов человека по методике, описанной О.Е.ТгегЦИаги с соавт. (1977) .

Иммобилизацию проводили методом эмульсионной полимеризации в модификации И.П.Гонтаря с соавт. (1990) в потоке газообразного азота с включением магнитного материала в структуру полиак-риламидного геля. Полученные препараты имели форму гранул с размерами 10 -100 мкм. При иммобилизации достигается стабилизация

s

фиксируемых белков, т.е. повышается их устойчивость к ьнешним воздействиям с сохранением их биологических свойств. Фиксация в поли-акриламидном геле значительного количества антигенов способствует повышению чувствительности метода. Включение магнитного материала позволяет ускорить и упростить ряд операций в тс.рдофазпых методах анализа. Количественная индикация изучаемых антител проводилась с помощью спектрофотометра при длине волны 490 им (полученные значения выражали в условных единицах оптической плотности).

Циркулирующие иммунные комплексы определялись методом преципитации полиэтиленппколем 6000 а.е.м. по Haskova в модификации Б-АЛемперта (1988). Определение иммуноглобулинов классов А, М, G проводилось методом радиальной иммуиоднффузии в геле по Манчини (Г.Фримель, 1987). Ревматоидный фактор выявлялся с помощью теста латекс-агглютинации (Станкайтене и соавт., 1977). У больных исследовался антинуклеарный фактор методом непрямой им-мунофлюоресценции на гистологических срезах печени белой крысы (Г.Фримель, ¡977).

Регенерацию ИГАП проводили путем промывки гранул 0.1 М глицин-HCl буфером рН = 2.0 3 раза по 10 минут. Стерилизацию -ИГАП проводили 70% этиловым спиртом в течение часов, после чего гранулы отмывались стерильным физиологическим раствором.

При проведении процедуры иммуносорбции в магнитном поле использовали установку, создающей градиент магнитного поля, что позволяло удерживать гранулы во взвешенном состоянии и препятствовало их адгезии друг с другом.

В качестве экспериментальных животных использовали кролики породы Шиншилла весом от 2,5 до 3 кг.

Перед проведением экспериментов in vivo была проведена иммунизация 8 лабораторных животных коллагеном II типа по схеме Trentham D.E. (1982).

Ими юсорбцню in vivo проводили следующим образом: в стерильных условиях под нембуталовым наркозом (40 мг нембутала на 1 кг веса внутримышечно) выделяли шейный сосудисто-нервный пучок кролика. Общую сонную артерию и наружную яремную вену ка: .олировали с помощью инъекционных игл и соединяли с перистальтическим насосом ("MICROPERPEX", "LKB"','Швеция). Далее животному внутривенно вводили 2500 ЕД гепарина; С помощью насоса кровь пропускали со скоростью 125 мл/час через колонку с 5 мл ИГАП, находящуюся вну:ри устройства для проведения jimmvho-сорбщш в магнитном поле в течение 2 часов. Далее, после перевязки сонной ар'ерин, канюли извлекали из сосудов, останавливали кровотечение, накладывали швы на фасции и на кожу, обрабатывали операционную рану антисептиками и накладывали стерильную повязку.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с использованием программного пакета "STATGRAPH1CS 5.0", а также по оригинальным программам, разработанным в Филиале Института Ревматологии РАМН.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Средний уровень АТкКП у здоровых лиц составил 0,052 ± 0,0046. Уровень показателей, определяемый как М ± 2 сигма, составил 0,102 и был принят за верхнюю границу нормы. Достоверной зависимости значений от пола, возраста - не выявлено.

У больных, поступивших в стационар для лечения РА, повышенное содержание антител к коллагену И типа встречалось

значительно чаще, чем у доноров. По данным ИФА у 85 из 120 больных, находившихся под нашим наблюдением, обнаружены антитела к коллагену II типа (70,83%).

Коэффициенты корреляции между содержанием АТ к коллагену II типа и уровнем IgA, IgM и IgG составили соответственно 0,29, 0,37 н 0,76. Была выявлена корреляция средней силы между атКН и РФ( г = 0J3), а также ЦИК ( г = 0,41) (р < 0,05).

Количество антител к исследуемо.лу коллагену достоверно зависело от активности патологического процесса (р < 0,05). При поступлении в стационар у больных со И степенью активности заболевания отмечалось более высокое содержание антител к коллагену II типа, чем у здоровых (р < 0,001) и у больных с I степенью активности (р < 0,01) (см. таб. 1). У больных с III степенью активности отмечен самый высокий уровень атКН типа, который составил 0,756 ± 0,61. По мере активизации процесса возрастают степень и глубина деструктивных процессов в очаге воспаления, что приводит к увеличению растворимых форм коллагена, обладающих большей иммуногенностью и вызывающих более выраженный иммунный ответ у пациентов с высокой степенью активности заболевания.

Таблица 1.

~ Содержание антител к коллагену II типа у больных РА с различной —

степенью активности

Í Степень активности I К-во обследо- Изучаемый параметр

i ¡ ванных больных АТкК II ( М ± ш )

1 ! 35 0,127 ±0,019

и 62 0,312 ±0,024

1 HI 1 23 0,756 ± 0,061

Имеется существенное различие в содержании AT к коллагену II типа у больных с III степенью патологического процесса по сравне-

нию с больными РА с I степенью (р < 0,001) и со II степенью (р < 0,01) активности заболевания.

Результаты определения АТ к коллагену II типа в зависимости от тяжести терния заболевания представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Содержание антител к коллагену II типа у больных РА

в зависимости от характера течения

Характер течения К-во обследованных больных Изучаемый параметр АТкКН(М±т)

Медленнопрогрессирующее 34 0,354 ±0,026

Быстропрогрессирующее 86 0,736 ± 0,032

Как видно из приведенных данных уровень антител к коллагену II типа при медленнопрогрессирующем течении достоверно превышает содержание этих антител у доноров (р < 0,01). При быстропрогрес-сирующем ^течении содержание АТ к коллагену II типа достоверно выше, чем при медленнопрогрессирующем (р < 0,01), и это различие даже более выражено, чем при сравнении показателей, полученных при медленнопрогрессирующем течении с нормальными значениями.

При анализе зависимости количества антител к коллагену II типа от стадии патологического процесса выявлено повышение изучаемого показателя при нарастании деструктивных процессов в соединительной ткани (см. таб. 3).

Таблица 3.

Содержание антител к коллагену II типа у больных в зависимости

от стадии патологического процесса

Стадия РА К-во обследо- Изучаемый параметр |

ванных больных АТкК II ( М ± т)

I 35 0,149 ±0,021

II 47 0,294 ±0,027

III - IV 38 0,566 ±0,031 {

Эта закономерность вполне объяснима, если учесть, что стадия патологического процесса определяется наличием рентгенологических изменений, обусловленных катаболическими процессами в костно-хряшевых тканях, где в основном и присутствует коллаген II типа.

Из таблицы видно, что наибольшее содержание AT отмечено у больных III - IV стадией РА. Оно не только выше содержания этих AT у доноров и больных с I стадией, но и заметно превышает подобные показатели у больных со II стадией патологического процесса (р < 0,001)- У больных со II стадией РА содержание AT к коллагену II типа выше, чем у больных с I стадией (р < 0,001).

Из 120 больных, находившихся под нашим наблюдением, 29 чет овек имели те или иные внесуставные проявления РА. В таблице 4 приведены показатели, характеризующие содержание антител к коллагену II типа у больных РА в зависимости от наличия у них висцеритов.

Таблица 4.

Содержание антител к коллагену II типа у больных РА

в зависимости от наличия висцеритов

Больные РА К-во обследованных больных Изучаемый параметр АТкК II(M±m)

Без висцеритов 91 0,489 ±0,043

С висцеритами 29 0,501 ±0,046

Как видно из приведенных данных, при поступлении в ста---—

ционар уровень антител к коллагену II типа у больных как без системных проявлений, так и с висцеритами достоверно превышал нормальные величины (р < 0,001). В то же время между группами больных без висцеритов и с висцеритами не было принципиальных различий в уровнях АТ к коллагену II типа (р > 0,05), что подчеркивает именно хряшевую специфичность коллагена II типа. Таким образом, результаты исследования говорят о большой роли антител к коллагену II типа в патогенезе РА, обуславливая активность и тяжесть патологичео

кого процесса. В связи с этим актуальной задачей является разработка новых методов по удалению данных антител из кровеносного русла больных РА.

В ход1 экспериментов по удалению АТкКИ из сыворотки крови больных РА, выполненных на полистероловых планшетах, были получены следующие результаты. Содержание АТкКН статистически достоверно читались после проведения сорбции с помощью ИГАП ( р < .>.01 ) и активированного угля ( р < 0.05).

Графическое отображение изменения концентрации АТкКИ е сыворотках больных РА после сорбции с использованием ИГАП и углей ГСУ представлено на рисунке 7.

Рисунок 7. Сравнение эффективности удаления АТкКН из сыворотки крови больных РА при помощи ИГАП и углей ГСУ.

Из рисунка 7 видно, что использование ИГАП в качестве сорбента позволяет добиться уменьшения концентраций антител к кол-ланену II типа в сыворотке крови больных РА в среднем в 6 - 8 раз и

До сорбции

После сорбции

□ ИГАП О ПСУ

превосходит по эффективности сорбции активированные угли марки ГСУ приблизительно в 4 - 5 раз.

В ходе экспериментов была отмечена зависимость степени снижения концентрации АТкКН от исходного уровня антител^ и от объема используемого сорбента ( р < 0.05 ).

Используя методы регрессионного анализа можно теоретически предсказать конечную концентрацию антител после иммуносорбции. Так, например, для снижения уровня АТкКН при максимальной степени активности РА до уровня, характерного для II степени активности заболевания, требуется 300 мл ИГАП (2 процедуры иммуносорбции по 150 мл сорбента); для снижения уровня антител до значений, характерных для 1 стадии активности РА, необходимо 450 мл ИГАП (3 процедуры иммуносорбции с использованием 150 мл сорбента на каждую процедуру).

.Для снижения уровня АТкКП при III - IV стадии ревматоидного процесса до значений, типичных для II стадии нужно провести 1 процедуру с использованием 200 мл ИГАП irai 2 процедуры карбоге-мосорбции с использованием 500 мл сорбента за сеанс; до уровня, типичного для I стадии РА - 300 мл ИГАП (2 процедуры иммуносорбции с использованием по 150 мл сорбента за сеанс). Для полного удаления АТкКИ у больных РА с выражетшым суставным сшщромом при III степени активности заболевания и III - IV рентгенологической стадии необходимо около 700 мл ИГАП или 2500 мл активированного угля.

В экспериментах in vitro использовали в качестве гемосорбента активированные угли марки ГСУ и ИГАП. В результате гемосорбции наблюдали достоверное снижение концентрации антител к коллагену II типа ( р < 0.05 ). В данном случае степень снижения концентрации антител также зависела от соотношения объема сорбента и исходного содержания АТкКН ( р < 0.05 ). Динамика снижения уровня антител к

коллагену II типа в процессе гемосорбщш на ИГАП была аналогична при сорбции АТкКН из сыворотки больных РА ( р < 0.05 ).

Сорбционная емкость ГСУ составила 1,2 ± 0,14 мг, а ИГАП - 3,25 ± 0,3 мг сп мифических антител на 1 мл сорбента. Иммунохимический анализ элюатов, проведенный после сорбции непрямым твердофазным иммуиоферментным методом, показал высокую активность антител, имеющих сходство к нативному коллагену II типа.

В результате процедуры сорбции было отмечено снижение концентрации циркулирующих иммунных комплексов с! 13,6 ± 1,8 до 5,8 ± 1,4 для ИГАП ( р < 0.05 ) и до 8,8 ± 0,9 (р < 0.05 ) для ГСУ. Наметилась тендецня к снижению уровня ревматоидного фактора, но изменения эти не носили достоверного характера. Также не были достоверными гаменишя концентрации общего белка и иммуноглобулинов классов О, А, М (п > 0.05 ). Таким образом, ИГАП по своим специфическим сорбциошшм характеристикам в 4-5 раз превосходит традиционно используемые активированные угли марки ГСУ.

В нашей работе мы осуществляли эксперименты по регенерации ИГАП с целью выяснения возможности повторного их использования. Для этого гранулы после проведения сорбции обрабатывали 0,1 М буфером глицин-НС1 (рН = 2,2) и регистрировали изменение сорбционнон емкости в последующих процедурах сорбции. После первой процедуры регенерации отмечалось некоторое снижение сор-бцнонной емкости ИГАП с 3,25 ± 0,3 до 3,1 ± 0,29 мг/мл сорбента после первой процедуры регенерации (р > 0.05 ), в последующем многократная регенерация ИГАП з'же практически не оказывала влияния на иммунохимическую активность сорбента (после 5 процедуры регенеращш сорбционная емкость составила 3,0 ± 0,27 мг/мл, р > 0.05).

При исследовании травматичности исследуемых гемосорбентов были подучены следующие результаты, представленные в таблице 5.

Таблица 5.

Травиатичность ИГАП и активированного угля (ТСУ).

Содержание ИГАП ГСУ

форменных элементов До сорбции После сорбции До сорбции После сорбции

Эритроциты (х 10'2) 5,П±0,17 5,02±0,15 5,09±0,19 4,I9iO,26

Лейкоциты (ХМ*) 5,72±0,25 5,б±0,23 5,7±0,25 3,91±0,2

Тромбоциты (X 109) 252,2+13,8 241,о±15,1 250,3+15,6 146,4±21,7

Как видно из таблицы, при применении ИГАП в качестве сор-óeirroB для удаления атКП из цельной кропи больных РА не отмечалось достоверного снижения содержания форменных элементов крови (р > 0.05 ). При использовании для аналогичных целей активированного угля марки ГСУ наблюдалось значительное снижение содержания тромбоцитов ( на 42% ), лейкоцитов ( на 32% ), эритроцитов ( на 28% ) ( р < 0.05 ). Приведенные данные говорят о значшельно менее травматичном влиянии ИГАП на форменные элементы крови по сравнению с активированными углями, в частности марки ГСУ.

С целью подготовки ИГАП для проведения экспериментов in vivo - исследовали эффективность стерилизации сорбента этиловым спиртом. _____________________________

После обработай сорбционной колонки с ИГАП этиловым спиртом (70°) через нее пропускали 0.9% раствор NaCl. Количество колоний микроорганизмов, выросших на питательной среде в исходном физиологическом растворе (отрицательный контроль), было равно 0,23 ± 0,15, после перфузии последнего через колонку с сорбентом данный показатель был равен 0,3 + 0,14 (р > 0.05 ).

п

Наличие роста микроорганизмов нз мясо-пептонном бульоне наблюдалось соответственно в 3 случаях из 20 в опыте и в 2 случаях из 20 в котроле ( р > 0.1).

Было выявленно незначительное снижение сорбционной емкости ИГАП после проведения процедуры стерилизации с 3,25 ± 0,31 до 3,18 ± 0,28 ( р > 0.05 ), которое однако не приводило к потере сорбентом своей иммунохимическоа активности.

При исследовании гемодинамических свойств ИГАП было показано, что последние обладают сильной сжимаемостью и, как следствие, высоким гидродинамическим сопротивлением,, препятствующим эффективной перфузии крови через сорбент, а также свойством слипа . ся друг с другом. Для устранения вышеуказанных -едостатков

л

было применено устройство, представляющее собой соленоид, внутри которого находится колонка с ИГАП. Магнитное поле, создаваемое установкой, удерживало гранулы во взвешенном состоянии, препятствуя тем самым их адгезии друг с другом И способствуя большему контакту сорбента с биологическими жидкостями. В установке использовались параметры магнитного поля, не оказывающие вредного влияния на организм человека ( напряженность поля до 5000 Э ).

При исследовании сжимаемости гранул в ходе сорбции без применения устройства, создающего магнитное поле, начальный их объем составил 5,1 ± 0,03 мл, конечный объем составил 3,7 ± 0.027 мл ( динамика достоверна р < 0.05 ), при применении вышеуказанного устройства: начальный объем 5,1 ± 0,03, конечный - 4.99 ± 0.035 мл ( динамика недостоверна, р > 0.05 ).

Таким образом, использование магнитного поля, создаваемого экспериментальной установкой для проведения иммуносорбции, позволяет снизить сжимаемость гранул и улучшить их реологические СЕОйсгсг..

Использование магнитного поля позволило существенно уменьшить утечку гранул за пределы экстракорпорального контура. Если ИГАП применялись для иммуносорбции в колонке без использования магнитного поля, то потери сорбента составили 258 ± 22 мг вещества на колонку объемом 5 мл. Если ИГАП использовались в колонке, помещенной в устройство, создающее магнитное поле, то утечка сорбента составляла 0,8 ± 0,2 мг вещества (различия достоверны р < 0.05). Таким образом, использование установки для проведения иммуносорбции в магнитном поле позволяет значительно снизить потери ИГАП за пределы экстракорпорального контура и обезопасить патента от попадания сорбента в кровеносное русло.

Частота тромбообразования в колонке без использования магнитного поля составило 7 случаев из 20. При проведешш иммуносорбции в вышеуказанной установке 1 ра> из 20 наблюдений были обнаружены микротромбы, которые не препятствовали току крови (р < 0.01). Следовательно использование, магнитного поля снижает частоту тромбообразоваиия в колонке с сорбентом.

Таким образом, использование установки, создающей магнитное ■ поле, позволяет улучшить гидродинамические свойства сорбента, снизить утечку гранул за пределы экстракорпорального контура, уменьшить частоту тромбообразования в колонке и повысить эффек-— тивность иммуносорбции. ИГАП могут эффективно стерилизоваться без потери ими иммунохимических свойств. Возможность регенерации и многократного повторного использования ИГАП позволяет значительно снизил, стоимость процедуры сорбции у больных РА

Перед проведением экспериментов по удалению антител in vivo была проведена иммунизация кроликов иативньш коллагеном II Tima. Средняя концентрация антител после иммунизации была равна 0,69 ±

0,07 сд. опт. плотности ( уровень АТкКН у интакп.лх животных составил 0,06 ± 0,008; различия достоверны, р < 0.05 ).

Процедура и.ч.чупо сорбции переносилась животными удовлетворительно. Не было отмечено пироген:ых реакций, нарушений жизненно важных фзтгкцип дыхания и кровообращения.

После проведения процедуры экстракорпоральной иммуносорб-цин на кроликах наблюдалось снижение концентращш антител к коллаг ену ,1 типа непосредственно после сорбции во всех 6 случаях (р<0.01) (см. таб. 6). ;

Таблица 6.

Результаты нммуиосорбщш на лабораторных животных.

Номер Уровень антител к коллагену И типа -

животного До После Через 1 Через 2 Через 4

сорбции сорбции неделю Н' те ли недели

1 0,48 0,22 0,28 0,46 0,44

2 0.65 0,31 0,32 0,63 0,62

3 0,57 0,23 0,25 0,60 0.55

4 0,78 0,29 0.28 0,71 0,63

5 0,53 0,25 0,27 0,50 0.57

6 0,86 0,39 0,44 0,79 0,82

7 0,67 0,33 • 0,36 0.6! 0,64

8 0,81 0,36 0,46 0,74 0,79

Нами исследовалась концентрация АТкКП в крови экспериментальных животных в течение I месяца после процедур и экстракорпоральной иммуносорбции. Было отмечено повторное появление антител к коллагену II типа через 2-4 недели после экстракорпоральной элиминации антител практически до исходного уровня (см. таб. 6).

У животных после нммуноссрбции не было отмечено каюк либо отклонений в весе, состоянии волосяного покрова, изменения аппетита и поведения. Операционная рана во ессх случаях захтзадг

первичным натяжением. Все лабораторные животные в течение 6 месяцев после процедуры иммуносорбции остались живы.

Исследования показали, что колонка с ИГАП практически не тромбировалась в процессе процедуры иммуносорбции. В единичном случае были обнаружены микротромбы, которые не препятствовали нормальному току крови.

Взвешивание гранул показало отсутствие их утечки за пределы экстракорпорального контура bj время процедуры; вес гранул составил до сорбции 5240 ± 80 мг, после нее 5190 х 60 мг (р > 0.1).

При исследовании динамики форменных элементов крови были подучены следующие результаты. Содержание эритроцитов составило 3,92 ± 0.11 и 3,88 ± 0.07, лейкоцитов 5,6 ± 0,2 и 5,5 ± 0,2, тромбоцитов 211 ± 20 и 195 ± 18, соответственно до и после процедуры ( во всех случаях динамика недостоверна, р > 0.05 ), т.е. форменные элементы крови практически не разрушались.

Таким образом, эксперименты ¡n vivo показали, что ИГАП являются гемосовместимым-сорбентом и эффективно удаляют антитела к коллагену И типа из крови экспериментальных животных, не травмируя при этом форменных элементов крови. Применение установки для проведения иммуносорбции в магнитном поле позволило улуч-~шитъ гемодинамические характеристики гранул и уменьшить утечку гранул за пределы экстракорпорального контура. В то же время,- в постсорбционном периоде наблюдался синдром "рикошета антител" (восстановление исходного уровня АТкКН через 2-4 недели после иммуносорбции).

В заключение представляется возможным отметить, что в ходе работы были созданы новые высокоэффективные иммуносорбенты для удаления АТкКП из крови больных РА и экспериментальных животных. Данные препараты выгодно отличаются от других сорбентов,

традиционно используемых в методах экстракорпоральной очистки крови, более высокой сорбционной емкостью и атравматичностью для форменных элементов крови. Разработаны методы стерилизации ИГАП. Применение оригинального устройства для проведения иммуносорбцни в магнитом поле позволило улучшить гидродинамические свойства сорбента, снизить утечку гранул за пределы экстракорпорального контура, уменьшить частоту тром-бо"бразования в колонке и повысить эффективность иммуносорбции. Эксперименты по удалешпо ATkKII in vivo подтвердили высокую эффективность ИГАП. Полученные данные показали перспективность исследований по создалшо новых иммуносорбентов на основе ИГАП и их практическому применению у больных РА.

ВЫВОДЫ:

1. Антитела к коллагену II типа играют одну из ведущих ролей в патогенезе ревматоидного артрита. Уровень АТкКИ у больных с этой патологией зависит от формы, активности заболевания и не зависит от наличия висцеральных поражений.

2. Антитела к коллагену II типа могут быть эффективно удалены из крови больных ревматоидным артритом с помощью соответствующих иммуносорбентов - иммобилизированных гранулированных антигенных препаратов с мапштньши свойствами.

3. ИГАП более эффективно удаляют антитела к коллагену II типа по сравнешпо с гемосорбентамии на основе активированного угля марки ГСУ.

4. ИГАП не оказывают травмирующего действия на форменные элементы крови, не вызывают гипопротеинемию, имеют значительную прочность, емкость, высокую чувствительность и специфичность.

5. Использование магнитного поля и соответствующих технических устройств в процессе иммуносорбции позволяет улучшить гидродинамические свойства сорбента, снизить утечку гранул за пределы экстракорпорального контура, уменьшить частоту тромбообразова-ния в колонке и тем самым повысить эффективность иммуносорбции.

6. Предлагаемые сорбенты с магнитными свойствами лег-ко регенерируются, обладают возможностью многократного использования и длительным сроком хранения.

7. Специфическое удаление антител к коллагену II типа, очевидно, является важный эвеном в комплексном лечении больных РА и ' может улучшить прогноз при данном заболевашш.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

!. Полученные нммупосорбснты на основе коллагена II типа пс _-ле соответствующей фармакологической-, апробации рекомендуются использовать у больных РА в качестве гемосорбентов для экстракорпоральной очистки крови от АТ к коллагену II типа.

2. С целью выяснения прогноза, контроля проводимого лечения и, особенно, оценки эффективности методов экстракорпоральной терапии у больных РА следует определять антитела к коллагену II типа.

3. Для снижения уровня АТ к коллагену II типа при III - IV стадии ревматоидного процесса до значений, типичных для II стадии нужно провести I процедуру с использованием 200 мл ИГАП или 2 процедуры карбогемосорбцин с использованием 500 мл сорбента за сеанс; до уровня, типичного для I стадии РА - 300 мл ИГАП (2 процедуры иммуносорбщш с использованием по 150 мл сорбента за сеанс). Для полного удаления АТ к коллагену II типа у больных РА с выраженным суставным синдромом при III стспаш активности

заболевания и III - IV рентгенологической стадии необходимо около 700 мл ИГАП или 2500 мл активированного угля.

ПУБЛИКАЦИИ:

1. Частота встречаемости антител к коллагену II типа и IgG-РФ у больных РА '/ Аллергия, иммунитет и патология виутрешшх органоз. / Т( исы докл. - Рязань, 1995. - С.17. (Соавт. Александров А.В., Гонтарь И.П.).

2. Новые возможности контроля эффективности терапии больных ревматоидным артритом. II III Российский национальный конгресс "Человек и лекарство" / Тезисы докл. - Москва, 1996..- С.101. (Соавт. Гонтарь И.П., Александров А.В., Сычёва Г.Ф., Зборовский А.Б.).

3. Мапюсорбснты в лечении ревматоидного артрита. // III Российский национальный конгресс "Человек и лекарство" / Тезисы докл. - Москва, 1996. - С.100-101. (Соавт. Гонтарь И.П., Александров А.В.. Сычёва Г.Ф.).

4. Magnetic sorbents as a medicine of pathogenetic therapy in rheumatoid arthritis patients. II Abstracts from 26th Scandinavian Congress of Rheumatology, Reykjavik, Iceland. / Scandin. Journal of Rheumatology. -1996. (I.P.Gontar, A.V.Alexandrov) (в печати).