Автореферат и диссертация по медицине (14.00.31) на тему:Идентификация и свойства бета-лактамаз полирезистентных штаммов грамотрицательных бактерий

Актуальность проблемы

Бактериальная резистентность к широко применяемым в клинике /-лактамным антибиотикам - пенициллинам и цефалоспоринам обусловлена в большинстве случаев их ферментативной инактивацией. Ферменты, инактивирующие /-лактамные антибиотики путем расщепления £-лактамного кольца, получили название ^-лактамаз.

-Лактамазы составляют обширную группу ферментов, различающихся по субстратной специфичности и другим свойствам. Наиболее многочисленную и сравнительно мало изученную группу ^-лак-тамаз составляют -лактамазы грамотрицательных .бактерий. Кроме того, внедрение в клинику.новых поколений пенициллинов. и цефа-лоспоринов приводит.к распространению в микробных популяциях-лактамаз с измененными субстратными спектрами, а также к появлению штаммов бактерий, содержащих в клетке две различных по субстратной .специфичности ^б-лактамазы. Разностороннее.изучение каталитических и физико-химических свойств ^з-лактамаз грамотрицательных бактерий является весьма актуальным, поскольку, эффективность антибиотикотерапии во многом зависит.от создания новых /-лактамных структур, не являющихся субстратами наиболее распространенных . £-лактамаз. Препараты £-лактамаз необходимы при оценке, .получаемых путем скрининга или химической, трансформации ^-лактамных антибиотиков, а также при оценке ингибиторов ^-лактамаз, которые могут быть использованы в комбинациях с ^-лактамными антибиотиками. . Характеристика . /-лактамаз бактерий, выделяемых в клинике, необходима при изучении эпидемиологии антибиотикорезистент-ности. .

Цель и основные задачи работы

Цель работы заключалась в идентификации, изучении свойств и классификации ^-лактамаз, ввделенных из клинических полирезистентных штаммов грамотрицательных бактерий, принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae И роду Pseudomonas, Для ЭТОГО предстояло решить следующие основные задачи: - модифицировать микроиодометрический и потенциометричес-кий методы определения активности ^3-лактамаз с целью их использования для работы как с пенициллинами, так и с цефалоспоринами;

- разработать быстрый метод дифференциации ^ß-лактамаз у штаммов, содержащих по две jß-лактамазы с разным субстратным спектром;

- определить субстратную , специфичность и провести классификацию >-лактнмаз, присутствующих у. полирезистентных жаммов, выявить среди них частоту встречаемости бактерий, содержащих в клетке одновременно две различные js-лактамазы;

- выделить, очистить до гомогенного состояния и исследовать физико-химические свойства /-лактамаз пенициллиназного и цефа-лоспориназного типов; .

- изучить особенности взаимодействия очищенных препаратов J3—лактамаз. -с ингибиторами - аналогами субстратов.

Научная новизна работы. Получены данные о субстратной.специфичности и распределении по классификационным группам ./-лактамаз полирезистентных штаммов грамотрицательных бактерий, выделенных в ряде клиник.

Разработаны схемы выделения высокоочищенных ферментных препаратов ß-лактамаз. .

Предложена модификация микроиодоме.трического метода определения активности yö-лактамаз, позволяющая использовать этот метод при сравнительных исследованиях ферментов, а также в случае испытания как субстратов не только пенициллинов, но и цефалоспо-ринов.

Внесены модификации в потенциометрический метод определения ,^-лактамазной активности, уменьшающие зависимость получаемых результатов от непостоянства емкости буферных растворов при изменениях рН.

Впервые разработан основанный на применении ЭВМ метод, позволяющий быстро устанавливать одновременное наличие в клетках одного штамма двух ^-лактамаз. Метод может быть использован для -характеристики штаммов при массовых исследованиях и изучении эпидемиологии ^-лактамаз и не требует предварительного разделения ферментных., б елков

Модифицирован, применительно к ^й-лактамазам, метод изсн-электрического фокусирования, позволяющий выделять, ^з-лактама-зы в препаративных количествах. Модификации приводят к более полному извлечению ^В-лактамаз из геля, ж предотвращают возможную инактивацию ферментных белков цри крайних (низких или высоких) значениях рН во время их миграции в геле.

При изучении кинетики гидролиза различных субстратов гомогенными препаратами ^-лактамаз впервые для регистрации ферментативной активности был использован метод кругового дихроизма, позволивший выявить особенности действия этих ферментов на некоторые субстраты, не выявляемые обычными методами, а также оцре-делить дот оС- и -спиральных участков в полипептидной цепи.

Практическая ценность работы. Изученные бактериальные штаммы с установленным классом ./З-лактамаз были рекомендованы к использованию в лабораторной практике во ВНИИА: I) при сравнительной характеристике новых клинических штаммов, 2) при поиске и оценке природных ^Л-лактамных структур с антибиотическими свойствами и/или свойствами ингибиторов ./-лактамаз.

Гомогенный препарат фермента цефалоспориназного типа был применен в практике работы ВНИИА при изучении фармакокинетики антибиотиков в случае комбинированной антибиотикотерапии. Фермент использован для инактивации цефалоспоринов (и выявлении при этом активности применяемых совместно с цефалоспоринами аминогликози-дов).

Модифицированные микрон одометрический и потенциомегрический методы определения /-лактамазной активности и метод быстрого обнаружения двух ^З-лактамаз у штамма с помощью ЭВМ могут быть использованы в лабораторной практике цри характеристике полирезистентных клинических штаммов бактерий, а также при поисковой работе и оценке новых ^-лактамных структур.

Методы препаративного выделения ^-лактамаз, в частности с помощью улыврафильтрации и изофокусирования могут быть использованы в работах по получению этих ферментов.

- 122 -ВЫВОДЫ

1. Из 56 полирезистентных клинических штаммов грамотрица-тельных бактерий выделены и охарактеризованы препараты ß -лак-тамаз. Изученные /-лактамазы отнесены к пяти классам по клас-. сификации Richmond. Около 30$ из них составляли ферменты цефало-спориназного типа (I класс), 70$ - пенициллиназы (П-У.классы). Видовой специфичности ß -лактамаз не было обнаружено.

2. Разработаны модифицированные микроиодометрический и по-тенциометрический методы определения ß -лактамаз. Методы.при-, годны для работы с различными ß -лактамазами при использовании . в качестве субстратов как пенициллинов, так и цефалоспоринов.Разработан модифицированный метод изоэлектрического фокусирования -лактамаз для аналитических и препаративных целей.

3. Разработан метод анализа спектра ß -лактамазной активности с использованием ЭВМ, позволяющий выявлять одновременное присутствие у штамма двух ß -лактамаз с описанием субстратного спектра каждого фермента. Обнаружены сочетания /-лактамаз (ТЕМ и PSE-2 - Ш класс, ТЕМ и I класс, ТЕМ и П класс, ТЕМ и У класс)

У штаммов, относящихся к Ps.aeruginosa, Ent.aerogenes,И Kl.pneumoniae. Данные ЭВМ подтверждены биохимическими методами.

4. Пенициллиназа группы ТЕМ, кодируемая плазмидой из Citr. freundii^n ß> -лактамаза цефалоспориназного типа из Ent.aerogenes 6803 с ранее не описанным субстратным спектром были получены в гомогенном состоянии. Определены их кинетические параметры и чувствительность к.реагентам на функциональные группы и ß -лактам-ным ингибиторам. Установлено соотношение о( - и ß -спиральных структур в молекулах.

5. Применение для изучения /-лактамаз метода кругового дихроизма позволило выявить не обнаруживаемый другими методами медленный гидролиз некоторых ингибиторов /-лактамной структуры. Впервые были определены Км и Ккат при гидролизе р -лактамазой ТМ метициллина. Показан гидролиз ^-лактамазой из Еп-иаегс^епев 6803 ее.ингибитора цефазолина, но не второго ингибитора - цефу-роксима.

6. Штаммы-продуценты охарактеризованных р -лактамаз, препараты ферментов, а также модифицированные методы определения активности р -лактамаз использованы при скрининге новых р -лак-тамных структур.

РЖОМЕНДАЦИИ ПО. ПРАКТИЧЕСКОМУ ПРИМЕНЕНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

Модифицированные микроиодометрический и потенциометрический методы определения активности -лактамаз, а также бактериальные штаммы с идентифицированными и отнесенными к разным классам -лактамазами могут быть использованы при скрининге и оценке свойств новых природных и полусинтетических р -лактамных структур.

Метод дифференциации -лактамаз при помощи ЭВМ может применяться для характеристики бактериальных штаммов при изучении эпидемиологии антибиотикорезистентности.

Указанные методы впервые апробированы в Лаборатории экспериментальной химиотерапии ВНИИА.

- 125