Автореферат и диссертация по медицине (14.00.31) на тему:Распространенность и механизмы устойчивости штаммов клинически значимых грамотрицательных бактерий к беталактамным антибиотикам

о <>

На правах рукописг

Макаров Алексей Николаевич

РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ И МЕХАНИЗМЫ УСТОЙЧИВОСТИ ШТАММОВ КЛИНИЧЕСКИ ЗНАЧИМЫХ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ К БЕТАЛАКТАМНЫМ АНТИБИОТИКАМ

14.00.31 - химиотерапия и антибиотики

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1997г.

Работа выполнена в Московском государственном университете пр ладной биотехнологии (ректор — академик РАСХН H.A. Рогов) и в Го дарственном научном центре по антибиотикам (генеральный директор академик РАМН С.М. Навашин).

Научные руководители:

заслуженный деятель науки РФ, доктор ветеринарных наук, профессор М.А. Сидоров

доктор медицинских наук, профессор C.B. Сидоренко

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Б.А. Шендеров доктор медицинских наук A.C. Анкирская

Ведущая организация:

Российская медицинская академия последипломного образован Москва

Защита состоится '"чл!1 СИТ 1997г. в № часов на заседа Диссертационного Совета Д 084.68.01 в Государственном научном цен по антибиотикам (ГНЦА) по адресу: 113105, Москва, ул. Нагатинская,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦА.

Автореферат разослан " " 1997г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат медицинских наук

С.М. Кузнеи

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

На протяжении всего времени, прошедшего после внедрения антибиотиков в клиническую практику, наблюдался неуклонный рост устойчивости клинически значимых бактерий к этим препаратам, что, вероятно, является неизбежным процессом. Применение новых антибиотиков вызывает селекцию устойчивых к ним мутантов в бактериальных популяциях (McGoven, 1983; Sanders, Sanders, 1992). Изучение распространенности и механизмов антибиотикоустойчивости клинически значимых бактерий необходимо для рациональной антибиотикотерапии, которая позволила бы по возможности замедлить распространение устойчивых к антибиотикам штаммов бактерий (Kunin, 1993).

Поскольку из всех групп антибиотиков наиболее широко применяются р-лактамные препараты, изучение бактериальной устойчивости к антибиотикам этой группы имеет особенно важное значение (Sanders, Sanders, 1992). Инактивация пенициллина, связанная с образованием р-лактамазы, была впервые обнаружена в 1940 году — почти сразу же после начала клинического применения этого антибиотика (Abraham, Chain, 1940). К настоящему времени распространение устойчивых за счет продукции В-лак-тамаз штаммов практически свело на нет эффективность бензилпенициллина и ампициллина в отношении большинства клинически значимых бактерий. Появление штаммов, устойчивых к новым р~лактамным антибиотикам, в частности цефалоспорилам третьего поколения, отмечалось спустя короткое время после внедрения этих антибиотиков в клиническую практику. В результате во многих случаях эти новые антибиотики также оказываются неэффективными в отношении ряда клинически значимых бактерий (Sanders, Sanders, 1992; Livermore, 1995).

Известны три механизма устойчивости к ¡3-лактамным антибиотикам: нарушение проницаемости клеточной стенки бактерий, инактивация этих препаратов путем гидролиза р-лактамазами и изменение мишени — пени-циллин-связывающих белков (ПСБ) (Bush, 1988; Livermore, 1988; Spratt, Cromie, 1988). Важнейшим из этих механизмов является продукция (5-лак-тамаз. Поэтому изучение свойств этих ферментов играет главную роль в исследовании проблемы устойчивости клинически значимых бактерий к |3-лактамным антибиотикам (Sanders, Sanders, 1992).

Первым этапом изучения устойчивости штаммов бактерий к (3-лактам-ным антибиотикам является определение МИК ряда препаратов данной груп-

пы для исследуемых штаммов. При этом чем более представительным яв, ется спектр этих р-лактамных препаратов, тем с большей достоверное: можно судить о возможных механизмах устойчивости. Данные об уровне ; тойчивости к р-лактамным препаратам, особенно новым, тех или иных в< будителей, их профилях антибиотикоустойчивости, а также о различия: уровнях устойчивости в зависимости от регионов и источников выделе1 являются весьма ценными для рациональной антибиотикотерапии.

Вместе с тем одно лишь определение МИК р-лактамных антибиотш не всегда дает возможность с необходимой степенью достоверности суд! о механизмах устойчивости к этим антибиотикам, и, следовательно, вы] батывать надлежащие рекомендации по рациональной антибиотикотерага Для более углубленного изучения механизмов устойчивости необход исследование субстратного и ингибиторного профилей (5-лактамаз, з правило, дающее возможность отнести эти ферменты к какому-либо из I вестных типов и исходя из этого предложить наиболее рациональную сх( антибиотикотерапии.

Таким образом, изучение распространенности и механизмов устой' вости клинически значимых бактерий к ¡З-лактамным антибиотикам, пре, тавляется весьма актуальным как с теоретической, так и с практичес; точек зрения.

Цель исследования

Изучение распространенности устойчивости к (Ьлактамным антитио кам в клинических популяциях грамотрицательных возбудителей нозоко; альных инфекций и исследование свойств (3-лактамаз высокоустойчи штаммов.

Задачи исследования

1) Определение распространенности и уровня устойчивости к р ¡5-лактамных антибиотиков (пенициллинам с ингибиторами (3-лактамаз, фалоспоринам второго, третьего и четвертого поколений, азтреонаму имипенему), а также некоторым альтернативным аминогликозидным и фт хинолоновым препаратам в клинических популяциях всех основных таксо мических групп грамотрицательных возбудителей нозокомиальных инфекц

2) Разработка простого и быстрого метода определения р-лактам ной активности.

3) Определение субстратного и ингибиторного профилей (3-лакта высокоустойчивых штаммов.

4) Ориентировочная оценка механизмов устойчивости к [3-лактамным антибиотикам исследованных штаммов, особенно высокоустойчивых, на основе полученных данных о МЙК р-лакташых антибиотиков и £-лактамазной активности высокоустойчивых штаммов.

Научная новизна

Впервые за последние годы в России было проведено многоцентровое исследование, охватившее девять лечебных учреждений различного профиля, в ходе которого были получены данные о распространенности и уровне устойчивости клинически значимых грамотрицательных бактерий к восьми ¡3-лактамным антибиотикам (четырем цефалоспоринам, в том числе к цефпи-рому, двум пенициллинам с ингибиторами р-лактамаз. азтреонаму и имипе-чему), а также некоторым альтернативным препаратам: двум аминоглико-зидным и двум фторхинолоновым антибиотикам. Получены также данные о фоФилях антибиотикоустойчивости исследованных штаммов и о различиях в 4увствительности между штаммами, выделенными в разных лечебных учреждениях и из разных источников.

Разработан модифицированный микроиодометрический метод определе-1ия (3-лактамазной активности, отличающийся простотой и дающий возмож-юсть быстро определить р-лактамазную активность в большом числе проб.

Определена активность р-лактамаз семи высокоустойчивых штаммов штеробактерий в отношении ряда пенициллинов (бензилпенициллина, ампициллина, оксациллина и карбенициллина) и цефалоспоринов (цефалотина, (ефотаксима и цефтазидима), изучено влияние ингибиторов (сульбактама, 1зтреонама и диклоксациллина) на активность этих ферментов, что позво-мло оценить механизмы устойчивости этих штаммов к (3-лактамным антиби-)тикам.

Практическая значимость

Получены данные об устойчивости к ряду широко применяемых 6-лак-'амных, а также аминогликозидных и фторхинолоновых антибиотиков всех 1сн0вных таксономических групп грамотрицательных возбудителей нозоко-мальных инфекций, выделенных в разных лечебных учреждениях и из раз-[ых источников, что имеет весьма важное значение для рациональной ан-■и биотикотерапии.

Разработан новый метод определения ¡3-лактамазной активности бак-ерий, не требующий разрушения бактериальных клеток, дающий возмож-ость быстро определить ¡"»-лактамазную активность в большом количестве

проб, требующий меньшего расхода посуды и реактивов по сравнению с р< нее известными методами, пригодный для широкого применения в клиничес ких лабораториях.

Получены данные о субстратном и ингибиторном профилях высокоус тойчивых штаммов энтеробактерий, которые позволяют оценить механиз! их устойчивости к (3~лактамным антибиотикам. Эти данные представляй интерес с точки зрения рациональной антибиотикотерапии инфекций, вы; ванных высокоустойчивыми штаммами энтеробактерий.

Апробация работы

По материалам диссертации опубликованы 2 статьи и 2 тезисов. Мг териалы диссертационной работы доложены на международной научно-тех1

ческой конференции "Пища. Экология. Человек." (Москва, 1995).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 186 страницах машинописного текста, ш люстрирована 7 рисунками и 45 таблицами. Работа состоит из введени* обзора литературы, раздела с описанием материалов и методов, раздела изложением собственных результатов и их обсуждения, заключения, вывс дов и списка цитированной литературы, включающего 183 литературных ис точника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Данные, представленные в работе, являются результатом анализ уровня устойчивости к восьми ß-лактамным, двум аминогликозидным и дву фторхинолоновым антибиотикам 866 клинических штаммов грамотрицательнь; бактерий, выделенных в пяти центрах Москвы — Онкологическом научно центре (НД) РАМН, Детской городской клинической больницы (ДГКБ) №1 имени Н.Ф. Филатова, Гематологическом НЦ, 15-й городской клиническо больнице (ГКБ) и клинической больнице управления делами правительств РФ (КБ УД ПРФ), трех центрах С.-Петербурга — Военно-медицинской ака демии (BMA), 2-й ГКБ и 122-й ГКБ и одном центре Рязани — Централизо ванной бактериологической лаборатории (ЦБЛ). Каждый центр предостави примерно по 100 штаммов.

Данные о видовой принадлежности и источниках выделения исследо

ванных штаммов представлены в таблице 1. Среди исследованных штаммов наиболее часто встречались представители родов Escherichia, Pseudomonas, Enterobacter и Klebsiella. По источникам выделения преобладали штаммы, выделенные из мочи — 183, мокроты — 105 и кала — 98 штаммов.

Для исследованных штаммов определялись МИК следующих антибиотиков: четырех цефалоспоринов (второго поколения — цефуроксима, третьего поколения — цефотаксима и цефтазидима и четвертого поколения --цефпирома), двух комбинированных препаратов пенициллинов с ингибиторами ß-лактамаз — ампициллина с сульбакт&чом и пиперациллина с тазобак-гамом, азтреонама, имипенема, а также двух аминогликозидных антибиотиков — амикацина и гентамицина и двух фторхинолоновых препаратов ~ зфлоксацина и ципрофлоксацина.

МИК антибиотиков определяли методом микроразведений в соответствии с руководством iiCCLS от 1993 г. Разведения проводили в бульоне йоллера-Хинтона следующего состава (на 1 л): мясной экстракт ~ 3 г, ^идролизат казеина — 17,5 г, крахмал — 1,5 г (pH после стерилиза-JHH 7,3±0,1). Разделение штаммов на чувствительные, умеренно чувствительные и устойчивые проводили исходя из пограничных значений МИК антибиотиков, указанных в данном руководстве.

Для исследования субстратного и ингибиторного профилей ß-лактамаз Зыли использованы 7 высокоустойчивых штаммов энтеробактерий (3 штамма i. aerogenes, Z штамма Е. cloacae и по 1 штамму £. coli и Kl. рпеишо-iiae), полученных из Центрального военного госпиталя имени H.H. Бур-;енко.

Исследованные культуры выращивали на жидкой среде Саттона следую-¡его состава: панкреатический гидролизат казеина — 35-40 мг% аминного [зота, КНг Р04 — 0,5 r, MgS04 ~ 0,5 г, лимонная кислота — 2 г, ли-юннокислое железо — 0,05 г, глицерин — 50 мл, дистилированная вода - до 1000 мл.

ß-лактамазную активность в отношении цефалоспоринов третьего по-оления определяли методом диффузии в агар в следующей модификации. К уточной культуре исследуемого штамма добавляли приблизительно 10% (по 'бъему) толуола и встряхивали в течение 10 минут для повышения прони-аемости внешней мембраны. Далее культуру центрифугировали в течение 5 минут при 4000 оборотах/мин, осадок ресуспендировали в фосфатном уфере (pH = 7.0) до густоты 0.5 или 1 млрд. микробных тел/мл. Полу-енную суспензию смешивали с равным объемом раствора цефалоспорина

Таблица .

Видовая принадлежность и источники, выделения исследованных шпатов.

Таксономическая

Число

Источник (в % от числа штаммов)

Моча Мокрота. ОДХ Кал, ПЩТ Раны, гной Зев Кров

Escherichia coli 236 36 7 27 9 4 2

E. hermanii 2 не указан

Pseudomonas spp. 177 19 26 8 16 18 2

Enterobacter spp. 131 15 27 20 8 10 2

Klebsiella pneumoniae 85 25 25 18 4 9 3

Kl. oxytoca 25 26 20 12 ~ 4 —

Kl. ozaenae 3 — -- — 33 — —

Klebsiella spp. 10 60 ~ 30 — —

Proteus mirabilis 27 33 8 27 23

Pr. vulgaris 20 30 5 25 15 — —

Proteus spp. 8 12 25 25 25 -- --

¿cinetobacter spp. 39 14 32 8 21 3 3

Citrobacter spp. 38 30 21 18 12 — —

Serratia spp. 20 5 30 30 ~ 10 5

Kluyvera spp. 12 не указан

Alcaligen.es spp. 10 10 30 20 30 — —

Morganella spp. 8 25 12 12 12 — —

Providencia stuartii 3 67 — 33 — — —

Cedacia spp. 2 не указан

Pas teureIIa multocida 1 не указан

stenotrophomonas 1 не указан

maltopMlia

Salmonella enteritidis 1 — — 100 — — —

Shigella flexneri 1 — -- 100 — — •

Неидентифицированные 6 33 33 — 17 — ■

грамотрицатель ные палочки

Условные обозначения: ОДХ — органы дыхания (легкие, бронхи, тра хея), ПЩТ -- пищеварительный тракт (желчь, абдоминальная жидкость).

концентрации от 20 до 100 мкг/мл. Густота клеточной суспензии и концентрация раствора антибиотика могли меняться в зависимости от ожидаемой ß-лактамазной активности в отношении исследуемого цефалоспорина. При ожидаемой высокой активности использовали более разбавленную суспензию клеток и более концентрированные растворы антибиотика, и наоборот. Для повышения надежности определения суспензии клеток каждого штамма смешивали с растворами антибиотика двух разных концентраций. В качестве стандарта использовали растворы цефотаксима концентрации 8 мкг/мл и цефтазидима концентрации 10 мкг/мл. Реакционные смеси инкубировали при 37°С в течение суток.

Далее количество оставшегося неразрушенным антибиотика определяли методом диффузии в агар согласно Государственной Фармакопее СССР (IX издание). Определение проводили на среде, содержащей панкреатический гидролизат мяса по Хоттингеру (130-140 мг% аминного азота), Na2HP04 — 3 г/л, агар-агар — 10 г/л, приготовленной на дистиллированной воде (pH после стерилизации — 6,8-7,0), с добавлением 0,1% глюкозы. В качестве тест-культуры использовали штамм Bacillus subtilis 6633 (концентрация суспензии ~ 40-50 млн. спор/ мл среды).

ß-лактамазную активность рассчитывали по следующей формуле:

А = (0,5-С - N)-10/(0,5-D-t) = (0,5-С - N)-20/(D-t), где А - ß-лактамазная активность (ЕД/минЮ млрд. клеток), С -исходная концентрация антибиотика, N - концентрация неразрушенного антибиотика, D - густота суспензии клеток исследуемой культуры, t - время инкубации в минутах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Определение чувствительности клинических штаммов грамотрицательных бактерий к ряду ß-лактамных. аминогликозидных и фторхинолоновых антибиотиков

Полученные нами данные о чувствительности штаммов основных исследованных таксономических групп к восьми ß-лактамным, двум аминоглико-зидным и двум фторхинолоновым антибиотикам представлены в таблице 2. Исследованные штаммы Е. coli обладали достаточно высокой чувстви-

тельностью к применявшимся ß-лактамным препаратам. Не менее 90% шта мов были чувствительны к каждому из препаратов этой группы, кроме а: пициллина с сульбактамом. Поскольку активность хромосомной ß-лактама у Е. coli, согласно литературным данным, незначительна, устойчивость ампициллину с сульбактамом, наблюдавшаяся у 19% штаммов, связана с а тивностью плазмидных ß-лактамаз. Наличие штаммов, устойчивых к цеф лоспоринам третьего и четвертого поколений (6% — к цефтазидиму, 3% к цефотаксиму и 1% — к цефпирому) свидетельствует о продукции пла мидных ß-лактамаз расширенного спектра действия.

Таблица

Чувствительность штаммов основных исследованных таксоножческ групп к применявшимся р-лакталшт, аминогликозидным и фторхинолонов антибиотикам.

Таксономическая Доля чувствительных штаммов (%)

группа _

MC ППТ ЦУР ЦТК ЦТЗ ЦПР АЗТ ИМП ГЕН АМК ОФЛ ЦИП

E. coli 72 97 91 95 94 99 92 100 85 95 100 99

Enterobacter spp. 50 83 72 85 82 93 73 96 79 89 97 92

Citrobacter spp. 61 89 68 82 89 92 84 97 79 92 97 95

Serratia spp. __ 55 — 50 50 80 50 85 20 80 45 50

Kl. pneumoniae 51 78 65 85 82 86 79 98 61 95 91 92

Kl. oxytoca 88 96 76 92 92 92 80 100 80 92 92 92

Pr. vulgaris 70 95 — 95 95 85 95 100 70 95 100 100

Pr. mirabilis 70 96 78 89 89 100 85 100 63 85 100 100

Pseudomonas spp. ~ 93 32 85 71 71 74 44 84 61 71

Ac inetofcacter spp. 41 67 — 31 56 51 -- 92 54 87 72 64

Условные обозначения: AMC — ампициллин с сульбактамом, ППТ - п перациллин с тазобактамом, ЦУР ~ цефуроксим, ЦТК -- цефотаксим, ЦТЗ цефтазидим, ЦПР — цефпиром, АЗТ — азтреонам, ГЕН ~ гентамици АМК — амикацин, ОФЛ — офлоксацин, ЦИП — ципрофлоксацин.

Анализ профилей антибиотикорезистентности показал, что абсолюта большинство (63%) исследованных штаммов Е. coli чувствительны ко вс применявшимся препаратам. Далее по распространенности следовали шта

лы, чувствительные лишь к ампициллину с сульбактамом. Наиболее полирезистентный из исследованных штаммов был нечувствителен ко всем приме-«вшимся препаратам, кроме офлоксацина.

Полученные данные позволяют сделать вывод, что при лечении инфекций, вызванных штаммами Е. coli, могут эффективно использоваться все исследованные ß-лактамные препараты.

Исследованные штаммы Enterobacter spp. обладали достаточно высокой чувствительностью к следующим ß-лактамным антибиотикам: цефалоспо-ринам третьего и четвертого поколений и пиперациллину с тазобактамом (было чувствительно более 80% штаммов). Согласно литературным данным, «ндуцибельная хромосомная ß-лактамаза неактивна в отношении данных препаратов. Дерепрессия хромосомной ß-лактамазы способна обеспечить устойчивость к цефалоспоринам третьего поколения и пиперациллину с тазобактамом, однако не исключено наличие и других факторов устойчивости: плазмидных ß-лактамаз расширенного спектра действия, а также нару-ления проницаемости клеточной стенки. Нечувствительность к цефпирому, наблюдавшаяся у 7% штаммов, вероятно, связана с продукцией плазмидных ß-лактамаз расширенного спектра действия.

Наиболее эффективным из ß-лактамных препаратов был имипенем (96% чувствительных штаммов). Следует, однако, отметить, что 4% исследованных штаммов были нечувствительны ко всем применявшимся препаратам, кроме фторхинолонов. Согласно литературным данным, это может объясняться сочетанием высокой ß-лактамазной активности с нарушением проницаемости клеточной стенки.

Исследованные штаммы Citrobacter spp. обладали достаточно высокой чувствительностью (более 80% чувствительных штаммов) ко всем применявшимся ß-лактамным препаратам, кроме ампициллина с сульбактамом и цефу-роксима. Цефпиром и цефтазидим существенно превосходили по активности цефотаксим. При этом, как показывает анализ множественной устойчивости, нечувствительность к цефпирому не всегда сопровождалась нечувствительностью к цефтазидиму. Наиболее активным из применявшихся ß-лактамных препаратов был имипенем. Следует отметить возможность быстрого роста устойчивости к фторхинолонам за счет штаммов с одно- или двухступенчатыми мутациями ДНК-гиразы. Эти штаммы сохраняют чувствительность к данным антибиотикам, однако МИК фторхинолонов для них значительно превышают значения, характерные для дикого типа.

Исследованные штаммы Serratia spp. отличались весьма высокой устойчивостью к применявшимся препаратам. Достаточно высокая чувстви-

тельность (80% и более чувствительных штаммов) наблюдалась лишь к ими пенему и амикацину. 10% штаммов были нечувствительны ко всем применяв' шимся препаратам.

Изученные штаммы Kl. pneumoniae обладали достаточно высокой чувствительностью (более 80% чувствительных штаммов) к цефалоспоринш третьего и четвертого поколений, имипенему, фторхинолонам и амикацину Следует, однако, отметить, что около 15% штаммов обладают плазмидныш р-лактамазами расширенного спектра действия, обеспечивающими нечувствительность не только к цефалоспоринам третьего поколения, но и ) цефпирому. При этом обнаружено, что штаммов, устойчивых к цефтазидиму, было существенно больше, чем устойчивых к цефотаксиму (соответствен» 11 и 5%). Несколько меньшая активность цефтазидима по сравнению с це-фотаксимом объясняется либо затрудненным проникновением этого цефалос-порина в клетку, либо продукцией плазмидных (>-лактамаз расширенной спектра действия, активных преимущественно в отношении цефтазидим; (ТЕМ—10, ТЕМ-26). Поскольку, как показывают результаты исследований, проведенных в Западной Европе и США, существует возможность быстрой распространения плазмидных (3-лактамаз расширенного спектра действия i клинических популяциях Kb. pneumoniae (Sanders, Sanders, 1992), следует ожидать быстрого роста устойчивости к этим цефалоспоринам.

Наиболее эффективным из применявшихся (S-лактамных препаратов бьи имипенем, к которому были чувствительны 98% штаммов. Весьма высоко! активностью обладали также фторхинолоны и амикацин. При этом, однако, возможен значительный рост устойчивости к фторхинолонам за счет ступенчатых мутаций ДНК-гиразы.

Исследованные штаммы Kl. oxytoca. отличались достаточно высоко} чувствительностью к применявшимся препаратам. К каждому из них, з; исключением цефуроксима, азтреонама и гентамицина, были чувствительш более 80% штаммов. Наиболее эффективным из применявшихся препарата! был имипенем, к которому были чувствительны все исследованные штаммы. Не было отмечено штаммов, устойчивых к цефпирому и пиперациллину с та-зобактамом.

Абсолютное большинство (64%) исследованных штаммов были чувствительны ко всем применявшимся препаратам. Однако выявлен полирезистентный фенотип (8% от общего числа штаммов), нечувствительный ко Beet применявшимся цефалоспоринам, азтреонаму и амикацину. Представляет интерес то, что при этом данный фенотип сохраняет чувствительность к ам-

пициллину с сульбактамом. Это, вероятно, связано с продукцией плазмид-ной (3-лактамазы расширенного спектра действия, высокочувствительной к икгибированкю сульбактамом.

Исследованные штаммы Рг. vulgaris обладали высокой чувствительностью к применявшимся препаратам. К каждому из ник были чувствительны не менее 70% штаммов. Следует отметить существенно более низкую эффективность цефпирома по сравнению с цефалоспоринами третьего поколения (соответственно 85 и 95% чувствительных штаммов). Поскольку известно, что цефпиром менее подвержен действию ¡3-лактамаз и легче проникает в клетку, чем цефалоспорины третьего поколения, возможным объяснением этого явления могут быть свойства ПСБ. К имипенему и фторхинолонам были чувствительны все исследованные штаммы.

Исследованные штаммы Pr. mirabilis обладали достаточно высокой чувствительностью к применявшимся препаратам. К каждому из них, за исключением гентамицина, было чувствительно не менее 10% штаммов. К цефпирому, имипенему и фторхинолонам были чувствительны все исследованные штаммы, отсутствовали штаммы, устойчивые к. пиперациллину с та-зобактамом.

Анализ профилей антибиотикорезистентности штаммов Pr. mirabilis показал, что нечувствительность к цефалоспоринам третьего поколения может сопровождаться чувствительностью к ампициллину с сульбактамом. Наличие штаммов, нечувствительных одновременно к цефалоспоринам третьего поколения и аминогликозидам, показывает, что возможна связь между плазмидными генами (5-лактамаз расширенного спектра действия и детерминантами устойчивости к аминогликозидам.

Из других таксономических групп энтеробактерий все исследованные штаммы Kl. ozaenae, Е. hermanii и 5. enteritidis были чувствительны ко всем применявшимся препаратам. Все штаммы Morganella morganii были чувствительны ко всем препаратам, кроме ампициллина с сульбактамом и цефуроксима. Весьма высокой антибиотикорезистентностью отличались исследованные штаммы Providencia stuartii. Все они были нечувствительны к ампициллину с сульбактамом, цефуроксиму, гентамицину и фторхинолонам.

Исследованные штаммы Pseudononas spp. обладали достаточно высокой устойчивостью к применявшимся препаратам. Лишь к пиперациллину с тазо-бактамом, цефтазидиму и амикацину были чувствительны более 80% штаммов.

Наиболее эффективным из применявшихся препаратов был пиперациллин ; тазобактамом, к которому были чувствительны 93% штаммов. Наличие

штаммов, устойчивых к этому препарату, вероятно, связано с высокс степенью дерепрессии хромосомной ß-лактамазы. Высокоэффективен бь также цефтазидим, существенно превосходивший по активности цефпирс (85 и 71% чувствительных штаммов соответственно). Имипенем существен^ уступал по активности пиперациллину с тазобактамом и цефтазидиму -этому препарату были чувствительны 74% штаммов. Относительно высоке устойчивость к этому препарату объясняется нарушением проницаемое! клеточной стенки и/или высокой степенью дерепрессии хромосомной ß-лаь тамазы.

Из альтернативных препаратов наиболее активным был амикацин (84 чувствительных штаммов). Следует отметить относительно высокий уровеь устойчивости к фгорхинолонам (29% штаммов устойчивы к офлоксацину 27% ~ к ципрофлоксацину). Таким образом, применение данных фторхинс лонов из-за возможности быстрого роста устойчивости к этим препарат* следует резко ограничить.

Исследованные штаммы Acinetobacter spp. обладали весьма высокс устойчивостью к применявшимся препаратам. Лишь к имипенему и амикацш были чувствительны более 80% штаммов. Относительно высокой активност! обладали пиперациллин с тазобактамом (67% чувствительных штаммов) фторхинолоны (72% штаммов были чувствительны к офлоксацину и 64% ~ ципрофлоксацину).

Из представителей других таксономических групп неферментирующ! бактерий наибольшая антибиотикорезистентность наблюдалась у Stenotro¡ homonas maltophilia (единственный исследованный штамм был чувствител( лишь к офлоксацину) и у штаммов Alcaligenes spp., в отношении котор! эффективны были лишь имипенем и пиперациллин с тазобактамом (по 81 чувствительных штаммов), а также цефтазидим (70% штаммов были чувств] тельны). Наиболее чувствительными были штаммы Cedacia spp. (чувств! тельны ко всем применявшимся препаратам) и Kluyvera spp. (более 81 штаммов были чувствительны ко всем препаратам, кроме ампициллина сульбактамом).

Выявлена достаточно четкая зависмость устойчивости исследованш штаммов от центров, в которых они выделялись (табл. 3). В 13-й ДГ1 Москвы им. Филатова были выделены наиболее устойчивые штаммы, чувств] тельность которых ко всем применявшимся препаратам была значителы ниже средней (т.е. доля чувствительных штаммов была ниже доли чувств: тельных штаммов среди всей исследованной микрофлоры), причем к бол шинству из них — самой низкой по сравнению со штаммами, выделенными

Таблица 3.

Антибиотикочувствительность исследованных штаммов грамотрицатель-ных бактерий, выделенных в разных центрах.

Центр Доля чувствительных штаммов (%)

AMC ППТ ЦУР ЦТК ЦТЗ ЦПР АЗТ ИМП ГЕН АМК ОФЛ ЦИП

Онкологический НЦ 42 73 36 62 79 82 66 95 65 91 73 74

Гематологический НЦ 40 74 66 74 81 84 69 83 60 78 98 90

13-я ДГКБ М. 17 50 21 38 70 63 67 71 33 90 63 65

КБ УД ПРФ 73 98 68 90 94 98 85 100 91 95 99 100

15-я ГКБ М. 63 89 72 84 83 91 78 98 67 86 93 93

BMA 57 94 60 76 90 86 82 96 70 82 97 97

2-я ГКБ С.-П. 43 77 46 61 96 88 74 100 66 95 77 86

122-я ГКБ С.-П. 49 88 54 82 87 89 76 95 69 89 88 92

ЦБЛ Рязани 67 97 95 97 94 99 94 100 88 96 100 98

Среднее 49 81 57 73 85 86 77 93 67 89 87 88

Условные обозначения: М. — Москва, С. -П. — С.-Петербург.

других центрах. Столь высокая антибиотикоустойчивость микрофлоры, выделенной в ДГКБ им. Филатова связана с интенсивным применением антибиотиков в этом детском лечебном учреждении.

Штаммы, выделенные в Онкологическом НЦ, обладали чувствительностью ниже средней ко всем препаратам, за исключением имипенема и амикацина.

Выделенные в Гематологическом НЦ штаммы обладали чувствительностью ниже средней к большинству применявшихся препаратов.

Чувствительность штаммов, выделенных в 15-й ГКБ Москвы, к большинству препаратов была незначительно выше среднего уровня.

Микрофлора, выделенная в КБ УД ПРФ, по сравнению с микрофлорой, зьщеленной в других центрах Москвы, отличалась исключительно высокой антибиотикочувствительностью. Чувствительность штаммов, выделенных в чанном центре, ко всем применявшимся препаратам была значительно выше вредней. При этом все штаммы, выделенные в КБ УД ПРФ, были чувствительны к имипенему и ципрофлоксацину. Высокий уровень антибиотикочувс-

твительности штаммов, выделенных в КБ УД ПРФ, вероятно, связан с yt. ренным применением антибиотиков в этом центре.

Выделенные в BMA С.-Петербурга штаммы обладали чувствительное! существенно выше средней к большинству препаратов.

Чувствительность штаммов, выделенных во 2-й ГКБ С.-Петербурга, большинству препаратов была близка к средней, однако все штаммы бь чувствительны к имипенему и наблюдалась самая высокая чувствительное к цефтазидиму.

Чувствительность штаммов, выделенных в 122-й ГКБ С.-Петербур1 была близка к средней.

Штаммы, выделенные в ЦЕЛ Рязани, отличались исключительно высо* чувствительностью к антибиотикам. Чувствительность штаммов как энте{ бактерий, так и неферментирующих бактерий, выделенных в данном цент[ ко всем применявшимся препаратам была значительно выше средней, при1 к большинству из них ~ наибольшей по сравнению со штаммами, выделе ными в других центрах. Все штаммы были чувствительны к имипенему и с локсацину.

В целом существенно более низкий по сравнению со штаммами, вы; ленными в Москве, уровень антибиотикоустойчивости штаммов, выделен} в С.-Петербурге и особенно в Рязани, вероятно, связан с менее интс сивным применением новых антибиотиков в клиниках этих городов.

Изучена также зависимость антибиотикоустойчивости исследоваш штаммов от источников их выделения (табл. 4). Чувствительность штг мов, выделенных из мочи, практически совпадала со средней. Лишь к аг кацину была отмечена наименьшая чувствительность по сравнению со штг мами, выделенными из других источников.

Чувствительность штаммов, выделенных из кала и пищеварительнс тракта, к применявшимся препаратам была близка к средней.

Штаммы, выделенные из зева, отличались достаточно высокой антШ отикоустойчивостью. Они обладали чувствительностью значительно m средней ко всем применявшимся препаратам, за исключением амикащ причем к большинству препаратов была отмечена самая низкая чувстЕ тельность по сравнению со штаммами, выделенными из других источнико£

Чувствительность штаммов, выделенных из мокроты и органов ды> ния, к большинству препаратов была близка к средней, однако доля штг мов, чувствительных к цефуроксиу, азтреонаму и фторхинолонам, была с щественно ниже средней.

Таблица 4.

Лншбиошкочувствшельноскь исслеЭованных штатов грамотрицатель-кых бактерий, выделенных из разных источников.

Источник Доля чувствительных штаммов (%)

амс ппт цур цтк цтз цпр азт имп ген амк офл цип

Моча 49 82 55 72 84 86 77 92 64 86 87 88

Кал, пщт 53 81 57 75 81 87 75 94 67 90 90 92

Зев 18 56 28 43 79 69 72 64 41 90 62 64

Мокрота, одх 49 80 47 68 87 85 71 93 67 88 83 81

Раны, гной 41 77 47 66 85 77 72 95 59 91 82 85

{ровь 15 69 62 85 100 92 85 100 62 92 92 100

вреднее 49 81 57 73 85 86 77 93 67 89 87 88

Условные обозначения: ПЩТ — пищеварительный тракт, ОДХ — органы дыхания.

Штаммы, выделенные из ран и гноя, обладали чувствительностью ниже :редней к большинству препаратов.

Было исследовано лишь небольшое число штаммов, выделенных из кро-ш, что не позволило получить статистически достоверных данных об их штибиотикоустойчивости. Однако имеющиеся данные позволяют заключить, [то чувствительность штаммов, выделенных из этого источника, к боль-[инству препаратов была значительно выше средней.

азработка модифицированного микроиодометшческого метода определения

активности (3-лактамаз

Поскольку главным механизмом устойчивости исследованных таксоно-ических групп является продукция В-лактамаз, для изучения этого меха-изма был разработан модифицированный микроиодометрический метод опре-еления субстратного и ингибиторного профилей данных ферментов. Разра-отанный метод позволяет проводить быстрое определение ¡3-лактамазной ктивности в большом количестве проб без предварительного разрушения икробных клеток.

Новизна разработанного метода заключается в том, что оптическ; плотность реакционной смеси, находящаяся в обратной зависимости от ю личества антибиотика, гидролизованного ß-лактамазами, определяется ki лориметрически в иммунологическом планшете. Определение исходной пло1 ности реакционной смеси дает возможность как определить густоту су> пензии исследуемых микробных клеток, так и учесть влияние микробн суспензии на конечную оптическую плотность реакционной смеси при ра чете ß-лактамазной активности. Полное расщепление ß-лактамных антиби тиков при построении калибровочной кривой проводится путем щелочно гидролиза.

По сравнению с применявшимися ранее методами данный метод отлич ется простотой и требует меньшего расхода посуды и реактивов, что да возможность для его широкого применения в клинической практике.

Модифицированный микроиодометрический метод дает надежные резул таты при определении ß-лактамазной активности в отношении пенициллин и цефалоспоринов первого поколения, а также при определении влиян ингибиторов на ß-лактамазную активность. Параллельное определен ß-лактамазной активности одних и тех же штаммов бактерий модифицир ванным микроиодометрическим и стандартным иодометрическим методами п казало высокую степень совпадения результатов, полученных обоими мет дами. Многократное повторение опытов показало высокую достоверное результатов, полученных при помощи нового метода.

Исследование субстратного и ингибиторного профилей ß-лактамаз высокоустойчивых штаммов энтеробактерий

Было проведено исследование субстратного и ингибиторного профш ß-лактамаз семи высокоустойчивых клинических штаммов энтеробактер* одного штамма £. coli, трех штаммов Е. aerogenes, двух штаммов Е. с1 асае и одного штамма Kl. pneumoniae. Значения МИК ряда ß-лактамных а тибиотиков для этих штаммов приведены в таблице 3. Была определена г тивность ß-лактамаз этих штаммов в отношении бензилпенициллина, амг циллина, карбенициллина, оксациллина, цефалотина, цефотаксима и цефт зидима, а также ингибиторная активность сульбактама, азтреонама и д> локсациллина в отношении данных ß-лактамаз. При определении ингибитс ной активности ß-лактамаз субстрат (бензилпенициллин) и ингибитор б{ лись в соотношении 4:1. Все эти исследования, за исключением определ ния активности в отношении цефотаксима и цефтазидима (для которых г.»

оиодометрический метод не дает надежных результатов), проводились при :омощи модифицированного микроиодометрического метода.

Субстратный и ингибиторный профили ß-лактамаз из Е. coli 13 были арактерны для плазмидных ТЕМ или SHV ß-лактамаз (табл. 5). Активность : отношении цефалоспоринов третьего поколения была промежуточной между начениями, характерными для плазмидных ß-лактамаз широкого спектра ;ействия подгруппы 2Ь (по классификации Bush, 1989b) и ферментов рас-¡иренного спектра действия. Это дает основание предположить, что у ¡анного штамма имеются две плазмидные ß-лактамазы: широкого спектра ;ействия подгруппы 2Ь (наиболее вероятно — ТЕМ-1) и расширенного пектра действия, способная со значительной скоростью гидролизовать ;ефалоспорины третьего поколения и при этом чувствительная к действию нгибиторов (подгруппы 2be) (Bush, Jacoby, Medeiros, 1995).

Штаммы Е. aerogenes 40 и 41 являются гиперпродуцентами хромосомой цефалоспориназь:. Значения МИК ß-лактамных антибиотиков и субстрат-ые и ингибиторные профили ß-лактамаз этих штаммов весьма близки друг другу (табл. 5, 6).

Штамм Е. aerogenes 42 значительно уступал двум другим исследован-ым штаммам Е. aerogenes по устойчивости к цефалоспоринам третьего по-оления. Однако по сравнению с активностью в отношении бензилпеницил-ина ß-лактамазная активность Е. aerogenes 42 в отношении цефалоспори-ов третьего поколения была выше, чем у гиперпродуцентов хромосомной ефалоспориназы. Ингибиторный профиль ß-лактамазы из Е. aerogenes 42 ыл также отличен от соответствующего профиля гиперпродуцентов хромо-омного фермента (табл. 6). Это дает основание предположить, что про-ежуточный уровень устойчивости к цефалоспоринам третьего поколения беспечивается за счет активности плазмидной ß-лактамазы расширенного пектра действия, которая продуцируется наряду с индуцибельной хромо-омной цефалоспориназой.

Штаммы Е. cloacae 48 и 49 являются гиперпродуцентами хромосомных ефалоспориназ, при этом субстратный и ингибиторный профили ферментов з этих штаммов существенно различаются (табл. 6). Цефалоспориназа из . cloacae 48 значительно превосходила фермент из Е. cloacae 49 по ак-гоности в отношении цефалоспоринов третьего поколения, однако уступа-î ему по активности в отношении карбенициллина. Азтреонам и диклокса-здлин ингибировали ß-лактамазу из Е. cloacae 48 сильнее, чем (5-лакта-1зу из £. cloacae 49. Полученные данные позволяют заключить, что у ^следованных двух штаммов Е. cloacae имеются различные типы хромосом-

Таблица 5

Значения МЖ (5-лакшшш: антибиотиков для высокоустойчивых клипи ческих штаммов грамошрицателькых бактерий.

Штамм МИК (мкг/мл)

АМП AMC КРБ ЦЛТ ЦТК ЦТЗ

Е. соli 13 2048 64 512 1024 32 2

Е. aerogenes 40 1024 128 2048 2048 128 64

Е. aerogenes 41 512 128 256 2048 128 128

Е. aerogenes 42 512 64 1024 1024 16 8

Е. cloacae 48 4096 128 1024 4096 256 128

Е. cloacae 49 1024 128 1024 2048 128 64

К1. , pneumoniae 24 512 32 - 512 8 8

Условные обозначения: АМП - ампициллин; КРБ - карбенициллин: ЦЛ1 цефалотин.

Таблица (

Субстратный и ингибиторный профили fi-лактамаз еысокоуспойчивъ ташов этеробатерш.

Штамм р-лактамазная активность (ЕД/мин-10 млрд. клеток)

БПН АМП КРБ OKC ЦЛТ ЦТК ЦТЗ СЛБ A3T ДКЛ

E. coli 13 100 122 17 21 74 1.8 0,3 3 56 >100

E. aerogenes 40 100 18 0,5 <0,1 594 0,2 0,1 45 22 31

E. aerogenes 41 100 33 0,3 <0,1 662 0,2 0,1 49 19 29

£. aerogenes 42 100 69 3 0,3 307 1,7 0.8 25 41 53

E. cloacae 48 100 11 0,1 <0.1 928 0,9 0,2 33 9 22

E. cloacae 49 100 15 0.3 <0,1 879 0,5 0,07 36 15 34

Kl. . pneumoniae 24 100 127 11 3 36 0,2 <0,01 16 64 >100

Условные обозначения: БПН - бензилпенициллин; ОКС - оксацилли! СЛБ - бензилпенициллин с сульбактамом; АЗТ - бензилпенициллин с азтр! онамом; ДКЛ - бензилпенициллин с диклоксациллином.

й цефалоспориназы: предположительно, у Е. cloacae 48 — цефалоспори-за типа А, а у Е. cloacae 49 — цефалоспориназа типа В (Seeberg, lxdorff-Neutziing, Wiedemann, 1933).

Штамм Kl. pneumoniae 24 обладает плазмидной (5-лактамазой широкого ектра действия, практически не активной в отношении цефалоспоринов 1етьего поколения. Низкая чувствительность данного штамма к этим цело с пор и нам (табл. 5) связана с другими механизмами устойчивости, на-юлее вероятно — с нарушением проницаемости клеточной стенки.

ВЫВОДЫ

1) Исследованные штаммы грамотрицательных бактерий были наиболее .'зствительны к следующим ß-лактамным антибиотикам: штаммы Е. coli, Ltrotecter spp. и Pr. mirabilis — к имипенему, цефпирому и пипера-¡ллину с тазобактамом; штаммы Enterobacter spp. и Serratia spp. — к шпенему и цефпирому; штаммы Kl. pneumoniae — к имипенему, цефпирому цефотаксиму; штаммы Kl. oxytoca — к имипенему и пиперациллину с та-збактамом; штаммы Pr. vulgaris — к имипенему, пиперациллину с тазо-1Ктамом и цефотаксиму; штаммы Pseudomonas spp. — к пиперациллину с 13обактамом и цефтазидиму и штаммы Acinetobacter spp. — к имипенему.

2) Цефпиром превосходил цефалоспорины третьего поколения по ак--¡вности в отношении штаммов Е. coli, Enterobacter spp., Citrobacter эр., Serratia spp., Kl. oxytoca и Pr. mirabilis, обладал примерно авной с ними активностью в отношении штаммов Kl. pneumoniae и сущест-знно уступал по активности в отношении штаммов Pr. vulgaris обоим це-алоспоринам третьего поколения, а в отношении Pseudomonas spp. и Лсг-etobacter spp. — цефтазидиму.

3) Из альтернативных препаратов фторхинолоны по активности в от-ошении штаммов Е. coli, Enterobacter spp., Citrobacter spp., Pr. vul-aris и Pr. mirabilis находились на уровне имипенема и существенно ревосходили другие ß-лактамные антибиотики. Амикацин был наиболее эф-ективным из альтернативных препаратов в отношении штаммов Kl. pneumo-iae, Serratia spp., Pseudomonas spp. и Acinetobacter spp.

4) Разработанный нами модифицированный микроиодометрический метод пределения ß-лактамазной активности дает надежные результаты при оп-еделении субстратного и ингибиторного профиля ß-лактамаз.

5) Штамм Е. coli 13 обладает двумя плазмидными ß-лактамазами: ши рокого спектра действия и расширенного спектра действия. Штаммы Е. ае rogenes 40 и 41 являются гиперпродуцентами хромосомной цефалоспорина зы. Штамм Е, aerogen.es 42 наряду с индуцибельной хромосомной цефалос пориназой обладает плазмидной ß-лактамазой расширенного спектра дейс твия. Штаммы Е. cloacae 48 и 49 являются гиперпродуцентами хромосомно цефалоспориназы, при этом субстратный и ингибиторный профили ферменте из этих штаммов существенно различаются. Штамм Kl. pneumoniae 24 обла дает ß-лактамазой широкого спектра действия. Пониженная чувствитель ность этого штамма к цефалоспоринам третьего поколения связана с др^ гими механизмами устойчивости.

1. Макаров А.Н., Сидоров М.А., Сидоренко C.B. Новый метод опреде ления ß-лактамазной активности бактерий.// Материалы международной ш учно-технической конференции "Пища. Экология. Человек." - Москвг МГАПБ, 4-6 декабря 1995 г. - С. 206.

2. Макаров А.Н., Сидоров М.А., Сидоренко C.B. Определение суб( тратного и ингибиторного профилей ß-лактамаз ряда штаммов грамотриц< тельных патогенных бактерий.// Материалы международной научно-техш ческой конференции "Пища. Экология. Человек." - Москва, МГАПБ, 4-6 д( кабря 1995 г. - С. 207.

3. Макаров А.Н., Сидоренко C.B. Бактериальные ß-лактамазы.// Ai тибиотики и химиотерапия. - 1996. - Т. 41, № 1. - С. 45-58.

4. Сидоренко C.B., Резван С.П., Макарова P.A., Макаров А.Н., К< зова Н.С., Огнева Н.С., Королев Ю.С., Гладин Д.П. Механизмы устойч] вости к хинолонам и современный уровень чувствительности клиничеа значимых микроорганизмов к офлоксацину.// Антибиотики и химиотерапи: - 1996. - Т. 41, № 9. - С. 33-38.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ