Автореферат и диссертация по медицине (14.01.09) на тему:Хроническая HBV-инфекция: молекулярно-генетические методы диагностики, оптимизирующие тактику ведения пациентов

На правах рукописи

ДУДИНА Кристина Рубеновна

ХРОНИЧЕСКАЯ НВУ-ИНФЕКЦИЯ: МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ, ОПТИМИЗИРУЮЩИЕ ТАКТИКУ ВЕДЕНИЯ ПАЦИЕНТОВ

14.01.09- инфекционные болезни

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

2 9 СЕН 2011

Москва-2011

4854915

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный консультант:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Ющук Николай Дмитриевич

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Шахгильдян Иосиф Васильевич

Руководитель лаборатории эпидемиологии, диагностики и профилактики вирусных гепатитов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России

доктор медицинских наук, профессор

Беляева Наталья Михайловна

Заведующая кафедрой инфекционных болезней ГОУ ДПО РМАПО Минздравсоцразвития России

доктор медицинских наук, профессор

Никитин Игорь Геннадьевич

кафедра госпитальной терапии лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России

Ведущее учреждение - ГОУ ВПО Первый Московский Государственный Медицинский Университет им. И.М.Сеченова Минздравсоцразвития России.

Защита диссертации состоится октября 2011 г. в «12» часов на заседании диссертационного совета Д 208.131.01 ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России (123 098, Москва, ул. Гамалеи, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России

Автореферат разослан 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Бурцева Елена Ивановна

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Хронический гепатит В продолжает оставаться социально-значимой проблемой мирового равоохранения и является одной из основных причин формирования ЦП и ГЦК, которые егодно в мире приводят к летальному исходу более, чем у 1 миллиона человек [Bosch F.X. et ., 2005]. Анализ заболеваемости вирусными гепатитами в России показал, что по сравнению с -ми годами, в России с 2001 года наблюдается отчётливая тенденция к снижению болеваемости острым вирусным гепатитом В, благодаря проведению массовой вакцинации селения в рамках приоритетного национального проекта «Здоровье» и борьбе с наркоманией, днако в течение последнего десятилетия показатель заболеваемости ХГВ удерживается на режнем уровне. Современной эпидемиологической особенностью гепатита В является минирование полового пути передачи инфекции и изменение возрастного состава болевших: общее число больных приходится на долю лиц в возрастных группах 19-29 и 30-39 среди которых плановую вакцинацию, как правило, не проводили. В связи с этим, в астоящее время распространение HBV реализуется естественными путями передачи, такими ак половая и перинатальная [Письмо от4 марта 2011 г. N 01/2390-1-32. Федеральная служба по адзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Минздравсоцразвития оссии; Шахгильдян И.В. и др., 2006; Шахгильдян И.В. и др., 2011].

Клинические проявления и исходы хронической HBV-инфекции во многом определяются заимодействием HBV и макроорганизма, а именно факторами вируса (генотипы HBV, уровень епликации HBV, рекомбинации и мутации вируса) и макроорганизма (возраст на момент нфицирования, давность инфицирования, пол, иммунный статус), а также экзогенными акторами (ко-инфицирование другими гепатотропными вирусами, употребление алкоголя) McMahon B.J., 2004; Fattovich G. et al„ 2008; EASL, 2009].

В последнее десятилетие изучается влияние генетической вариабельности HBV на течение исход заболевания. С помощью методов секвенирования появилась возможность определения азличных генотипов и мутантных форм вируса HBV, отличающихся низким уровнем епликации, латентным характером течения инфекции, более активным поражением печени, оявляются данные, указывающие на то, что генотип HBV может влиять на скорость НВе-ероконверсии, тяжесть течения болезни, частоту хронизации и вероятность развития ГЦК. С азными генотипами HBV связывают различные варианты манифестации заболевания и ответ а лечение у больных хронической HBV-инфекцией [Feld J.J., Heathcote E.J., 2006; Hadziyannis .J, Papatheodoridis G.V., 2006; EASL, 2009]. Под вопросом остается корреляционная связь ежду генотипом HBV и уровнем репликации HBV, а также степенью поражения печени и сходом заболевания.

В последние годы внедрение молекулярно-генетических методов исследования в . иническую практику позволило улучшить диагностику ХГВ и выделять хроническую HBV-нфекцию с высокой и низкой репликативной активностью HBV. Проведенные за последние 10

лет несколько крупномасштабных, длительных, проспективных когортных исследовани" выявили взаимосвязь между постоянно высоким уровнем виремии HBV и неблагоприятным исходами заболевания - ЦП и ГЦК [Yu M.W. et al., 2005; Chen C.J. et al, 2009]. Во много благодаря этим исследованиям постоянно высокий уровень виремии HBV в настоящее врем предлагается рассматривать в качестве одного из критериев назначения пациенту с хроническо HBV-инфекцией ПВТ, целью которой является предотвращение неблагоприятных исходо заболевания путем снижения уровня виремии HBV до неопределяемого, вследствие че происходит улучшение гистологической картины печени. До настоящего времени отсутствуг Российские национальные рекомендации по тактике ведения пациентов с хронической HBV инфекцией. Однако специалисты в России, обсуждая результаты международных исследовани на научных конференциях, также отмечают целесообразность использования определени уровня вирусной нагрузки HBV при динамическом обследовании для выработки тактик ведения пациента.

Благодаря появлению коммерческих тест-систем, позволяющих выявлять количественно содержание HBsAg в крови, в настоящее время активно изучается клиническое значени данного показателя. Часть работ, посвященных определению количественного содержани HBsAg в крови, показала прямую корреляцию уровня виремии HBV с концентрацией HBsA [Deguchi M. et al., 2004; Wang G.S. et al., 2004]. Ряд других работ демонстрирует слаб) корреляцию концентрации HBsAg с уровнем виремии HBV и различные диапазонь количественного содержания поверхностного антигена в крови у больных НВе-позитивным НВе-негативным ХГВ [Kuhns М.С. et al., 2004; Thompson A.J. et al., 2009; Lu L. et al., 2009 Thompson A.J. et al., 2010].

До настоящего времени в России не проводились исследования, посвященны комплексному обследованию большой группы пациентов с хронической HBV-инфекцией включающему динамическое определение активности АлАТ и АсАТ в крови, виремии HBV серологического уровня HBsAg, морфологическое исследование ткани печени в сочетании генетической вариабельностью HBV и генетически детерминированным риском развития ЦП человека. Данный диагностический подход может позволить разработать алгоритм оптимизировать тактику ведения больных при многовариантном течении ХГВ. Учитыв имеющиеся нерешенные клинические проблемы, касающихся тактики ведения пациентов хронической HBV-инфекцией, были сформулированы цели и задачи данного исследования.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: клинико-лабораторное обоснование использовани молекулярно-генетических методов диагностики в совершенствовании тактики ведени больных с различными вариантами хронической HBV-инфекции и создание алгоритма действи" врача при обследовании пациентов.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Оценить клиническое и прогностическое значение комплекса диагностических методик, лючающих определение уровня виремии НВУ, концентрации НВзА§ в крови при намическом наблюдении пациентов с хронической НВУ-инфекцией в сочетании с рфологическим исследованием пунктата печени и генетически детерминированным риском 1вития ЦП.

2. Определить особенности клинического течения хронической НВУ-инфекции на фоне ременности с учетом уровня виремии НВУ.

3. Определить уровень виремии НВУ при динамическом наблюдении у пациентов с зличными вариантами течения хронической НВУ-инфекции (НВе-позитивный ХГВ, Ве-негативный ХГВ, неактивное носительство НВУ).

4. Сопоставить показатели уровня активности АлАТ и АсАТ в крови, виремии НВУ и орфологические характеристики ткани печени у пациентов с различными вариантами

онической НВУ-инфекции для выявления больных с показаниями к назначению ПВТ.

5. Провести сравнительный анализ результатов оценки фиброза печени инвазивным и инвазивным методами диагностики у пациентов с хронической НВУ-инфекцией для оценки ли больных с прогрессирующим течением заболевания (И > 2).

6. Определение количественного содержания НВ5А£ в крови у неактивных носителей ВУ и пациентов с различными вариантами течения ХГВ при динамическом наблюдении.

7. Изучить генетическую вариабельность НВУ с помощью методов ПЦР и \1ALDI-T0F асс-спектрометрии, а также - распределение выявленных генотипов НВУ у пациентов с азличными вариантами течения хронической НВУ-инфекции.

8. Определить предикторы риска развития ЦП у больных ХГВ на основе анализа олиморфизма 11 кандидатных генов (АгШ1, ТЬЯ4, ТИРМ5, («2290351), ге4290029), БОТб (гз17740066), А(ЗР2, АОН1В, АЬЭН2, СУР2ЕЫац1, СУР2Е1-рзП) человека с омощью метода МАЬЭМОГ масс-спектрометрии.

9. Усовершенствовать алгоритм по тактике ведения пациентов с различными вариантами ронической НВУ-инфекции в зависимости от комплекса диагностических критериев: степени иска формирования ЦП на основе данных генетического анализа, геноварианта НВУ, инамики уровня виремии НВУ, концентрации HBsAg в крови, биохимической активности

патита, морфологических изменений ткани печени.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Только комплексное обследование пациентов с хронической НВУ-моноинфекцией, включающее динамическое определение уровней активности АлАТ, количественного

содержания ДНК НВУ, НВ5А§ в крови, позволяет выявить пациентов с неактивны носительством НВУ, а также лиц, которым требуется проведение ПБП для уточнения диагноз и выявления показаний для назначения ПВТ.

2. У пациентов с хронической НВУ-инфекцией, преимущественно, регистрируются низки уровни виремии НВУ в крови при динамическом трехкратном обследовании в течение 1,5-2-лет, НВеА§-негативный вариант хронической НВУ-инфекции и инфицирование генотипом НВУ.

3. Значимое повреждение печени (ИГА > 6 и/или И > 2), являющееся показанием дл проведения ПВТ, выявляется у пациентов с хронической НВУ-инфекцией, как на фон отсутствия ДНК НВУ в крови (при однократном обследовании), так и на фоне различно; уровня виремии НВУ (постоянно низкого, постоянно высокого и волнообразного), а также пр нормальной и повышенной активности АлАТ в крови.

4. При сравнительном анализе данных двух методов оценки фиброза печени (ПБП и ТФ) применяемых у пациентов с хронической НВУ-инфекцией, выявлено преимущественн несоответствие результатов, а именно в ряде случаев переоценка, а в большинстве случае недооценка стадии фиброза по данным ТФ при сравнении с результатами морфологическо исследования биоптата печени.

5. Концентрация НВзА§ в крови при хронической НВУ-инфекции значительно варьирует не коррелирует с уровнем виремии НВУ у НВеА§-негативных пациентов в крови, снижается большинства лиц с неактивным носительством НВУ при трехкратном динамическо обследовании в течение 1,5 - 2-х лет, а у части из них - до минимальных значений последующей сероконверсией (HBsAg«-»/aнти-HBs«+»), что позволяет рекомендоват использование данного показателя в качестве дополнительного критерия благоприятно исхода хронической НВУ-инфекции у лиц с нормальной активностью АлАТ в крови авиремией НВУ при динамическом обследовании.

6. Как у пациентов без признаков хронического диффузного поражения печени старше 5 лет и в отсутствии инфицирования НВУ и НСУ, так и у больных ЦП различной этиологии преобладает частота выявления «неблагоприятных» вариантов аллелей генов А2ГЫ1, ТЯЬ (ге4986791), ТЯРМ5 (гз886277), (^2290351), А(}Р2 (^2878771), СУР2Е1-р1з1 определяющих генетическую предрасположенность к развитию неблагоприятного исхода ХЗП.

7. Выявление высокого и неопределенного генетически детерминированного риско развития ЦП у подавляющего большинства больных ЦП вирусной, алкогольной и криптогенно этиологии, более частая регистрация низкого генетического риска ЦП у лиц с неактивны носительством НВУ и его отсутствие в группе пациентов с неэффективностью ПВТ по данны анамнеза, позволяет рассматривать данный показатель как критерий возможно неблагоприятного исхода заболевания, что говорит о целесообразности определени генетического риска развития ЦП у кандидатов для назначения ПВТ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые применено комплексное обследование пациентов с естественным течением онической НВУ-инфекции, включающее количественное определение уровня в крови ДНК ВУ и НВ$А§ в сопоставлении с уровнем активности АлАТ, АсАТ в крови и оценкой степени спалительной активности и стадии фиброза печени с помощью инвазивного и неинвазивного годов диагностики фиброза печени для уточнения диагноза.

Определение уровня виремии НВУ у большой группы НВэАз-позитивных беременных енщин позволило уточнить вариант течения хронической НВУ-инфекции и выявить в 3,5% 1учаев реактивацию НВУ в третьем триместре беременности, характеризующуюся уровнем ремии 105 - 107 копий/мл на фоне высокой активности АлАТ и АсАТ в крови (до 20 Ы).

Впервые получены данные о клиническом значении количественного содержания НВвАд в эви как дополнительного критерия неактивного носительства НВУ у лиц с отсутствием тестируемого уровня ДНК НВУ при динамическом обследовании с интервалом 6 - 12 месяцев течение 1,5 - 2-х лет.

Выявлены данные о низком уровне количественного содержания HBsAg в крови у ациентов за 6-12 месяцев до сероклиренса НВзА£ (в диапазоне от 15 до 600 МЕ/мл) и нижение минимальных концентраций поверхностного антигена в динамике наблюдения у еактивных носителей НВУ.

При сопоставлении данных ПБП и ТФ показано, что в большинстве случаев регистрируется есовпадение результатов этих двух методов диагностики фиброза печени,как в виде едооценки, так и в виде переоценки неинвазивным методом диагностики стадии фиброза ечени у пациентов с хронической НВУ-инфекцией, и обосновано предпочтение метода ПБП.

Впервые с использованием определения полиморфизма 7 кандидатных генов выявлены оли высокого, неопределенного и низкого генетически детерминированных рисков развития П при вирусной, алкогольной и неизвестной этиологии данного заболевания, а также оказано, что генетически детерминированный низкий риск развития ЦП чаще выявляется у ^активных носителей НВУ, чем у пациентов с другими вариантами течения хронической НВУ-нфекции.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

1. Показана целесообразность внедрения в практическое здравоохранение арсенала овременных молекулярно-генетических методов, включающих количественное определение НК НВУ, НВ$А§, комбинацию инвазивной и неинвазивной диагностики фиброза печени, пределение генетической вариабельности генома НВУ и человека, что позволит уточнить диагноз пациенту с хронической НВУ-инфекцией, прогнозировать исход заболевания и выбрать

кандидатов для назначения ПВТ.

2. Обоснована необходимость включения в стандартный план обследования HBsAg беременных женщин определение уровня виремии HBV методом ПЦР, что позволи контролировать течение хронической HBV-инфекции на фоне беременности и своевременн диагностировать её реактивацию.

3. Целесообразно использовать определение количественного содержания HBsAg в кров как дополнительный критерий диагноза неактивного носительства HBV при динамическо обследовании пациента.

4. Несмотря на широкое внедрение ТФ для неинвазивной диагностики фиброза печени, пациентов с хронической HBV-инфекцией предпочтительно применять ПБП, а дальнейше мониторирование выраженности фиброза печени возможно с применением ТФ.

5. У пациентов с НВе-негативной хронической HBV-инфекцией необходимо включить план обследования определение генетических рисков развития ЦП: выявление высоко1 генетически детерминированного риска развития ЦП в сочетании с уровнем виремии HBV >10 копий/мл вне зависимости от уровня активности АлАТ в крови является дополнительны основанием для назначения ПВТ без необходимости выполнения ПБП.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ, ПУБЛИКАЦИИ И ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ

Диссертация апробирована на заседании кафедры инфекционных болезней эпидемиологии ГОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России 26 мая 2011 г (протокол №108). Материалы диссертации доложены на Юбилейной XV научно-практической конференции «Клинические чтения в Мытищинской городской больнице. Инновационный университет практическому здравоохранению» (Мытищинская городская клиническая больница, 06 июня 2008); VI научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства» (Москва, 03.10.2008 г.), 111 конгрессе с международным участием «Российский Медицинский Форум - 2008», посвященный 250-летию Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (Москва, 19.11.2008 г.), VII научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства» (Москва, 02.10.2009 г.), научно-практической конференции кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава (Москва, протокол №83 от 30.09. 2009 г.), X Юбилейном съезде научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 05.03.2010 г.), II Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 29.03.2010 г.), VIII научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства» (Москва, 06.10.2010 г.), III Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 29.03.2011 г.), научно-практической конференции ГОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России (Москва. 28.04.2011 г).

Основные положения диссертации изложены в 27 печатных работах, опубликованных в риод с 2005 г. по 2011 г., из них - 13 в центральной печати, включая 1 монографию.

Материалы проведенных исследований используются в учебном процессе кафедры нфекционных болезней и эпидемиологии ГБОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России а до- и последипломном уровнях образования врачей: включены в лекционный материал, азбираются на практических занятиях со студентами и врачами на курсах повышения валификации. Предложенный алгоритм обследования пациентов с хронической НВУ-нфекцией используется в практической работе на базе Инфекционной клинической больницы »1 г. Москвы.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА

Личное участие автора в получении научных результатов заключалось в отборе пациентов в анное исследование, разработке дизайна исследования, изучении клинических, лабораторных морфологических данных, характерных для течения хронической НВУ-инфекции, изучении езультатов генетического анализа, полученного от больных ЦП различной этиологии и лиц онтрольной группы. Сформирован банк сывороток крови всех пациентов, включенных в сследование. Автором осуществлялось сопоставление результатов ТФ с данными ПБП. ыполнен статистический анализ полученных данных и проведено сопоставление результатов сследования с данными научной литературы.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 348 страницах и состоит из введения, обзора литературы, 7 глав -обственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и практических рекомендаций, абота иллюстрирована 64 таблицами, 43 рисунками, 3 клиническими примерами. Список штературы содержит 345 источников, из которых 23 отечественных и 322 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Объём, характер и методы проведённых исследований

В исследование включен 661 пациент, которых на основании клинико-лабораторных данных, полученных в ходе обследования, разделили на 5 групп: группа №1 - 103 НВзА§-позитивные пациентки на различных сроках беременности (подгруппа 1а - неактивные носители НВУ, п=43; подгруппа 16 - больные ХГВ без дельта-агента, п=43; подгруппа 1в - ХВГ смешанной этиологии, п=17 (И больных ХГВ+Д; 4 пациентки с ХГВ+С; 2 пациентки с ХГВ+С+Д); группа №2 - пациенты с хронической НВУ-моноинфекцией, п=189; группа №3 -

пациенты с ХВГ смешанной этиологии, п=36; группа №4 - больные ЦП различной этиологии, п=273 (подгруппа 4а - больные ХГВ с исходом в ЦП, п=40; подгруппа 46 - больные ХВГ смешанной этиологии с исходом в ЦП, п=33; подгруппа 4в - больные ХГС с исходом ЦП, п=117; подгруппа 4г - больные алкогольным ЦП, п=42; подгруппа 4д - больные криптогенным ЦП, п=41); группа №5 (контрольная группа сравнения) - 60 практически здоровых лиц старше 50 лет, из них 23 (38%) женщины и 37 (62%) мужчин; средний возраст пациентов данной группы составил 65,5 + 1,7 лет. Отбор пациентов в исследование осуществлялся в четырёх лечебных учреждениях г. Москвы, в которые обращались больные за медицинской помощью в 2006-2009 гг.

Критерии включения пациентов в исследование: выявление HBsAg (± другие маркеры вирусных гепатитов) на фоне нормальной и/или повышенной активности АлАТ и АсАТ в крови в течение 6 месяцев и более перед включением в исследование, возможность наблюдения за пациентами с ХВГ различной этиологии в динамике в течение 1,5 - 2-х лет (за исключением, пациенток на различных сроках беременности, которых обследовали однократно). Для оценки вклада полиморфизма генов человека в развитие ЦП в исследование также были включены пациенты возрастом не менее 18 лет с ЦП различной этиологии (HBV, ко-инфекция HBV с HCV и HDV, алкоголь, криптогенный ЦП), а также пациенты контрольной группы с отсутствием маркеров вирусных гепатитов (HBsAg, анти-HCV в крови по данным методов ИФА и хемилюминесценции, ДНК HBV и РНК HCV в крови по данным метода ПЦР) и клинико-лабораторных признаков хронического диффузного поражения печени. Обязательным условием для включения в данное исследование было письменное информированное согласие пациента.' Критерии исключения пациентов из исследования: наличие ВИЧ-инфекции, психических заболеваний и тяжелой соматической патологии; наличие в анамнезе сопутствующих заболеваний, требующих приём медикаментозной терапии и утяжеляющих течение ХГВ (гормональная, цитостатическая, иммуносупрессивная). Исключение данных критериев было необходимо для корректной трактовки клинической картины заболевания и результатов молекулярно-генетических исследований у пациентов с естественным течением хронической HBV-инфекции. В качестве основных методов обследования больных были применены:

- стандартные лабораторные: общеклинический и биохимический анализы крови, общий анализ мочи;

- серологический: определение маркеров хронических вирусных гепатитов В, С и Д с помощью коммерческих тест-систем методами ИФА и хемилюминесценции; антител к ВИЧ, CMV, HSV-1, -2, EBV, аугоантител (ANA, АМА) методом ИФА; дополнительно проводилось количественное определение HBsAg в крови методом хемилюминесценции с помощью коммерческой тест-системы «HBsAg Architect» фирмы «Abbott» на автоматическом анализаторе «Architect» (чувствительность - 0,05 МЕ/мл);

- инструментальные: УЗИ органов брюшной полости; ПБП с последующим морфологическим

(¡следованием пунктата; транзиентная фиброэластография;

молекулярно-генетический: определение РНК HAV, ДНК HBV, РНК HCV, РНК HDV, РНК GV, ДНК TTV, ДНК CMV, ДНК EBV, ДНК HSV-1,2, ДНК HHV-6 в крови методом ПЦР в ежиме реального времени (чувствительность - < 103 копий/мл); количественное определение ровня виремии HBV методом ПЦР в режиме реального времени при помощи программного беспечения «ABI prism 7000 SDS Software vl,0» на основании полученной в ходе реакции алибровочной кривой; генотипирование HBV с использованием реакции минисеквенирования последующим определением продуктов реакции методом MALDI-TOF масс-спектрометрии; пределение полиморфизма 11 генов человека с использованием технологии MALDI-TOF масс-пектрометрии.

Для анализа клинико-лабораторной картины хронической HBV-инфекции выделены ледующие диапазоны уровня виремии HBV: неопределенный уровень виремии HBV - <103 опий/мл; постоянно низкий уровень виремии HBV - <103-104 копий/мл; волнообразный ровень виремии HBV - <10} - Ю10 копий/мл; постоянно высокий уровень виремии HBV -105копий/мл.

Обработка результатов проводилась с помощью методов непараметрической статистики с спользованием критерия Манна-Уитни и критерия %2 Д™ сравнения средних .величин при тсутствии нормального распределения данных (уровень значимости был принят равным < ,05). Были определены: процентное содержание ряда полученных данныхсредняя рифметическая (М), средняя ошибка средней арифметической (т). Корреляционный анализ роводился с использованием коэффициента Спирмена. Для определения индивидуального иска развития ЦП использовали модифицированный алгоритм Байеса [Witten I.H., Frank Е., 005]. Общий принцип метода выражается формулой:

P(AW) = Í»,

где Р(А) - априорная вероятность гипотезы А\ Р(А\В) - вероятность гипотезы А при наступлении события В (апостериорная вероятность); Р(В\А) - вероятность наступления события В при истинности гипотезы А; Р(В) - вероятность наступления события В.

Для расчета вероятности развития ЦП (далее - ВРЦ) были использованы ранее рассчитанные значения априорной и условной вероятности:

_0,626 « Р(S I cirrhosis)_

~ 0,626 * P(S I cirrhosis) + 0,374P(S I no cirrhosis)

Значения условной вероятности цирроза P(S I cirrhosis) и не цирроза P(S I no cirrhosis) рассчитывались как произведения от условных вероятностей всех независимых полиморфизмов: PP(S I cirrhosis) и PP(S I no cirrhosis).

Установленные пороговые значения «cut off» составили 0,5 для Pmin и 0,7 для Ртах. ВРЦ>

Ртах (0,7) - пациент относится к группе высокого риска развития ЦП. ВРЦ < Pmin (0,5) -пациент относится к группе низкого риска развития ЦП. Если значение ВРЦ находится между Ртах и Pmin (0,5 <ВРЦ <0,7), то вероятность развития ЦП считается неопределенной.

Математическая и статистическая обработка результатов проводилась при помощи программных пакетов «Microsoft Office 2010», SPSS 17.0 (SPSS Inc.,США), MacChiSquare 1.2.0.0 (Marley W. Watkins, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

На первом этапе исследования для уточнения диагноза с учетом однократного определения уровня виремии HBV в сопоставлении с активностью АлАТ в крови и оценки особенностей клинического течения хронической HBV-инфекции были обследованы 103 HBsAg-позитивные женщины на различных сроках беременности, поступивших в акушерское отделение инфекционного стационара Средний возраст пациенток данной группы составил 27 лет. Всем беременным женщинам сделано однократное определение генетического материал гепатотропных и условно гепатотропных вирусов в крови, а также серологическое исследование на наличие в крови маркеров HCV- и HDV-инфекций. В 4,9% (5/103) случаев в группе беременных женщин обнаружен HBeAg на фоне отсутствия анти-НВе в крови. На основании проведенного дополнительного обследования в 35,9% (37/103) случаев были уточнены диагнозы пациенток с хронической HBV-инфекцией, которые на этом основании распределены на подгруппы: подгруппа 1а - неактивное носительство HBV (п=43), подгруппа 16 - ХГВ без дельта-агента (п=43), подгруппа 1в - ХВГ смешанной этиологии (п=17).

Основная (74%) масса пациенток в акушерское отделение инфекционного стационар поступала с направительным диагнозом «неактивное носительство HBV». Как известно, данный диагноз в амбулаторных условиях пациенткам устанавливается в основном на основании отсутствия жалоб при осмотре, персистенции HBsAg на фоне постоянно нормального уровня аминотрансфераз в биохимическом анализе крови (АсАТ и АлАТ до 40 мкмоль/мин.л) в течение 6 месяцев и более. При однократном определении уровня ДНК HBV в крови методом ПЦР в рамках данного исследования только у 56,6% (43/76) HBsAg-позитивных женщин диагноз «неактивное носительство HBV» оказался правомерен, т.к. на фоне отсутствия жалоб пациенток, нормальных показателей АлАТ и АсАТ в крови регистрировался неопределяемый уровень ДНК HBV в крови. Проведенное углубленное клинико-лабораторное обследование, включающее однократное ПЦР-обследование, 28 (36,8%) пациенткам с направительным диагнозом «неактивное носительство HBV» позволило диагностировать «ХГВ без дельта-агента».

Дополнительные серологическое и молекулярно-генетическое обследования (определение анти-HCV, анти-HDV IgM и IgG в крови методом ИФА; ДНК HBV, РНК HCV, РНК HDV в

ови методом ПЦР) позволили также выявить смешанную этиологию хронического вирусного ражения печени у восьми пациенток с хронической НВУ-моноинфекцией, а также - у 1-ой ациентки с ХГВ+С выявить сопутствующую НЭУ-инфекцию. Среди 5 пациенток с аправительным диагнозом «неактивное носительство НВУ» у 4-х беременных женщин иагностирован ХГВ с дельта-агентом и у одной пациентки - ХГВ+С+Д. Среди беременных енщин с направительным диагнозом «ХГВ без дельта-агента» в 16,7% (3/18) случаев после роведенного дополнительного серологического обследования диагностирован ХГВ с дельта-гентом на основании обнаружения анти-НОУ в крови. Таким образом, проведенные ополнительно серологическое и молекулярно-генетическое обследования позволили уточнить иологию ХВГ у беременных женщин, а также в 30,2% (26/86) случаев определение уровня иремии ИВУ позволило уточнить вариант течения хронической НВУ-моноинфекции.

Давность обнаружения НВвАд в крови у большинства пациенток подгруппы 1а и 16 оставила от 1 до 5 лет (55,8% и 67,4%, соответственно, р=0,2675), напротив, у больных ХВГ мешанной этиологии - более 5 лет (76,5%). Обращает на себя внимание, что в 31% (32/103) лучаев НВэАя в крови обнаружен впервые при постановке на учет в женской консультации.

Основная (74%) масса пациенток первой группы поступала для планового родоразрешения подгруппа 1а - 70% (30/43), подгруппа 16 - 84% (36/43), подгруппа 1в - 59% (10/17). При вступлении в стационар 78% (80/103) беременных женщин активных жалоб не предъявляли. У 3 пациенток первой группы жалобы при поступлении в основном обусловлены патологией временности и/или обострением сопутствующей патологии, из них в группе больных ХГВ без ельта-агента и ХВГ смешанной этиологии в 40% случаев регистрируются проявления моррагического (кровоточивость десен, носовые кровотечение), астено-вегетативного слабость), диспепсического (поташнивание, горечь во рту) синдромов. Средние значения сследуемых показателей биохимического (АлАТ, АсАТ, общий билирубин, тимоловая проба, бщий белок, глюкоза) и клинического анализов крови находятся преимущественно в пределах нормальных значений. При проведении биохимического исследования крови у большинства 64%, 66/103) НВбАз-позитивных беременных женщин достоверно чаще регистрируются нормальные показатели трансаминаз (р=0,0001).

В данном исследовании частота преждевременных родов составила 7% у неактивных носителей НВУ и 18% у больных ХВГ смешанной этиологии. Помимо преждевременных родов, зарегистрированы стремительные роды - только в 4,7% случаев у больных ХГВ без дельта-агента, запоздалые роды - у 2,3% больных ХГВ без дельта-агентом и в 5,9% случаев у больных с ХВГ смешанной этиологии. В среднем у одной трети пациенток во всех подгруппах (подгруппа 1а - 32,6%, подгруппа 16 - 25,6%, подгруппа 1в - 47%) была выявлена различная патология беременности (ранний токсикоз беременных - рвота беременных, анемия, водянка беременных, гестоз, гестационный пиелонефрит, нарушения жирового обмена 2 степени, внутриутробная задержка развития плода 1 степени, хроническая внутриутробная гипоксия

плода, фетоплацентарная недостаточность, умеренное маловодие, нефропатия 1 степени, плоский плодный пузырь, частичное плотное прикрепление плаценты, гиперандрогения, дородовое излитие околоплодных вод, отягощенный акушерско-гинекологический анамнез).

При проведении молекулярно-генетического исследования крови беременных женщин генетический материал условно гепатотропных вирусов CMV, HSV-1,2 и HHV-6 обнаружен у только больных ХГВ без дельта-агента, и частота их выявления колебалась от 2,3% до 4,7%. Генетический материал HGV в крови у неактивных носителей HBV и пациенток с ХГВ без дельта-агента обнаружен в 4,7% случаев, у больных подгруппы 1в - в 11,8% случаев (р=0,3195). У женщин с ХГВ без дельта-агента достоверно чаще выявляется ДНК TTV по сравнению с неактивными носителями HBV (25,6% и 53%, соответственно, р=0,0473). Выявление ДНК CMV и ДНК HSV-1,2 типов у беременных женщин с ХГВ без дельта-агента регистрировалось н фоне отсутствия специфических антител класса М и обнаружения специфических антител класса G в крови. Обнаружение генетического материала условно гепатотропных вирусов в крови пациенток первой группы, а также имеющиеся данные о возможном неблагоприятном перинатальном исходе беременности у женщин с HSV-, CMV-инфекциями, говорит о необходимости включения в план обследования беременных женщин определение ДНК CMV и ДНК HSV-1,2 в крови методом ПЦР с одновременным определением специфических антител и их тщательного наблюдения.

В нашем исследовании, как у беременных женщин с ХГВ без дельта-агента, так и с ХВГ смешанной этиологии, в большинстве случаев регистрируются неопределяемый (57,3%) и низкий (28,1%) уровни виремии HBV. Высокий уровень виремии HBV (>105 копий/мл) выявлен у 14,6% (15/103) больных и чаще регистрируется у больных ХГВ без дельта-агента с повышенной активностью АлАТ и АсАТ в крови, чем у пациенток с нормальным уровнем трансаминаз, а у беременных женщин с микст-инфекцией - на фоне отсутствия генетического материала РНК HCV и РНК HDV в крови. Уровень виремии HBV 106 - 109 копий/мл выявлен только у 5,8% (6/103) беременных женщин, из них у одной на фоне HBeAg-емии. Обращает на себя внимание, что у 3,5% (3/86) пациенток, поступавших на 38 - 40 неделях беременности для планового родоразрешения, выявлено повышение АлАТ и АсАТ в крови более 10 норм (от 12 до 23 N) на фоне высокого уровня виремии HBV (105 - 107 копий/мл), отсутствия жалоб и HBeAg-емии, что говорит о реактивации HBV на фоне беременности.

Таким образом, дополнительное однократное обследование HBsAg-позитивных беременных женщин, включающее определение в крови уровня виремии HBV, маркеров HCV-инфекции и HDV-инфекции, показало регистрацию преимущественно низких уровней виремии HBV, позволило уточнить этиологию ХВГ и выявить реактивацию HBV на фоне беременности.

В настоящее время значимыми критериями прогрессирующего течения ХГВ являются активность АлАТ в крови, уровень виремии HBV и степень изменения морфологии печени, которые учитываются при отборе больных ХГВ для назначения ПВТ. В связи с чем, на втором

апе исследования для клинической оценки варианта течения хронической НВУ-инфекции у циентов второй (моно-инфекция) и третьей (микст-инфекция) групп был проведен авнительный анализ результатов однократного, двукратного и трехкратного (с интервалом в 12 месяцев в течение 1,5 - 2-х лет) обследования, включающего стандартное клиническое ¡следование, биохимическое исследование крови и количественное определение ДНК НВУ в юви в сопоставлении с морфологией печени (у лиц второй группы).

Всего обследовано 189 пациентов с хронической НВУ-моноинфекцией, среди них было 82 3,4%) женщины и 107 (56,6%) мужчин, средний возраст которых составил 39 ± 1,2 лет (от 15 о 72 лет). В 55,6% случаев были лица в возрасте до 40 лет. У 16 (8,5%) из 189 пациентов с ронической НВУ-моноинфекцией диагностирован НВе-позитивный ХГВ. Подавляющее ольшинство пациентов второй группы (51,9%, 98/189), также как и подгрупп 1а, 16 (61,6%, 3/86), составили лица с давностью выявления НВзА§ в крови от года до 5 лет (р=0,1309). бращает на себя внимание тот факт, что у трети пациентов второй группы HBsAg в крови ыявлен впервые перед включением в данное исследование (26/98), как и у беременных енщин первой группы (32/103). У большинства (95,8%, 181/189) пациентов НВвАд в крови ьивлен случайно при амбулаторном или стационарном обследовании по поводу заболеваний, е связанных с патологией печени, в качестве доноров крови, при плановом обследовании в .ериод беременности в женской консультации, прохождении диспансеризации, а также при юявлении тяжести в правом подреберье. Случайное выявление НВзА§ в крови_у пациентов, ключенных в данное исследование, отражает эпидемиологическую особенность НВУ-нфекции, что связано, в первую очередь, с бессимптомным течением хронической НВУ-нфекции в большинстве случаев, а также - наличием скрытой НВУ-инфекции.

Бессимптомное течение хронической НВУ-моноинфекции у большинства пациентов одтверждают и результаты данного исследования. Так, при первичном обнаружении НВбА§ в крови, как в амбулаторных, так и в стационарных условиях, состояние всех пациентов было довлетворительным. При обследовании пациентов, включенных в исследование, с интервалом 6-12 месяцев в течение 1,5 - 2-х лет клинические проявления ХГВ были достаточно скудными. Активных жалоб при динамическом наблюдении большинство (89,4%) пациентов не предъявляло. Жалобы, которые предъявляли только 10,6% (20/189) пациентов при динамическом обследовании, не постоянные и самостоятельно проходящие. У большинства пациентов с хронической НВУ-инфекцией регистрируются проявления астено-вегетативного (65%, 13/20) и диспепсического (40%, 8/20) синдромов. Основными жалобами больных ХГВ были астения (50%) и дискомфорт в правом подреберье (20%). Обращает на себя внимание наличие сопутствующей патологии желудочно-кишечного тракта (язвенная болезнь, хронический гастрит, хронический колит, хронический холецистит) у 50% (4/8) пациентов с хронической НВУ-инфекцией с проявлениями диспепсического синдрома (дискомфорт в верхних отделах живота, тяжесть в правом подреберье). При объективном обследовании 189

пациентов с хронической НВУ-инфекцией только в 17,5% (33/189) случаев выявлена гепатомегалия.

Среди 36 пациентов с ХВГ смешанной этиологии (третья группа) было 16 (44,4%) женщин и 20 (55,6%) мужчин, средний возраст которых составил 35,6 ± 2,2 лет (от 16 до 70 лет, с преобладанием лиц в возрасте до 40 лет (69,4%). Также как у пациентов с хронической НВУ-моноинфекцией, у большинства больных ХВГ смешанной этиологии HBsAg в крови выявлен случайно при плановом обследовании. Большинство (55,6%) пациентов третьей группы, также как и подгруппы 1в (76,5%, 13/17), составили лица с давностью выявления HBsAg в крови более 5 лет.

При включении пациентов в исследование состояние всех пациентов было удовлетворительным. Так же как и у больных с хронической НВУ-моноинфекцией, клинические проявления ХВГ смешанной этиологии достаточно скудные. Активных жалоб при динамическом наблюдении у большинства (86%) пациентов нет. Жалобы, которые предъявляли только 14% (5/36) пациентов при динамическом обследовании, не постоянные и самостоятельно проходящие. У пациентов с ХВГ смешанной этиологии регистрируются проявления астено-вегетативного и диспепсического синдромов. При сборе анамнеза у пациентов, включенных в исследование, указаний на злоупотребление алкоголем не было. При объективном обследовании 36 пациентов с ХВГ смешанной этиологии в 6% случаев выявлена гепатомегалия.

У пациентов второй группы средние значения исследуемых показателей биохимического (АлАТ, АсАТ, общий билирубин, ЩФ, ГГТП, протромбиновый индекс, тимоловая проба, общий белок) и клинического анализов крови находятся преимущественно в пределах нормальных значений. Средние значения АлАТ и АсАТ в крови при динамическом обследовании у пациентов третьей группы по сравнению с пациентами с хронической НВУ-моноинфекцией выше нормальных величин (от 1,5 до 4,5 норм), и максимальные их значения регистрируются при ХВГ смешанной этиологии: НВУ+НСУ+НЭУ. Средние показатели общего билирубина и клинического анализа крови у больных ХВГ смешанной этиологии находятся в пределах нормальных значений. При однократном, двукратном и трехкратном обследовании пациентов с хронической НВУ-моноинфекцией доля лиц с нормальными показателями АлАТ в крови статистически достоверно выше, чем доля пациентов, имеющих повышенный уровень АлАТ в крови (р=0,0006, р=0,0075, р=0,0048, соответственно). Эта группа представляет наибольший интерес для клиницистов, т.к. несмотря на нормальную активность АлАТ в крови, у пациентов данной категории возможны достаточно выраженные фиброзные изменения в ткани печени, что требует их более углубленного обследования. На рисунке 1 представлена доля лиц с различной активностью АлАТ в крови при динамическом обследовании у пациентов с хронической НВУ-моноинфекцией.

I

I I

I

АлАТ в крови среди пациентов с хронической НВУ-моноинфекцией по результатам динамического обследования

При анализе уровня виремии НВУ, второго критерия прогрессирующего течения ХГВ, выявлено, что при однократном обследовании достоверно чаще встречаются пациенты (48%) с ¡неопределяемым уровнем ДНК НВУ в крови, чем пациенты (18%) с высоким (105 - 108 ^опий/мл) уровнем виремии НВУ (р=0,0014). Как у пациентов первой группы, так и у лиц второй группы, в большинстве случаев регистрируются низкие (в том числе, неопределяемый) [уровни виремии НВУ, а высокий уровень вирусной нагрузки НВУ в крови, который в |настоящее время считается одним из факторов прогрессирующего течения ХГВ, выявляется в среднем в 21,8% случаев (см. рисунок 2). Различный (неопределяемый, низкий и высокий) уровень виремии НВУ регистрируется у пациентов, как на фоне нормального, так и на фоне повышенного уровня активности АлАТ в крови. В то же время, статистически достоверно чаще 'при однократном обследовании неопределяемый уровень виремии НВУ регистрируется на фоне нормальной активности АлАТ в крови, а высокий уровень виремии НВУ - на фоне повышенной активности АлАТ в крови (р=0,0129 и р=0,0018, соответственно). При динамическом "обследовании пациентов второй и третьей групп выделена группа с волнообразным уровнем виремии НВУ. у которых регистрируются колебания ДНК НВУ в крови от неопределяемого до высокого, что необходимо учитывать при обследовании пациентов (см. рисунок 3). При (динамическом ПЦР-обследовании у пациентов третьей группы достоверно чаще регистрируется неопределяемый уровень НВУ, чем у пациентов с хронической НВУ-моноинфекцией (р=0.0004). напротив, волнообразный уровень виремии НВУ достоверно чаще у пациентов второй группы (26,1%), чем у лиц третьей группы (8%). р=0,0246.

17

Рисунок 1. Доля лиц с нормальной и повышенной активностью

18

100% 80»« «0»» 40% 20% 0% ¥

Сл, Р. Но pi .

! 1 I Й________1 1

4>>Ш

1 1 1 I

». 1 Р-.......... 1 {¡7

Берем ённые женщины т

С

110(3)-10(4) коняй/мл

; 210(5) копий мл «< 10(3) копий

Рисунок 2.Частота выявления различных уровней виремии HBV при однократном обследовании пациентов 1 и 2 групп

ХГВ

ХВГ-мккст

-< 10(3)- 10(10)ковий мл

>10(5) коп* ¡Мил ■ 1О(3)-1О(4)к0лив мл 10(3)копнЙ'нл1

Рисунок 3. Частота выявления различных уровней виремии HBV при динамическом обследовании пациентов 2 и 3 групп

У пациентов второй группы неопределяемый и постоянно низкий уровни виремии HBV в большинстве случаев регистрируются на фоне нормальной активности АлАТ в крови, как при однократном (97%, р=0,0001 и 53%, р=0,7316, соответственно), так и двукратном (80%, р=0,0578 | и 89%, р=0,001, соответственно) обследованиях. При двукратном обследовании частота выявления различного уровня виремии HBV в сопоставлении с уровнем активности АлАТ в крови достоверно не различается между этими группами. Однако среди пациентов с волнообразным (<103 - 10б копий/мл) уровнем виремии HBV достоверно чаще регистрируется повышенный уровень активности АлАТ в крови (р=0,0264). По данным трехкратного ПЦР-обследования в большинстве случаев (69,4%, 77/111) выявлены ДНК HBV-позитивные больные, как и при двукратном ПЦР-обследовании (82%, 23/28: х2=1,807, р=0,1788), в то же время, достоверно чаще, чем при однократном ПЦР-обследовании (52%, 26/50: %2=4,513, р=0,0336). Среди больных HBeAg-нвгативным ХГВ, обследованных трехкратно, фактически с одинаковой частотой встречаются больные с постоянно низким и волнообразным уровнями виремии HBV (44,3% и 45,9%, соответственно), а доля пациентов с постоянно высоким уровнем виремии HBV статистически достоверно ниже (9,8%, р=0,00001). В 83,3% (5/6) случаев постоянно высокий уровень виремии KBV у больных НВе-негативным ХГВ регистрируется на фоне повышенной активности АлАТ в крови. При проведении корреляционного анализа выявлено, что существует прямая корреляционная зависимость между повышенной активностью АлАТ в крови и высоким уровнем виремии HBV (г=0,385, р=0,008). При однократном, двукратном и трехкратном обследованиях доля больных НВе-негативным ХГВ с низким уровнем виремии HBV и нормальной активностью АлАТ в крови составила 20% (9/44), 16% (4/25) и 31% (19/61), соответственно.

Среди 16 пациентов с НВе-позитивным ХГВ (вторая группа), обследованных однократно, вукратно и трехкратно, в большинстве случаев регистрируются высокие уровни виремии НВУ >4%) и повышенная активность АлАТ в крови (87,5%), р=0,0001. Во время динамического аблюдения у 2-х пациентов с НВе-позитивной хронической НВУ-моноинфекцией арегистрирована сероконверсия HBeAg-/aнти-HBe+, из них у одной пациентки, 28 лет, спустя 3 ода после проведения ПВТ стандартным ИФН с последующим снижением виремии НВУ до изкого уровня и нормализацией активности трансаминаз в крови; у второй пациентки, 31 года, а фоне повышенной активности АлАТ в крови до 1,5Ы произошла спонтанная сероконверсия 1ВеА§-/анти-НВе+ с последующей авиремией НВУ и нормализацией активности АлАТ в рови.

Неопределяемый уровень НВУ в крови при обследовании пациентов с хронической НВУ-оноинфекцией в течение 1,5 - 2-х лет вьивлен в 30,6% (34/111) случаев. Среди 34 пациентов с виремией НВУ при динамическом обследовании у 3-х пациентов в анамнезе были указания на роведение ПВТ за 5-7 лет до включения в исследование, что говорит о достижении иохимического и вирусологического ответов, подтверждаемое результатами настоящего сследования. В 20,6% (7/34) случаев у пациентов (пять из них старше 50 лет) при инамическом наблюдении на фоне авиремии НВУ при трехкратном обследовании егистрирется волнообразный уровень АлАТ в крови (от 2 до 4,5 К), среди них - в 50% случаев при постоянно повышенной активности АлАТ в крови.

Как известно, в настоящее время критериями неактивного носительства НВУ являются неопределяемый уровень виремии НВУ, нормальные показатели АлАТ в крови, а также отсутствие гепатита по данным ПБП. По данным трехкратного динамического обследования среди 34 пациентов с авиремией НВУ только у 23 можно было предположить неактивное носительство НВУ. В течение 1,5-2-х лет с интервалом 6-12 месяцев у данных пациентов отсутствовали жалобы, общее состояние пациентов было удовлетворительным при осмотрах, на фоне персистенции НВ$А§ и постоянно нормального уровня активности трансаминаз в крови не определялась ДНК НВУ (<103 копий/мл) и другие маркеры репликации НВУ (анти-НВсоге ^М и НВеА§) в крови. Одна (2,9%) пациентка, несмотря на неопределяемый уровень ДНК НВУ в крови в течение 1,5 лет на фоне нормальных показателей АлАТ и АсАТ в крови, с учетом обнаружения ДНК НВУ в крови на фоне нормальных значений трансаминаз по данным анамнеза, не была отнесена к группе неактивных носителей НВУ.

Таким образом, по данным трехкратного клинико-лабораторного обследования у пациентов с хронической НВУ-моноинфекцией частота выявления ДНК НВУ-позитивных больных достоверно выше, чем у пациентов с однократным ПЦР-обследованием. Динамический мониторинг НВеАд-статуса, уровня активности АлАТ и виремии НВУ позволил выявить группы пациентов с активной и неактивной хронической НВУ-моноинфекцией, что в дальнейшем требует различной тактики ведения пациента.

У больных ХГВ с дельта-агентом статистически достоверно чаще регистрируется повышенная активность АлАТ в крови (76,5%; %г=9,529, р=0,002), как при наличии виремии HBV и HDV, так и на фоне её отсутствия, а также по данным однократного ПЦР-обследования в большинстве (59%) случаев регистрируются неопределяемые уровни, как ДНК HBV, так и РНК HDV в крови (ДНК HBV+/PHK HDV - 29%, ДНК HBV-/PHK HDV+ - 12%). У больных ХГВ+С также регистрируется чаще (60%) повышенная активность АлАТ в крови, но статистических достоверных различий не выявлено (х2=1,2, р=0,2733), однако неопределяемые уровни ДНК HBV и РНК HCV в крови регистрируются только в 40% случаев (ДНК HBV+/PHK HCV - 46,6%, ДНК HBV-/PHK HCV+ - 6,7%, ДНК HBV+/PHK HCV+ - 6,7%). У больных ХГВ+С+Д также регистрируется чаще повышенная активность АлАТ в крови (75%: х2=2,000, р=0,1573, соответственно) и в 100% случаев зафиксированы неопределяемые уровни виремии HBV, HCV и HDV. В целом при ко-инфекции HBV с HCV и HDV при динамическом обследовании достоверно чаще регистрируются неопределяемые (63,9%), чем постоянно низкие (13,9%), волнообразный (8,3%) и высокий (13,9%) уровни виремии HBV (х2=18,935, р=0,00001, х2=24,08, р=0,00001, х2 = 18,935, р=0,00001, соответственно). Таким образом, у больных ХВГ смешанной этиологии в крови в большинстве случаев выявляется генетический материал одного из гепатотропных вирусов на фоне повышенной активности АлАТ в крови.

Для оценки третьего значимого критерия прогрессирующего течения ХГВ, а именно, степени изменения морфологии печени, у пациентов с хронической HBV-моноинфекцией проведен сравнительный анализ результатов ПБП и ТФ в сопоставлении с активностью АлАТ в крови и уровнем виремии HBV. С целью уточнения степени воспалительной активности и стадии фиброза печени 40 пациентам второй группы с различным уровнем виремии HBV выполнена ПБП. ИГА больше 4 баллов выявлен у 35 (87,5%), > 6 баллов - у 30 (75%) из 40 больных ХГВ (р=0,00001). Стадия фиброза печени F > 2 диагностирована в 30% случаев среди 10 пациентов с ИГА 9-12 баллов и в 4% случаев среди 25 пациентов с ИГА 4-8 баллов. Стадии фиброза печени F0 - Fl у больных ХГВ выявлены в 90% случаев, среди них только в 2,8% случаев выявлена F0. Десять (25%) из 40 пациентов, которым произведена ПБП, были с НВе-позитивным ХГВ и имели в 100% случаев волнообразно повышенный уровень АлАТ в крови и в 80% случаев постоянно высокий уровень виремии HBV. По данным ПБП у 3-х (30%) из 10 больных НВе-позитивным ХГВ ИГА был 2-3 балла, у 5 (50%) пациентов - 6-7 баллов по Knodell. В целом показания для назначения ПВТ по данным ПБП выявлены в 75% случаев, т.е. ИГА > 6 баллов, среди них F > 2 в 13% случаев.

Среди пациентов, у которых проведена ПБП, в 30% (12/40) случаев регистрируется высокий, в 17,5% (7/40) - волнообразный, в 37,5%, (15/40) - постоянно низкий и в 15% (6/40) -неопределяемый уровни ДНК HBV в крови. Анализируя результаты ПБП в сопоставлении с активностью АлАТ в крови и уровнем виремии HBV обнаружено, что даже у пациентов с низким и неопределяемым уровнями виремии HBV на фоне нормальной активности АлАТ в

рови выявлены показания для проведения ПВТ (см. рисунок 4).

Высокий уровень АлАТ - > N

АлАТ - > N 100%

Показания к ПВТ (ИГА>6±Г^2) 58%

уровень »премии НВ\' 17,5% (7/40)

А1АТ- > N 57%

| Пока зания к ПВТ > (ПГА>б±Г>2) ! 85,7%

ЛлАТ — N 43%

Пшкий уровень виремии ИВУ 37,5% (15/40)

АлАТ - > N 33%

А'1Л1 - N «7%

оказания к ПВТ <ИГЛ>6±1^2) 73%

Неопределяемый уровень НВУ ' 15% (6/40)

А.1ЛТ — > N , 17% _____\

ХЙТ-ЗУ" X

' ИоктшикПВТ

\ (11Г.Л>6±Р>2) / 100%

[ 83% _ _ _

Рисунок 4. Сопоставление результатов морфологии печени с уровнем виремии НВУ и активностью АлАТ в крови при хронической НВУ-инфекции с целью определения показаний к ПВТ (п=40)

Полученные данные говорят о том, что, вне зависимости от уровня виремии НВУ, активности АлАТ и АсАТ в крови, всем пациентам с хронической НВУ-моноинфекцией необходимо проведение ПБП с целью уточнения степени воспалительной активности и стадии фиброза печени.

Неинвазивная диагностика фиброза печени с помощью ТФ проведена 70 пациентам второй группы. По данным ТФ у пациентов с хронической НВУ-моноинфекцией в 75,7% случаев выявляется стадия фиброза < Р2 и в большинстве случаев (55,7%) стадия фиброза РО по МЕТАУЖ. Неопределяемый уровень виремии НВУ фактически с одинаковой частотой встречается у пациентов со стадией фиброза печени ИО, Р1 и Р2 по данным ТФ. Среди 22 пациентов с постоянно низким уровнем ДНК НВУ в крови большинство (77,3%) со стадией фиброза печени РО, но также есть больные со стадиями фиброза печени Р1 (13,6%) и Р2 (9,1%) по МЕТАУШ. Постоянно высокий уровень виремии НВУ преимущественно выявляется в одинаковых пропорциях при стадиях фиброза печени РО - Р1 (50%) и Р > 2 (50%) по данным ТФ. Следует отметить, что при стадии фиброза печени Р4 по МЕТАVIII по данным ТФ, помимо постоянно высокого уровня виремии НВУ (50%), у пациентов также выявляются неопределяемый и волнообразный уровни ДНК НВУ в крови.

В группе пациентов с хронической НВУ-инфекцией со стадией фиброза Р0 - Р1 по данным ТФ достоверно чаще регистрируются нормальные показатели АлАТ в крови (77%, р=0,00001). При выраженных стадиях фиброза печени (Р > 2) по данным ТФ у пациентов достоверно чаще

регистрируется повышенная активность АлАТ в крови, чем при стадиях F0 - F1 (65%, 11/17 и 23%, 12/53, соответственно, р=0,0013). Повышенная активность АлАТ в крови (п=7) при стадии фиброза F0 по данным ТФ регистрируется при различных (от неопределяемого до высокого) уровнях виремии HBV.

Данная закономерность прослеживается и при сопоставлении уровня виремии HBV с результатами ТФ. В группе пациентов со стадией фиброза F0 - F1 (п=53) по данным ТФ достоверно чаще выявляются неопределяемый (30,2%) и постоянно низкий (37,7%) уровни ДНК HBV в крови по сравнению с высоким уровнем виремии HBV (11,3%, р=0,0166 и р=0,0016, соответственно). В тоже время, при стадии фиброза печени F > 2 по данным ТФ высокий уровень виремии HBV выявляется статистически достоверно чаще, чем при стадиях фиброза печени F0-F1 (35,3%, 6/17 и 11,3%, 6/53, соответственно, р=0,0123).

Пяти из семи пациентов с авиремией HBV и повышенной активностью АлАТ в крови при трехкратном обследовании в отсутствии ПВТ в анамнезе проведена ТФ, по результатам которой у 3 (60%) пациентов стадия фиброза печени больше 2 (F2 - F4 по METAVIR), у 2 (40%) пациентов - стадия фиброза печени F1 по METAVIR. В подгруппе пациентов (п=23) с авиремией HBV на фоне нормальных показателей АлАТ в крови в отсутствии ПВТ в анамнезе, у которых можно было предположить неактивное носительство HBV по данным трехкратного динамического обследования, 16-ти пациентам выполнена ТФ: у 75% (12/16) пациентов диагностирована стадия фиброза печени F0, у 12,5% (2/16) пациентов - стадия фиброза печени F1 по METAVIR. Обращает внимание выявление в 12,5% (2/16) случаев стадии фиброза печени F3 по METAVIR, что не позволило рассматривать этих пациентов как неактивных носителей HBV. Учитывая данные научной литературы о возможности ТФ в ряде случаев (при остром гепатите, умеренном повышении активности АлАТ в крови и при стеатозе печени) завышать истинные показатели фиброза печени, а также выявление в данном исследовании в группах пациентов с авиремией HBV, нормальными показателями АлАТ в крови и F3 по METAVIR, а также с авиремией HBV, повышенными показателями АлАТ в крови и F2 - F4 по METAVIR, диффузных изменений печени и поджелудочной железы по данным УЗИ органов брюшной полости, данной категории пациентов требуется проведение ПБП для исключения стеатоза печени.

Для сравнительного анализа результатов ПБП и ТФ 21 больному ХГВ проведены эти два исследования одновременно. При анализе результатов инвазивного и неинвазивного методов диагностики фиброза печени выявлено, что, как по данным ТФ (76,2%), так и по данным ПБП (86%), у подавляющего числа пациентов с хронической HBV-инфекцией регистрируются стадии фиброза печени F < 2 (р=0,4319). При сравнении результатов ПБП и ТФ у больных ХГВ в 28,6% (6/21) случаев получено совпадение результатов этих двух исследований: по стадии фиброза печени F1 - 35,7% (5/14), по стадии фиброза печени F > 2 - 33,3% (1/3). При анализе результатов этих двух исследований выявлены расхождения в сторону занижения реального

езультата показателями ТФ в 52,4% (11/21) случаев, из них - при стадии фиброза Р1 по данным БП в 50% (9/18) случаев по данным ТФ диагностирована стадия фиброза Р0, а при стадии иброза печени Р > 2 по данным ПБП в 67% (2/3) случаев по данным ТФ диагностирована ■алия фиброза Р0-Р1. Также выявлено расхождение в сторону завышения показателей фиброза а 1-2 стадии по результатам ТФ в 19% (4/21) случаев: при стадии фиброза Р1 по данным ПБП в 2% (4/18) случаев по данным ТФ диагностирована стадия фиброза Р2-РЗ. При динамическом бследовании у пациентов с расхождением показателей в пользу увеличения результатов по анным ТФ регистрируются преимущественно нормальные показатели активности АлАТ в рови.

Таким образом, у подавляющего числа пациентов с хронической НВУ-моноинфекцией, ключенных в исследование, по данным ПБП и ТФ регистрируются стадии фиброза печени Р0 -1. Однако большая часть результатов ПБП и ТФ не совпадают, как в виде недооценки, так и в виде переоценки на 1 - 2 стадии фиброза печени по данным ТФ при сравнении с результатами морфологического исследования биоптата печени. Полученные результаты данного исследования позволяют сделать вывод о том, что ПБП остается «золотым стандартом» для исключения значимых гистологических изменений в ткани печени и необоснованного назначения ПВТ больным ХГВ. Как было показано, ТФ является неинвазивным методом, заменяющим ПБП, среди пациентов с минимальной и наиболее выраженными стадиями фиброза печени в сочетании с повышенной активностью АлАТ и высоким уровнем виремии ИВУ. В связи с этим, пациентам с авиремией НВУ и нормальной активностью АлАТ в крови при динамическом обследовании оправдано проведение ТФ, что позволит отобрать пациентов, которым в первую очередь для уточнения диагноза необходимо проведение ПБП, только благодаря которой можно выявить выраженные некрозо-воспалительные изменения и минимальный фиброз печени.

Учитывая в последние годы появление данных о клинической значимости количественного содержания HBsAg в крови у пациентов с хронической НВУ-инфекцией, следующим этапом исследования был анализ концентрации НВзА£ в крови у пациентов в зависимости от варианта естественного течения хронической НВУ-инфекции. В ходе проведенного исследования на большой когорте НВ$А£-позитивных пациентов (п=135), в 96% случаев инфицированных генотипом Э НВУ и обследованных однократно, двукратно и трехкратно, показано, что концентрация НВвАд в крови значимо различается между НВе-позитивной и НВе-негативной фазами хронической НВУ-инфекции, что согласуется с данными литературы. Так, у 36 пациентов с различными вариантами течения хронической НВУ-инфекции при однократном определении количественного содержания HBsAg в крови выявлено, что средние значения концентрации HBsAg (275 360,33 ± 109 738,1 МЕ/мл) у больных НВе-позитивным ХГВ достоверно выше, чем у больных НВе-негативным ХГВ (5 000,9 ± 1 567,72 МЕ/мл) и неактивных носителей НВУ (1 986,5 ± 1 333,7 МЕ/мл), р < 0,05. Наиболее высокие значения

концентрации НВбА§ в крови, как минимальные, так и максимальные (от 179 250 до 454 400 МЕ/мл), выявлены также в группе пациентов с НВе-позитивным ХГВ. При динамическом обследовании сохраняется выявленная связь концентрации HBsAg в крови с HBeAg-cтaтycoм пациентов, включенных в исследование (р < 0,01). Так, средний уровень HBsAg в крови 8 больных НВе-позитивным ХГВ, у которых в основном (88%) регистрируется повышенный уровень активности АлАТ в крови, составил 119 834,6 ± 27 211 МЕ/мл. При динамическом обследовании 99 больных НВе-негативным ХГВ средний уровень HBsAg в крови составил 11813,8 ± 1 284,8 МЕ/мл, и в большинстве случаев (75%) регистрировались нормальные показатели АлАТ и АсАТ в крови. Средняя концентрация HBsAg в крови в крови 18 пациентов с неактивным носительсггвом НВУ, имевших неопределяемый уровень ДНК НВУ в крови и нормальный уровень активности АлАТ в крови на протяжении динамического наблюдения в течение 1,5 - 2-х лет, составила 4 732,82 ± 1 692,75 МЕ/мл. Как при однократном, так и при динамическом обследовании, не выявлено достоверных различий в среднем количественном содержании НВвА§ в крови между группами пациентов с отсутствием HBeAg в крови, а именно, с неактивным носительством НВУ и НВе-негативным ХГВ.

При анализе колебаний серологического уровня НВзА§ у больных НВе-негативным ХГВ при динамическом наблюдении в течение 1,5 - 2-х лет не выявлено корреляции концентрации HBsAg в крови с уровнем виремии НВУ. Вне зависимости от уровня виремии НВУ у одного и того же пациента выявлены, как минимальные, так и выраженные колебания концентрации HBsAg в крови при естественном течении НВе-негативного ХГВ в пределах одного-двух логарифмов. Сравнительный анализ также показал, что у больных НВе-негативным ХГВ высокие концентрации HBsAg в крови регистрируются на различных уровнях виремии НВУ: как на фоне высокого уровня виремии НВУ (от 11,2 до 131 200 МЕ/мл), так и на фоне неопределяемого уровня ДНК НВУ в крови (от 0,78 до 101 010 МЕ/мл). В тоже время, у больных НВе-негативным ХГВ с высоким уровнем ДНК НВУ в крови (>105 копий/мл) регистрируются концентрации НВбА§ в крови менее 1 000 МЕ/мл, а при уровне виремии НВУ Ю10 копий/мл от 7 333 до 11 275 МЕ/мл.

Как у пациентов с НВе-негативным ХГВ, так и у пациентов с НВе-позитивным ХГВ, статистически достоверных различий в серологическом уровне HBsAg в зависимости от уровня активности АлАТ и вирусной нагрузки НВУ в крови не выявляется. Однако, как на фоне нормальной, так и повышенной активности АлАТ в крови, у больных НВе-позитивным ХГВ статистически достоверно выше концентрации HBsAg в крови, чем у больных НВе-негативным ХГВ (р < 0,01). У неактивных носителей НВУ, также как и у больных НВе-негативным ХГВ, концентрации HBsAg в крови статистически достоверно ниже, чем у больных НВе-позитивным ХГВ с нормальной активностью АлАТ в крови (р < 0,01).

У неактивных носителей НВУ концентрация HBsAg в крови менее 1 000 МЕ/мл при динамическом обследовании зарегистрирована в 72,2% (13/18) случаев, из них у большинства

(61,5%, 8/13) пациентов обнаружены минимальные концентрации HBsAg в крови (от 0,1 до 42 'МЕ/мл); в 38,5% случаев выявлены колебания HBsAg в крови от 100 до 860 МЕ/мл. В 11,1% (2/18) случаев концентрация HBsAg в крови колебалась от 2 430 до 9 110 МЕ/мл. В целом у большинства (83,3%, 15/18) неактивных носителей HBV при трехкратном динамическом обследовании наблюдается снижение концентрации HBsAg в крови, причём у 7 (38,9%) человек регистрируются наименьшие концентрации HBsAg в крови (от 0,7 до 12 МЕ/мл), которые снизились в течение 1,5 - 2-х лет от неопределяемого до 2,3 МЕ/мл (см.рисунки 5 и 6).

Рисунок 5. Концентрация HBsAg в крови менее 1 000 МЕ/мл у 13 неактивных носителей НВУ при динамическом обследовании

Рисунок 6. Концентрация HBsAg в крови менее 14 МЕ/мл у 1 неактивных носителей НВУ при динамическом

.V

обследовании

Щ •I

В ходе данного исследования при качественном и количественном определении содержания HBsAg в крови у 3 (1,5%) из 189 пациентов с хронической НВУ-моноинфекцией при 'динамическом обследовании в течение 2-х лет зафиксировано исчезновение HBsAg в крови на фоне исходного уровня HBsAg в крови от 15 до 600 МЕ/мл, неопределяемого уровня виремии НВУ и нормальной активности АлАТ в крови с появлением специфических антител к поверхностному антигену (у двух из них - с защитным уровнем анти-НВв в крови).

Таким образом, у больных НВе-позитивным ХГВ достоверно выше количественное содержание HBsAg в крови, чем у пациентов с НВе-негативным ХГВ и неактивных носителей ¡НВУ. Полученные данные о низкой концентрации HBsAg в крови и последующего её уменьшения у части неактивных носителей НВУ, а также о зарегистрированной сероконверсии HBsAg-/aнти-HBs+, позволяют рассматривать определение количественного содержания НВвАд в качестве дополнительного критерия для выявления «истинных» неактивных носителей НВУ. ¡Динамический контроль низких концентраций HBsAg в крови позволит выявить «истинных» реактивных носителей НВУ, у которых существует вероятность спонтанной элиминацией НВУ. Как показало исследование, серологический уровень HBsAg менее 1 000 МЕ/мл, помимо

признанных нами по результатам комплексного динамического обследования неактивных носителей HBV, также регистрируется в образцах крови с неопределяемым уровнем ДНК HBV в крови и у больных НВе-негативным ХГВ в 37% случаев. Поэтому, учитывая возможность выявления у части больных НВе-негативным ХГВ при динамическом обследовании неопределяемого уровня HBV на фоне нормальной активности АлАТ в крови, необходим динамический (как минимум 1,5 - 2 года) мониторинг уровней ДНК HBV, HBsAg и АлАТ в крови у пациентов с НВе-негативной хронической HBV-инфекцией для выявления «истинных» неактивных носителей HBV. У больных с неопределяемым уровнем виремии HBV снижение концентрации HBsAg в крови при динамическом обследовании может говорить о возможном сероклиренсе HBsAg с появлением специфических анти-HBs.

Результаты исследования показали, что определение количественного содержания HBsAg в крови не является альтернативой определению уровня виремии HBV у пациентов с хронической HBV-инфекцией. Не следует забывать, что снижение концентрации HBsAg в крови может быть связано с мутациями в S-гене, а не с уровнем репликацией HBV. Учитывая тот факт, что повышение активности АлАТ и АсАТ в крови не является специфическим маркером вирусного повреждения ткани печени, комплексное количественное определение содержания HBsAg и ДНК HBV в крови позволит клиницисту определить активность хронической HBV-инфекции и выработать тактику ведения пациента.

Следующим этапом исследования было определение генетической вариабельности HBV, т.к. исследования последних лет показали, что с генотипами HBV связаны темпы прогрессирования хронического заболевания печени. В частности показано, что генотипы С и D HBV ассоциируется с более активной формой хронической HBV-инфекции. При определении генетической вариабельности HBV у 113 HBsAg- и ДНК HBV-позитивных больных хронической HBV-инфекции (ХГВ моно- и микст-инфекция, ЦП HBV, ЦП HBV+HDV) показано, что в изучаемой популяции пациентов достоверно чаще регистрируется инфицирование генотипом D HBV (84,8%), по сравнению с другими выявленными генотипами HBV (р < 0,001), которые обнаружены в небольшом проценте случаев: генотип HBV А - в 4,5% случаев, генотип С HBV - в 2,7% случаев, а также смешанный генотип C/D HBV - в 8% случаев.

Среди 5 пациентов, инфицированных генотипом A HBV, выявлены низкий и высокий уровни виремии HBV в одинаковой пропорции (40%). У 2-х больных диагностирован HBeAg-негативный ХГВ с нормальной активностью трансаминаз в крови, у 1 пациентки - НВе-позитвиный ХГВ с повышенной активностью АлАТ в крови, у одной больной - ХГВ с дельта-агентом с волнообразным уровнем ДНК HBV в крови и нормальной активностью АлАТ в крови. Генотип A HBV также обнаружен у одной пациентки ХГВ с исходом в ЦП, при однократном ПЦР-обследовании которой выявлен высокий уровень виремии - 109 копий/мл. Таким образом, при инфицировании пациентов генотипом A HBV регистрируется различная

ктивность заболевания.

У трех (100%) пациентов, инфицированных генотипом С HBV, выявлена высокая ктивность хронической HBV-моноинфекции: у 2-х больных - HBeAg-негативный ХГВ высокая вирусная нагрузка HBV - Ю7"10 копий/мл, повышенная активность АлАТ и АсАТ в рови), у 1-го пациента - HBeAg-негативный ХГВ с исходом в ЦП. Среди 9 пациентов, нфицированных генотипами C/D HBV, было 7 (77,8%) больных ХГВ, 1 (11,1%) больная BeAg-негативным ХГВ с исходом в ЦП и 1 (11,1%) больной ХГВ с ко-инфекцией HCV. У ациентов с хронической HBV-инфекцией, инфицированных смешанным генотипом C/D HBV, ак на фоне нормальной, так и повышенной активности АлАТ в крови, в 100% случаев егистрируется высокий уровень виремии HBV.

Анализируя распространенность генотипов HBV в изучаемой популяции выявлено, что реди пациентов с различными вариантами хронической HBV-инфекции регистрируется иркуляция в основном (95,5%) генотипов D и С HBV, среди них в 8,4% случаев выявлен мешанный генотип C/D. Течение хронической HBV-инфекции у пациентов, инфицированных енотипом С и C/D HBV, в 100% случаев характеризуется наличием высокой вирусной гагрузкой ДНК HBV преимущественно на фоне повышенной активности АлАТ в крови. Таким бразом, у пациентов, включенных в данное исследование, выявлены два значимых фактора иска развития неблагоприятного исхода хронического заболевания печени, а именно шфицирование генотипами D, С, C/D HBV (в большинстве случаев) и высокий уровень иремии HBV (~ у 1/5 пациентов).

Наряду с определением генотипов HBV у 26 больных ХГВ и 10 больных ХГВ с исходом ЦП изучена мутационная изменчивость HBV. Среди обследованных 26 ДНК HBV-позитивных 1 ациентов с ХГВ, инфицированных преимущественно (85%) генотипом D HBV, как в группе п=10), получавших различную ПВТ в анамнезе, так и в группе пациентов (п=16) с стественным течением ХГВ, в 50% случаев выявлены различные мутации в S- и Р-генах HBV.

группе пациентов (п=8) с естественным течением ХГВ и выявленными мутациями HBV, нфицированных генотипом D HBV, в 50% случаев выявлены мутации, как в S-гене, так и в Рне (F180W в S-гене + с W79R и Y89D в Р-гене; Р120Т, I86T в S-гене + T128N в Р-гене; T116Р, 118Р и SI 17G в S-гене + мутации S135F, Н100Р в Р-гене; L95S в S-гене и R110G в Р-гене), у ех (37,5%) пациентов мутации выявлены только в S-гене (Т118А, D144V, T126N), у одной 12,5%) пациентки - в Р-гене (A194D). У больных ХГВ с естественным течением мутации в S- и -генах HBV регистрируются при различных уровнях ДНК HBV в крови, однако в большинстве 62,5%) случаев мутации выявлены у пациентов с высоким уровнем виремии HBV у больных Ве-позитивным и НВе-негативным ХГВ (р=0,3173). Среди пациентов, получавших терапию <интерферон+ламивудин» в анамнезе и инфицированных генотипом D HBV, в 50% случаев ыявлены мутации и только в Р-гене (n=l - S85F, n=l - L180M в сочетании T184S). Среди 6 ациентов, получавших терапию ИФН в анамнезе, у 2-х пациентов, инфицированных

генотипом D HBV, с наличием HBeAg в крови выявлены мутации в S-гене (Т118А), у одного пациента, инфицированного генотипом A HBV, - в Р-гене (S219A). У 2-х (100%) пациентов, получавших терапию ИФН и инфицированных генотипом С HBV, мутаций в S- и Р-генах не обнаружено. Обращает на себя внимание, что мутация TI 18А в S-гене была выявлена только у больных НВе-позитивным ХГВ, как при естественном течении, так и у пациентов с указанием на проведение в анамнезе различной ПВТ. Среди 10 ДНК HBV-позитивных больных ЦП, у которых проводилось определение мутационной изменчивости HBV, 90% пациентов инфицированы генотипом D и в 70% случаев вывялены точечные замены. В 57,1% случаев выявлены мутации только в S-гене (F80S; L109I; 2 пациента - Т118А, из них у одного в сочетании с I110F), в 28,6% случаев - мутации только в Р-гене (Q130D; N139D), в 14,3% случаев сочетание мутаций Y134N и М133Т в S-гене и V142E в Р-гене HBV. У одного пациента, инфицированного генотипом A HBV, мутаций не выявлено. Не выявлено связи уровня виремии HBV и концентрации HBsAg в крови с наличием или отсутствием выявленных аминокислотных замен в S- и Р-генах HBV.

Таким образом, среди 36 пациентов дикий штамм HBV выявлен в 50% случаев при ХГВ и 30% случаев при ЦП (р > 0,05), а различные аминокислотные замены в S- и Р-генах HBV - в 56% случаев. При этом описанные в научной литературе мутации в S-гене, связанные с уровнем репликации HBV, исходами в ГЦК, в данном исследовании выявлены не были. У больных ХГВ с естественным течением чаще регистрируются сочетанные мутации S- и Р-генов (50%), а также мутации в S-гене (37,5%). Напротив, у больных ЦП с естественным течением чаще регистрируются мутации в S-гене (50%), а сочетанные мутации S- и Р-генов - в 14,3% случаев (р>0,05). Выявленные точечные мутации в S- и Р-генах HBV, не описанные раннее в научной литературе, могут быть потенциально клинически значимыми.

Анализ полиморфизма 7 генов [Huang H., 2007] показал, что, как у лиц контрольной группы (старше 50 лет и без клинических признаков ЦП), так и больных ЦП различной этиологии, преобладает выявление «неблагоприятных» генотипов генов AZIN1 (GG), TRL4 (СС), TRPM5 (СС+СТ), SNP5 (GG) и «благоприятные» генотипы полиморфизмов rs2290351 (SNP4 - GG) и rs 17740066 (SNP6 - GG). «Неблагоприятные» полиморфизмы СТ и СС гена TRPM5 чаще выявляются у больных ЦП различной этиологии по сравнению с контрольной группой, однако различия статистически не достоверны.

Только у больных ЦП HCV-этиологии достоверно реже выявляется «благоприятный» полиморфизм AG гена AZIN1 (антизим-ингибитора-1) по сравнению с лицами контрольной группы (х2=3,672, р=0,0553). У больных алкогольным ЦП по сравнению с лицами контрольной группы достоверно реже выявляются «неблагоприятные» генотипы SNP4: AG+AA - р=0,0451; AG - р=0,0329. «Неблагоприятный» полиморфизм GG гена AQP4 в большинстве (71,7% случаев выявляется у лиц контрольной группы, а у пациентов с ЦП различной этиологии встречается от 38,5 до 67,6%, в тоже время, по сравнению с контрольной группой статистическ

ростоверно реже у больных ЦП НВУ-этиологии (р=0,0244) и ЦП смешанной вирусной тиологии (р=0,0036).

Анализ полиморфизма 4 генов, отвечающих за метаболизм алкоголя, показал, что в ¡¡ольшинстве случаев в исследуемых группах встречаются «благоприятные» генотипы генов ОН1В (ОС: 76,9% - 95%), АЬОН2 (00: 100% во всех группах) и СУР2Е1-р8И (00: 88,5% -00%). Напротив, среди больных ЦП различной этиологии и лиц контрольной группы чаще 'стречается «неблагоприятный» полиморфизм гена СУР2ЕНач1 (СС: 76,3% - 96,2% и 78,3%, ^ответственно). У больных ЦП смешанной вирусной и неуточненной этиологий достоверно 1аще по сравнению с контрольной группой встречается «неблагоприятный» полиморфизм ОА (•ена АОН1В (р=0,0119 и р=0,0285, соответственно). У больных ЦП НВУ-этиологии, как при ,юно-инфекции, так и при микст-инфекции, достоверно реже по сравнению с лицами контрольной группы выявляется «благоприятный» генотип Сй СУР2Е14ац1 (р=0,0397 и ^=0,0398, соответственно).

Таким образом, в обследованной популяции, как среди лиц контрольной группы, так и среди больных ЦП различной этиологии, в большинстве случаев регистрируются неблагоприятные» генотипы изучаемых кандидата ых генов, что при действии Дополнительных факторов, приводящих к развитию хронического заболевания печени, могут рпособствовать развитию ЦП.

Частота выявления генетически детерминированных рисков развития неблагоприятного исхода хронического заболевания печени у больных ЦП вирусной, алкогольной и деуточненной тиологий представлена на рисунке 7.

Рисунок 7. Частота выявления генетически детерминированных рисков развития неблагоприятного исхода хронического заболевания печени у больных ЦП вирусной, алкогольной и неуточненной этиологий

При анализе генетического риска развития ЦП в целом среди всех подгрупп больных ЦП наименее часто регистрируется низкий риск развития ЦП и его максимальная частота выявления составила 21,4% при ЦП HBV-этиологии без сопутствующего алкогольного поражения печени. Учитывая самое минимальное (7,7%) выявление генетически детерминированного низкого риска развития ЦП у больных ЦП вирусной смешанной этиологии, можно предположить, что это отражает независимый от генетической предрасположенности вклад сочетанного инфицирования (HBV, HCV, HDV) в развитие неблагоприятного исхода ХВГ. В большинстве случаев независимо от этиологии ЦП регистрируются высокий (от 29,7% до 57,1%) и неопределенный (от 28,6% до 57,7%) риски развития ЦП. У больных ЦП HBV- и HCV-этиологии без учета сопутствующего алкогольного поражения печени преимущественно регистрируется высокий (39,3% и 35,4%, соответственно) и неопределенный (39,3% и 43,8%, соответственно) генетические риски развития ЦП. Однако при разграничении больных ЦП HBV- и HCV-этиологии, злоупотребляющих алкоголем, высокий риск ЦП уже регистрируется в 57,1% и 50% случаев, соответственно, а неопределенный риск - в 28,6% и 38,9% случаев, соответственно (статистически не достоверно). У больных ЦП HBV-этиологии и в целом у больных ЦП смешанной вирусной этиологии высокий генетически детерминированный риск развития ЦП выявляется достоверно чаще, чем низкий генетически детерминированный риск развития ЦП (х2-4,242, р=0,0394 и х2-5,650, р=0,0175, соответственно). У больных ЦП смешанной вирусной этиологии неопределенный генетически детерминированный риск развития ЦП также выявляется достоверно чаще, чем низкий генетически детерминированный риск развития ЦП (х2=14,770, р=0,0001). Таким образом, полиморфизмы 7 генов, которые определялись с высокой частотой у больных с неблагоприятным исходом хронической HCV-инфекции [Huang Н., 2007], показали в нашем исследовании аналогичную значимость, как у больных ЦП HCV-этиологии, так и у пациентов с ЦП иной этиологии.

Дополнительно, для оценки возможного вклада генетического полиморфизма генов человека в развитие ЦП, проанализировано распределение генетических рисков развития неблагоприятного исхода ХГВ среди пациентов с высокой активностью хронической HBV-инфекции (НВе-позитивный ХГВ, п=13; НВе-негативный ХГВ с высоким уровнем виремии HBV (> 105 копий/мл) и повышенной активностью АлАТ в крови, п=37; предполагаемо неактивное носительство HBV, п=35; 10 больных ХГВ с неэффективностью ПВТ в анамнезе), см.рисунок 8. У пациентов с высокой активностью хронической HBV-моноинфекции, как пр НВе-позитивном, так и НВе-негативном ХГВ преимущественно регистрируются высоки" (38,5% и 43,2%, соответственно) и неопределенный (46,1% и 40,5%, соответственно генетические риски развития неблагоприятного исхода ХГВ, что наблюдается и у пациентов ЦП различной этиологии. Наиболее часто (37,1%) в рассматриваемых группах пациентов хронической HBV-инфекцией низкий риск развития ЦП встречается у пациентов

I 31

минимальной активностью заболевания, а именно у неактивных носителей НВУ, и достоверно ч!аще только по сравнению с больными НВе-негативным ХГВ (х2-4,055, р=0,0440).

60% -

50% 40%

'' Высокий риск ЦП ■ Неопределенный ркск ЦП «Нкшнн ригкЦП

*-** р=0,0440

рисунок 8. Частота выявления варианта генетического риска развития неблагоприятного исхода у пациентов с различной активностью течения хронической НВУ-моноинфекции

У больных НВе-негативным ХГВ с высоким уровнем виремии НВУ и" повышенной ¡¡ктивностью АлАТ в крови достоверно чаще регистрируются высокий и неопределенный -енетически детерминированные риски развития ЦП по сравнению с низким генетическим . иском развития ЦП (%2=6,469, р=0,0110, х2=5,385, р=0,0203, соответственно). В группе больных ЧВе-позитивным ХГВ не выявлено статистически достоверных различий в частоте выявления высокого и неопределенного генетически детерминированных рисков развития ЦП по уравнению с низким генетическим риском развития ЦП (х2= 1,759, р=0,1847 и х2=2,889, з=0,0892, соответственно). У больных ХГВ с неэффективностью ПВТ в анамнезе регистрируются только высокий и неопределенный генетически детерминированные риски ЦП. Таким образом, на основании проведенного генетического анализа выявлено, что у эольшинства пациентов с ЦП различной этиологии регистрируются высокий и неопределенный генетически детерминированные риски развитии ЦП, а в группе пациентов с минимальной исгивностью хронической НВУ-инфекции выявлена максимальная частота регистрации низкого | енетически детерминированного риска развития ЦП, что говорит о целесообразности использования данного показателя как критерия возможности неблагоприятного исхода |заболевания и необходимости его учета при решении вопроса о назначении ПВТ.

На основании полученных результатов в ходе проведения данного исследования разработан алгоритм действий врача при обследовании пациента с различными вариантами

хронической НВУ-инфекции (см. приложение 1, 2,3).

ВЫВОДЫ

1. Пациенты с хронической НВУ-моноинфекцией нуждаются в комплексном обследовании по определенному диагностическому алгоритму, включающему динамическое определение уровней активности АлАТ, количественного содержания ДНК НВУ, концентрации НВзА§ в крови для выявления неактивных носителей НВУ, а также пациентов с любым детектируемым уровнем НВУ, которым с целью выявления показаний для назначения ПВТ требуется проведение ПБП и определение генетического риска ЦП.

2. У беременных женщин отмечается мягкое течение хронической НВУ-инфекции: в большинстве случаев поводом для госпитализации является не наличие данного заболевания, а плановое родоразрешение (70% - при неактивном носительстве НВУ, 84% - при ХГВ, 59% - при ХВГ смешанной этиологии); преимущественно отсутствуют жалобы при поступлении в стационар; частота выявления патологии беременности в указанных трёх подгруппах пациенток достоверно не различается (р > 0,05); в то же время определение уровня виремии НВУ в 30,2% случаев позволяет уточнить вариант течения хронической НВУ-моноинфекции.

3. Среди пациентов, включенных в исследование, доминирует выявление НВеА§-негативного варианта хронической НВУ-инфекции, при котором достоверно чаще регистрируется нормальная активность АлАТ в крови (р<0,05) и низкий (103"4 копий/мл) уровень виремии НВУ (при однократном, двукратном и трехкратном обследованиях от 26,1 до 49%).

4. НВеА§-позитивный вариант хронической НВУ-моноинфекции диагностирован у 7°/ пациентов и характеризуется выявлением высокого (> 105 копий/мл) уровня виремии НВУ 100% случаев (у 93% в сочетании с повышенным уровнем активности АлАТ в крови) различной степенью повреждения ткани печени (ИГА от < 4 до 7 баллов, стадия фиброза Р0 Р4).

5. Показания для назначения ПВТ по данным биопсии печени (ИГА > 6 и/или Р > 2 выявлены у больных хронической НВУ-моноинфекцией с различной активностью АлАТ крови, как в отсутствии, так и при наличии виремии НВУ: при различных диапазон определяемого уровня виремии НВУ с повышенной активностью АлАТ в крови - у 55°/ больных, с нормальной активностью АлАТ - у 45% пациентов; у лиц с высоким уровне виремии НВУ в 58%, у пациентов с низкой виремией НВУ - в 73% случаев.

6. Как по данным ПБП (86%), так и по данным ТФ (76,2%), у подавляющего числ больных ХГВ регистрируются стадии фиброза печени Р < 2, однако в 52,4% случаев выявлен-недооценка, а в 19% случаев - переоценка на 1-2 стадии фиброза печени по данны, транзиентной фиброэластографии.

7. Средняя концентрация HBsAg в крови у больных НВе-позитивным ХГВ (119 834,6 ± 211 МЕ/мл) достоверно выше по сравнению с больными НВе-негативным ХГВ и

еактивными носителями HBV (11 813,8 ± 1 284,8 МЕ/мл, р < 0,05, 4 732,8 ± 1 692,78 МЕ/мл, р 0,01, соответственно).

8. Корреляционный анализ не выявил связи уровня виремии HBV с количественным держанием HBsAg в крови у пациентов с НВе-негативной хронической HBV-моноинфекцией, нако в отсутствии виремии HBV у большинства (72,2%) пациентов с неактивным

осительством HBV при трехкратном динамическом обследовании в течение 1,5 - 2-х лет егистрируются концентрации HBsAg в крови менее 1 ООО МЕ/мл, причем у 38,9% пациентов анной группы - менее 15 МЕ/мл с последующим динамическим снижением до минимальных ачений (0,09 - 2,3 МЕ/мл), включая его неопределяемый уровень.

9. Среди пациентов с ХГВ и ЦП, преимущественно инфицированных генотипом D HBV, астота выявления дикого варианта HBV достоверно не различается в группах больных ХГВ и ольных ЦП HBV-этиологии, в 56% случаев выявлены различные аминокислотные замены в егионах S- и Р-генов HBV, не связанные с уровнем виремии HBV и концентрацией HBsAg в рови; только мутация Т118А в S-гене регистрируется, как в группе больных ХГВ, так и ольных ЦП HBV-этиологии.

10. Как у лиц контрольной группы, так и у больных ЦП различной этиологии, выявлены в олыпинстве случаев «неблагоприятные» варианты аллелей генов AZIN1, TRL4 (rs4986791), RPM5 (rs886277), SNP5 (rs2290351), AQP2 (rs2878771), CYP2El-ptsI, ..высокий и еопределенный генетически детерминированные риски развития ЦП; не обнаружено тдельных вариантов полиморфизма изучаемых генов, независимо влияющих на развитие ЦП, а аксимальная частота регистрации генетически детерминированного низкого риска развития П обнаружена в группе неактивных носителей HBV.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Учитывая возможное однократное отсутствие ДНК HBV в крови на фоне повышения ктивности АлАТ, наличие виремии HBV на фоне нормальных значений трансаминаз в крови, а акже отсутствие в течение длительного времени виремии HBV на фоне нормальной ктивности АлАТ в крови, для своевременного выявления лиц, нуждающихся в назначении ВТ, целесообразно комплексное динамическое обследование с помощью предложенного горитма тактики ведения пациентов с хронической HBV-моноинфекцией, включающее

пределение уровней активности АлАТ, АсАТ в крови, виремии HBV, УЗИ органов брюшной олости 1 раз каждые 6 месяцев, морфологическое исследование ткани печени, определение енетически детерминированного риска развития ЦП.

2. Динамический мониторинг количественного содержания HBsAg в крови показан

пациентам с неопределяемым уровнем виремии НВУ, нормальной активностью АлАТ в крови в течение 1,5 - 2-х лет в качестве дополнительного критерия неактивного носительства НВУ как состояния с минимальным риском реактивации НВУ.

3. Пациентам с НВе-негативной хронической НВУ-моноинфекцией вне зависимости о уровня активности АлАТ в крови и уровня виремии НВУ показано проведение морфологического исследования пунктата печени, полученного методом ПБП.

4. При наличии противопоказаний для проведения ПБП у пациентов с хронической НВУ моноинфекцией в качестве альтернативного метода диагностики фиброза печени возможн использование ТФ, однако учитывая большой процент расхождений результатов ПБП и ТФ п данным проведенного исследования, целесообразно ТФ дополнять другим сертифицированными серологическими неинвазивными методами диагностики фиброза печени.

5. Целесообразно проведение динамического мониторинга уровня активности АлАТ, АсА в крови, виремии НВУ у женщин на различных сроках беременности, что позволи своевременно выявлять пациенток, у которых существует высокий риск реактивации НВУ в время беременности и после родов, что, в первую очередь, требует решения вопроса назначении ПВТ без учета триместра беременности и проведения активно-пассивно иммунизации для снижения риска вертикальной передачи НВУ-инфекции.

6. Во время беременности целесообразно проведение серологического обследования н наличие маркеров НОУ- и НСУ-инфекций для исключения у НВзА§-позитивных пациента ХВГ смешанной этиологии.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АлАТ - аланинаминотрансфераза АсАТ - аспартатаминотрансфераза ГЦК - гепатоцеллюлярная карцинома ИГА - индекс гистологической активности ИФА - иммуноферментный анализ ПВТ - противовирусная терапия ПЦР - полимеразная цепная реакция ПБП - пункционная биопсия печени ТФ - транзиентная фиброэластография ХВГ - хронический вирусный гепатит ХГВ - хронический гепатит В

ХГВ+С- хронический гепатит В с ко-инфекцией НСУ ХГВ+Д- хронический гепатит В с ко-инфекцией НОУ ХГВ+С+Д- хронический гепатит В с ко-инфекцией НСУ + НОУ

П - цирроз печени Ф - щелочная фосфатаза ГП - гаммаглютамилтранспептидаза BsAg - поверхностный антиген вируса гепатита В BV - вирус гепатита В CV - вирус гепатита С DV - вирус гепатита Д

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

Ющук, Н.Д. Диагностическая роль выявления коллагена IV типа и гиалуроновой кислоты сыворотке крови больных хроническим гепатитом С для определения стадии фиброза печени / .Д. Ющук, О.О. Знойко, Н.Х. Сафиуллина, K.P. Дудина и др. // Терапевтический архив,-05. - №4. - Т.П. - С. 50-55.

Дудина, K.P. Количественное содержание HBsAg в крови у пациентов с различными риантами хронической HBV-инфекции / K.P. Дудина, С.А. Шутько, О.О. Знойко и др. II ерапевтический архив. - 2008. - №11. - С. 29-32.

Малахова, М.В. Масс-спектрометрическое генотипирование вируса гепатита В / .В. Малахова, E.H. Ильина, В.М. Говорун, С.А. Шутько, K.P. Дудина и др. // Бюллетень •спериментальной биологии и медицины. - 2009. - №2. - Т.147. - С. 181-187.

Шутько, С.А. Клиническое значение динамического определения уровня вирусной агрузки в крови у пациентов с естественным течением хронической HBV-моноинфекции / .А. Шутько, K.P. Дудина, О.О. Знойко и др. // Российский журнал гастроэнтерологии, епатологии, колопроктологии. - 2009. - №6. - T.XIX. - С. 28-33.

Дудина, K.P. Этиологическая структура заболеваний у беременных женщин с овышенной активностью АлАТ и АсАТ в крови, поступающих в акушерское отделение нфекционного стационара / K.P. Дудина, О.О. Знойко, Ю.Г. Трубицына и др. // "ерапевтический архив. -2010. - №11. - С. 45-48.

Ющук, Н.Д. Проблемы диагностики гепатоцеллюлярной карциномы в клинической рактике / Н.Д. Ющук, Н.П. Блохина, О.О. Знойко, K.P. Дудина и др. // Хирург. - 2010. - №12. -.21-24.

Дудина, K.P. Клинико-диагностическое значение уровня виремии HBV у беременных енщин с хронической HBV-инфекцией / K.P. Дудина, О.О. Знойко, Ю.Г. Трубицына и др. // [ечащий врач.-2010. - №11. - С. 23-26.

Ющук, Н.Д. Протокол диагностики и лечения больных вирусными гепатитами В и С / .Д. Ющук, Е.А. Климова, О.О. Знойко, Г.Н. Кареткина, С.Л. Максимов, Ю.В. Мартынов, .С. Шухов, K.P. Дудина и др. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, солопроктологии. - 2010. - №6. - Т.ХХ. - С. 4-60.

9. Чоговадзе, А.Г. Ассоциация полиморфизмов генов ADH1B, ALDH2 и CYP2E1 с развитием алкогольной зависимости и алкогольного цирроза печени / А.Г. Чоговадзе, Э.В. Генерозов, В.В. Николаева, К.Н. Поплевченков, А.Г. Веретинская, И.П. Анохина, K.P. Дудина и др. И Наркология. - 2011. - №1. - С. 50-56.

10. Цыганова, Е.В. Острый гепатит неугочненной этиологии // Е.В. Цыганова, О.О. Знойко, Н.Д. Ющук, K.P. Дудина и др. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии колопроктологии. - 2011. - №1. -T.XXI. - С. 32-39.

11. Дудина, K.P. Динамическое определение количественного содержания HBsAg в крови сопоставлении с уровнем вирусной нагрузки у пациентов с хронической HBV-моноинфекцией / K.P. Дудина, О.О. Знойко, С.А. Шутько и др. // Российский журнал гастроэнтерологии гепатологии, колопроктологии. - 2011. - №4. - T.XXI. - С. 50-55.

12. Дудина, K.P. Сравнительный анализ инвазивной и неинвазивной диагностики фиброз печени у больных ХГВ / K.P. Дудина, О.О. Знойко, С.А. Шутько и др. // Врач. -№10. - С. 57-59.

13. Ющук, Н.Д. Генетическая изменчивость вирусов гепатита человека и ее клиническо значение / Н.Д. Ющук, О.О. Знойко, Е.А. Климова, K.P. Дудина и др. // Москва. - МГМСУ 2007. - 139 С. МОНОГРАФИЯ.

14. Чешик, Д.С. Хроническая алкогольная интоксикация и наркомании у больных находящихся в отделении вирусных гепатитов / Д.С. Чешик, K.P. Дудина, H.A. Малышев / Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. Материалы Девято Российской конференции «Гепатология сегодня». -2004. - №1. -Том XIV. - Приложение №22. С. 29.

15. Чешик, Д.С. Роль гипоальбуминемии в клинических проявлениях отёчно-асцитическог синдрома у больных циррозами печени различной этиологии / Д.С. Чешик, K.P. Дудин О.О. Знойко и др. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии Материалы Десятой Российской конференции «Гепатология сегодня». - 2005. - №1. - T.XV. Приложение №24. - С.40.

16. Znoyko, О.О. Viral hepatitis со-infections in human immunodeficiency virus positive patient recorded by Moscow Infectious Disease hospital during 2006 / O.O. Znoyko, K.R. Dudin S.A. Shutko, M.G. Isaguliants // 3rd International Workshop on HIV and Hepatitis Co-infection Paris - France, 7-9 June 2007. - Abstract 28. - P. 24.

17. Трубицына, Ю.Г. Этиологическая структура заболеваний печени у беременных Ю.Г. Трубицына, О.О. Знойко, K.P. Дудина и др. // Материалы VI Всероссийской научно практической конференции «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики лечения и профилактики». - М. - 2007. - С. 73-74.

18. Шутько, С.А. Распространенность генотипов вируса гепатита В среди пациентов хронической HBV-инфекцией, госпитализированных в стационары г.Москвы / С.А. Шутько K.P. Дудина, О.О. Знойко и др. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии

лопроктологии. Материалы XIII Российской конференции "Гепатология сегодня». - 2008. -XVIII. - № 1. Приложение №31. - С. 44.

Шутько, С.А. Показатели уровня вирусной нагрузки HBV в сыворотке крови больных оническим гепатитом В при динамическом обследовании / С.А. Шутько, K.P. Дудина, .0. Знойко и др. // Тезисы докладов VI научно-практической конференции «Инфекционные лезни и антимикробные средства». - М. - 2008. - С.65.

Дудина, K.P. Анализ генетических факторов риска развития цирроза печени у больных с личными исходами хронической инфекции вирусами гепатита В и С / K.P. Дудина, .А. Шутько // ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава. XXXI Итоговая конференция молодых ученых. ГМСУ труды конференции. - М. - 2009. - С.104-105.

Шутько, С.А. Клиническое значение определения ДНК HBV и уровня вирусной нагрузки крови у больных с различными вариантами хронической HBV-инфекции / С.А. Шугько, .Р. Дудина // ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава. XXXI Итоговая конференция молодых ученых. ГМСУ труды конференции. - М. - 2009. - С. 399-400.

Вавилова, Е.В. Клинико-лабораторная характеристика и этиологическая структура [иентов с циррозом печени, поступающих в хирургическое отделение портальной пертензии / Е.В. Вавилова, K.P. Дудина // Материалы 57 Итоговой студенческой научной нференции ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава. - М. - 2009. - С.75.

Дудина, K.P. Динамическое определение концентрации HBsAg в зависимости от уровня русной нагрузки в крови пациентов с хронической HBV-инфекцией / K.P. Дудина, .А. Шутько, О.О. Знойко и др. // Материалы X Юбилейного съезда научного общества строэнтерологов России. - М. - 2010. - С.67.

Пыпкина, Е.В. Серологический уровень HBsAg у пациентов с хронической HBV-нфекцией / Е.В. Пыпкина, K.P. Дудина // Материалы 58-ой Итоговой студенческой научной нференции ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава. - М. - 2010. - С.93-94.

5. Дудина, K.P. Роль полиморфизма генов человека в развитии цирроза печени у больных роническими вирусными гепатитами / K.P. Дудина, О.О. Знойко, С.А. Шутько и др. II VIII аучно-практическая конференция «Инфекционные болезни и антимикробные средства». - М. -010.-С.24-26.

6. Знойко, О.О. Российский пациент с хроническим гепатитом В - от клинических сследований к реальной практике / О.О. Знойко, K.P. Дудина, С.А. Шутько и др. // VIII научно-рактическая конференция «Инфекционные болезни и антимикробные средства». - М. - 2010 г. С.28.

7. Козина, А.Н. Клиническая значимость методов диагностики фиброза печени у ациентов с хронической HBV-инфекцией / А.Н. Козина, K.P. Дудина // Материалы 59-ой тоговой студенческой научной конференции ГОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития оссии. - М. - 2011. - С.45 - 46.

Выражаю искреннюю признательность и благодарность научному консультанту: академику РАМН, д.м.н., профессору Ющуку Николаю Дмитриевичу за оказанную мне консультативную и методическую помощь при выполнении диссертационной работы, теплое и внимательное отношение.

Отдельно выражаю сердечную благодарность профессору кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ГБОУ МГМСУ Минздравсоцразвития России, д.м.н. Знойко Ольге Олеговне за оказанную всестороннюю помощь при выполнении данной работы. Также выражаю благодарность сотрудникам кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии МГМСУ: к.м.н. Кареткиной Г.Н., д.м.н. Климовой Е.А.,

к.м.н. Кулагиной М.Г.; главному врачу ИКБ №1 г. Москвы, д.м.н., профессору Малышеву H.A.; заведующим 16 и 18 отделений ИКБ №1 - Каширину В.И. и к.м.н. Чешику Д.С.; сотрудникам клинико-диагностической и микробиологической лаборатории

ГУЗ ИКБ №1 ДЗ г.Москвы; руководителю лаборатории молекулярной генетики человека ФГУ НИИ физико-химической медицины ФМБА, к.б.н. Генерозову Э.В. и его сотрудникам; руководителю лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов ФГУ НИИ физико-химической медицины ФМБА, к.б.н. Ильиной E.H. и её сотрудникам; заведующему лаборатории эпидемиологии гепатитов ГУ института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова, к.б.н. Кюрегяну К.К.

Подписано в печать: 20.07.11

Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 150 экз. Заказ № 367 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Страстной бульвар, 6/1 (495) 978-43-34; www.reglet.ru

Вирусные гепатиты продолжают оставаться одной из социально-значимых проблем мирового здравоохранения. Хронические гепатиты В и С являются основными причинами формирования ЦП и ГЦК, которые ежегодно в мире приводят к летальному исходу более, чем у 1 миллиона человек [48]:

Анализ заболеваемости вирусными гепатитами в Российской Федерации показал, что по сравнению с 90-ми годами, в России с 2001 года наблюдается отчётливая тенденция к снижению заболеваемости ОГВ, благодаря массовой вакцинации населения в рамках приоритетного национального проекта «Здоровье» и реализации в стране мер по борьбе с наркоманиями. Так, в 1992 г. показатель заболеваемости гепатитом В составлял 18,1 на 100 тыс. населения и был близок к показателям в других развитых странах. В последующем происходил рост заболеваемости и в 1999-2000 гг. она достигла пика (43,3 -42,5 на 100 тыс. населения). Начиная с 2001 года, регистрируется отчётливое снижение заболеваемости: 2001 год — 35,3 на 100 тыс. населения, 2005 год -8,56 на. 100 тыс. населения, 2010 год - 2,24 на 100 тыс. населения. В целом, заболеваемость вирусным гепатитом В в Российской Федерации в последние' 5 лет удерживается, в первую очередь, за счет пациентов с хронической HBV-инфекцией. Современной эпидемиологической особенностью гепатита В является активизация полового пути передачи (в отдельных регионах - Москва, Челябинск, Свердловская область и др. такой путь инфицирования регистрируется у 40-50% больных ОГВ) и изменение возрастного состава заболевших: общее число пациентов приходится на долю лиц в возрастных группах 19-29 и 30-39 лет, среди которых плановую вакцинацию, как правило, не проводили (до реализации проекта «Здоровье», которая начата с 2006 года) [16, 20, 21]. В связи с этим, в настоящее время большую роль в распространении HBV играют больные хроническими формами HBV-инфекции, которое реализуется естественными путями передачи HBV, такими

ТЫРМ5 — 5 член субсемейства М потенциал-зависимых катионных каналов ТТУ - вирус, передаваемый при трансфузиях АлАТ — аланин-аминотрансфераза

Анти-НВсоге - антитела к соге-антигену вируса гепатита В класса М

Анти-НВсоге - антитела к соге-антигену вируса гепатита В класса в

Анти-НВе — антитела к HBeAg

Анти-НВб - антитела к HBsAg

Анти-НСУ - антитела к вирусу гепатита С

Анти-НБУ ^М - антитела к вирусу гепатита дельта класса М

Анти-НБУ - антитела к вирусу гепатита дельта класса в

АсАТ - аспартат-аминотрансфераза

ВГ - вирусные гепатиты

ВИЧ — вирус иммунодефицита человека

ГГТП - гамма-глутамилтранспептидаза

ГЦК - гепатоцеллюлярная карцинома

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЖКК - желудочно-кишечное кровотечение

ИГА - индекс гистологической активности

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФН - интерферон кПа— килоПаскали н.о. - нуклеотидные основания

ОГВ - острый гепатит В

ПБП - пункционная биопсия печени

ПВТ - противовирусная терапия

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

ТФ — транзиентная фиброэластография

ХВГ - хронический вирусный гепатит

ХГВ - хронический гепатит В как половая и перинатальная передача.

В последние годы появление методов генодиагностики позволило улучшить диагностику ХГВ и выделять хроническую HBV-инфекцию с высокой и низкой репликативной активностью HBV. Проведенные за последние 10 лет несколько' крупномасштабных, длительных, проспективных когортных исследований выявили взаимосвязь между постоянно высоким уровнем виремии HBV и неблагоприятными исходами заболевания - ЦП и ГЦК [70, 338]. Во многом благодаря этим исследованиям постоянно высокий уровень виремии HBV в настоящее время предлагается рассматривать в качестве одного из критериев назначения больному ХГВ противовирусной терапии, целью которой является снижение уровня виремии HBV до неопределяемого уровня, так как. вследствие этого происходит нормализация уровня биохимических показателей крови и улучшение гистологической картины печени [106, 160].

В настоящее время активно изучается клиническое значение второй количественной характеристики HBV, а именно концентрации HBsAg в крови, которую определяют с помощью коммерческих тест-систем. Часть работ, посвященных- определению количественного содержания * HBsAg в крови, показали прямую корреляцию уровня виремии HBY с концентрацией HBsAg [92, 316]. Ряд других работ демонстрирует слабую корреляцию концентрации HBsAg с уровнем виремии HBV и различные диапазоны количественного содержания HBsAg в крови у больных НВе-позитивным и НВе-негативным ХГВ [170, 204, 304, 305]. Наличие существующих противоречий требует проведение дальнейших исследований, посвященных изучению связи количественного содержания HBsAg с вариантами течения хронической HBV-инфекции.

Благодаря появлению и внедрению молекулярно-генетических методов в клиническую практику, появилась возможность определения различных генотипов HBV, а также - выявления наряду с «дикими» штаммами вируса мутантных вариантов HBV, отличающихся низким уровнем репликации, латентным характером течения инфекции, более активным поражением печени у больных с рге-соге мутациями НВУ [112, 130]. В последнее десятилетие изучается влияние генетической вариабельности НВУ на течение и исход заболевания. С разными генотипами НВУ связывают различные варианты манифестации заболевания и ответ на лечение у больных хронической НВУ-инфекцией. Так показано, что генотип НВУ может влиять на скорость НВе-сероконверсии, тяжесть течения болезни, частоту хронизации и вероятность развития ГЦК [80, 101]. Под вопросом остается корреляция между генотипом НВУ, репликацией вируса, тяжестью поражения печени и исходом заболевания. В целом изучение субтипов и генотипов НВУ является важным для установления связи генетического варианта вируса с тяжестью течения острого и хронического гепатита, развитием фульминантного гепатита В, а также - для создания эффективных вакцин и противовирусных препаратов.

Анализ научной литературы показал, что проявления хронической НВУ-инфекции во многом определяются факторами вируса (генотипы, уровень репликации, рекомбинации и мутации НВУ), макроорганизма (возраст на момент инфицирования, давность инфицирования, пол пациента, иммунный статус), а также - экзогенными факторами (ко-инфицирование гепатотропными вирусами, употребление алкоголя). Однако нуждается в изучении роль дополнительных факторов, которые могут способствовать прогрессированию хронической НВУ-инфекции, а именно стеатоз печени, метаболические нарушения, генетическая предрасположенность макроорганизма, уровень вирусной нагрузки НВУ в крови [106,108,110, 112, 221].

До настоящего времени отсутствуют Российские национальные рекомендации по тактике ведения пациентов с хронической НВУ-инфекцией. В связи с этим, комплексное обследование большой группы пациентов с хронической НВУ-инфекцией, включающее динамическое определение уровней АлАТ и АсАТ в крови, виремии НВУ, серологического уровня НВзА§, морфологическое исследование ткани печени в сочетании с генетической вариабельностью НВУ и генетически детерминированным риском развития ЦП у человека, которое раннее в России не проводили, особенно актуально. Данный диагностический подход может позволить разработать алгоритм и оптимизировать тактику ведения больных при многовариантном течении ХГВ. Учитывая имеющиеся нерешенные клинические проблемы, касающиеся тактики ведения пациентов с хронической НВУ-инфекцией, были сформулированы следующие цель и задачи данного исследования.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: клинико-лабораторное обоснование использования молекулярно-генетических методов диагностики в совершенствовании тактики ведения больных с различными вариантами хронической НВУ-инфекции и создание алгоритма действий врача при обследовании пациентов.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Оценить клиническое и прогностическое значение комплекса диагностических методик, включающих определение уровня виремии НВУ, концентрации HBsAg в крови при динамическом наблюдении пациентов с хронической НВУ-инфекцией в сочетании с морфологическим исследованием пунктата печени и генетически детерминированным риском развития ЦП.

2. Определить особенности клинического течения хронической НВУ-инфекции на фоне беременности с учетом уровня виремии НВУ.

3. Определить уровень виремии НВУ при динамическом наблюдении у пациентов с различными вариантами течения хронической НВУ-инфекции (НВе-позитивный ХГВ, НВе-негативный ХГВ, неактивное носительство НВУ).

4. Сопоставить показатели уровня активности АлАТ и АсАТ в крови, виремии НВУ и морфологические характеристики ткани печени у пациентов с различными вариантами хронической НВУ-инфекции для выявления больных с показаниями к назначению ПВТ.

5. Провести сравнительный анализ результатов оценки фиброза печени инвазивным и неинвазивным методами диагностики у пациентов с хронической НВУ-инфекцией для оценки доли больных с прогрессирующим течением заболевания (Б > 2).

6. Определение количественного содержания HBsAg в крови у неактивных носителей НВУ и пациентов с различными вариантами течения ХГВ при динамическом наблюдении.

7. Изучить генетическую вариабельность НВУ с помощью методов ПЦР и МАЫ)1-ТОР масс-спектрометрии, а также - распределение выявленных генотипов НВУ у пациентов с различными вариантами течения хронической НВУ-инфекции.

8. Определить предикторы риска развития ЦП у больных ХГВ на основе анализа полиморфизма 11 кандидатных генов (А21Ш, ТЫ14, ТКРМ5, 8ИР4 (Г82290351), 8ЫР5 04290029), БИРб (гв17740066), А0Р2, АБН1В, А1ЛШ2, CYP2El-taqI, СУР2Е1-р8И) человека с помощью метода МАЫЛ-ТОР масс-спектрометрии .

9. Усовершенствовать алгоритм по тактике ведения пациентов с различными вариантами хронической НВУ-инфекции в зависимости от комплекса диагностических критериев: степени риска формирования ЦП на основе данных генетического анализа, геноварианта НВУ, динамики уровня виремии НВУ, концентрации HBsAg в крови, биохимической активности гепатита, морфологических изменений ткани печени.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Только комплексное обследование пациентов с хронической НВУ-моноинфекцией, включающее динамическое определение уровней активности АлАТ, количественного содержания ДНК НВУ, HBsAg в крови, позволяет выявить пациентов с неактивным носительством НВУ, а также лиц, которым требуется проведение ПБП для уточнения диагноза и выявления показаний для назначения ПВТ.

2. У пациентов с хронической НВУ-инфекцией преимущественно регистрируются низкие уровни виремии НВУ в крови при динамическом трехкратном обследовании в течение 1,5 — 2-х лет, HBeAg-нeгaтивный вариант хронической НВУ-инфекции и инфицирование генотипом Б НВУ.

3. Значимое повреждение печени (ИГА > 6 и/или К > 2), являющееся показанием для проведения ПВТ, выявляется у пациентов с хронической НВУ-инфекцией, как на фоне отсутствия ДНК НВУ в крови (при однократном обследовании), так и на фоне различного уровня виремии НВУ (постоянно низкого, постоянно высокого и волнообразного), а также при нормальной и повышенной активности АлАТ в крови.

4. При сравнительном анализе данных двух методов оценки фиброза печени (ПБП и ТФ), применяемых у пациентов с хронической НВУ-инфекцией, выявлено преимущественно несоответствие результатов, а именно в ряде случаев переоценка, а в большинстве случаев недооценка стадии фиброза по данным ТФ при сравнении с результатами морфологического исследования биоптата печени.

5. Концентрация НВзА§ в крови при хронической НВУ-инфекции значительно варьирует, не коррелирует с уровнем виремии НВУ у HBeAg-нeгaтивныx пациентов в крови, снижается у большинства лиц с неактивным носительством НВУ при трехкратном динамическом обследовании в течение 1,5 — 2-х лет, а у части из них - до минимальных значений с последующей сероконверсией (HBsAg«-»/aнти-HBs«+»), что позволяет рекомендовать использование данного показателя в качестве дополнительного критерия благоприятного исхода хронической НВУ-инфекции у лиц с нормальной активностью АлАТ в крови и авиремией НВУ при динамическом обследовании.

6. Как у пациентов без признаков хронического диффузного поражения печени старше 50 лет и в отсутствии инфицирования НВУ и НСУ, так и у больных ЦП различной этиологии, преобладает частота выявления «неблагоприятных» вариантов аллелей генов А2Ж1, ТЯЬ4 (ге4986791), ТЯРМ5 (гя88б277), БМР5 гз2290351), А0Р2 (Г82878771), СУР2Е1-р181, определяющих генетическую предрасположенность к развитию неблагоприятного исхода ХЗП. 7. Выявление высокого и неопределенного генетически детерминированного рисков развития ЦП у подавляющего большинства больных ЦП вирусной, алкогольной и криптогенной этиологии, более частая регистрация низкого генетического риска ЦП у лиц с неактивным носительством НВУ и его отсутствие в группе пациентов с неэффективностью ПВТ по данным анамнеза, позволяет рассматривать данный показатель как критерий возможного неблагоприятного исхода заболевания, что говорит о целесообразности определения генетического риска развития ЦП у кандидатов для назначения ПВТ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые применено комплексное обследование пациентов с естественным течением хронической НВУ-инфекции, включающее количественное определение уровня в крови ДНК НВУ и HBsAg в сопоставлении с уровнем активности АлАТ, АсАТ в крови и оценкой степени воспалительной активности и стадии фиброза печени с помощью инвазивного и неинвазивного методов диагностики фиброза печени для уточнения диагноза.

Определение уровня виремии НВУ у большой группы HBsAg-пoзитивныx беременных женщин позволило уточнить вариант течения хронической НВУ-инфекции и выявить в 3,5% случаев реактивацию НВУ в третьем триместре

5 7 беременности, характеризующуюся уровнем виремии 10 - 10 копий/мл на фоне высокой активности АлАТ и АсАТ (до 20 К).

Впервые получены данные о клиническом значении количественного содержания HBsAg в крови как дополнительного критерия неактивного носительства НВУ у лиц с отсутствием детектируемого уровня ДНК НВУ при динамическом обследовании с интервалом 6-12 месяцев в течение 1,5 — 2-х лет.

Выявлены данные о низком уровне количественного содержания НВзА§ в крови у пациентов за 6-12 месяцев до сероклиренса HBsAg (в диапазоне от 15 до 600 МЕ/мл) и снижение минимальных концентраций поверхностного антигена в динамике наблюдения у неактивных носителей НВУ.

При сопоставлении данных ПБП и ТФ показано, что в большинстве случаев регистрируется несовпадение результатов этих двух методов диагностики фиброза печени, как в виде недооценки, так и в виде переоценки неинвазивным методом диагностики стадии фиброза1 печени у пациентов с хронической НВУ-инфекцией, и обосновано предпочтение метода ПБП.

Впервые с использованием определения полиморфизма 7 кандидатных генов выявлены доли высокого, неопределенного и низкого генетически детерминированных рисков развития ЦП при вирусной, алкогольной и неизвестной этиологии данного заболевания, а также показано, что генетически детерминированный низкий риск развития ЦП чаще выявляется у неактивных носителей НВУ, чем у пациентов с другими вариантами течения хронической НВУ-инфекции.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

1. Показана целесообразность внедрения в практическое здравоохранение арсенала современных молекулярно-генетических методов, включающих количественное определение ДНК НВУ, HBsAg, комбинацию инвазивной и неинвазивной диагностики фиброза печени, определение генетической вариабельности генома НВУ и человека, что позволит уточнить диагноз пациенту с хронической НВУ-инфекцией, прогнозировать исход заболевания и выбрать кандидатов для назначения ПВТ.

2. Обоснована необходимость включения в стандартный план обследования HBsAg-бepeмeнныx женщин определение уровня виремии НВУ методом ПЦР, что позволит контролировать течение хронической НВУ-инфекции на фоне беременности и своевременно диагностировать её реактивацию.

3. Целесообразно использовать определение количественного содержания HBsAg в крови как дополнительный критерий диагноза неактивного носительства НВУ при динамическом обследовании пациента.

4. Несмотря на широкое внедрение ТФ для неинвазивной диагностики фиброза печени, у пациентов с хронической НВУ-инфекцией предпочтительно применять ПБП, а дальнейшее мониторирование выраженности фиброза печени возможно с применением ТФ.

5. У пациентов с НВе-негативной хронической НВУ-инфекцией необходимо включить в план обследования определение генетических рисков развития ЦП: выявление высокого генетически детерминированного риска развития ЦП в сочетании с уровнем виремии НВУ > 104 копий/мл вне зависимости от уровня активности АлАТ в крови является дополнительным основанием для назначения ПВТ без необходимости выполнения ПБП.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ

Диссертация апробирована на заседании кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ГОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России-26 мая 2011 г. (протокол №108). Материалы диссертации доложены на Юбилейной ХУ научно-практической конференции «Клинические чтения в Мытищинской городской больнице. Инновационный университет практическому здравоохранению» (Мытищинская городская клиническая больница, 06 июня 2008 г.); VI научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства» (Москва, 03.10.2008 г.), III конгрессе с международным участием «Российский Медицинский Форум -2008», посвященный 250-летию Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (Москва, 19.11.2008 г.), VII научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства» (Москва, 02.10.2009 г.), научно-практической конференции кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ГОУ ВПО МГМСУ Росздрава (Москва, протокол №83 от

30.09.2009 г.), X Юбилейном съезде научного общества гастроэнтерологов России (Москва, 05.03.2010 г.), II Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 29.03.2010 г.), VIII научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства» (Москва,

06.10.2010 г.), III Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 29.03.2011 г.), научно-практической конференции ГОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России (Москва, 28.04.2011 г.).

Основные положения диссертации изложены в 27 печатных работах, опубликованных в период с 2005 г. по 2011 г., из них - 13 в центральной печати, включая 1 монографию.

Материалы проведенных исследований используются в учебном процессе кафедры инфекционных болезней и эпидемиологии ГБОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России на до- и последипломном уровнях образования врачей: включены в лекционный материал, разбираются на практических занятиях со студентами и врачами на курсах повышения квалификации. Предложенный алгоритм обследования пациентов с хронической HBV-инфекцией используется в практической работе на базе Инфекционной клинической больницы №1 г. Москвы.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА

Личное участие автора в получении научных результатов заключалось в отборе пациентов в данное исследование, разработке дизайна исследования, изучении клинических, лабораторных и морфологических данных, характерных для течения хронической HBV-инфекции, изучении результатов генетического анализа, полученного от больных ЦП различной этиологии и лиц контрольной группы. Сформирован банк сывороток крови всех пациентов, включенных в исследование. Автором осуществлялось сопоставление результатов ТФ с данными ПБП. Выполнен статистический анализ полученных данных и проведено сопоставление с данными научной литературы.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 348 страницах и состоит из введения, обзора литературы, 7 глав собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 64 таблицами, 43 рисунками, 3 клиническими примерами. Список литературы содержит 345 источников, из которых 23 отечественных и 322 зарубежных.

ВЫВОДЫ

1. Пациенты с хронической НВУ-моноинфекцией нуждаются в комплексном обследовании, по определенному диагностическому алгоритму, включающему динамическое определение уровней активности АлАТ, количественного содержания Д НК НВУ,, концентрации- HBsAg в - крови: для-выявления» неактивных носителей НВУ, а также пациентов- с любым детектируемым уровнем НВУ, которым с целью выявления показаний для-назначения ПВТ требуется-проведение ПБП и определение генетического риска ЦП.

2. У беременных женщин отмечается, мягкое течение хронической, НВУ-инфекции: в большинстве- случаев поводом для госпитализации5 является не наличие данного заболевания; а плановое родоразрешение (70% - при неактивном носительстве НВУ, 84% - при ХГВ, 59% - при ХВГ смешанной- этиологии); преимущественно отсутствуют жалобы при поступлении в. стационар; частота^ выявления патологии беременности в указанных трёх подгруппах пациенток достоверно не различается (р > 0;05); в то же время определение уровня виремии НВУ В5 30,2%, случаев позволяет уточнить вариант течения хронической НВУ-моноинфекции.

3. Среди пациентов, включенных в исследование, доминирует выявление HBeAg-нeгaтивнoгo варианта хронической НВУ-инфекции, при котором достоверно чаще регистрируется нормальная активность АлАТ в крови (р<0,05) и низкий (10 копий/мл) уровень виремии НВУ (при однократном, двукратном и трехкратном обследованиях от 26,1 до 49%).

4. HBeAg-пoзитивный вариант хронической НВУ-моноинфекции диагностирован у 7% пациентов и характеризуется выявлением высокого (> 105 копий/мл) уровня виремии НВУ в 100% случаев (у 93% в сочетании с повышенным- уровнем активности АлАТ в крови) и различной степенью повреждения ткани печени (ИГА от < 4 до 7 баллов, стадия фиброза F0-F4).

5. Показания для назначения^ ПВТ по данным биопсии печени (ИГА > 6 и/или F > 2) выявлены у больных хронической НВУ-моноинфекцией с различной активностью АлАТ в крови, как в отсутствии, так и при наличии виремии HBV: при различных диапазонах определяемого-уровня виремии HBV с повышенной активностью АлАТ в крови - у 55%-больных, с нормальной активностью АлАТ - у 45% пациентов; у лиц с высоким* уровнем виремии HBV в 58%, у пациентов с низкой виремией HBV — в 73% случаев.

6. Как по данным ПБП (86%), так и по данным ТФ'(76,2%), у подавляющего числа больных ХГВ регистрируются стадии фиброза печени F < 2, однако в 52,4% случаев* выявлена недооценка, а в Л 9% случаев - переоценка на 1-2 стадии фиброза печени по данным транзиентной фиброэластографии.

7. Средняя концентрация HBsAg в крови у больных НВе-позитивным ХГВ (119 834,6 ± 27 211 МЕ/мл) достоверно выше по сравнению с больными НВе-негативным ХГВ и неактивными носителями HBV (11 813,8 ± 1 284,8 МЕ/мл, р < 0,05, 4 732,8 ± 1 692,78»МЕ/мл, р < 0,01, соответственно).

8. Корреляционный анализ не выявил связи уровня» виремии HBV с количественным содержанием HBsAg в кровш у пациентов с НВе-негативной хронической HBV-моноинфекцией, однако в отсутствии виремии HBV у большинства (72,2%) пациентов с неактивным носительством HBV при трехкратном динамическом обследовании в течение 1,5 - 2-х лет регистрируются концентрации HBsAg в крови менее 1 000 МЕ/мл, причем у 38,9% пациентов данной группы - менее 15 МЕ/мл с последующим динамическим снижением до минимальных значений (0,09 - 2,3 МЕ/мл), включая его неопределяемый уровень.

9. Среди пациентов с ХГВ и ЦП, преимущественно инфицированных генотипом D HBV, частота выявления дикого варианта HBV достоверно не различается в группах больных ХГВ и больных ЦП HBV-этиологии, в 56% случаев выявлены различные аминокислотные замены, в регионах S- и Р-генов

HBV, не связанные с уровнем виремии HBV и концентрацией HBsAg в крови; только мутация Т118А в S-гене регистрируется, как в группе больных ХГВ, так и больных ЦП HBV-этиологии.

10. Как у лиц контрольной группы, так и у больных ЦП различной этиологии, выявлены в большинстве случаев «неблагоприятные» варианты аллелей генов AZIN1, TRL4 (rs4986791), TRPM5 (rs886277), SNP5 (rs2290351), AQP2 (rs2878771), CYP2El-ptsI, высокий и неопределенный генетически детерминированные риски развития ЦП; не обнаружено отдельных вариантов полиморфизма изучаемых генов, независимо влияющих на развитие ЦП, а максимальная частота регистрации генетически детерминированного низкого риска развития ЦП обнаружена в группе неактивных носителей HBV.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Учитывая возможное однократное отсутствие ДНК Н ВУ в крови на фоне | повышения« активности! АлАТ, наличие: виремии НВУ на фоне нормальных значении трансаминаз в крови, а также отсутствие в течение длительного времени | . виремии НВУ на фоне нормальной активности АлАТ в крови, для своевременного выявления лиц, нуждающихся в назначении ПВТ, целесообразно комплексное динамическое обследование: с помощью предложенного алгоритма тактики

I , ведения» пациентов» с хронической НВУ-моноинфекцией, включающее определение- уровней; активности' АлАТ, АсАТ в:- кровщ виремии НВУ; УЗИ органов брюшной полости 1 раз каждые: 6 месяцев, морфологическое I исследование ткани печени, определение генетически детерминированного риска развития ЦП.

2. Динамический мониторинг количественного> содержания HBsЛg в крови показан пациентам с неопределяемым уровнем виремии НВУ, нормальной активностыо АлАТ в крови в течение 1,5 - 2-х лет в качестве дополнительного ? критерия неактивного носительства НВУ каксостоянияс минимальным риском

Ц- реактивации НВУ.

3. Пациентам с НВе-негативной хронического НВУ-моноинфекцией; вне зависимости от уровня активности АлАТ в крови и уровня виремии НВУ показано проведение морфологического- исследования пунктата печени, полученного методом ПБП.

I 4. При наличии противопоказаний для проведения ПБП у пациентов с хронической НВУ-моноинфекцией в качестве альтернативного метода г '

§ диагностики фиброза печени возможно использование ТФ, однако учитывая

1 большой процент расхождений результатов ПБП и ГФ по данным проведенного I I исследования, целесообразно ТФ дополнять другими сертифицированными серологическими неинвазивными методами диагностики фиброза печени.

5. Целесообразно проведение динамического мониторинга уровня активности АлАТ, АсАТ в крови, виремии НВУ у женщин на различных сроках беременности, что позволит своевременно выявлять пациенток, у которых существует высокий риск реактивации НВУ во время беременности и после родов, что, в первую очередь, требует решения вопроса о назначении ПВТ без учета триместра беременности и проведения активно-пассивной иммунизации для снижения риска вертикальной передачи НВУ-инфекции.

6. Во время беременности целесообразно проведение серологического обследования на наличие маркеров НОУ- и НСУ-инфекций для исключения у HBsAg-пoзитивныx пациенток ХВГ смешанной этиологии.