Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Хромосомный анализ и мониторинг минимальной резидуальной болезни при остром миелоидном лейкозе у детей

На правах рукописи

<—I м

V. 011! Ш

Батурина Юлия Анатольевна

ХРОМОСОМНЫЙ АНАЛИЗ И МОНИТОРИНГ МИНИМАЛЬНОЙ РЕЗИДУАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ ПРИ ОСТРОМ МИЕЛОИДНОМ ЛЕЙКОЗЕ У ДЕТЕЙ

14.00.14 - Онкология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Москва, 2002

Работа выполнена в Научно-Исследовательском Институте Детской Онкологии Российского Онкологического Научного Центра им. H.H. Блохина РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

С.А. Маякова Е.В. Флейшман

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

В.Г. Савченко A.A. Ставровская

Ведущее научное учреждение: НИИ Педиатрии ГУ НЦЗД РАМН

Защита диссертации состоится " /<? Р£ги* 2002 года

на заседаннии специализированного совета (К.001017.01) Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН (Москва, Каширское шоссе, 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

Автореферат разослан " " 2002 г.

Учёный секретарь

специализированного диссертационного совета,

доктор медицинских наук Ю.А. Барсуков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность.

Прогнозирование ответа на лечение при остром миелоидном лейкозе (ОМЛ) является пока весьма трудной задачей. Только комплекс клинико-лабораторных показателей в каждом конкретном случае позволяет с некоторой долей вероятности сделать предположение о возможности получения ремиссии и её длительности.

Современные методы изучения лейкозных клеток включают морфоцитохимический анализ с использованием световой и электронной микроскопии, иммунофенотипирование, цитогенетический анализ и различные молекулярно-биологические методики (М.А. Френкель, 2001; H.H. Тупицин, 2001; Е.В. Домрачева, 2001; Martinez-Climent, 1999; Radich, 2000). Показано, что лейкозные клетки имеют фенотипические маркёры, соответствующие определённым линиям и стадиям развития кроветворных клеток. Наряду со свойствами, присущими нормальным клеткам гемопоэтической системы, у лейкозных клеток выявлены уникальные признаки, никогда не обнаруженные в нормальных клетках (Rowley, 2001). Исследования, направленные на изучение прогностического значения различных особенностей лейкозных клеток, в настоящее время весьма актуальны.

Некоторые специфические признаки лейкозных клеток, а также их сочетания положены в основу различных классификаций ОМЛ (ВОЗ, 2001; Бене, 1996 и др.). Отдельные классификации оценивают также прогноз заболевания; выделяются группы пациентов благоприятного, неблагоприятного и, иногда, промежуточного прогноза (Grimwade, 1998; Slovak, 2000).

Хромосомный анализ лейкозных клеток, выполненный до начала специфической терапии, зарекомендовал себя, как наиболее информативный и независимый фактор прогноза у больных ОМЛ (Grimwade, 1998; Slovak, 2000; Raimondi, 1999).

Несомненными факторами прогноза при ОМЛ являются некоторые клинико-гематологические показатели, в частности, уровень лейкоцитов в периферической крови на момент постановки диагноза и количество бластов на 14-28 день от начала лечения.

Для оценки глубины ремиссии и максимально ранней (доклинической) диагностики рецидивов ОМЛ широкое распространение получили исследования по мониторингу минимальной резидуальной болезни (И.В. Гальцева, 1997; Radich, 2ООО; Estey, 2001; Venditti, 2000; Liso, 2000).

Цитогенетическое исследование явилось основой для расшифровки аномалий кариотипа на молекулярном уровне, а открытие метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) K.Mullis в 1986 году открыло перспективу широкого внедрения методов молекулярной диагностики в различные отрасли медицины, в частности, в онкогематологию. С помощью ПЦР онкогематологи получили возможность применять эту высокочувствительную методику как с диагностическими целями, так и для обнаружения резидуального лейкозного клона (А.Г. Сергеев,1998; А.Г. Сергеев, 1999; Pallisgaard, 1998; Radich, 2000). Установлено, что специфические хромосомные транслокации приводят к образованию слитных (химерных) генов, которые играют ключевую роль в лейкемогенезе. Эти гены и их продукты (транскрипты) служат маркёрами лейкозных клеток и используются при мониторинге минимальной резидуальной болезни (МРБ). Наиболее характерными для ОМЛ у детей являются специфические хромосомные транслокации t(8;21), t(15;17) и инверсия хромосомы 16, им соответствуют химерные гены AML1-ETO, PML-RARa и CBFP-MYH11.

Несмотря на широкий комплекс исследований, применяемый для установления диагноза ОМЛ, в части случаев дифференциальный диагноз между отдельными вариантами заболевания затруднён, например, между М2 и МЗ вариантами по ФАБ классификации (М.А. Френкель, 2001; Л.В. Байдун, 1996; Avvisati, 2001). Точная верификация диагноза у этих пациентов необходима для назначения адекватной терапии больным ОМЛ(МЗ), в частности аП-трансретиноевой кислоты, позволяющей не только

4

достичь высоких показателей выживаемости, но и предотвратить развитие тяжёлых геморрагических осложнений. Хромосомный анализ и ПЦР помогают решить эту проблему.

Новые подходы в лечении и тактике ведения больных ОМЛ позволили увеличить выживаемость в этой группе пациентов, ранее считавшихся практически некурабельными (A.B. Попа, 1999; В.Г. Савченко, 2001; М.А. Волкова, 2001; Creutzig, 1999). Однако у 30-70 % больных развиваются рецидивы заболевания. Ряд вопросов пока до конца не решён, в частности, "почему морфологическая ремиссия достигается не в 100 % случаев?", "почему кто-то из больных переживает пятилетний рубеж, а кто-то погибает значительно раньше от рецидива заболевания?", "почему у некоторых пациентов достигается молекулярная ремиссия, а у других нет?", "почему больные с отсутствием молекулярной ремиссии не развивают гематологический рецидив?".

Цель работы.

Оценить значение хромосомного анализа и полимеразной цепной реакции в диагностике и прогнозировании течения ОМЛ у детей.

Задачи:

1. Изучить наиболее характерные цитогенетические изменения при ОМЛ у детей

2. Исследовать морфо-цитогенетические параллели при ОМЛ у детей.

3. Оценить прогностическое значение хромосомного анализа при ОМЛ у детей.

4. Исследовать динамику химерного транскрипта AML1-ETO (методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией) в ходе течения ОМЛ с транслокацией t(8;21) у детей.

5. Исследовать динамику химерного транскрипта PML-RARa (методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией) в ходе течения ОМЛ с транслокацией t(15;17) у детей.

6. Исследовать динамику химерного транскрипта СВР(3-МУН11 (методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией) в ходе течения ОМЛ с инверсией хромосомы 16 у детей.

7. Определить клинико-гематологические особенности группы РИЗТО-позитивных ОМЛ у детей.

Научная новизна.

Впервые в России дана детальная хромосомная характеристика ОМЛ у детей, позволившая стратифицировать пациентов на различные прогностические группы. Проведён молекулярный мониторинг минимальной резидуальной болезни с использованием полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) у больных ОМЛ, ассоциированным с одной из следующих хромосомных аномалий: транслокацией 1(8;21), транслокацией 1(15;17) или инверсией хромосомы 16.

Проведено исследование маркёра стволовоклеточной тирозинкиназы 1 - РИ31ТО при ОМЛ у детей. Этот маркёр вошёл в клиническую практику за рубежом всего два-три года назад. Получены данные о его ассоциации с плохим прогнозом. Для определения прогностического значения РК31ТО нами была выявлена и взята под наблюдение группа ОМЛ детей, у которых лейкозные клетки характеризуются наличием этого маркёра.

Практическая ценность.

Подтвержена необходимость исследования кариотипа бластных клеток для дифференциальной диагностики типов ОМЛ у детей и прогнозирования течения этого заболевания.

Метод ОТ-ПЦР (молекулярный мониторинг) внедрён в клиническую практику для оценки глубины ремиссии при ОМЛ у детей. Проведение молекулярного мониторинга МРБ при ОМЛ, ассоциированного с транслокацией 1(15;17), может явиться основой для индивидуализации лечения этих пациентов.

В комплекс прогностических критериев при ОМЛ у детей внедрён

новый показатель- характеристика стволовоклеточной тирозинкиназы РИЗ в

6

лейкозных клетках. Молекулярный маркёр FK3ITD может быть использован для проведения мониторинга МРБ.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Апробация диссертации.

Апробация диссертации проведена 30 мая 2002 года на совместной научной конференции отделений НИИ детской онкологии РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН: химиотерапии гемобластозов, онкологии, ДТКМ, амбулаторных методов диагностики и лечения, реанимации и интенсивной терапии, лаборатории гемоцитологии; химиотерапии гемобластозов НИИ клинической онкологии РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН; лаборатории клинической иммунологии; лаборатории цитогенетики НИИ канцерогенеза РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. Основные положения диссертации доложены на II съезде детских онкологов и гематологов России (июнь 2001 года, Ростов-на-Дону), Учёном Совете НИИ ДО РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН (февраль 2002 г., Москва); I всероссийском съезде гематологов (апрель 2002 г., Москва).

Объём и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 117 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трёх глав, в которых представлены результаты собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя, включающего 144 источника отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 24 таблицами и 19 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования.

Исследовано 83 больных ОМЛ: 75 детей в возрасте от 1 года до 15 лет и 8 подростков в возрасте от 15 до 20 лет. Включение подростков в группу было произведено согласно рекомендациям ряда авторов (см. Martinez-

Climenl et al., 1995), считающих что ОМЛ у пациентов этих возрастных групп характеризуется рядом общих черт. Количество подростков в исследуемой группе было небольшое и составило 9,6 % от общего числа больных, поэтому в описании полученных результатов и выводах для краткости использовался термин "дети". Среди больных 29 детей находились на лечении в отделении химиотерапии лейкозов НИИ ДО РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН (зав. отделением д.м.н., проф. С.А. Маякова) за период с 1991 года по февраль 2002 года (катамнестическое наблюдение за этими пациентами проводилось в отделении амбулаторных методов диагностики и лечения НИИ ДО РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, зав. отделением д.м.н. Е.И. Моисеенко), 43 ребёнка получали лечении в отделении общей гематологии Российской детской клинической больницы (зав. отделением к.м.н. Г.А Новичкова.) с апреля 1997 года по февраль 2002 года, 3 ребёнка и 1 подросток находились на лечении в отделении детской онкологии Московского областного онкологического диспансера (зав. отделением к.м.н. С.Р. Варфоломеева), 7 подростков находились на лечении в отделении химиотерапии острых лейкозов Главного военного клинического госпиталя (начальник отделения подполковник медицинской службы C.B. Шаманский). Наблюдаемые больные были в возрасте от 1 года до 20 лет, из них мальчиков было 47 (56,6 %), а девочек 36 человек (43,4 %).

Кроме того, в исследование было включено 10 больных с рецидивами ОМЛ (9 детей в возрасте от 7 до 15 лет и один подросток в возрасте 17 лет), а также один ребёнок с вторичным ОМЛ, развившимся после лечения опухоли головного мозга. Из них семь пациентов получали лечение в НИИ ДО РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН (в отделениях химиотерапии лейкозов и ДТКМ), три - в Республиканской детской клинической больнице, один - в Московском областном онкологическом диспансере. Наблюдаемые больные были в возрасте от 7 до 17 лет (мальчиков - 5, девочек - 6 человек).

Все больные были детально обследованы для получения комплекса клинических и лабораторных показателей - гематологических, цитологических, иммунологических, цитогенетических, биохимических.

s

Проведение мониторинга минимальной резидуальной болезни включало регулярные заборы проб костного мозга и периферической крови (до начала лечения, после каждого курса полихимиотерапии при восстановлении показателей периферической крови и далее в динамике с интервалами 2-12 месяцев) с проведением морфологического и молекулярно-биологических исследований.

Морфологические и цитохимические исследования пунктатов костного мозга и периферической крови выполнены в лаборатории гемоцитологии детского возраста НИИ ДО РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН (зав. лабораторией к.м.н. И.И. Матвеева), в клинико-цитологичекой лаборатории НИИ ДГ МЗРФ на базе РДКБ (зав. лабораторией к.м.н. J1. В. Байдун.), а также в клинической лаборатории ГВКГ им. H.H. Бурденко (зав. лабораторией Ю.Н. Канищев).

Иммунофенотипическое исследование бластных клеток проводилось под руководством д.м.н., профессора H.H. Тупицына в лаборатории клинической иммунологии РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН (зав. лабораторией д.м.н., профессор З.Г. Кадагидзе), а также в лаборатории клинической иммунологии и цитогенетики НИИ ДГ МЗРФ на базе РДКБ (зав. лабораторией к.м.н. Л.В. Байдун).

Хромосомный анализ (G-banding) осуществлялся группой сотрудников лаборатории цитогенетики НИИ Канцерогенеза РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН под руководством д.м.н. Е.В.Флейшман (зав. лабораторией д.м.н., профессор Б.П. Копнин).

С помощью молекулярно-биологических методов исследовались мононуклеары, выделенные из костномозговых аспиратов и/или периферической крови больных ОМЛ до начала проведения специфической терапии, а также в динамике у больных, включённых в исследование по мониторингу МРБ. Для обнаружения транскриптов химерных генов применялась ОТ-ПЦР гнёздный вариант, для обнаружения Flt3/ITD мутации -ПЦР. Мононуклеарные клетки крови и костного мозга были выделены путём центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Hypaque и использовались

немедленно для РНК и ДНК изоляции. Изоляция РНК проводилась из 108-107 клеток с помощью Trizol-реагента. Пробы РНК хранились в 75 % растворе этилового спирта при температуре -20°С. Качество выделенной РНК оценивалось после проведения электорфореза в 0,8% растворе агарозы, подкрашенной бромистым этидием. Количество РНК определялось путём спектрофотометрии с длиной волны 260 и 280 лт. 1-5 микрограмм (цд) растворённой в воде РНК использовались немедленно для синтеза комплементарной ДНК (кДНК). Качество полученной кДНК оценивалось после проведения ПЦР на фрагмент гена ABL (Tobal, 2001).

Проведение ОТ-ПЦР и ПЦР осуществлялось по протоколам, рекомендованным van Dondgen et al, 1999; Meshinchi et al, 2000. Амплификация ДНК осуществлялась в термоциклере "Терцик" (ДНК-технология, Москва).

Уровень чувствительности при проведении гнёздного ОТ-ПЦР составлял;

для AML1-ETO - одна лейкозная клетка среди 100000 нормальных клеток; для PML-RARa - одна лейкозная клетка среди 10000 нормальных клеток; для CBFß-MYH11 - одна лейкозная клетка среди 10000 нормальных клеток.

Количественная ОТ-ПЦР была выполнена в НИИ физико-химической медицины (лаборатория иммуногенентики и генной инженерии под руководством д.б.н. В.М. Говоруна) совместно с сотрудником лаборатории О.Ю. Мисюриной на приборе ABI 5700 Prizm ("Perkin Elmer"). Уровень транскрипта AML1-ETO в каждой исследованной пробе был выражен как доля от уровня экспрессии транскрипта AML1-ETO в клеточной линии Kasumi-1.

Методы лечения:

В исследование были включены больные, получившие различные современные программы лечения (AML-2000, m-BFM-87, IPH AML - 93, "7+3").

Интенсивную модифицированную программу BFM-87 получили 27 больных. Она состояла из курса индукции ремиссии ADE (цитозар,

10

рубомицин, этопозид), консолидации ремиссии (преднизолон, 6-меркаптопурин, цитозар, рубомицин, винкристин - 1-ая фаза, 6-меркаптопурин, цитозар, циклофосфан - 2-ая фаза), интенсификации (цитозар, этопозид), поддерживающей терапии (6-меркаптопурин, цитозар, рубомицин) и профилактики нейролейкоза.

Интенсивная программа AML-2000 была проведена^31 больному с первичным ОМЛ и одного ребёнка со вторичным ОМЛ и состояла из курса двойной индукции ремиссии ADE (цитозар, рубомицин, этопозид) + НАМ (высокие дозы цитозара, митоксантрон) и последующих трёх курсов консолидации (L-аспарагиназа, высокие дозы цитозара, этопозид, митоксантрон) и профилактики нейролейкоза.

Интенсивная программа IPH AML - 93 была проведена 9 больным ОМЛ и состояла из курса индукции AME (цитозар, митоксантрон, этопозид), консолидации ремиссии (6-меркаптопурин, цитозар, рубомицин, винкристин), 2 курсов интенсификации (цитозар, этопозид, митокснтрон), поддерживающей терапии (6-меркаптопурин, цитозар) и профилактики нейролейкоза.

У 5 пациентов (подростков) с первичным ОМЛ лечение состояло из индукции ремиссии (цитозар, рубомицин), последущих 2-3 курсов консолидации ремиссии (высокие дозы цитозара, митоксантрон), профилактики нейролейкоза и поддерживающей терапии.

Всем пациентам с острым промиелоцитарным лейкозом (11 человек) проведено лечение, включавшее аН-транс-ретиноевую кислоту и полихимиотерапию (цитозар, антрациклиновые антибиотики): индукция ремиссии, 2-3 курса консолидации и поддерживающая терапия.

Пациенты с рецидивами ОМЛ получали лечение по противорецидивным протоколам.

Статистическая обработка данных производилась на персональном компьютере при использовании статистического пакета SPSS-8.0. Оценка непараметрических данных производилась с помощью построения таблиц сопряжённости признаков. Сравнение данных производилось по методу х2

и

Пирсена. Различия данных считались достоверными при Р<0,05. Оценка параметрических данных производилась с помощью сравнения средних величин по методу Стьюдента. Различия данных считались достоверными при Р<0,05. Безрецидивная выживаемость определялась с помощью построения кривых выживаемости по методу Kaplan-Meier. Оценка различий данных выживаемости групп больных произведена по методу Log-Rank. Различия данных считались достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Хромосомный анализ при первичных ОМЛ и рецидивах ОМЛ.

Хромосомный анализ при ОМЛ у детей: клинико-лабораторная характеристика пациентов с ОМЛ с различными аномалиями, прогностическое значение.

Хромосомный анализ клеток костного мозга и периферической крови был проведён у 83 детей с ОМЛ. У 6 из них наличие конкретной специфической аномалии было установлено только после применения ОТ-ПЦР. У трёх из этих 6 пациентов цитогенетический анализ провести .не удалось, у трёх других была невозможна точная идентификация хромосомных маркёров из-за сложности структурных перестроек. Применение ОТ-ПЦР позволило выявить химерный транскрипт AML1-ETO, соответствующий транслокации t(8;21) у трёх пациентов; у других трёх больных выявлен химерный транскрипт PML-RARa, соответствующий транслокации t(15;17). Согласно рекомендациям ВОЗ при анализе собственного материала мы разбили все исследованные случаи на 7 групп, взяв за основу хромосомные перестройки, наблюдавшиеся в нашей выборке сравнительно часто. Первую группу составили пациенты с ОМЛ, у которых кариотип лейкозных клеток был нормальным; в каждую из групп с изменённым кариотипом вошли пациенты с одной из перечисленных специфических аномалий: транслокацией t(8;21); транслокацией t(15;17); инверсией хромосомы 16; различными перестройками, затрагивающими

участок я23 в длинном плече хромосомы 11; утратой хромосомы 7 (моносомией 7); остальные больные вошли в сборную группу, у них обнаружены другие разнообразные изменения кариотипа, наблюдающиеся относительно редко. Необходимо отметить, что почти во всех группах были пациенты с ОМЛ, у которых кариотип лейкозного клона наряду с основными перестройками хромосом, включал дополнительные изменения кариотипа.

Частота выявления отдельных аномалий у детей с ОМЛ была различной (таблица 1).

Таблица 1

Частота обнаружения отдельных хромосомных аномалий у детей с ОМЛ.

№ Хромосомные аномалии Абсолютное число случаев (%)

1. без аномалий * 14(16,9)

2. t(8;21)(q22;q22) 24 (29,0)

3. t(15;17)(q21;q22) 11 (13,3)

4. inv(16)(p13;q22) 7 (8.4)

5. аномалии 11q23 5 (6,0)

6. моносомия 7 7 (8,4)

7. другие: как единственная аномалия в сочетании с другими аномалиями

трисомия хромосомы 8 3 (3,6) 6 (7,2)

утрата хромосомы Y 2 (2,4) 9(10,8)

inv3(q21;q26) 1 (1,2) 3 (3,6)

I(16;21)(p11;q21) 1 (1,2) 0

трисомия хромосомы 15 1 (1,2) 0

del 1(р13) 1 (1,2) 0

del 8(q) 1(1,2) 0

del 16(р22) 1 (1,2) 0

t(9;22)(q34;q11) 1 (1.2) 0

моносомия хромосомы 6, +кольцо 1 (1,2) 0

три и более аномалии** 2 (2,4)

8. все пациенты 83(100)

* - нормальные кариотип

** - кроме t(8;21), t(15;17), инверсии 16, аномалий 11q23, моносомии 7. Как видно из таблицы 1, у 14 пациентов (16,9 %) кариотип лейкозных клеток был нормальным (46,XX - у девочек, 46,XY - у мальчиков).

Самой частой перестройкой была транслокация t(8;21), обнаруженная у 24 больных (29,0 %). Эта транслокация лишь в единичных случаях была единственной аномалией; у большинства больных наблюдалось сочетание

t(8;21) с разными дополнительными хромосомными изменениями. Среди них наиболее часто выявлялась потеря одной из половых хромосом (X у девочек, Y у мальчиков).

Транслокацию t(15;17) мы обнаружили у 11 пациентов (13,3 %), причём у половины из них наблюдались дополнительные аномалии. У 7 больных (8,4 %) ОМЛ была выявлена перицентрическая инверсия хромосомы 16 или транслокация (16; 16), дополнительные хромосомные перестройки документированы у половины больных в этой группе (во всех случаях присутствовала добавочная хромосома 22). Моносомия хромосомы 7 отмечена у 7 пациентов, причём у двух из них данная аномалия сочеталась с перицентрической инверсией хромосомы 3. Аномалии с вовлечением хромосомного участка 11q23 выявлены у 5 пациентов (6,0 %). Трисомия хромосомы 8 была обнаружена у 6 пациентов: у трёх из них в виде единственной аномалии, у одного - в сочетании с транслокацией t(15; 17), у второго - в сочетании с инверсией хромосомы 16 и ещё у одного - в сочетании с транслокацией t(9; 11). Утрата Y хромосомы была отмечена у 9 из 47 мальчиков с ОМЛ, включённых в исследование: причём только у двух из них данная хромосомная перестройка присутствовала как единственная аномалия, у остальных пациентов утрата Y сочеталась с наличием транслокации t(8;21). Множественные аномалии кариотипа (три и более) были выявлены у 10 человек, причём у трёх из этих 10 детей транслокация t(8;21) сочеталась с наличием двух и более дополнительных аномалий, у двух человек моносомия хромосомы 7 входила в число множественных аномалий, один пациент с инверсией хромосомы 16 и один с транслокацией t(15; 17) также имели клоны клеток с множественными аномалиями, включавшие ¡nv(16) или t(15;17), соответственно.

В каждой из 7 групп детей изучались корреляции между выявленными хромосомными перестройками и клинико-гематологическими особенностями ОМЛ на момент постановки диагноза: возраст, уровень лейкоцитов в периферической крови, относительное количество властных клеток в костном мозге, размеры печени и селезёнки (см. из-под края рёберной дуги),

14

наличие экстрамедуллярных лейкозных очагов, морфологический вариант (по ФАБ классификации), иммунофенотипические особенности бластных клеток.

Этот анализ позволил установить ряд клинико-цитогенетических параллелей. Так при распределении больных по возрасту было выявлено, что пациенты с транслокацией t(8;21) чаще обнаруживались в возрастной группе 2-10 лет по сравнению с больными моложе двух лет или больными старше 10 лет (р=0,047).

Среднее значение уровня лейкоцитов в периферической крови на момент постановки диагноза было наименьшим у детей с ОМЛ, ассоциированным с транслокацией t(8;21) - 17,5 ± 14,0 х 109/л, а наибольшим у пациентов с аномалиями 11 q23 - 35,6 ± 69,0 х 109/л (р=0,8).

При оценке среднего значения относительного количества бластов в пунктате костного мозга у больных ОМЛ было отмечено, что наименьшая инфильтрация бластными клетками характерна для пациентов с транслокацией t(8;21), с нормальным кариотипом и детей с моносомией хромосомы 7 (49,6 ± 17,8 %, 43,3 ± 20,0 % и 37,7 ± 14,3 % соответственно), в> то время как у пациентов с t(15;17) определялась субтотальная инфильтрация бластами костного мозга (87,0 ± 11,7 %) (р<0,001) (таблица 2).

Таблица 2

Средние значения количества бластов в костном мозге у детей с ОМЛ с различными

хромосомными аномалиями.

Хромосомные аномалии Число случаев Среднее значение бластов в костном мозге (%)

нормальный кариотип 14 43,3 ±20,0

t(8;21) 24 49,6 ± 17,8

t(15;17) 11 87,0 ± 11,7

¡nv 16 7 55,0 ±29,6

аномалии 11q23 5 70,0 ±23,0

моносомия 7 7 37,7 + 14,3

другие 15 53,3 ±24,0

Гепато-лиенальный синдром не был характерен для большинства исследованных больных.

Наличие экстрамедуллярных лейкозных очагов зафиксировано у 16 пациентов (19 %) с ОМЛ (таблица 3).

Таблица 3. Размеры печени и селезёнки, наличие экстрамедуллярных

лейкозных очагов у детей с ОМЛ с различными хромосомными аномалиями.

Хромосомные аномалии Экстрамедуллярны е очаги лейкоза Размеры печени (см из-под края рёберной Дуги) Размеры селезёнки (см из-под края рёберной дуги)

есть ] нет 22 см | >2 см ¿2 см | >2 см

число больных

без аномалий 3 11 12 2 13 1

Ц8;21) 5 19 22 2 23 1

П15;17) 2 9 7 4 11 0

¡т/16 1 6 3 4 4 3

аномалии11д 23 3 2 3 2 4 1

моносомия 7 1 6 4 3 4 3

другие 1 14 В 7 12 3

всего 16 67 59 24 71 12

При определении морфологического варианта ОМЛ у больных

использовалась ФАБ-классификация. Каждый ФАБ-вариант (кроме МЗ и М7) оказался цитогенетически гетерогенным (таблица 4).

Таблица 4

Распределение детей с ОМЛ с различными хромосомными аномалиями в зависимости от

морфологического варианта бластов по ФАБ классификации.

Хромосомные Морфологический вариант (по ФАБ классификации)

МО М1 М2 МЗ М4 М5 Мб М7

без эозинофилии с эоэинофилией

Число л у ч а е в

без аномалий 0 1 8 0 1 0 3 1 0

1(8;21) 0 1 22 0 1 0 0 0 0

415; 17) 0 0 0 11 0 0 0 0 0

|ПУ 16 0 1 2 0 0 4 0 0 0

аномалии11ч23 0 0 0 0 0 0 5 0 0

моносомия 7 1 2 2 0 1 0 1 0 0

другие 2 1 6 0 2 0 1 2 1

все больные 3 6 40 11 5 4 10 3 1

Наблюдалась строгая корреляция между транслокацией 1 (15;17 и М

вариантом. Группа лейкозов с М2 вариантом была наибольшей - 48 % и

включала детей с 1(8;21) (55 %), нормальным кариотипом (20%), инверсией хромосомы 16 (5 %), моносомией хромосомы 7 (5 %) и другими перестройками (15 %). М5 вариант был констатирован у 12 % детей, и в половине случаев сочетался с аномалиями М4 вариант

зафиксировали у 9 больных (11 %), причём у 4 из них наблюдалось выраженное расширение эозинофильного ростка. Во всех случаях М4 с эозинофилией была обнаружена инверсия хромосомы 16; данная хромосомная аномалия также была выявлена у пациентов с М1 или М2 вариантами. Среди детей с М4 без эозинофилии наблюдались случаи с 1(8;21), нормальным кариотипом, моносомией 7 и другими перестройками. ОМЛ с МО, М1 или Мб вариантами были на нашем материале немногочисленны, однако, также цитогенетически гетерогенны.

Иммунофенотипическое исследование властных клеток было проведено у 61 больного ОМЛ; экспрессия миелоидных антигенов (СОЗЗ, СР13 и др.) на поверхности клеток была обнаружена у всех пациентов. Также было выявлено, что В-клеточный антиген СЭ19 чаще экспрессировался у пациентов с транслокацией 1(8;21), чем у детей с другими аномалиями кариотипа (в 44 % и 8 %, соответственно) (р=0,017).

Нами изучена безрецидивная выживаемость (БРВ) больных ОМЛ с различными хромосомными аномалиями (Рис. 1).

10 30 50 70 90 1 10 130 время наблюдения, месяцы

Рис. 1. Безрецидивная выживаемость детей с ОМЛ с различными хромосомными

аномалиями 1. - пациенты с транслокацией Ц15;17) (п=11)

2. - пациенты с хромосомными аномалиями, объединёнными в группу "другие" (п=15)

3. - пациенты с транслокацией 1(8;21) (п=24)

4. - все больные (п=83)

5. - пациенты с нормальным кариотипом (п=14)

6. - пациенты с инверсией хромосомы 16 (п=7)

7. - пациенты с аномалиями 11 д23 (п=5)

8. - пациенты с моносомией хромосомы 7 (п=7).

Из представленного Рис.1 видно, что наиболее высокая БРВ наблюдалась у пациентов с 1( 15; 17) - 90,9 ± 8,6 %; у больных с 1(8,21) показатель БРВ также был относительно высоким - 55,6 ± 17,9 %. Более низкая БРВ обнаружена у пациентов с нормальным кариотипом и пациентов с инверсией хромосомы 16 (48,8 ± 17,8 % и 40,0 ± 29,0 %, соответственно). У больных с моносомией хромосомы 7 БРВ составила 14,3 ± 13,2 %. Выживаемость пациентов, объединённых в группу "другие", была относительно высокой и составила 58,6 ± 16,0 %, однако эта величина, по нашему мнению, не представляет значимой прогностической ценности, так как данная группа больных была сборной и критерием включения в неё служило отсутствие одной из 5 наиболее часто встречаемых хромосомных перестроек или нормального кариотипа. В таблице 5 приведены данные о результатах лечения каждого из 15 пациентов, включённых в группу "другие".

Таблица 5

Результаты лечения детей с ОМЛ с хромосомными аномалиями из группы "другие"

Хромосомные аномалии Число больных Результат лечения

«16',21)(р11;д21) 1 рецидив на 11 мес. от начала лечения

трисомия 15 1 рефрактерное течение

делеция 16(я) 1 ремиссия 34 мес. +

((9,-22) 1 погиб в ремиссии на сроке 5мес. от сепсиса

моносомия 6 (+кольцо) 1 рефрактерное течение

делеция 1 ремиссия 13 мес. +

делеция 8(я) 1 ремиссия 6 мес. +

моносомия У 2 ремиссия 3 мес. +

ремиссия 103 мес. +

трисомия 8 3 рефрактерное течение

ремиссия 2 мес. +

ремиссия 6 мес. +

¡пчЗ №1^26) 1 рефрактерное течение

3 и более аномалии 2 ремиссия 6 мес. +

ремиссия 120 мес. +

Значение хромосомного анализа для уточнения диагноза у больных ОМЛ с затруднённой морфологической верификацией диагноза.

Известно, что в ряде случаев ОМЛ могут возникать определённые трудности при морфологической идентификации варианта лейкоза в соответствии с ФАБ-классификацией. Точная верификация варианта важна для выбора правильной лечебной тактики. Известно, что максимально раннее назначение АТЯА в сочетании с полихимиотерапией является наиболее важным шагом для достижения более высокой выживаемости и предупреждения тяжёлых геморрагических осложнений при остром промиелоцитарном лейкозе (МЗ). Цитогенетический анализ позволяет выявить характерные хромосомные транслокации, при которых показаны программы лечения с включением АТЯА.

В настоящем исследовании у 5 пациентов тип лейкоза (М2 или МЗ вариант) удалось уточнить после хромосомного анализа (таблица 6).

Таблица 6.

Морфо-цитогенетическая характеристика 5 случаев ОМЛ с затруднённой

дифференциальной диагностикой между М2 и МЗ вариантами по ФАБ-классификации.

Больной Первоначальный вариант ОМЛ (ФАБ) Кариотип лейкозных клеток

1. Б.Р., 13 лет МЗ 46,ХУ, К8;21)

2. З.М., 14 лет МЗ 45,Х(-Х)Д(8;21)

3. Ч.О., 5 лет МЗ 45,Х(-У),1(8;14;21)

4. К.А., 19 лет М2 46,ХУД(15;17)

5. Л.К., 11 лет М2 цитогенетические препараты исследовать не удалось; при проведении ОТ-ПЦР-обнаружен транскрипт РМ1_-Р?АЯа

Хромосомный анализ у пациентов с рецидивами ОМЛ. У 10 больных с рецидивами ОМЛ и одного пациента с вторичным ОМЛ (после лечения опухоли головного мозга) также был проведён хромосомный анализ лейкозных клеток (таблица 7).

Таблица 7

Кариотип лейкозных клеток у больных с рецидивами ОМЛ, пациента с вторичным

ОМЛ и результаты лечения.

Больной Кариотип лейкозных клеток в первый острый период Кариотип лейкозных клеток во время рецидива Результат противорецидивного лечения

К.Л., 10 лет не исследована 45,Х,(-Х), «8;21№22;ч22),с1е1(9д), +аег(1) погибла в ремиссии на сроке 4 мес. от сепсиса

К.И., 13 лет не исследован 46,XX ремиссия 12 мес.+

К.С., 10 лет не исследован 46,ХУ,7я+(д32-33), 1ПУ(16)(р13;я22),с1е1(14) (д31-32) рецидив И через 10 мес. от момента достижения ремиссии II

С.Н., 9 лет не исследована 48,ХХД(6;9)(р23;р34),+ 8,+13 резистентное течение

К.П., 7 лет не исследован 49,ХУ,+8,+19,+ неидентифицированны й маркёр резистентное течение

Х.О., 10 лет не исследован 46,ХУ,<1е115я ремиссия 28 мес.+

К.Т., 7 лет не исследована 46,ХХ,1(6;7)(я23;р21) погибла в ремиссии на сроке 12 мес. от осложнений терапии

Р.С., 17 лет не исследован 46,ХУ ремиссия 6 мес.+

АО., 14 лет* 46,XX, ¡т/(16)(р13я22) погибла в ремиссии на сроке 8 мес. от сепсиса

М.А., 10 лет 46,ХХЛ(8;21 )(я22;ц22) 46,ХХ,1(8;21)(д22;я22) рецидив II через 2 мес. от момента достижения ремиссии II

С.А., 13 лет 48,ХУ,+8,+22, ¡пу(16)(р13;д22) 48,ХУ,1т/(16)(р13;д22), ¡пз(17) резистентное течение

* пациент с вторичным ОМЛ

Клональные хромосомные аномалии были обнаружены у 9 из 11 пациентов. У 5 пациентов с рецидивами ОМЛ было обнаружено две и более различные аномалии.

Таким образом, на данном клиническом материале создаётся впечатление, что кариотип лейкозных клеток в рецидиве более сложен, чем до лечения, однако, из-за отсутствия в большинстве случаев данных о кариотипе на момент постановки диагноза ОМЛ невозможно установить, какие перестройки маркировали лейкозные клетки в первом остром периоде, а какие появились уже как результат прогрессии лейкоза.

Мониторинг МРБ с помощью О Т-П Ц Р у пациентов с ОМ Л.

Мониторинг МРБ при ОМ/1 с Ц8;21).

С помощью ОТ-ПЦР исследовано 16 пациентов (15 человек с первичным ОМЛ и один с рецидивом ОМЛ). У 13 из этих больных мониторинг проводился от момента диагностики заболевания и на протяжении всего последующего периода наблюдения. Дополнительно в исследование было включено ещё три ребёнка с ОМЛ с транслокацией 1(8;21) и, соответственно, химерным транскриптом АМИ-ЕТО, обнаруженной ранее: на момент начала молекулярного мониторинга все три пациента находились в клинико-морфологической ремиссии I.

Результаты мониторинга схематично представлены на Рис. 2. Период наблюдения составил от 1 до 94 мес. (средняя продолжительность наблюдения 21,0 ± 24,7 мес.), в течение первого года от начала лечения было исследовано 10 человек, в течение второго года - 4 пациента, после двух лет от начала лечения - три ребёнка.

По результатам ОТ-ПЦР было выделено три группы пациентов: больные с перманентной ПЦР-позитивностью, пациенты, достигшие ПЦР-негативности, и больные промежуточной группы (пробы костного мозга ПЦР-позитивные, пробы крови - ПЦР-негативные). На Рис. 3 представлена электрофореграмма результатов ОТ-ПЦР у пациентов с АМИ-ЕТО-позитивным ОМЛ.

12 11 109 87654321м

М - молекулярный ДНК-маркёр 1-9 пробы от пациентов 10 - положительный контроль 11,12- отрицательные контроли

Рис. 3. Электрофореграмма результатов ОТ-ПЦР мониторинга пациентов с АМ1.1-ЕТО-поэитивным ОМЛ.

месяцы от начала лечения

Пациент 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 *11 12 13 14 15 16 17 18 19 20.... 24.... 28....40... 84

1. Б.М.

2. Б О.

3. ВС.

4. Г.К.

5. В.А.

6. Д.Т.

7. ЕН.

8. К Л.

9. М.М.

10.М.А.

11.Р.О.

12.Т.И.

13.Х.М.

14.Щ.А.

15.Б Р.

16. К.М. мес.+

погибла а ремисси на сроке 5 мес. от сепсиса

•—— рефрактерное течение

•— погиб от осложнений, развившихся на фоне аплазии кроветворения

• □ О-□ о-я о-■ о

ремиссия 18 мес.

—

выбыл из-под наблюдения ■о выбыл из-под наблюдения

■ ремиссия 21 мес. ■

-погибла в ремисси на сроке 3 мес. от сепсиса

-оо-погиб в ремисси на сроке 4 мес. от сепсиса

- ремиссия 12 мес. -

-X рецидив II -ремиссия 21 мес. +

а

- ремиссия 2 мес. +

- рем.. 94мес+

- рем. 42 мес.+ -рем. 42

Условные обозначения: черный цвет обозначает позитивный (транскрипт обнаружен) результат ОТ-ПЦР; белый цвет обозначает негативный (транскрипт не обнаружен) результат ОТ-ПЦР; квадрат обозначает пробу костного мозга; круг обозначает пробу крови; к - обозначение рецидива заболевания.

Рис. 2. Результаты ОТ-ПЦР мониторинга у пациентов с АМИ-ЕТО-позитивным ОМЛ

Перманентная ПЦР-позитивность (то есть постоянное обнаружение химерного транскрипта АМИ-ЕТО) как в крови, так и в костном мозге была зафиксирована у 8 из 16 пациентов. Период наблюдения в этой группе больных составил от 1 до 18 мес. (средняя продолжительность наблюдения 9,0 ± 6,9 мес.).

Исчезновение химерного транскрипта как из крови, так и из костного мозга было обнаружено у 4 человек (25 %). При этом один пациент достиг ПЦР-негативности непосредственно после индукционной терапии. У второго больного транскрипт перестал определяться после консолидации II. В третьем случае ПЦР - негативность наблюдалась на 28 мес. от начала проведения специфической терапии (пациент впервые был обследован лишь на этом сроке). Помимо перечисленных трёх больных, ПЦР-негативность обнаружили ещё у одного ребёнка: кровь этого пациента была впервые и однократно исследована лишь на 84 мес. от начала специфической терапии.

У двух из 4 достигших ПЦР-негативности пациентов была обнаружена повторная конверсия ПЦР-статуса: в костном мозге вновь стал определяться транскрипт АМ1.1-ЕТО, при этом пробы крови оставались ПЦР-негативными. У одного из этих двух пациентов повторное появление химерного транскрипта в костном мозге было зафиксировано через 3,5 мес. после окончания последнего цикла интенсивной полихимиотерапии. У другого пациента смена ПЦР-статуса произошла на 40 мес. от начала специфической терапии (через 12 мес. от окончания поддерживающей терапии). В обоих случаях повторное появление транскрипта АМН-ЕЮ не отразилось на течении болезни - продолжалась клинико-гематологическая ремиссия. Период наблюдения за больными после возврата ПЦР-позитивности составил 3 и 8 мес.

Больные промежуточной группы - это пациенты, которые достигли ПЦР-негативности только в крови, в то время как в пробах костного мозга химерный транскрипт продолжал определяться. У одого из этих трёх пациентов транскрипт АМИ-ЕТО перестал определяться в крови на 7 мес.

23

от начала лечения, однако через 5,5 мес. у ребёнка вновь был обнаружен транскрипт АММ-ЕТО в крови. Повторное появление транскрипта не отразилось на течении болезни: ремиссия продолжалась. Период наблюдения после возвращения к ПЦР-позитивности составил 8,5 мес. У другого больного ПЦР-негативность в крови была обнаружена после консолидации I. Кровь третьего пациента с помощью ОТ-ПЦР впервые была исследована на 36 мес. от начала проведения специфической терапии: химерный транскрипт АМ1_1-ЕТО не был обнаружен, в то время как в пробе костного мозга, исследованной раньше, была документирована ПЦР-позитивность.

Рецидив наблюдался у одного из 16 пациентов и был диагностирован на 16 мес. от начала лечения; у девочки определялась персистенция химерного транскрипта как в костном мозге, так и в крови на протяжении всего периода наблюдения: от момента постановки диагноза и до констатации клинико-морфологического рецидива (материал исследовали на 2, 4, 5, 7 и 11 мес. от начала лечения). После проведения противорецидивного курса ПХТ у ребёнка была достигнута вторая клинико-морфологическая ремиссия, однако повторная ОТ-ПЦР показала, что химерный транскрипт сохранялся и в костном мозге, и в крови. Через два мес. после констатации ремиссии II у ребёнка был диагностирован костномозговой рецидив II.

У трёх из 16 пациентов мониторинг МРБ проводился не только с использованием качественной ОТ-ПЦР, но и с применением количественной ОТ-ПЦР.

Результаты мониторинга представлены на Рис. 4 (уровень транскрипта АМИ-ЕТО в каждой пробе выражен как доля от уровня экспрессии АМИ-ЕТО в клеточной линии КаэитМ).

трёх больных с АМИ-ЕТО-позитивным ОМЛ.

Из Рис. 4 видно, что уровни МРБ в крови и в костном мозге до лечения практически одинаковы у всех пациентов и сопоставимы с уровнями МРБ, обнаруженными у одного пациента в рецидиве. В процессе лечения снижение уровня МРБ отмечено у всех пациентов.

Необходимо отметить, что у пациентки Б.О. после терапии индукции наблюдалось значительное снижение уровня химерного транскрипта, однако количество бластов в миелограмме не уменьшилось, и ребёнок погиб от прогрессии лейкоза. Можно предположить, что у этой девочки изначально существовали два самостоятельных лейкозных клона, один из которых был маркирован транслокацией 1(8;21) и поддался лечению, а второй (более агрессивный) не имел цитогенетических маркёров и был причиной рефрактерного течения лейкоза.

Мониторинг МРБ при ОМЛ с транслокацией Ц15;17).

С помощью ОТ-ПЦР исследовано 8 пациентов с острым промиелоцитарным лейкозом (ОМЛ МЗ). У 6 из этих больных молекулярный мониторинг проводился от момента диагностики заболевания и на протяжении всего последующего периода наблюдения. Дополнительно в исследование было включено 2 ребёнка - пациенты с ОПЛ с транслокацией

t(15;17), обнаруженной ранее. На момент начала проведения молекулярного мониторинга оба ребёнка находились в клинико-морфологической ремиссии!.

Период наблюдения за пациентами с PML-RARa-позитивным OMJ1 составил от 5,0 до 35,5 мес. (средняя продолжительность наблюдения 19,0 ± 10,0 мес.). Результаты мониторинга МРБ у пациентов с ОМЛ с t(15;17) представлены на Рис. 5.

До начала лечения исследовано 6 пациентов, транскрипт PML-RARa обнаружен у всех (тип Ьсг1 - у двух пациентов, тип ЬсгЗ - у 4 больных). Исчезновение химерного транскрипта как из крови, так и из костного мозга в процессе лечения было зарегистрировано у всех пациентов. После терапии индукции ремиссии ОТ-ПЦР проб крови и костного мозга была выполнена у 6 пациентов. Химерный транскрипт PML-RARa продолжал определяться и в костном мозге, и в крови у всех больных. После проведения второго курса полихимиотерапии (консолидации I) ПЦР-негативность документирована у 4 из 6 пациентов (у большинства исследованных). У двух пациентов наблюдалось отсроченное (по сравнению, с большинством больных) исчезновение транскрилта: у одного из них исчезновение химерного транскрипта было зафиксировано на 4 мес. от начала лечения (после консолидации II), у другого пациента - на 12 мес. (на этапе поддерживающей терапии) (таблица 8).

Пациент тип тр-та 0 1

1. А.С. ЬсМ

2. К К. ЬсгЗ

3. К.А. ЬсгЗ

4. Л К. ЬсгЗ

5. М.В. ЬсгЗ

6. Н Ж. Ьсг1

7. С.Н. н/д 8 Ч.Л. н/д

месяцы от начала лечения 3 4 5 6 7 8 9

10 11

ремиссия 5 мес. +

-□о—по—ао—по—по-со-

- ремиссия 7 мес.

12

13 14 15......24........36

- рем. 25 мес. •

- ремиссия 14 мес. + - рем. 17 мес. +

-□о-зо— ремиссия 18мес. + ,

-по—ремиссия 23 мес. +

-оо-рем. 35 мес +

Условные обозначения: чёрный цвет обозначает позитивный (транскрипт обнаружен) результат ОТ-ПЦР: белый цвет обозначает негативный (транскрипт не обнаружен) результат ОТ-ПЦР; квадрат обозначает пробу костного мозга; круг обозначает пробу крови; н/д - нет данных Рис 5 Результаты ОТ-ПЦР мониторинга у пациентов с РМ1_-КАР!а-позитивным ОМЛ

Таблица 8.

Динамика транскрипта РМЫЗДРа в костном мозге/в крови в процессе лечения у больных ОМЛ с 1(15;17).

ДО лечения после индукции после консоли дации 1 после консоли дации 2 после консоли дации 3 поддерживающая терапия

месяцы от начала лечения

0 2-ой 3-ий 4-ый 5-ый 5...8 8...12 12 ...

1. А.С. +/+ +/+ -/- -/-

2. К.К. +/+ +/+ н/и н/и н/и н/и -/- -/-

3. К.А. +/+ +/+ +/+ -/- -/- -/- +/+ -/-

4. Л.К. +/+ +/+ н/и +/+ н/и +/- -/- н/и

5. М.В. +/+ +/+ -/- -/-

6. Н.Ж. +/+ +/+ -/- -/- н/и -/- -/- -/-

7. С.Н. н/и н/и -/- -/- н/и -/- -/- -/-

8. ч.л. н/и н/и н/и н/и н/и н/и н/и -/-

н/и - не исследован.

У обоих пациентов с отсроченным (по сравнению с большинством больных) исчезновением транскрипта РМЬИАРа была затруднена морфологическая идентификация типа лейкоза по ФАБ-классификации (при постановке диагноза). Первоначально эти больные рассматривались как пациенты с ОМЛ М2, и поэтому терапия индукции ремиссии была проведена без применения АТРА. АТЯА была добавлена к терапии только после получения результатов цитогенетического анализа и ОТ-ПЦР.

Ни в одном из исследованных случаев не было рецидивов заболевания.

У одного больного на 11 мес. от начала проведения терапии химерный транскрипт РМЫЗАЯа вновь стал определяться и в крови, и в костном мозге (при морфологическом исследовании статус ремиссии был подтверждён). Возврат ПЦР-позитивности у этого пациента был документирован через три мес. после вынужденной отмены поддерживающей терапии из-за развития у больного острого вирусного гепатита. После обнаружения конверсии ПЦР-статуса поддерживающую терапию продолжили, и последующие результаты ОТ-ПЦР (через один мес. и три мес. после возобновления поддерживающей

28

терапии) показали отсутствие химерного транскрипта в крови и в костном мозге больного.

Мониторинг МРБ при ОМЛ с инверсией хромосомы 16. С помощью ОТ-ПЦР исследовано 8 пациентов с инверсией хромосомы 16, из них: 6 с первичным ОМЛ, один - с первым рецидивом ОМЛ и один - со вторичным ОМЛ, развившимся после лечения опухоли головного мозга. У всех больных мониторинг проводился от момента диагностики заболевания и на протяжении всего последующего периода наблюдения.

Период наблюдения за пациентами составил от 1 до 13 мес. (средняя продолжительность наблюдения 8,0 ± 4,8 мес.).

Химерный транскрипт СВР(3-МУН11 до начала специфического лечения был обнаружен у 6 из 8 исследованных пациентов с ОМЛ и инверсией хромосомы 16. У двух пациентов с цитогенетически выявленной инверсией хромосомы 16 не был идентифицирован ни один из десяти известных в настоящее время транскриптов СВРр-МУН11 (были исследованы как пробы костного мозга, так и пробы крови). У 5 из 6 СВРР-МУН11-позитивных до начала лечения пациентов был идентифицирован тип транскрипта "А", а у одного больного - тип транскрипта "Д"

Результаты мониторинга МРБ и результаты лечения пациентов представлены на Рис. 6.

месяцы от начала лечения

Пациент типтр-та 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

1. Б.М А ------«о— ремиссия 11 мес. +

2. В А А -- выбыл из-под наблюдения

3. Д.Е. А - погиб в ремиссии на сроке один месяц

4. К С. А --■-■-к погиб от прогрессии лейкоза

5. П.И. Д ■*----ремиссия 11 мес. +

6. А О. А --погибла в ремиссии на сроке 9 мес.

О

Условные обозначения: черный цвет обозначает позитивный (транскрипт обнаружен) результат ОТ-ПЦР; белый цвет обозначает негативный (транскрипт не обнаружен) результат ОТ-ПЦР; квадрат обозначает пробу костного мозга; круг обозначает пробу крови; х - обозначение рецидива заболевания.

Рис. 6. Результаты ОТ-ПЦР мониторинга у пациентов с СВР|3-МУН11-позитивным ОМЛ.

В костном мозге всех пациентов на протяжении клинико-морфологической ремиссии продолжал определяться химерный транскрипт СВРр-МУН11. ПЦР-негативности в костном мозге, и в крови не достиг ни один из пяти исследованных в динамике пациентов. Парциальная ПЦР-негативность (т.е. только в пробе крови) была зафиксирована у одного больного на 11 мес. от начала терапии.

У одного пациента мониторинг был начат после диагностики первого рецидива ОМЛ. От момента начала исследования и до развития второго рецидива ребёнок был исследован 4 раза, и транскрипт СВРР-МУН11 выявлялся постоянно (при морфологическом исследовании костного мозга статус ремиссии всё время подтверждался).

Мутация РИ31ТО у детей с ОМЛ/рецидивами ОМЛ.

С помощью ПЦР были исследованы пробы костного мозга и/или крови 69 пациентов с ОМЛ в первый острый период, у 11 из них (16 %) была обнаружена внутренняя тандемная дупликация РИЗ гена (РОТО).

При исследовании возрастных особенностей больных с мутацией РИ31ТО установлено, что РИ31ТО чаще (в 32 % случаев) была обнаружена у детей в возрасте 10-15 лет по сравнению с пациентами моложе 10 лет (у 8 % больных) (р=0,045).

Распределение детей по полу было приблизительно одинаковым: 5 мальчиков и 6 девочек.

Больные с РИ31ТО мутацией были обнаружены во всех ФАБ-подгруппах, кроме МО, М4 и М7, однако и общее количество больных в этих подгруппах было небольшое (два, 7 и один человек, соответственно). РИ31ТО чаще встречалась у больных с МЗ вариантом (у 4 из 8 исследованных пациентов) по сравнению с пациентами, у которых были другие варианты ОМЛ (р=0,02).

Хромосомный анализ был выполнен у всех 69 пациентов, исследовнных на присутствие РИЗШЭ. Показано, что наиболее часто РИ31ТО мутация обнаруживалась у больных с нормальным кариотипом (у 5 из 11

исследованных пациентов) и у больных с t(15;17) (в 4 из 8 случаев). У детей с t(8;21) FH3ITD была выявлена в одном из 20 исследованных случаев. У больных ОМЛ с моносомией хромосомы 7, инверсией хромосомы 16 или перестройками 11q23 FH3ITD мутация не обнаружена ни в одном из исследованных случаев (7, 7 и 5 больных, соответственно). Наличие FH3ITD было зафиксировано у одного пациента с инверсией хромосомы 3.

Наличие одновременно двух FIÍ3ITD мутаций было обнаружено у двух

из 11 пациентов. Гш

0bH¿tf<jfmtHo

Отсутствие нормального аллеля не было^ни у одного из 11 пациентов с FH3ITD мутацией.

Показатели выживаемости (процент достижения ремиссии и БРВ) не различались между пациентами с РИЗИй-позитивным ОМЛ и пациентами с Flt3ITD-HeraTHBHbiM ОМЛ.

У трёх больных с Flt3ITD проводился мониторинг МРБ, в качестве молекулярного маркёра использовалась данная мутация. Результаты мониторинга схематично представлены на Рис. 7.

пациент М.И.

к/м ■-d-ремиссия 3 мес+

кр » —

I о И \2 |3 |4 15 1 Срок после начала лечения, месяцы

пациент Н.Е.

к/м ■-о— ремиссия 18 мес+

кр » о—

I 0 I 1 I ........ . 171

Срок после начала лечения, месяцы

пациент Г.Т.

к/м ш-□-ремиссия 1 мес+

кр « -о —

10 11 12 13 14 | Срок после начала лечения, месяцы

Рис. 7. Результаты мониторинга МРБ у пациентов с РК31ТО-позитивным

ОМЛ.

Дополнительно было исследовано 7 пациентов с первым рецидивом ОМЛ. РИ31ТО обнаружена у трёх из этих больных. Необходимо отметить, что у больного, исследованного дважды (в первом остром периоде и во время

первого рецидива ОМЛ), РИ31ТО мутация была зафиксирована только в рецидиве (таблица 9).

Таблица 9.

Результаты определения мутации ЯИЗИБ и исход ОМЛ у больных с рецидивами.

Пациент РИЗГГО в первый острый период РИ31ТО в рецидиве Результат лечения

Х.О., 10 лет не исследовали не обнаружена ремиссия 28 мес.+

К.С., 10 лет не исследовали не обнаружена рецидив II через 10 мес. от момента достижения ремиссии II

P.C., 17 лет не исследовали не обнаружена ремиссия 6 мес.+

К.Т., 7 лет не исследовали обнаружена погибла в ремиссии на сроке 12 мес. от осложнений терапии

С.Н., 9 лет не исследовали обнаружена резистентное течение

К.П., 7 лет не исследовали не обнаружена резистентное течение

С.А., 13 лет не обнаружена обнаружена резистентное течение

Итак, в своём исследовании мы подтвердили важную роль хромосомного анализа в прогнозировании течения ОМЛ у детей, а также в диагностике и дифференциальной диагностике различных морфологических вариантов заболевания. Нами дана клинико-лабораторная характеристика групп пациентов с различными хромосомными аномалиями. Мониторинг МРБ позволил оценить полноту ремиссии у пациентов с АМ1.1-ЕТО-позитивным ОМЛ, пациентов с СВРР-МУН11-позитивным ОМЛ и пациентов с РМЫЗАР?а-позитивным ОМЛ. У 16 % детей с ОМЛ была выявлена мутации гена РИЗ (РИ31ТО). Дана клинико-лабораторная характеристика пациентов с РКЗИР-позитивным ОМЛ, а также предпринята попытка проведения мониторинга МРБ с использованием в качестве молекулярного маркёра -мутацию РИ31ТО.

Выводы

1. Проведено цитогенетическое исследование 83 детей с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ). У 69 (83 %) из этих больных выявлены клоны аномальных клеток с разнообразными хромосомными изменениями. Наиболее частыми являлись транслокации 1(8;21) и 1(15; 17), инверсия хромосомы 16, моносомия хромосомы 7, аномалии 11423, трисомия хромосомы 8 и перицентрическая инверсия хромосомы 3.

33

2. Установлены определённые морфо-цитогенетические корреляции при ОМЛ у детей:

• Транслокация t(8;21) у 92 % пациентов была ассоциирована с М2 вариантом по ФАБ-классификации;

• Транслокация t(15;17) в 100 % случаев наблюдалась при МЗ варианте;

• У всех больных ОМЛ М4 с эозинофилией была обнаружена инверсия хромосомы 16; при других вариантах ОМЛ у детей (М1, М2) данная хромосомная аномалия наблюдалась в единичных случаях.

3. Показана важная роль хромосомного анализа в дифференциальной диагностике и прогнозировании ОМЛ у детей. В 5 случаях цитогенетический анализ явился решающим фактором в уточнении диагноза ОМЛ и корректировке программы лечения. Установлено, что наиболее высокая безрецидивная выживаемость (БРВ) была у больных с транслокацией t(15;17) (90,9 ± 8,6 %) и пациентов с транслокацией t(8;21) (55,6 ± 17,9 %), а наиболее низкая БРВ - у детей с моносомией хромосомы 7 (14,3 ±13,2%).

4. Применение полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) позволило выявить у детей с ОМЛ лейкоз-ассоциированные молекулярные маркёры: химерный транскрипт AML1-ETO у пациентов с транслокацией t(8;21), химерный транскрипт PML-RARa у пациентов с транслокацией t(15;17) и химерный транскрипт CBFP-MYH11 у пациентов с инверсией хромосомы 16.

5. Молекулярный мониторинг минимальной резидуальной болезни (МРБ), проведённый с помощью качественного варианта ОТ-ПЦР у 30 детей с ОМЛ, показал:

• Молекулярная ремиссия (переход от ПЦР-позитивности к ПЦР-негативности) у большинства (66,6 %) больных ОМЛ с транслокацией t(15;17) наблюдалась на 2-3 месяце от начала лечения; химерный транскрипт PML-RARa не обнаруживался в клетках костного мозга и периферической крови во время длительной ремиссии у всех исследованных пациентов;

• У 86 % больных ОМЛ с транслокацией (8;21) и у всех исследованных детей с инверсией хромосомы 16 соответствующие химерные транскрипты AML1-ETO и CBFß-MYH11 определялись в клетках костного мозга в течение длительного времени, сохраняясь и в периоде полной клинико-гематологической ремиссии; в то же время количественная ПЦР, проведённая у трёх пациентов с транслокацией (8;21), показала снижение уровня химерного транскрипта в процессе лечения.

6. Для мониторинга МРБ может быть использован новый молекулярный маркёр лейкозных клеток - мутация гена Flt3. У 11 из 69 (16 %) детей с О МЛ (до начала лечения) была выявлена прогностически неблагоприятная мутация FH3ITD (ITD - внутренняя тандемная дупликация); дети с РИ31ТО-позитивным ОМЛ взяты под наблюдение, как группа высокого риска развития рецидива.

Практические рекомендации

1. Рекомендовано включать цитогенетический анализ в комплекс лабораторных исследований при постановке диагноза ОМЛ.

2. Метод ОТ-ПЦР рекомендуется для выявления скрытых специфических хромосомных перестроек, важных для диагностики и прогнозирования ОМЛ.

3. При обнаружении мутантного гена Flt3 (Flt3ITD) и отсутствии других молекулярных маркёров лейкозных клеток, Flt3ITD рекомендуется для мониторинга МРБ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ю.А. Батурина, A.B. Попа, Е.В. Флейшман, О.И. Сокова, О.П. Кириченко, Л.Н. Константинова, O.E. Кулагина, С.А. Маякова. Транслокация t(8;21)(q22;q22) при остром миелобластном лейкозе у детей // Современная Онкология.- 2001.- № 1, том 3.- сс. 9-13.

2. E.B. Флейшман, О.И. Сокова, О.П. Кириченко, Ю.А. Батурина, A.B. Попа. Редкая неслучайная хромосомная транслокация при t(6;11) при остром лейкозе // Гематология и трансфузиология,- 2001.- № 5,- сс. 9-11.

3. Ю.А. Батурина, A.B. Попа, Е.В. Флейшман, О.И. Сокова, О.П. Кириченко, Л.Н. Константинова, O.E. Кулагина, И.И. Матвеева, С.А. Маякова. Особенности клинического течения детского ОМЛ, ассоциированного t(8;21)(q22;q22) II Материалы II съезда детских онкологов и гематологов России, Ростов-на-Дону.- 2001,- с. 27.

4. Ю.А. Батурина, Е.В. Флейшман, A.B. Попа, О.И. Сокова, О.П. Кириченко, Л.Н. Константинова, O.E. Кулагина, С.А. Маякова. Мониторинг остаточной резидуальной болезни детей с ОМЛ, ассоциированным транслокацией t(8;21)(q22;q22), транслокацией t(15;17)(q22;q21) или инверсией 16(p13;q22) II Материалы II съезда детских онкологов и гематологов России, Ростов-на-Дону.- 2001.- с. 28.

5. Ю.А. Батурина, A.B. Попа, О.И. Сокова, О.П. Кириченко, Л.Н. Константинова, O.E. Кулагина, С.В. Шаманский, С.А. Маякова, A.A. Масчан, Е.В. Флейшман. Мониторинг минимальной резидуальной болезни при остром миелоидном лейкозе с транслокацией t(8;21)(q22;q22) // Гематология и трансфузиология,- 2002,- № 1,- сс. 10-14.