Автореферат и диссертация по медицине (14.01.17) на тему:Хирургический компонент лечения первично-множественного рака молочной железы и рака яичников

На правах рукописи

005531901

Чхиквадзе Нино Валерьяновна

ХИРУРГИЧЕСКИИ КОМПОНЕНТ ЛЕЧЕНИЯ ПЕРВИЧНО-МНОЖЕСТВЕННОГО РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И РАКА ЯИЧНИКОВ

14.01.17 — хирургия 14.01.12 - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- 8 АВГ 2013

Москва-2013

005531901

Работа выполнена на кафедре онкологии (зав. кафедрой - заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Сельчук В.Ю.) факультета последипломного образования Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» (ректор - заслуженный врач РФ, доктор медицинских наук, профессор Янушевич О.О.) Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

Паяниди Юлия Геннадьевна - доктор медицинских наук, сотрудник гинекологического отделения ФГБУ «Российского онкологического научного центра имени H.H. Блохина» РАМН.

Официальные оппоненты:

Меркулов Игорь Александрович - доктор медицинских наук, руководитель онкологического центра ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий ФМБА России»

Марченко Анна Ивановна - доктор медицинских наук, профессор кафедры медицины катастроф и мобилизационной подготовки здравоохранения ГБОУ ВПО МГМСУ имени А.И. Евдокимова Минздрава России.

Ведущее учреждение: ГБОУ ВПО "Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова" Минздрава России.

Защита состоится « 3 » сентября 2013 г. в 14:00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.041.02, созданного на базе ГБОУ ВПО МГМСУ имени А.И. Евдокимова Минздрава России по адресу: 127473, Москва, ул. Делегатская д. 20 стр. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного медико-стоматологического университета им. А.И. Евдокимова (127206, г. Москва, ул. Вучетича, д. 10а)

Автореферат разослан «_»_2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Ярема Владимир Иванович

Список сокращений

РМЖ — рак молочной железы РЯ — Рак яичников

ПМЗН — первично множественные злокачественные образования

ОМ — опухолевые маркеры

ДУ - дискриминационный уровень

BRCA1 - Breast Cancer Associated genel

BRCA2 - Breast Cancer Associated gene2

ТАБ - тонкоигольная аспирационная биопсия

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Урбанизация и старение населения, ухудшение общей экологической ситуации, техногенные катастрофы за последнее десятилетие приводят к неуклонному росту заболеваемости первично-множественными злокачественными новообразованиями.

В России показатель заболеваемости ПМЗН на 2005г. составил 8.3, а на 2010г. - 11.2 на 100 000 населения. При этом доля синхронных опухолей из них составила 33% [Попова Т.Н. и др., 2011].

По имеющимся наблюдениям, ПМЗН могут быть одним из проявлений различных наследственных синдромов, которые развиваются в большинстве случаев из-за наличия мутаций в генах-супрессорах опухоли [Казубская Т.П., 2010]. И поэтому риск развития полинеоплазии выше для лиц из наследственно отягощенных семей.

Самой частой разновидностью семейных опухолевых заболеваний является наследственный рак молочной железы. Его вклад в общую встречаемость РМЖ составляет примерно 5-10% [Имянитов Е.Н., 2010]. «Классические» разновидности наследственного РМЖ ассоциированы также с высоким риском развития рака яичников, поэтому в медицинской литературе обычно используется термин «синдром РМЖ/РЯ» (breast-ovarian cancer syndrome). Считается, что как минимум 10-15% случаев РЯ можно объяснить присутствием генетического фактора [Имянитов Е.Н., 2010].

Наследственный синдром РМЖ/РЯ стал предметом интенсивных исследований в начале 90-х годов прошлого столетия. Так, в 1994г. был открыт первый ген, ассоциированный с данным заболеванием - BRCA1 (Breast cancer 1) (Miki Y., et al., 1994), а годом позже - второй ген, BRCA2 (Wooster R., et al., 1995). Однако необходимо подчеркнуть, что на сегодняшний день число работ, посвященных вопросам изучения частоты встречаемости мутаций в генах BRCA1/2 среди больных РМЖ и РЯ, особенно при полинеопла-

4

зии, невелико. А используемые для этого молекулярно-биологические методики имеют ряд недостатков.

Кроме того, в практической онкологии остро назрела необходимость внедрения современных молекулярно-генетических технологий, позволяющих выявлять злокачественные опухоли (в частности, РМЖ и РЯ) на доклинической стадии их развития. Вопросы ранней диагностики и лечения первично-множественных и/или солитарных РМЖ и РЯ остаются предметом оживленных обсуждений и дискуссий.

Именно поэтому нам представляется целесообразным и своевременным рассмотрение проблемы первично-множественного синхронного и/или мета-хронного РМЖ и РЯ в свете клинико-генетических аспектов.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ Повышение эффективности диагностики и лечения первично-множественного рака молочной железы и рака яичников.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучить особенности клинического течения первично-множественного синхронного и/или метахронного РМЖ и РЯ.

2. Определить возможности комплексного определения опухолеоассо-циированных маркеров (СА 125 и СА 15.3) в диагностике первично-множественного РМЖ и РЯ.

3. Определить роль генов ВКСА1/2 и СНЕК2 в развитии наследственных форм первичной множественности злокачественных новообразований путем исследования частоты встречаемости в этих генах восьми мутаций: 185с1е1АО, 30()Т>0, 4153с1е1Л, 4158А>С и 5382тхС в гене ВЯСА1, 6951тТ и 6174с1е1Т в гене ВЯСА2, варианта 1100с1е1С в гене СНЕК2, - в группах больных первично-множественным и солитарным РЯ и РМЖ.

4. Изучить метилирование генов ЯАББЕМ, НА¡1/12, БЕМАЗВ у больных солитарным и первично-множественным РМЖ и РЯ.

5

5. Изучить отдаленные результаты комплексного и комбинированного лечения больных первично-множественным РМЖ и РЯ.

6. Проанализировать результаты одномоментного и двухэтапного хирургического лечения больных синхронным первично-множественным РМЖ и РЯ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

В настоящей работе на большом клиническом материале представлены особенности клинического течения больных первично-множественным синхронным и/или метахронным РМЖ и РЯ с учетом их возраста, количества и времени выявления диагностированных опухолей, а также гистологического строения.

Были использованы комплексные подходы в диагностике первично-множественного РМЖ и РЯ. В частности, впервые изучены возможности комплексного определения опухолево-ассоциированных маркеров СА-125 и СА 15.3. Комплексное определение этих маркеров позволит повысить эффективность выявления первично-множественных опухолей молочной железы и яичников еще на доклиническом этапе, будет способствовать снижению частоты недиагностированных новообразований при синхронном типе их развития и раннему выявлению второй и последующих опухолей при метахрон-ном.

ПМЗН яичников и молочной железы рассмотрены в свете учения о синдроме наследственного РМЖ/РЯ. Где в случае подтверждения присутствия соответствующей мутации организуется комплекс мероприятий, направленных на предупреждение и раннюю диагностику онкологической патологии.

Проведена ДНК-диагностика наследственных форм заболеваний у больных первично-множественным и солитарным РМЖ и РЯ, что позволило выявить практически здоровых носительниц мутаций в генах ВКСА1, ВЯСА2

6

среди родственников этих пациентов. Предложена тактика мониторинга этого контингента с использованием комплексных подходов к их ранней диагностике.

Проведено определение статуса метилирования CpG-островков генов RASSF1A, RARß2 и SEMA3B в опухолевых и нормальных тканях молочной железы и яичников у больных ПМЗН, а также солитарным РМЖ, РЯ, и в лимфоцитах периферической крови здоровых доноров. Изучение аномального метилирования промоторной области гена RASSF1A позволяет диагностировать заболевания еще на до клинической стадии развития этих опухолей.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Диссертация апробирована на совместной научной конференции кафедры онкологии ФПДО МГМСУ имени А.И. Евдокимова, Первого Московского медицинского университета им. И.М. Сеченова, хирургического отделения опухолей молочных желез, хирургического отделения опухолей женской репродуктивной системы, отделения гинекологии, отделения диагностики опухолей НИИ КО РОНЦ им H.H. Блохина РАМН от 19.06.2012.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 64 источника отечественной литературы и 81 источник зарубежной литературы. Иллюстрирована 24 таблицами и 15 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Мы изучали клиническую целесообразность одновременного определения ОМ в диагностике первично-множественного РМЖ и РЯ в ФГБУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН с 1994 по 2011 г.. В общем понимании определяющим ОМ для РЯ является СА125; для РМЖ - CA 15.3.

В исследование включено 113 женщин (проспективное исследование), которые были подразделены на следующие группы:

1. контрольная группа - 16 здоровых доноров и 16 пациенток с доброкачественными образованиями яичников и молочной железы;

2. группу «патологического» контроля - 22 пациентки с различными злокачественными заболеваниями, исключая РМЖ и РЯ;

3. Основная группа - 30 больных синхронными и 29 метахронными ПМЗН яичников и молочной железы.

Ретроспективно анализировали уровни СА125 и СА15.3 в контрольных группах, а также у больных ПМЗН на старте лечения. Определение онко-маркеров проводили электрохемилюминесцентным методом с использованием диагностических тест-систем производства компании Hoffmann-La Roche на автоматическом анализаторе ELECSYS 2010 этого же производителя.

Молекулярные исследования, с использованием биологических микрочипов для определения спектра и частоты наиболее распространенных в популяциях восточной Европы точечных мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2, проводились на базе Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгард-та РАМН (к.м.н Т.В.Наседкиной и к.м.н. O.E. Федоровой) . С помощью метода биологических микрочипов, сочетающего мультиплексную ПЦР и гибридизацию с олигонуклеотидными биочипами, определялась частота встречаемости восьми мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2. В гене BRCA1 варианты -185delAG, 300T>G, 4153delA, 4158A>G и 5382insC, в гене BRCA2- 695insT и 6174delT, в гене СНЕК - llOOdelC определялись у больных ПМЗН, РЯ и РМЖ, в популяции российских женщин, которые получали лечение в клиниках ФГБУ РОНЦ им.H.H. Блохина РАМН за период с 2004 по 2006 гг.

Исследование уровня метилирования промоторных районов генов RASSF1A, RARß2, SEMA3B проводилось на базе Государственного Научного Центра РФ Гос НИИ генетики и совместно с Каролинским институтом (Шве-

8

ция). Исследование включало комбинацию методов: ПЦР-анализ образцов геномной ДНК, последовательно расщипленной с помощью набора метилчув ствительных рестриктаз (МЧРА), бисульфитной модификации ДНК с последующей метилспецифичной ПЦР. В анализ включены 330 пар образцов ДНК, выделенной из опухолевой и гистологически нормальной ткани больных РМЖ, РЯ и первично-множественными опухолями с поражением молочной железы и яичников. В качестве контроля использовали лимфоциты периферической крови здоровых индивидов (15 человек). ДНК выделяли из ткани опухоли и из лимфоцитов крови по стандартной методике.

При статистической обработке полученных данных была использована компьютерная программа Statistica 5.0. Достоверность полученных результатов вычислялась нами по методике Стьюдента-Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Из 635 больных ПМЗН органов женской репродуктивной системы, находившихся на лечении в клиниках ФБГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН за период с 1990 по 2010 гг., в 102 наблюдениях был выявлен синхронный и/или метахронный первично-множественный РМЖ и РЯ, что составило 16,06%.

В общей сложности у 102 больных первично-множественным РМЖ и РЯ было выявлено 217 злокачественных опухолей. При этом в структуре полинеоплазии преобладало сочетание двух опухолей (90 (88,23%) наблюдений). Случаи тройной локализации встретились в 11 (10,78%) наблюдениях, а 4 - в одном (0,99%). Наличие у одного больного пяти, шести и более опухолей является редким и в нашем исследовании не встретилось ни разу (табл. 1).

Таблица 1

Распределение больных ПМЗНмолочной железы и яичников по количеству диагностированных опухолей

Количество опухолей у одного больного Число больных Количество выявленных в группе опухолей

2 90 (88,2%) 180 (83,0%)

3 11 (10,8%) 33 (15,2%)

4 1 (1,0%) 4(1,8%)

Всего: 102 (100%) 217(100%)

При этом средний возраст больных ПМЗН на момент выявления РМЖ составил 42,4±2,4 лет, а на момент выявления РЯ — 47,9±3,2 лет. Учитывая, что средний возраст заболевания спорадическим РЯ составляет 61,2 ± 10,9 лет, а средний возраст больных спорадическим РМЖ - 50,9 ±1,9 лет, мы можем предположить, что большинство случаев первично-множественного РМЖ и РЯ являются наследственно обусловленными, что послужило одним из основополагающих моментов в планировании и проведении соответствующих генетических исследований.

В нашем исследовании число больных с метахронными опухолями (82 (80,4%)) достоверно превышало число наблюдений с синхронными опухолями (19 (18,62%)). Сочетанные опухоли имели место лишь в одном (0,98%) наблюдении.

У больных с тремя опухолями во всех 11 (100%) наблюдениях рак яичников сочетался со злокачественными новообразованиями обеих молочных желез. При этом в 6 (54,55%) наблюдениях опухоли были метахронными, а в 5 (45,45%) - синхронными. В 9 (81,82%) из них третья опухоль локализовалась в яичниках.

При метахронных первично-множественных злокачественных новообразованиях в большинстве наблюдений (63 (76,82%)) вторая опухоль локализовалась в яичниках.

Статистически значимым признаком оказалась более высокая частота инфильтративно-протокового рака (ИП) у больных первично-множественным РМЖ — 79% по сравнению с 47% в группе спорадическим РМЖ (р<0,05). Отсутствие рецепторов стероидных гормонов также достоверно чаще регистрировалось в опухолях пациентов РМЖ при полинеоплазии — 78% и 75% по сравнению с частотой этого показателя в группе пациентов солитарным РМЖ — 44% и 54% соответственно (р<0,05) (табл. 2).

Таблица 2

Гистологические и шшуногистохшшческие характеристики опухолей

молочной железы у больных ПМЗН

Признак Число наблюдений

Гистологический тип опухоли:

ИП 89 (78,76%)

ИД 20(17,7%)

Медуллярный 4 (3,54%)

Рецепторный статус опухоли:

РЭ- 88 (77,88%)

РЭ+ 25 (22,12%)

РП- 85 (75,22%)

РП+ 28 (24,78%)

Примечания: ИП - инфильтративно-протоковый рак молочной железы;

ИД - инфильтративно-дольковый рак молочной железы; РЭ -рецепторы к эстрогенам; РП - рецепторы к прогестерону.

Наиболее часто при раке яичников у больных с ПМЗН встречались серозная и эндометриоидная аденокарцинома — в 56 (54,9%) и 21 (20,46%) наблюдений соответственно. Остальные формы опухолей были представлены редко (табл. 3).

Таблица 3

Гистологическое строение злокачественных опухолей яичников

у больных полинеоплазией

Гистологический тип опухоли Число больных

Серозная аденокарцинома 56 (54,9%)

Эндометриоидная аденокарцинома 21 (20,46%)

Муцинозная аденокарцинома 3 (2,94%)

Светлоклеточная аденокарцинома 8 (7,98%)

Недифференцированная аденокарцинома 11 (10,78%)

Гранулезоклеточная опухоль 3 (2,94%)

Всего: 102 (100%)

Мы изучали целесообразность одновременного определения ОМ в диагностике первично-множественного РМЖ и РЯ.

Ретроспективно анализировали уровни СА125 и СА15.3 в контрольных группах, а также у больных ПМЗН на старте лечения. Проведенные нами расчеты показали, у больных с синхронными ПМЗН при 35 Е/мл диагностическая специфичность СА125 очень низкая и составляет всего 68,5%. По-видимому, это связано с включением в контрольную группу нескольких пациентов с неспецифически высокими (обусловленными наличием асцита или плеврита) значениями СА125. Реально по этой причине около трети женщин с уровнем СА125, превышающим 35 Е/мл, будут симулировать РЯ (диагностическая чувствительность — 100%). Следовательно, для использования в целях диагностики, такая специфичность неприемлема. На практике диагностическая специфичность и чувствительность являются взаимозависимыми величинами, и могут изменяться путем изменения ДУ. В нашем случае повышение верхней границы нормы СА125 до 200 Е/мл приводило к значительному увеличению специфичности (98%) без потери чувствительности (100%) (табл. 4).

Чувствительность и специфичность СА125 в диагностировании РЯу

пациенток с метахронным ПМЗН (первая опухоль - РМЖ, вторая - РЯ)

Онкомаркер CA 125

Дискриминационный уровень (ДУ) 35 Е/мл 200 Е/мл

Диагностическая специфичность 68,5% 98%

Диагностическая чувствительность 100% 91%

Необходимо отметить, что для метахронных ПМО эти показатели относятся исключительно ко второй опухоли, так как именно вторая опухоль отражает суть полинеоплазии. Первая же опухоль при метахронном развитии заболевания ведет себя как обычная солитарная опухоль.

В исследовании, которое проводилось на базе Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАМН, определялась частота встречаемости восьми мутаций в генах BRCA1/2 и СНЕК2 (185delAG, 300T>G, 4153delA, 4158A>G и 5382insC в гене BRCA1, 695insT в гене BRCA2, варианта llOOdelC в гене СНЕК2), у женщин с диагнозом РЯ с использованием технологии биочипов. Протестировано 527 анонимных образцов ДНК, выделенных из лейкоцитов периферической крови и ткани опухолей пациенток, находившихся на лечении в ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. По количеству первичных опухолей их распределили на четыре группы. В первую вошли женщины с диагнозом органоспецифический РЯ (п=79, возраст от 31 до 76 лет, средний возраст — 59,9 ±11,1 лет). Вторая группа состояла из пациенток с диагнозом ПМЗН с поражением яичников (п=33, возраст от 27 до 76 лет, средний возраст — 49,4 ± 12,1 лет). Третья группа представлена неотобранной в соответствии с семейным анамнезом выборкой больных РМЖ (п=410). И, пожалуй, в самую малочисленную группу вошли 5 больных ПМЗН обеих молочных желез.

У пациенток с диагнозом солитарный РЯ обнаружено восемь случаев мутаций (10,13%) в гене ВЯСА1, из них один случай с мутацией 185с1е1АО (1,47%) и семь с мутацией 5382тзС (8,66%). При этом средний возраст больных РЯ, не являющихся носителями мутаций, составил 61,2 ± 10,9 лет, а средний возраст пациенток — носителей мутаций — значительно ниже и составил 52,5 ±10,1 лет. Выявленные различия среднего возраста пациенток, у которых мутация не обнаружена, и пациенток, содержащих мутацию, статистически достоверны (р<0,01).

В группе больных ПМЗН с поражением яичников найдено 18 случаев мутаций в гене ВЯСА1 (54,55%), из них 2 случая с мутацией 185(1е1АС (6,06%), 5 случаев с мутацией 300Т>С (15,15%), 2 — с мутацией 4153с1е1А (6,06%) и 9 случаев с мутацией 5382тзС (27,28%). Средний возраст пациенток, у которых мутации не выявлены, составил 57,6 ± 13,7 лет. При сравнении с группой больных полинеоплазией, являющимися носителями мутаций (их средний возраст составил 43,0 ± 5,8 лет), были получены статистически достоверные различия (р<0,01). Частота мутаций в группе больных ПМЗН с поражением яичников существенно выше по сравнению с группой больных солитарным РЯ. Полученные различия статистически достоверны (р<0,01). Это позволяет сделать вывод, что мутации в гене ВЯСА1 увеличивают риск развития ПМЗН (табл. 5)

Таблица 5

Частота мутаций в гене ВЯСА1 у больных РЯ и ПМЗН с поражением яичников

Диагноз

Ген Мутация Органоспецифический РЯ ПМЗН с поражением яичников

число % число %

ВЯСА1 185с1е1АО 1 1,47 2 6,06

ВЯСА1 зоот>о 0 0 5 15,15

ВЯСА1 4153<1е1А 0 0 2 6,06

ВЯСА1 5382ип$С Всего больных, несущих мутацию

8,66 9

10,13 18

27,28 54,55

При наличии мутаций в гене ВЯСА1 средний возраст манифестации заболевания значительно ниже, чем при отсутствии последних. Это относится как к группе больных солитарным РЯ, так и к пациенткам с диагнозом ПМЗН. При этом средний возраст больных-носителей мутаций при ПМЗН ниже, чем средний возраст больных-носителей мутаций при РЯ, не связанном с первично-множественным процессом (43,0 ± 5,8 лет против 52,5 ± 10,1 лет). Эти различия также статистически достоверны (р<0,01).

В изученной выборке больных было выявлено 4 типа мутаций в гене ВЯСА1, а именно: 185с1е1АСЗ, ЗООТХЗ, 4153ёе1Аи 5382швС. В группе больных РЯ наиболее часто встречается мутация 5382тзС (87,5% всех мутаций) в гене ВЯСА1, в группе больных ПМЗН ее доля составляет 50,0%.

В группе больных солитарным РМЖ (п=410), протестированной на РМЖ-биочипе, частота 4 исследуемых мутаций ВЯСА1 (популяционная) составила 5,1% (21 из 410), а мутации ВЯСА2 (695 in.sC и 6174с1е1Т) были выявлены у 2 пациенток, что согласуется с литературными данными и отражает низкую популяционную частоту мутаций генов ВЯСА1/2.

При диагностике наследственных мутаций в генах ВЯСА1/2, из 5 больных ПМЗН молочных желез, только у одной обнаружена мутация -6174с1е1Т в гене ВЯСА2. У 4-х - выявлена мутация 5382in.sC гена В НС А, три из них имели - билатеральный РМЖ и одна - совместное поражение первичным раком молочных желез и первичным раком легкого (табл. 6).

Частота мутаций генов ВЯСА1/2 в группе больных солитарным РМЖ и больных ПМЗН обеих молочных

желез

Ге н Экзон Мутация Носители мутаций в группе больных солитарным РМЖ ПМЗН обеих молочных желез

ВЛ СА 1 2 185с1е1АО 2 (0,5%)

ВЯ СА 1 5 С6Ш 3 (0,73%)

ВЯ СА 1 11 4154с1е1А 3 (0,73%)

ВЯ СА 1 20 5382шзС 16(3,9%) 4 (80%)

37? СА 2 5 695шбТ 1 (0,24%)

5Й СА 2 11 6174с1е1Т Роипскг-пниаПоп 1 (0,24%) 1 (20%)

Всего больных, несущих мутации 26 (5,6%) 5 (100%)

Следует отметить, что в изучаемых нами группах мутаций в гене

СНЕК2 обнаружено не было. Это соответствует полученным ранее данным о

частоте мутаций в этом гене при РЯ в других популяциях.

Рассмотрев роль мутаций генов В КС А1/2 в развитии наследственных

форм РМЖ/РЯ, необходимо отметить, что только 20-30% из них обусловлено

наличием мутаций в генах ВЯСА! или В11СА2. Огромные усилия ученых

направлены на идентификацию других генов, ответственных за развитие

РМЖ и/или РЯ, которые позволили бы выявлять эти заболевания еще на

доклинической стадии. Как и многие злокачественные опухоли, РМЖ и РЯ

16

имеют мультифакториую природу. В их патогенезе важную роль играют онкогены и гены опухолевой супрессии. Определение степени метилирования генов-супрессоров опухолевого роста может служить ранним маркером агрессивности опухолевого процесса и служить для прогноза течения заболевания, и для терапевтической стратегии при лечении.

В своей работе мы провели комплексный анализ метилирования генов-супрессоров ЯАББРЫ, БЕМАЗВ и 11АЯр2 при РМЖ, РЯ и полинеоплазии.

Изучение метилирования ДНК в опухолях молочной железы и яичников проводилось с использованием метил-чувствительного рестриктного анализа (МЧРА), что позволило не только более полно определить долю образцов, в которых эти гены метилированы, но и оценить плотность метилирования Срв островка в каждом образце.

Анализ метилирования промоторного района гена ЯЛББПА при РМЖ и РЯ. Согласно полученным данным, частота метилирования гена КАББЕ1А в опухолях молочной железы и яичников достоверно выше, чем в прилежащей гистологически нормально ткани (Р<0.05) (таб.2). Частота метилирования гена МББПА при РМЖ и РЯ составила 78% (46/59) и 72% (36/50), соответственно, что почти вдвое превышает литературные данные (40%). Хотя наблюдаемые различия в метилировании гена ИАББРЫ могут быть связаны как с чувствительностью метода, так и с этнографическими особенностями исследуемых популяций.

Плотность метилирования Срв-пар, была менее выражена и, согласно данным МЧРА, достоверна только при РМЖ (Р=1.6хЮ~5). Установлены четкие различия в уровнях метилирования промоторного района гена ИАББРЫ в опухолевой и прилежащей гистологически нормальной ткани при РМЖ (49% против 14%) и РЯ (42% против 6%) (табл. 7).

Частота и плотность метилирования промоторного района гена ЯЛБЗР1А в РМЖ и РЯ по данным МЧРА *.

Вид Частота метили- Плотность мети- Уровень метили-

рака рования лирования рования

Р= 5.9x1 СГ6 1,0х1(Г7

Р эпухоль 46/59, 78% 522/828, 63% 49%

M Ж яорма 21/59,36% 151/378,40% 14%

р= 1,11х10-9 0,1415

РЯ опухоль 36/50, 72% 376/648, 58% 42%

норма 6/50, 12% 54/108, 50% 6%

Следует отметить, что нами впервые была показана значимая корреляция частоты метилирования для гена ЯАББР1А при ПМЗН (Р<0.05). Частота метилирования промоторной области гена ЯАББРЫ составила 90% (12/11), причем, у 6 пациенток наблюдался билатеральный РМЖ, а у 5 -первой опухолью был РМЖ. Метилирование гена ЯАББРЫ также выявлено у 90% (4/5) больных ПМЗН, у которых первой опухолью был РЯ. Для всех пациенток с ПМЗН метилирование гена ЯАББР1А была найдено и в прилежащей гистологически нормальной ткани. В то же время метилирование промоторного района гена ЯАББР1А в ДНК, выделенной из пяти образцов тканей молочной железы и яичников, полученных от доноров без онкологических заболеваний в анамнезе, выявлено не было. Все это позволяет считать метилирование этого гена ранним событием в патогенезе РМЖ и РЯ, и может быть использовано как молекулярный маркер злокачественной трансформации.

Анализ метилирования промоторного района гена ЯАЯ{12 при РМЖ и РЯ. Проведенный нами анализ показал, что частота метилирования промоторного района гена ЯАЯр2 составляет 46% (27/59) при РМЖ и 30%

(15/50) при РЯ и статистически достоверно отличается от таковой в гистологически нормальной прилежащей ткани (Р<0.05).

У больных ПМЗН метилирование этого гена выявлено в 67% (8/12) наблюдений при РМЖ и в 90% (4/5) наблюдений - при РЯ. Наличие метилирования промоторной области гена ЯАЯ/32 в некоторых образцах ДНК гистологически нормальной ткани молочной железы и яичников, выявляемое с частотой до 2-4%, означает, что эта модификация может происходить в начале онкогенеза, предшествуя структурным изменениям в ДНК тканей пациентов. В то же время метилирование промоторного района гена ИА11/32 в дополнительном контроле выявлено не было.

Нами также была выявлена связь частоты изменения метилирования промоторного района гена со стадией, степенью анаплазии и

размером опухоли при РМЖ. Выявление зависимости изменения частоты метилирования от прогрессии опухоли позволяют включить ген в

число эпигенетических онкомаркеров прогноза течения РМЖ.

Анализ метилирования промоторного района гена БЕ МАЗ В при РМЖ и РЯ. Проведенный анализ показал, что метилирование гена БЕМАЗВ выявляется в 36% наблюдений РМЖ (21/59) и в 50 % образцах РЯ (25/50). У больных ПМЗН частота метилирования гена БЕМАЗВ обнаружена в 33% (4/12) наблюдений при РМЖ и в 60% (3/5) наблюдений при РЯ. Кроме того, показано, что промоторная область гена БЕМАЗВ достоверно чаще метилирована в ДНК опухоли, чем в ДНК прилежащей гистологически нормальной ткани молочной железы или яичников (Р<0.05). В то же время метилирование промоторного района гена БЕМАЗВ в дополнительном контроле выявлено не было. Эти данные указывают на функциональное значение и специфичность метилирования промоторной области этого гена в онкогенезе изучаемых опухолей.

Выявлена достоверная корреляция частоты метилирование промоторного района гена БЕ№43В с клинической стадией РМЖ (Р<0.05). Нами рассчитана плотность метилирования Срв-островка гена БЕ МАЗ В (сумма метилированных Срв относительно суммы исследованных Срй в 21 образце ДНК первичных опухолей молочной железы и 25 образцах РЯ, в которых выявлено метилирование). Показана достоверная прямая корреляция плотности метилирования со степенью злокачественности и стадией РМЖ (.Р<10по Фишеру) и степени метилирования (с учетом плотности) с прогрессированием РЯ (Р<0.05).

Высокая частота метилирования в образцах ДНК опухолей и феномен выявления метилирования в нормальной ткани у больных РМЖ и РЯ (еще до возникновения морфологических изменений) может указывать на связь метилирования гена БЕМАЗВ с началом онкогенеза, что важно для использования этого теста в качестве маркера при комплексной диагностике рака.

Таким образом, изучение статуса метилирования генов ЯАББР1А, ЯАД/32 и БЕМАЗВ показало, что эпигенетическое изменение этих генов может быть одним из последовательных молекулярных изменений при РМЖ и РЯ, а метилирование ЯАББР1А и ЯАЩ32 коррелирует с тенденцией к развитию ПМЗН молочной железы и яичников. Возможно, метилирование ДНК является одной из самых значимых причин возникновения первично-множественного РМЖ и РЯ. Выявленные особенности эпигенетических изменений генов ЯАББР1А, ЯАЩ2 и БЕМАЗВ могут быть использованы как с целью ранней диагностики РМЖ (ЯАББР1А), так и в качестве новых прогностических тестов (БЕМАЗВ и ЯАЦ32). Это позволит выделить группы риска больных по развитию РМЖ и РЯ как солитарных, так и ПМЗН.В последнее время в выборе тактики лечения большое значение придается

биологическим особенностям опухоли, что безусловно включает в себя молекулярно-генетический подтип.

Хирургическое лечение синхронных ПМЗН рак молочной желез+рак яичников проводится как одномоментно, так и в два этапа. В нашем исследовании из 19 пациентов с синхронным раком молочной железы+раком яичников 15 пациентам операции по поводу обоих заболеваний проводились одномоментно (по поводу рака яичников — всем пациентам была проведена экстирпация матки с придатками и удаление большого сальника, а по поводу рака молочной железы — 6 пациентам была выполнена радикальная мастэктомия с сохранением грудных мышц, а 9 пациентам — радикальная резекция молочных желез). При этом во всех наблюдениях первоначально выполнялась операция по поводу рака яичников, а затем — по поводу рака молочной железы. При двухэтапном хирургическом лечении на первом этапе также выполнялась операция по поводу рака яичников, а в последующем — по поводу рака молочной железы. В 11 случаях при ПМЗН обоих молочных желез операции выполнялись одномоментно двумя бригадами. При хирургическом лечении синхронных ПМЗН молочной железы и рак яичников послеоперационное осложнение было получено в 1 случае (5,3%) в виде ранней спаечной тонко-, толстокишечной непроходимости. Постмастэктомический синдром выражался в отеке мягких ткани верхней конечности со стороны операции, обусловленном лимфостазом 1ст у трех пациенток, а 2 ст — у четырех. Данная выраженность лимфостаза у пациенток не требовала хирургической коррекции, поскольку легко устраняется физиотерапевтическими процедурами, в частности магнитотерапией. Постмастэктомический синдром как осложнение после различных вариантов радикальных операций на молочной железе в последнее время встречается нечасто, поскольку современная техника оперирования подразумевает максимальное сохранение венозно-

артериальных сосудов подмышечной области, что, безусловно, способствует раннему раскрыванию коллатералей и максимальной компенсации лимфооттока верхней конечности (98%).

При одномоментных операциях по поводу рака молочной железы и яичников риск оперативного вмешательства определяется общим состоянием пациенток и их сопутствующими заболеваниями и не отличается от таковой при выполнении подобных операции при солитарных опухолях. Послеоперационное ведение таких пациенток не имеет особенностей, отличающихся от стандартного. Вышеуказанные осложнения не превышают процент осложнений при поэтапном хирургическом лечении пациенток.

Пятилетняя выживаемость больных ПМЗН молочной железы и яичников практически не отличается от пятилетней выживаемости больных солитарным РМЖ и составила 68% и 69%, соответственно. Возможно, это объясняется, тем, что в нашем исследовании большинство ПМЗН (82 (80,4%) наблюдений) были метахронными, при этом в 63 (76,82%) из них первая опухоль возникала в молочной железе. Поскольку более чем в 60% наблюдений у таких больных РЯ развивается через 5 лет и позже, мы можем говорить, что агрессивно протекающее второе заболевание в этом случае практически не сказывалось на их пятилетней выживаемости.

При этом 10-летняя выживаемость значительно выше у больных солитарным РМЖ, чем при РМЖ/РЯ (49% и 41%, соответственно). Т.е., теперь сказывается влияние более агрессивно протекающего РЯ. 10-летняя выживаемость статистически достоверно лучше в группе больных наследственным ВДС4-ассоциированным РМЖ (72%) (р<0,05).

Рис. 1. Выживаемость больных ВЯСА1-ассоциированным солитарным раком янчников и при ПМЗН

Пятилетняя выживаемость больных раком яичников при полинеоплазиях составила 42,3 ± 3,8%, а пятилетняя выживаемость больных раком яичников, не связанным с первично-множественным процессом, — 39,7 ± 4,6% (р<0,05). Пятилетняя выживаемость ВЯСА/-ассоциированного рака яичников при полинеоплазиях достоверно лучше выживаемости ВЯСА1-ассоциированного рака яичников, не связанного с множественным процессом, — 73,68% ± 5,2 % и 58,9 ± 6,3% соответственно (Р=0,012) (рис. 1).

ВЫВОДЫ

1. Первично-множественный рак молочной железы и рак яичников был выявлен в 16,06% наблюдений среди 635 больных ПМЗН органов женской репродуктивной системы.

2. Установлены достоверные различия возрастного проявления при соли-тарном спорадическим РЯ (61,2 ± 10,9 лет), солитарном раке яичников с мутацией в гене ВЯСА1 (52,5 ±10,1 лет) и при ПМЗН с поражением яичников и наличием мутации в гене ВЯСА1 (43,0 ± 5,8 лет, р<0,05). Средний возраст

23

больных ПМЗН на момент выявления РМЖ составил 42,4±2,4 лет, что достоверно ниже среднего возраста больных спорадическим РМЖ - 50,9 ±1,9 лет (р<0,05).

3. Наиболее часто первичная множественность представлена двумя опухолями (88,23%), реже тремя (10,78%). Четыре новообразования встретились в одном (0,99%) наблюдении. Первично-множественный РМЖ и РЯ в большинстве наблюдениях (80,4%) был синхронным, в 18,62% наблюдениях - ме-тахронным. Сочетанные опухоли имели место лишь в одном (0,98%) наблюдении. При метахронных ПМЗН в большинстве наблюдениях (76,82%) вторая опухоль локализовалась в яичниках.

4. При первично-множественном РМЖ и РЯ СА125 может обладать высоким диагностическим потенциалом в выявлении РЯ у пациенток как с синхронными, так и с метахронными опухолями при ДУ более 200 Е/мл: диагностическая специфичность составила 98%, а чувствительность - 100%. Диагностическая чувствительность СА15.3 в отношении метахронных ПМЗН составляла всего 33%.

5. Молекулярно-генетический скрининг восьми мутаций в генах ВЯСА1/2 и СНЕК2 (185с1е1А<3, ЗООТХЗ, 4153ёе1А, 4158А>С и 5382тзС в гене ВЯСА1, 695тзТ и 6174ёе1Т в гене ВЯСА2, варианта 1100с1е1С в гене СНЕК2) в группах больных солитарным РЯ и ПМЗН с поражением яичников выявил мутации только в гене ВЯСА1. Частота этих мутаций в группе больных ПМЗН с поражением яичников составила 53,85%, что существенно выше, по сравнению с группой больных солитарным РЯ - 10,13% (р<0,05). В неотобранной в соответствии с семейным анамнезом выборке больных РМЖ (п=410) частота мутаций гена ВЯСА1 (популяционная) составила 5,1%, а частота мутаций гена ВЯСА2 (695 тэС и 6174с1е1Т) - 0,5%. У 5 больных ПМЗН молочных желез обнаружена одна мутация гена ВЯСА2 (6174с1е1Т) и 4 мутации (5382тзС) гена ВЯСА.

6. Метилирование промоторных районов генов-супрессоров опухолевого роста ЯАББР1А, БЕМАЗВ и Я А Я/32 может быть использовано в качестве маркеров в ранней диагностике и прогнозе РМЖ и/или РЯ. Аномальное метилирование генов КАББЕМ, БЕМЛЗВ и КАЩП было выявлено при РМЖ в 78%, 46% и 35% наблюдениях, соответственно, и при РЯ - в 73%, 30% и 50% наблюдениях, соответственно. У больных ПМЗН аномальное метиллирование СрО островка гена ЯАББЕМ выявлялось в 100% наблюдений в опухолях молочной железы и яичников, а гена ЯАЯр2 — во всех опухолях яичников. Выявлена корреляция частоты метиллирования промоторных районов генов КАЯР2 и БЕМАЗВ с клинической стадией заболевания и степенью анаплазии опухоли.

7. Анализ пятилетней выживаемость больных раком яичников при поли-неоплазиях показал 42,3 ± 3,8%. У больных ВЯСА/-ассоциированного рака яичников пятилетняя выживаемость при первичной множественности новообразований достоверно выше и составила 73,68% ± 5,2 %. Пятилетняя выживаемость ВЯСА1 -ассоциированного рака яичников, не связанного с множественным процессом, - 58,9 ± 6,3% (Р=0,012). Десятилетняя выживаемость значительно выше у больных солитарным РМЖ, чем при РМЖ/РЯ (49% и 41%, соответственно). Десятилетняя выживаемость статистически достоверно лучше в группе больных наследственным ВЯСА1 ассоциированным РМЖ (72%) (р<0,05).

8. При ПМЗН молочной железы и яичников операции проводят одномоменино (79%) или в два этапа (21%). При этом первоначально выполняются операции по поводу рака яичников. При синхронном ПМЗН молочных желез операции выполняются одномоментно двумя операционными бригадами.

9. Частота послеопрационных осложнений при одномоментном хирургическом лечении ПМЗН молочной железы и яичников не отличалась от

25

таковых при двухэтапном хирургическом лечении и составила 5,3% и 6,2%, соответственно.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Комплексное определение опухолевых маркеров СА-125 и СА-15.3 обладает высоким диагностическим потенциалом в доклинической диагностики первично-множественного рака молочной железы и рака яичников. Поэтому больных с солитарными опухолями указанных локализаций следует ориентировать на длительное, регулярное определение комплекса онкомаркеров (СА-125, СА-15.3). Повышение уровней хотя бы одного из них должно стать основанием для проведения тщательного обследования больной на предмет возможного обнаружения второй опухоли.

2. Выявление мутаций в генах-супрессорах опухоли ВЯСА1/2 у больных первично-множественным раком молочной железы и раком яичников, а также у их практически здоровых родственников, позволяет установить наследственный характер заболевания, что особенно важно для выявления лиц, формирующих группу риска по развитию наследственной опухолевой патологии, и создания канцер-регистра. В случае подтверждения наличия у них генетической предрасположенности к возникновению рака, проводится комплекс профилактических мероприятий, направленных на предупреждение, а, возможно, и профилактику развития заболевания.

3. В качестве маркеров ранней диагностики и прогноза РМЖ и/или РЯ может быть использовано метилирование промоторных районов генов-супрессоров опухолевого роста ЯАББРЫ, БЕ МАЗ В и

4. Основным методом лечения первично-множественного рака молочной железы и рака яичников является хирургический. При этом операции следует выполнять одномоментно, первоначально — по поводу рака яичников. При синхронном ПМЗН обеих молочных желез операции следует выполнять одномоментно двумя операционными бригадами.

26

Список работ опубликованных по теме диссертации:

1. Казубская Т.П., Метилирование генов ЯА88Р1 А, БЕМАЗВ в эпителиальных опухолях молочной желехзы. / Т.П Казубская, В.И. Логинов, Д.С. Ходырев, В.Д. Ермилова, Ю.Г. Паяниди, Н.В.Чхиквадзе, В.Ю. Сельчук, Э.А. Брага // Опухоли женской репродуктивной системы. № 1 12.,

2. Паяниди Ю.Г., Роль онкомаркеров в диагностике первично-множественных злокачественных новообразований органов женской репродуктивной системы. / Ю.Г. Паяниди, В.М. Шелепова, Н.В. Чхиквадзе, А.Ю. Коршунков, Д.С. Огай, В.Ю. Сельчук. // Опухоли женской репродуктивной системв. № 1 □ 12.,

3. Казубская Т.П., Метилирование генов-супрессоров в эпителиальных опухолях молочной и яичников, включая первично-множественные. / Т.П. Казубская, И.В. Пронина, В.Д. Ермилова, Ю.Г. Паяниди, Н.В. Чхиквадзе, В.Ю. Сельчук, Э.А. Брага // Российский биотерапевтический журнал № 1/2012

4. Денчик Д.А. Роль молекулярно-генетических маркеров в диагностике и прогнозе листовидных опухолей / Д.А Денчик, И.К. Воротников, Н.В. Чхиквадзе, Л.Н. Любченко // Онкогинекология № 1 □ 2012

Отпечатано в РИО МГМСУ 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20, стр. 1. Заказ № 2208 Тираж 100 экз.