Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Микротетразолиевый тест в прогнозировании химиочувствительности карцином яичников человека (экспериментальное исследование)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИ! ИНСТИТУТ

ИМ. П.А.ГЕРЦЕНА

На правах рукописи УЖ 618.11-006.04:615.28

КУРИЛЯК ОЛЬГА АДАМОВНА

МИКРОТЕТРАЗОЛИЕВЫЙ ТЕСТ В ПРОГНОЗИРОВАНИИ ХИМИОЧУВСГВИТЕЛЬНОСШ КАРЦИНОМ ЯИЧНИКОВ ЧЕЛОВЕКА

(экспериментальное исследование)

14.00.14 - Онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических, наук

Москва - 1993

/У -/ . /

< - / о /

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском онкологическом институте им. П.А.Герцена МЗ РФ (директор чл.-корр. РАМН профессор В.И.Чиссов).

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

Доктор биологических наук Н.С.Сергеева. Доктор медицинских наук Е.Г.Новикова.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор биологических наук, профессор Л.Б.Горбачева. Доктор медицинских наук, профессор Г.А.Франк.

Ведущая организация - Московский научно-исследовательский институт диагностики и хирургии МЗ РФ.

Защита состоится " " ____1993 года в 14.00 час.

на заседании диссертационного совета при МНИОИ им. П.А.Герцена МЗ РФ (125284, г.Москва, 2-й Боткинский проезд, д.З).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МНИОИ им. П.А.Герцена.

Автореферат разослан " -М "Р/^/Г.ШРЗ. .1993 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, професоор 4 И.А.МАКСИМОВ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Наиболее эффективной тактикой лечения больных раком яичников а настоящее время считается сочетание операции с адьювантной полихимиотерапией, обязательным компонентом которой являются препарата платины (De Palo G., 1989, Negishl Y. et al., 1991). Однако, многие авторы отмечают, что объективный антибластический эффект лечения после нескольких курсов химиотерапии удается получить не у всех, а лишь у 70-80$ пациентов (Kraíít Я., 1989, Перэводчикова Н.И., 1993). Значительные трудности отмечаются и при выборе схем химиотерапии второй линии, так как в процессе первых курсов лечения у части больных происходит развитие резистентности опухоли к цитостатикам, что устанавливается эмпирически как отсутствие клинического ответа на несколько курсов химиотерапии (Averette Н.Е. et al., 1990, Cowan К.Н., 1991).

Все вышесказанное свидетельствует об актуальности проблемы индивидуализации подходов к лекарственной терапии больных с карциномами яичников. Попытки индивидуализации тактики лечения на основании учета таких параметров, как стадия процесса, возраст больной, размер опухоли, ее гистологическая форма и степень ди®ерен-цировки имели ограниченный успех, так как дахз и при таком дифференцированном подходе в пределах однородных групп больных отмечались значительные различия в реакции опухолей на лечение (Чиссов В.И.идр., 1989, Tucker S.I., 1989).

Огромный клинический опыт, а также успехи в исследовании механизмов действия цитостатнков и механизмов химиорезистентности опухолевых клеток привели к пониманию того, что ведущей причиной неэффективности лекарственной терапии карцином человека и, в частности, определенной доли карцином яичников является исходная либо приобретенная в процессе лечения хжнорезистантность опухолевых клеток, обусловленная экспрессией ряда генов и активацией з клетках разнообразных детоксицирущих систем (Ozola R.F. et al., 1991, Hamilton Т.е., 1992). Поэтому одним из адекватных подходов к индивидуализации лечения больных является оценка с помощью лабораторных методов индивидуальной чувствительности кавдой опухоли к планируемым антибластическим воздействиям и выявление до лечения тех агентов, к которым опухолевые клетки данного новообразования резистентны.

Уже известен ряд исследований, в которых показано, что назна-

чаше противоопухолевого лечения с учетом лабораторных данных об индивидуальной химиочувствителъности повышает вероятность правильного выбора сочетаний цитостатических агентов для химиотерапии как первой, так и второй линии, что позволяет избавить ряд больных от бесполезных (в плане антибластического эффекта), но не безразличных для организма воздействий, и, в конечном итоге, повысить эффективность лечения (Chapman. D.J. et al., 1989, Salmon S.E., 1990). . '

Известен и ряд лабораторных In vitro методов оценки химио-чувствительности опухолевых клеток, пригодных для индивидуального прогнозирования эффекта лечения (Kem D. et al., 1990, Gazdar A.F., 1990). Наиболее высокой прогностической значимостью среди них обладаэт клонирование опухолевых клеток в полужидком агаре (Von Eofi D. et al., 1991). Этот метод позволяет с вероятностью 85-998 предсказывать химиорезистентность и с вероятностью 70-80% -химиочувствительность карцином некоторых типов (Alberts D.S. et al., 1981, Srldhar K.S.et al., 1988, Tvelt К.Ы. et al., 1989). Однако, в силу низкой клоногенной способности значительной части опухолей и необходимости иметь для анализа достаточно большое количество опухолевых клеток, этот подход к индивидуальному прогнозированию не получил широкого распространения. Определенные надежды многие авторы связывают с разработкой и применением в онкологической клинике других in vitro тестов, таких как антиметаболический, анишролиферативный с использованием радиоактивномеченных предиественников, а также метода оценки структуры клеточной популяции на основе цитометрии (Khoo S.K. et al., 1989, Volm М., 1989).

Накопленный опыт в области индивидуального прогнозирования свадательствует о том, что хороший метод прогноза должен удовлетворять по крайней мере трем требованиям: быть краткосрочным, пригодным для тестирования опухолей различных гистологических типов и локализаций и обладать высокой прогностической точностью, чтобы ревизия терапевтической тактики проводилась только при реальной необходимости. Пока таким требованиям не отвечает ни один из известных подходов. Поэтому необходимость разработки в целях индивидуального прогнозирования простых, дешевых, технологичных методов остается актуальной. В настоящей работе исследуется возможность использования для оценки реакции опухолевых клеток карцином яични-

ков на цитостатики исследуется возможность использования микро-тетразолиевого теста (МТТ-теста) - количественного полуавтоматического метода определения степени угнетения дегидрогеназной активности опухолевых клеток, разработка которого в целях индивидуального прогноза начата параллельно несколькими группами исследователей около 5-ти лет тому назад(Ба^ег^ J.M. et al., 1989, Campling B.G. et al., 1991). В сравнении с другими In vitro методами прогноза МТТ-тест достаточно прост в исполнении, требует сравнительно небольшого количества клеток для одного тестирования, и, вероятно, может быть применим для широкого спектра опухолей человека. Однако, к настоящему времени количество работ, выполненных этим методом не превышает 30-ти и до сих пор не стандартизированы условия проведения теста, неизвестна степень его адекватности для прогноза химиочувствительности опухолей разных локализаций и гистологических типов и препаратов с разным механизмом действия.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ.

Разработка и экспериментальная апробация краткосрочного полуавтоматического количественного In vitro теста (МТТ-теста) для оценки индивидуальной реакции карцином яичников человека на химио-терапевтические препараты.

ЗАДАЧИ РАБОТЫ.

1. Разработать условия проведения МТТ-теста как метода оценки химиочувствительности клеток на модели перевивной клеточной линии аденокарциномы легкого человека.

2. Оценить адекватность НТТ-теста для прогноза химиочувствительности путем параллельного исследования влияния цитостатиков на клоногенную способность и окислительно-восстановительные процессы опухолевых клеток.

3. Разработать критерии оценки индивидуальной химиочувствительности карцином яичников человека с помощью тетразолиового метода.

4. Выявить закономерности в проявлении клетками рака яичников чувствительности/резистентности к традиционно используемым в онко-гинеколопга антибластическим агентам в широком диапазона доз.

5. Изучить возможности использования МТТ-теста для мониторинга изменения реакции клеток карцином яичников человека на химио-

препарата в процессе противоопухолевого лечения<

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Разработан ряд методологических приемов для проведения МТТ-теста, позволящкх выявлять индивидуальные различия в реакции карцином яичников на цитостатические агенты с различными механизмами действия.

Установлено, что данные тетразолиевого метода о чувствительности злокачественных новообразований яичников к отдельным противоопухолевым препаратам можно использовать для составления схем полихимиотерапии.

Показано, что резистентность в ЫТТ-твств клеток карцином яичников к платидиаму является показателем полихиыиорезистентности для карцином яичников первичных больных.

Выявлена перекрестная резистентность клеток рака яичников к тио-ТЭфу и винкристину, винкристину и 5-фгорурациду, что позволяет при резистентности к первому компоненту пары с вероятностью не менее 75* прогнозировать и резистентность ко второму ее компоненту.

Путем исследования кривых "доза агента - цитостатическиб эффект" в большинстве карцином яичников обнаружены субпопуляции опухолевых клеток, различающиеся по уровню химиочувствителшости.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Доказана адекватность МТТ-теста для выявления случаев первичной резистентности карцином яичников человвека к отдельным цито-статикам и мониторинга развития в процессе лечения вторичной поли-химиорезистентности этих карцином.

Показана возможность использования МТТ-теста для составления схем полихимиотерапии раки яичников пергой и второй линии с учетом возможной перекрестной хиниорезистентности этих опухолей к разным цитоотатикам.

На основании данных о реакции карцином яичников на разные дозы цитостатиков разработаны методологические подходы для индивидуальной апробации в клинике онкогинеколопш стратегии высоких доз отдельных химиопрепаратов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Основные результаты диссертационной работы доложены н обсуждены на:

- Конференциях колодах ученых ЫНИОИ им.П.А.Герцена (ишь 1990 г. и ноябрь 1992 г.);

- семинарах отделения прогноза эффективности консервативной терапии опухолей МНИОИ иы.П.А.Герцена (1990 - 1993 гг.);

- объединенных научных конференциях экспериментальных отделений МНИОИ ИМ.П.А.Герцена (1990 - 1993 гг.).

Предварительная защита диссертации состоялась б июля 1993 г. на совместной научной конференции отделений прогноза эффективности консервативной терапии опухолей, модификаторов и протекторов противоопухолевой терапии, вирусологии и клинической иммунологии, онкогинекологии и абдоминальной онкологии МНИОИ им.П.А.Герцена.

ПУБЛИКАЦИИ. ...

По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертационная работа изложена на страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы (3 главы), главы, посвященной материалам и методам исследования, 3-х глав, в которых представлены собственные результаты и их обсуждение, заключения, выводов и списка литературы, содержащего отечественных и

иностранных источников. Диссертация содержит таблиц и б рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объект исследования.

В работе использованы: 1) линия клеток аденокарциномы легкого человека (АНЛ); 2) асцитическая гидкость (АН), полученная сотрудниками онкогинекологии МНИОИ им.П.А.Герцена путем парацентеза больных раком яичников (РЯ)- 47 образцов; 3)ткань рака яичников (операционный материал) первичных (30 образцов) и метастатических (12 образцов) опухолевых узлов - всего 42 образца.

Приготовление суспензии одиночных опухолевых клеток.

1. АКЛ.

Перевивную клеточную линию АКЛ культивировали в среде HPMI-1640 <Serva, Germany) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и добавками по Pike В., Robinson W.(1970); исходная плотность клеток - 1 млн на мл среда. Клетки для исследования получали из культуры, находящейся в логарифмической фазе роста, путем обработки монослоя теплым (37°С) 0,02% .раствором Версена. Далее суспензию дважды отмывали от хелатирувдего агента, осаждая клетки цетрифуги-рованием (1000 об/мин, 6 мин) и разводили, до конечной концентрации 500 ООО кл/мл.

2. Ткань рака яичников.

Дня приготовления суспензии одиночных клеток из ткани рака яичников использовали сочетание механической (измельчение фрагмента ножницами в инкубационной среде на холоду до получения грубой взвеск) и ферментативной дезвграгации (инкубация при 37°С, 5% С02 в смеси ферментов, содержащей 0,02% ДНКазы (Serva, Germany) и 0,1% коллагоназы (Serva, Germany). Путем фильтрования через серию нейлоновых сеток суспензию освобождали от 1фупных фрагментов, после чего фильтрат триады отмывали в инкубационной среде, осаждая клетки центрифугированием (см. выше).

3. Асцитическая жидкость.

Опухолевые клетки из AS выделяли путем центрифугирования (1000 об/мин, 10 мин), предварительно добавив 10 ед/мл гепарина.

Подсчет и оценку доли жизнеспособных опухолевых клеток на всех этапах работы осуществляли в камере Горяева, добавляя к суспензии 0,2» трипанового синего (Plow Lab., UK).

В тех случаях, когда доля опухолевых клеток в суспензии не превышала 50% из-за контаминации суспензии неопухолевыми (фибро-бласты, эритроциты) или мертвыми клетками, проводили.ее очистку от конташниру вдих элементов.

Для удаления фибробластов из клеточной взвеси использовали их. высокую адгезивную способность: клеточную суспензию инкубировали в течение 1 часа (37°С, 5% С03) во флаконах из полистирола. Далее суспензию декантировали. Данный метод позволяет освободить клеточную взвесь от 85 - 95% фибробластов, которые остаются фиксирован-

вши к полистиролу.

Контаминируксцю суспензию опухолевых клеток эритроциты удаляли путем их лизиса в растворе хлористого аммония. (Шд01 0,15 М, КНС03 0,015 М) (Klaus G.G.B., 1990). Применение данной методики позволяло полностью освободиться от эритроцитов во взвеси, но в то же время вызывало гибель части опухолевых клеток, что выражалось в сникении (на 10-15%) доли жизнеспособных опухолевых клеток в очищенной суспензии в сравнении с исходной.

Очистку клеточной суспензшш от мертвых клеток и их фрагментов проводили путем центрифугирования в градиенте плотности эмбриональной телячьей сыворотки (30 сек, 1000 oö/мин), что позволяло повысить долю жизнеспособных опухолевых клеток з суспензии на 30-35$ от исходной.

С помощью описанных выше способов удалось выделить достаточное (для тестирования противоопухолевой активности 6-ти цитостати-ков) количество опухолевых клеток (более 3,0 х 10б клеток на опухолевый образец) из 35-ти образцов ткани рака яичников и из 37-ми выпотов в брюшную полость.

Терапевтически-эквивалентные концентрации хиниопрепаратов для In vitro тестов.

При расчете терапевтически-эквивалентных концентраций (ТЭК) цитостатиков мы, как и ряд других авторов /Sondak V.X. et al., 1988, Ebert A et al., 1989, Wilson К et al., 1991/ исходили из предположения, что уровень противоопухолевых препаратов в среде инкубации клеток должен равняться максимальной их концентрации в крови при внутривенном введении. Такт.» образом, для какдого цито-статика ТЭК расчитывали по формуле:

^сут.

ТЭК --х 2 х 10*,

V

крови

где Доут - суточная доза препарата (в мг/кг веса), Y^^ - объем крови (5000 мл).

В качестве ТЭК использовали следующие: для Пл1 - 6,0 ыкг/мл, Адр - 2,0 мкг/мл. Т-Т - 12,Б мкг/мл, Б-ФУ - 25 мкг/мл, Вин - 0,5 мкг/мл и Бл 5,0 мкг/мл.

Клонирование опухолевых клеток в полужидком агаре. .

Суть клоногенного теста состоит в учете количества и чувствительности к антибластическим воздействиям клеток опухоли с неограниченным пролиферативным потенциалом (клоногенных), способных, делясь в полужидком агаре, за короткое время образовывать мульти-клеточные образования - колонии (Hamburger A.W. et al., 1988).

В настоящей работе клонирование опухолевых клеток яичника осуществляли в условиях 1л vitro - в стеклянных капиллярах (модификация метода All-Osman Р. et ai., 1988). Для атого опухолевые клетки (5,0 х 105 кл/мл) инкубировали с цитостатиками в концентрациях, соответствующих 1/10 ТЭК при 37°С, 5% С02 в течение 1 часа. Далее путем центрифугирования (1000 об/мин, 5 мин) отмывали клетки от антибластических агентов и ресуспецдировали в среде ЫсСоу-5А (Serva, Germany), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 0,32% агара, добавки по Pike В., Robinson W. (1970) из расчета 5,0 х 10s клеток на 100 мкл, после чего помещали в стеклянные капилляры (d=1,5 мм, 1=100 мм, 7=100 мкл), в которых клетки культивировали в течение 14 дней при 37°С в атмосфере воздуха с 5Ж С02.

Оценка химиочувствительности клоногенных клеток рака яичников.

Подсчет числа образовавшихся в капиллярах колоний осуществляли о помощью светового микроскопа МБР (х160), считая колонией мультиклеточное образование, содержащие 50 и более опухолевых клеток. Эффективность колониеобразования (ЭКО) вычислили в процентах как отношение среднего арифметического числа колоний в 4-5-ти идентичны! пробах к общему числу высеянных клеток.

Влияние цитостатиков на ЭКО учитывали только для . случаев, когда в контрольных образцах образовывалось не менее 30 колоний

1 Пл - платидиам, Адр - адриабластин, Т-Т - тио-ТЭФ, Вин

вшкристин, 5-ФУ - 5-фторурацил, Бл - блеомицин.

(на капилляр). При оценка действия цитостатиков вычисляли процент

угнетения ЭКО: эко

оп.

X = 100%--X 100Ж ,

контр.

где X - степень угнетения ЭКО препаратом, ЭКОконтр>- среднее ЭКО в контрольных образцах, ЗК0оп>- среднее ЭКО в опытных образцах. Препарат считали эффективным , если он в концентрации 1/10 ТЭК уменьшал ЭКО опухолевых клеток не менее, чем на 15% от контроля .

Оценка окислительно-восстановительной активности опухолевых клеток (ЫГТ-тест).

Чувствительность опухолевых клеток к различным цитостатикам оценивали по влиянию этих препаратов на окислительно-восстановительный потенциал исследованных клеток с помощью собственной модификации МТТ-теста, предложенного T.Mosmann в 1983 году.

В качестве субстрата в МТТ-тесте использовали соль тетразолия 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолий бромистый (МТТ) производства МГУ им.М.В.Ломоносова.

Суспензию одиночных опухолевых клеток помещали в 96-ти луночные круглодошше планшеты (Linbro, UK) (5,0 х 103 клеток на пробу, объем инкубационной среды 100 шел). Затем к пробам добавляли цито-статики (диапазон концентраций 0,008 - 10 ТЭК) в объеме 100 мкл на лунку; в контрольные лунки вместо цитостатиков вносили по 100 мкл физиологического раствора. Далее плашки с пробами инкубировали в атмосфере воздуха, обогащенного 5% С02, при 37°С в течение 72-х часов. По окончании инкубации из кавдой лунки декантировали по 100 мкл среды и вносили по 25 мкл раствора МТТ (маточный раствор .МТТ -5 мг/мл, конечная концентрация - 1мг/мл). Через 3 часа инкубации (5% С02, 37°С) из каждой лунки удаляли по 50 мкл среды и добавляли по 150 мкл изопропанола, после чего тщательно суспендировали (до полного растворения гранул синтезированного клетками формазана). От осадка, образующегося в результате преципитации белков в изопропанола, освобождались путем центрифугирования плат при 3000 об/мин (10 мин). Далее по 100 мкл супернатанта из кавдой лунки переносили в 96-ти луночше плоскодонные планшеты (Linbro, UK) и немедленно спектрофотометрировали при длине волны 550 нм. В качес-

тве спектрофотомвтрического контроля использовали пробы, содержащие все вышеуказанные ингридаенты, исключая суспензию клеток.

Оценка эффективности цитостатиков в отношении опухолевых Клеток в МТТ-тесте.

При тестировании чувствительности опухолевых клеток к химио-торапэвтическим препаратам в ЫТТ-тесте каждый цитостатик использовали как минимум в трех концентрациях: Адр., Пл., Вин в диапазоне 0,05 -25,0 МКГ/МЛ, Т-Т И Бл - 0,25-25,0 МКГ/МЛ, 5-ФУ - 1,25-125,0 МКГ/МЛ.

При оценке действия цитостатиков вычисляли процент ингиСиро-вания интенсивности окислительно-восстановительных процессов в опухолевых клетках (т.е. степень уменьшения оптической плотности образованного опухолевами клетками формазана) при каждой концентрации цитостатика (в сравнении с контролем) по следующей формуле:

ЭДоп.

у = 100%--X 100% ,

^контр.

где У -степень угнетения окислительно-восстановительной активности опухолевых клеток препаратом, °ДКОНТр.~сР0дае9 значение ОД в трех идентичных контрольных лунках, 0Доп - среднее значение ОД в трех идентичных опытных лунках.

По полученным данным строили кривые "доза-эффект". Препарат считали эффективным в отношении данной опухоли, если он в ТЭК уменьшал (в сравнении с контролем)' накопление формазана опухолевыми клетками не менее, чем на 50%.

Цитологические исследования.

С помощью цитологических исследований контролировали опухолевую природу полученного из клиник материала для исследования и все этапы очистки клеток. Окраску цитологических препаратов производили по методу Паппенгейма (Никитина Н.И. и др., 1975). Консультативную помощь в этом разделе работы оказывали сотрудники отделения онкоцитологии ЫНИОИ им.П.А.Герцена - проф. К.А.Агамова и к.м.н. Е.Н.Славнова.

Статистическая обработка результатов.

Статистическую обработку полученных результатов проводили по экспресс-методу Стрелкова Р.Б., 1986.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка МТТ-теста для оценки химиочувствительности карцином человека.

Отработку МГТ-метода для прогнозирования индивидуальной реакции опухолей человека на химиотерапевтические воздействия осуществляли на перевивной клеточной линии АКЛ и опухолевых клетках из 7-ми образцов рака яичников человека.

На первом этапе работы по спектрам поглощения МТТ и МТТ-формазана определили, что максимум поглощения МТТ в изопрспаноле находится в области 360-390 км, а МТТ-формазана (в том т растворителе) - в области 540-600 нм. Поэтому в дальнейших исследованиях учет количества синтезированного опухолевыми клетками формазана проводили при 550 нм. Далее было установлено, что в диапазоне концентраций МТТ 25-125 мкг/пробу от 1 до 4-х часов инкубации количество синтезированного клетками формазана возрастает линейно и не изменяется при дальнейшем увеличении концентрации субстрата. Линейная зависимость количества образованного формазана от концентрации меток в пробе выявлена в диапазоне 12,5 - 150 тыс. клеток на пробу.

Учитывая полученные результаты, в дальнейшем при постановке дегидрогеназной реакции опухолевые клетки (по 5,0 х 104 клеток на пробу) инкубировали с субстратом (МТТ) в концентрации 125 мкг/пробу в течение 3-х часов, что обеспечивало накопление в клетках формазана в количестве, соответствующем 0,150 - 0,400 относительных единиц ОД.

Увеличение количества синтезированного клетка!.« формазенс с ростом концентрации посаженных клеток получено и при предварительном (до проведения МТТ-реакции) культивировании клеток АКЛ в точение 1-3-х суток (37°С, Ъ% С02). По этим данным были построена кривые нарастания численности популяции АКЛ, анализ которых позволил заключить, что с 1 по 3-й день инкубации количество клеток АКЛ увеличивается, то есть процессы размножения клеток преобладают над процессами табели. Это позволило нам использовать АКЛ в течение

указанного времени в опытах по оценке лекарственной чувствительности клеток.

Нам удалось достигнуть достаточно высокую степень стандартизации ЫТТ-теста: более чем в 87% случаев чувствительность клеток АКЛ 3-х последовательных пассажей к 7-ми различным концентрациям таких цитостатиков, как адриабластин, винкристин и метотрексат совпала.

Еще одним доказательством адекватности МТТ-теста для целей индивидуального прогнозирования мы считаем совпадение в более, чем 94% случаев в реакции 5-ти образцов карцином яичников на действие платидиама, адриабластина, винкристина, тио-ТЭФа и 5-фторурацила в МТТ и клоногенном тесте (Габл 1), прогностическая сила которого в настоящее время считается доказанной.

Таблица 1.

Сравнение химиочувствительности клеток рака яичников в клоногенном и ЫТТ-тестах.

Цитостатики * опухолевого образца 1 2 3-4 5 Количество совпадений 0бщев количество случаев

Адриабластин ПЛатидиам 5-фторурацил Тио-ТЭФ Винкристин +/+ -/- +/+ +/+ -/-/+ +/+ +/+ +/+ -/- -/- -/- -/-+/+ Б/5 3/4 4/4 2/2 1/1

В целом 15/16 ( 93,7 ± 5,9% )

Условные обозначения:

+ - опухолевые клетки чувствительны к действию цитостатика — опухолевые клетки резистентны к действию цитостатика; в числителе - реакция опухолевых клеток на цитостатик в клоногенном тесте;

в знаменателе - реакция опухолевых клеток на цитостатик в МТТ-тесте.

Полученные результаты позволили перейти к следующему этапу работы - изучению закономерностей в реакции клеток рака яичников на цнтостатики.

Анализ химиочувствительности опухолевых клеток рака яичников чоловека к отдельным цитостатикам в МТТ-тасте.

На данном этапе работы мы, во-первых, попытались решить вопрос, в какой мэре сопоставимы данные о химиочувствительности опухоли, полученные при исследовании клеток из асцитической жидкости и ткани рака яичников одних и тех же больных. Для этого для 8-.ми болышх была параллельно оценена реакция клеток из АЖ и ткани РЯ на действие платидиама, адриабластина, 5-фторурацила, тио-ТЭФа и винкристина (Табл. 2). Совпадение в профиле химиочувствительности получено в 90,8±5,ЗЖ всех тестирований, что позволило нам в дальнейшем использовать в качестве источника опухолевых клеток для исследования химиочувствительности как ткань РЯ, так и АЖ.

Таблица 2.

Сравнение реакции на цнтостатики опухолевых клеток, выделенных из асцитической жидкости и ткани рака яичника одних и тех же болышх в МТТ-тесте.

№ Источник Цнтостатики

п/п опухолевых Адриа- Плати- 5-фтор- Тио- Вин-

клеток бластин диам урацил ТЭФ кристин

1. АЖ/ткань РЯ + / + + / + + / - + / +

2. АЖ/ткань РЯ + / - + / + + / +

3. АЖ/ткань РЯ - / - + / +

4. АЖ/ткань РЯ + / - + / + + / + + / +

5. АЖ/ткань РЯ + / + + / + _ / _ - / -

б. АЖ/ткань РЯ + / + + / + - / - - / - + / +

7. АЖ/ткань РЯ + / ■- + / + - / -

8. АЖ/ткань Ш + / !- + / + - / - - / - - / -

% совпадений 75,0^1,6 100 85,7±13,2 100 100

В целом: 90,3 ± 5,3 3 ( п = 31)

Условные обозначения см. табл.1.

Далее с помощью МТТ-теста было проведено 316 тестирований хвмиочувствительности опухолевых образцов, полученных от 45-ти больных раком яичников. В результате были выявлены значительные индивидуальные различия в реакции карцином яичников на ТЭК цито-статиков: от полихимиочувствительности, которую проявили клетки 20,0±5,9% всех опухолевых образцов, до полихимиорезнстентности, выявленной для клеток 11,0*4,7% этих новообразований. Доминировали «е в исследованной выборке опухоли с одновременной чувствительностью не более, чем к 2-м химиотерапевтическим агентам (53,317,4%).

Наиболее эффективными в ЫТТ-тесте оказались: платидиам, адри-абластин и тио-ТЭФ - 88,4±4,9%, 53,3±7,4% и 40,5±8,1% опухолей (соответственно) были чувствительными к действию перечисленных агентов. Более низкая эффективность в отношении клеток овариалышх карцином отмечена для винкристина, 5-фторурацила и блеомицина: 24,2±7,4Ж, 23,8±б,6%, 11,8±7,6% чувствительных опухолей (соответ-ствзнйо). Полученные данные сравнительно хорошо согласуются с результатами других авторов (АПвоп К. е1; а1., 1990) и клиническими наблюдениями (Переводчикова Н.И., 1993) и, таким образом, являются еще одним доказательством адекватности МТТ-теста для индивидуального пронозирования хиыиочувствительностй карцином яичников.

Учитывая тот факт, что для лечения рака яичников в настоящее время используется не ыоно-, а полихимиотерапия и, разделяя мнение ряда исследователей о проблематичности в краткосрочных тестах исследовать чувствительность опухолевых клеток к сочетаниям химио-препаратов (Бопйак У.К. ег а1., 1988), мы попытались разработать принципы индивидуального подбора наиболее удачных сочетаний цито-статиков для адъювантной химиотерапии больных раком яичников, основываясь на данных о чувствительности опухолевых клеток к отдельным препаратам. При составлении схем полихимиотерапии мы исходили из того, что, если сочетание препаратов хорошее, то процент опухо-лой, чувствительных к 3-м или 2-м из 3-х компонентов схемы должен бить сравнительно велик, а процент резистентных опухолей ко всем компонентам схемы"достаточно мал. Проведя соответствующую математическую обработку собственных результатов, мы установили, что среди исследованных пар цитостатиков наиболее высокую эффективность в отношении клеток карцином яичников имеет сочетание Адр -Пл, что полностью соответствует клиническим наблюдениям и доказы-

ваот возможность по данным о чувствительности карцином яичников к отдельным препаратам составлять индивидуальные схемы полихимиотерапии. Среди других комбинаций цитостатиков нами было выделено еще несколько схем, таких как Адр - Пл - Т-Т, Адр - Пл - 5-ФУ, Адр -Пл - Вин и Пл - 5-ФУ - Т-Т, для которых высокой была доля опухолей, чувствительных к 3-м или 2-м из 3-х компонентов ( 54,5 -64,9%) при сравнительно низком проценте полихшиорезистентности (6,1 - 10,ЗЖ). Мы полагаем, что некоторые из этих схем наряду с известными могут оказаться достаточно эффективными при клиническом использовании.

При анализе закономерностей в проявлении клетками рака яичю»-ков резистентности к исследованным цитостатикам, было установлено, что исходная устойчивость клеток к платидиаму является своеобразным индикатором полихшиорезистентности этих клеток. Выявлены также пары цитостатиков ( Т-Т - Вин и 5-ФУ - Вин), для которых при резистентности к одному из препаратов высоким (более 75%) был и процент опухолей, резистентных к другому препарату. Полученные данные позволяют со сравнительно высокой долей вероятности при установлении резистентности к одним химиопрепаратам, прогнозировать резистентность к другим, что важно учитывать при составлении схем полихимиотерапии при невозможности, например, оценить чувствительность ко всему спектру цитостатиков.

Поскольку химиотерапия как системное. воздействие направлена на все очаги опухолевого роста в организме, для правильного использования данных МТТ-теста в клинике мы сочли необходимым сравнить химиочувствительность опухолевых клеток, полученных из разных опухолевых тканей одних и тех же пациенток. Процент совпадений в реакции на цитостатики опухолевых клеток правого и левого яичников оказался сравнительно высоким (87,0+7,0%). Несколько меньаим он был для клеток из первичного опухолевого узла и метастазов в большой сальник (69,6+9,6,%). В целом, эти данные свидетельствуют о преобладании сходных по хкмиочувствительности клеточных популяций в разных центрах опухолевого роста. В то же время обращает на себя внимание тот факт, что в подавляющем большинстве случаев при несовпадении в реакции на цитостатики клеток первичной опухоли и метастаза резистентными оказывались клетки из метастазов (6 из 7-ми случаев)(Табл.3). Этот феномен необходимо учитывать при сопоставлении клинических и лабораторных данных в процессе клинической

апробации МТТ-таста.

Таблица 3.

Сравнение реакции на цитостатики опухолевых клеток, полученных из первичного и метастатического опухолевых узлов,

в ЫТТ-тесте.

# п/п Источник Цитостатики

опухолевых клеток Адриа-бластин Плати-диам 5-фТОр-урацил Тио-ТЭФ Вин-кристин

1. яичник/ большой сальник - / + + / 4 + / + + / +

2. яичник/ большой сальник + / - + / + - / - - / -

3. асцит/ большой сальник + / + + / + - / - - / - - / -

4. яичник/ большой сальник + / + + / + + / - - / - + / -

5. асцит/ большой сальник + / - + / 4 + / - + / - - / -

Условные обозначения см. Табл.1.

Еда одной клинической проблемой является возможность развития в процессе лечения вторичной полихимиорезистентности рака яичников. Поэтому актуальным является решение вопроса о том, возможно ли с помощью МТТ-теста осуществлять контроль реакции клеток РЯ на цитостатики в динамике противоопухолевой терапии. Ш исследовали реакцию опухолевых клеток на химиопрепараты в динамике лечения 7-ми больных III - IV стадией РЯ (34 парных тестирования химио-чувствительности)(Табл.4). В 16-ти из 34-х случаев отмечено развитие химиорезистентности после 2-6-ти курсов химиотерапии, причем неэффективными в отношении данной опухоли становились как использованные в лечении цитостатики (12 из 16-ти случаев), так и препараты, не применявшиеся у этих больных (4 из 16-ти случаев). Последний феномен полностью согласуется с выявленными нами ранее закономерностями в проявлении клетками РЯ перекрестной химиоре-

зистентности. В 3-х из 34-х случаев после проведения 2-х - 5-ти курсов полихимиотерапии бала выявлена чувствительность клеток РЯ к цитостатикам, не оказывавшим существенного влияния на метаболические процессы в них на старте лечения. Мы полагаем, что это может быть обусловлено селекцией и нарастанием в процессе химиотерапии удельного веса первично минорных клонов клеток, обладавдих исходно отличной от доминирующей популяции химиочувствительностью. В целом же полученные данные свидетельствуют о возможности и целесообразности использования МТТ-теста для контроля изменения химиочувстви-тельности карцином яичника в процессе лечения, своевременного выявления вторичной хвмиорезистантности этих карцином и адекватного выбора тактики терапии второй линии.

Таблица 4.

Количественное соотношение разных вариантов изменения реакции опухолевых клеток на действие цнтостатиков в процессе химиотерапавтического лечения.

а п/п Варианты Количество случаев Количество случаев с применением данных препаратов

1. ч р 16 12

2. ч ч 6 4

3. р р 9 1

4. р ч 3 0

Общее количество тестирований химиочувствительности в динамике опухолевого процесса 34

Условные обозначения:

ч - опухолевые клетки чувствительны к действию цитостатика р - опухолевые клетки резистентны к действию цитостатика

Анализ зависимости цитостатического эффекта от дозы препаратов в МТТ-тесте.

Описанные выше исследования выполнены при использовании одной (тэр-эквиваяентной) концентрации каждого цитостатика. В то же время анализ научных публикаций последних лет свидетельствует о том, что не только цитостатики, но и их дозы необходимо подбирать сугубо индивидуально, и в ряде случаев удачной может оказаться как тактика малых, так и больших доз (Dodwell D.J. et al., 1990, Har-strick A. et al., 1992). С помощью МТТ-теста мы попытались найти подтверждение этому на клеточном уровне. С этой целью мы проанализировали влияние нескольких концентраций каждого из 6-ти цитоста-тиков на опухолевые клетки 45-ти образцов РЯ. В каждом случае нами были использованы как дозы, более низкие (0,008-0,1 ТЭК), так и значительно превышапцие ТЭК (5-10 ТЭК). Всего проанализировано 210 кривых "доза - эффект". В результате выделено 4 основных типа изменения антибластического эффекта с увеличением дозы цитостатиков (Рис.1): 1а, 16 - независимость аффекта от дозы, II -линейный рост эффекта с увеличением дозы, III - наличие плато на кривой "доза - эффект", что свидетельствует о наличии в опухоли популяции клеток, резистентной к данному цитостатику и IV - наличие плеча вначале кривой "доза - эффект", которое свидетельствует о доминировании в опухоли популяции клеток, чувствительных лишь к высоким дозам агента.

Рис.1. Объяснение в тексте.

Независимость эффекта от дозы (I тип кривой) обнаружена примерно в 1/3 проведенных тестирований. Причем в подавляющем большинстве случаев (82,1±4,7%) опухоли оказывались резистентными как к низким (0,008 - 0,1 ТЭК), так и к высоким (превышающим ТЭК в 5-10 раз) дозам цитостатиков (1а тип). Мы полагаем, что такой феномен является проявлением истинной - генетически опосредственной химиорезистентности клеток. В остальных же 17,9±4,7 % случаев (16 тип) было выявлено значительное (более, чем на 50% от контроля) ингибирование окислительно-восстановительной активности опухолевых клеток уже при низких дозах цитостатиков, что свидетельствует о высокой степени чувствительности клеток к исследованным антиблас-тическим агентам.

Еще в 1/3 всех тестирований зависимости антибластического эффекта от дозы цитостатиков был выявлен II тип кривых "доза -эффект" - линейное увеличение эффекта с дозой. Причем в подавляющем большинстве случаев (91,б±5,7% тестирований) опухолевые клетки были чувствительными лишь к действию цитостатика в дозах, нре-выаащах ТЭК.

Примерно 1/5 всех кривых "доза - эффект" были III типа. Причем в большинстве случаев (70,4±б,9%) опухолевые клетки оказались чувствительными к действию химиотерапевтических агентов уже в ТЗК. Однако, плато на графиках этого типа свидетельствует о наличии малочувствительной к действию данного агента популяции клеток, которая численно равна величине (в Ж), полученной при экстраполяции точки перегиба на ось ординат.,

Последний тип зависимостей "доза - эффект", для которого характерно наличие плеча в области низких доз цитостатиков (IV тип) был выявлен лишь в 1/10 всех проведенных тестирований. В большинстве этих случаев опухолевые клетки были резистентными к действию химиопрепаратов в ТЭК. В то же время, в 90,0±9,5% случаев при увеличении дозы исследуемого агента до максимально переносимой удавалось достичь выраженного цитотоксического эффекта. То ость, для этих случаев увеличение дозы цитостатика является одним из путей отмены резистентности.

Далее мы проанализировали распределение I-IV типов зависимостей "доза - эффект" для каждого из исследованных химиотерапевтических агентов и выявили, что кривые разных типов встречаются у разных цитостатиков с разной частотой. Так , для наиболее эффок-

тивных в отношении РЯ цитостатиков (Ил, Адр и Т-Т) доминирующим является II тип зависимости "доза - эффект", т.е. линейное увеличение эффекта с дозой, а для менее эффективных агентов (5-ФУ, Вин и Бл) - 1а тип кривой, т.е. низкая химиочувствительность во всем диапазоне доз.

Таким образом, нам удалось выявить как опухоли, чувствительные лишь к высоким дозам цитостатиков, так и опухоли, чувствительные уже к низким концентрациям протестированных агентов, и, кроме того, опухоли, в которых кроме преобладающей популяции клеток, чувствительной к ТЭК цитостатического агента была выявлена минорная химиорезистентная популяция клеток, которую не удается стерилизовать даже при использовании максимально переносимых доз химио-препарата. Селекция и дальнейшая пролиферация именно этой минорной химаорезистентной популяции клеток в процессе химиотерапии может быть ответственной за формирование феномена вторичной множественной лекарственной устойчивости. Тем не менее, учитывая закономерности в проявлении опухолевыми клетками сочетанной химиорезистент-ности к цитостатикам, а также данные, о том, что клетки одной опухоли по чувствительности к одним препаратам делятся на субпопуляции, а по чувствительности к другой - нет, мы полагаем, что более выраженного и длительного эффекта в химиотерапии РЯ можно достигнуть, индивидуализируя адьювантную химиотерапию не только путем выбора наиболее эффективных цитостатиков, но и их рациональных сочетаний и доз.

Таким образом, на основании вышеизложенного можно заключить, что ШТ-метод с биологических позиций является адекватным тестом для индивидуального прогнозирования химиочувствительности карцином яичников человека, и целесообразным является его апробация в клинике онкогинекологии для индивидуального подбора адъювантной химиотерапии, рациональных доз цитостатиков, коррекции схем лечения больных при контроле изменения химиочувствительности в' процессе лечения.

выводы

1 . Шкротетразолиевый тест в разработанной модификации, позволяет выявлять индивидуальные различия в реакции на цитостатшш клеток карцином яичников человека, причем сравнительная эффективность разных хиниотрепаратов го данным МТТ-теста соответствует их сравнительной клинической эффективности.

2. При параллельном тестировании реакции клеток рака яичников на цитостатики с помощью классического клоногенного и МЕТ-тестов совпадения в химиочувствительности установлена в 93,8Ж случаев, что отражает адекватность МТТ-теста для индивидуального прогнозирования химиочувствительности опухолевых клеток.

3. На основании учета частот параллельной чувствительности и резистентности опухолевых клеток к отдельным цитостатиквм разработаны методологические приемы для планирования с помощью МТТ-теста наиболее эффективных схем полихимиотерапии рака яичников.

4. При анализе закономерностей в проявлении опухолевыми клетками резистентности к платидиаму, адриабластину, тио-ТЭФу, 5-фторурацилу и винкристину, установлено, что резистентность к платидиаму является показателем полихикиорезистанотости клеток карцином яичников первичных больных.

5. С помощью МТТ-теста установлено, что после проведения больным 2 - 6-ти курсов адызвантной полихимиотерапии более, чей в половине случаев исходная чувствительность опухолевых клеток к отдельным цитостатикам сменяется их резистентностью, причем в ряде случаев и к препаратам, при лечении не использованным. Это свидетельствует о возможности с помощью МТТ-теста улавливать становление вторичной химиорезистентности и, таким образом, осуществлять контроль за изменением химиочувствительности карцином яичников в динамике противоопухолевого лечения для правильного выбора тактики химиотерапии второй линии.

6. В части случаев (26,1%) с помопц>ю МГТ-теста выявлена более высокая химиорезистенгность опухолевых клеток метастатических узлов в сравнении с клетками первичной опухоли, что может быть причиной невозможности достижения полных ремиссий у больных раком яичников при адыовантной химиотерапии даже с учетом индивидуальной химио-чувствительности.

7. При исследовании кривых "доза цитостатика - эффект" в карциномах яичников обнаружены субпопуляции опухолевых клеток, различающиеся по уровню химиочувствительности. Эти данные свидетельствуют о целесообразности использования ЫТТ-теста для подбора рациональных доз цитостатиков для адъювантной химиотерапии больных с опухолями этой локализации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Использование ЫТТ-теста при определении индивидуальной чувствительности опухолей яичника человека к цитостатикам. - Экспер. онкол., 1993, т.16, N 2, с.72-77.

2. Разработка краткосрочного антиметаболического метода для прогноза индивидуальной чувствительности опухолей яичников человека к химиотерапевтическим воздействиям. - Экспер. онкол., 1993, т.15, N 2, с.77-81 (соавт. В.И.Чиссов, И.К.Свиридова и др.).

3. МТТ-метод в оценке реакции опухолей человека на цитостатики. - Сб. трудов МНИОИ им.П.А.Герцена "Прогнозирование в онкологии", М., 1993, с.29-32 (соавт. И.К.Снирздова, Н.С.Сергеева, В.И.Чиссов).

4. Краткосрочный антиметаболический тест как возможный прогностик реакции опухолевых клеток на цитостатики. - Сб. трудов МНИОИ им.П.А.Герцена "Прогнозирование в онкологии", М., 1993, с.33-35 (соавт. И.К.Свиридова, Н.С.Сергеева, В.И.Чиссов).

5. Разработка микрометода определения индивидуальной чувствительности опухолей к химиотерапии. - Сб.трудов Молодых Ученых МНИОИ им. П.А.Герцена, 1993, с.Ь^'ЧО