Химико-токсикологическое исследование отдельных нитропроизводных анилина

Зайцева, Алина Сергеевна

Автореферат диссертации по медицине на тему Химико-токсикологическое исследование отдельных нитропроизводных анилина

00504534**

ЗАЙЦЕВА АЛИНА СЕРГЕЕВНА

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ

ИССЛЕДОВАНИЕ ОТДЕЛЬНЫХ НИТРОПРОИЗВОДНЫХ АНИЛИНА

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

- 7 и ЮН 2012

Курск-2012

005045344

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор

Шорманов Владимир Камбулатович

Официальные оппоненты:

Будко Елена Вячеславовна - доктор фармацевтических наук, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, заведующий кафедрой общей и биоорганической химии Лазарян Джон Седракович - доктор фармацевтических наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, заведующий кафедрой токсикологической химии

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов»

Защита диссертации состоится » ссг-р^^ 2012 г. в ^"¿^¿часов

на заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (305041, г. Курск, ул. К.Маркса, д. 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КГМУ Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан « А ? » _2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Многие нитропроизводные анилина обладают выраженной биологической активностью и широко применяются в медицине, ветеринарии и растениеводстве. Например, 2,6-динитро-4-(трифторметил)-М,М-дипропиланилин (трифлуралин) является лекарственным средством для лечения лейшманиоза, малярии, болезни Шагасса и системным почвенным гербицидом, применяемым, в частности, на посевах лекарственных растений. Отдельные нитропроизводные анилина (2-нитроанилин; 2-нитро-4-метиланилин) используют как полупродукты в фармацевтическом синтезе и синтезе пестицидов, например, при получении трифлуралина, производстве синтетических красителей, в текстильной, лакокрасочной и других отраслях промышленности.

Нитропроизводные анилина являются токсичными веществами, класс токсичности - 2. ЛД50 2-нитроанилина для белых крыс составляет 1500 мг/кг при пероральном приеме и 800 мг/кг при введении в брюшную полость, для мышей - 1070 -1290 мг/кг, для морских свинок - 2350 мг/кг. ЛД5о трифлуралина для крыс составляет 4600 мг/кг (по другим данным 10000 мг/кг), для белых мышей - 3300 мг/кг, для кроликов, собак, кур - 2000 мг/кг.

Нитропроизводные анилина относятся к метгемоглобинобразующим ядам.

Описаны случаи отравления соединениями данной химической группы, в том числе с летальным исходом.

Отравления могут происходить при непосредственном контакте с веществами в процессе их производства, хранения и применения, при необоснованном завышении доз в процессе лечения, ошибочном приёме, вследствие аварий, в условиях загрязнения объектов окружающей среды отходами химических производств, выбросами в атмосферу и сточными водами предприятий, а также при суицидальных попытках.

Широкое применение отдельных нитропроизводных анилина, их токсические свойства, наличие случаев отравлений с летальным исходом обуславливают необходимость изучения этих соединений в химико-токсикологическом отношении.

До настоящего времени остаются недостаточно разработанными вопросы изолирования этих соединений из биологического материала, их обнаружения, идентификации и количественного определения. В доступной литературе отсутствуют данные по вопросам сохраняемости рассматриваемых веществ в биологическом (трупном) материале.

Исходя из вышеизложенного, разработка методик химико-токсикологического исследования 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина и трифлуралина является актуальной.

Цель и задач и исследования. Целью настоящего исследования является разработка методики химико-токсикологического анализа отдельных нитропроизводных анилина: 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина, 2,6-динитро-4-(трифторметил)^,Ы-дипропиланилина (трифлуралина).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить особенности электронных и колебательных спектров 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина, трифлуралина;

- определить характер хроматографической активности исследуемых веществ в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностями в случае использования жидких подвижных фаз;

исследовать хроматографическое поведение отдельных нитропроизводных анилина в капиллярных колонках при использовании газообразных подвижных фаз с последующим масс-селективным детектиро ванием;

- исследовать особенности изолирования объектов изучения из биологического материала настаиванием с изолирующими агентами различной химической природы, разработать схему очистки извлечений;

- изучить распределение 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина и трифлуралина в органах и биожидкостях теплокровных животных;

определить сроки сохранения рассматриваемых веществ в разлагающемся трупном материале.

Научная новизна. Изучены особенности поглощения 2-нитроанилином, 2-нитро-4-метиланилином, трифлуралином электромагнитного излучения в УФ-, видимой и ИК- областях спектра. Для повышения селективности определения рассматриваемых соединений методом электронной спектрофотометрии рассчитан ряд основных оптических характеристик.

Изучены особенности масс-спектров изучаемых веществ, полученных методом электронного удара. Показана возможность селективного и высокочувствительного определения данных соединений по совокупности характеристических сигналов осколков молекулы в масс-спектре и времени удерживания 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина, трифлуралина в капиллярной колонке при хроматографировании методом ГЖХ.

Исследованы закономерности хроматографической активности 2-нитропроизводных анилина в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностями в условиях применения различных элюентов; определены оптимальные условия и рассчитаны параметры хроматографирования исследуемых веществ методами ТСХ и жидкостной колоночной хроматографии низкого давления.

На основе предварительных исследований разработаны методики идентификации и количественного определения рассматриваемых соединений спектральными и хромата графическими методами.

Выявлены основные параметры и условия очистки биологических объектов, содержащих 2-нитроанилин, 2-нитро-4-метиланилин и трифлуралин от соэкстрактивных веществ методам жидкость-жидкостной экстракции и различными видами хроматографии.

Впервые для изолирования отдельных нитропроизводных анилина из биологического материала в качестве изолирующего агента предложен ацетон. На основе использования ацетона как изолирующего агента и очистки методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии в тонких слоях и колонках сорбентов разработаны оригинальные методики определения рассматриваемых соединений в ткани трупных органов и биожидкостях, приемлемые как для исследования свежего, так и гнилостно-измененного трупного материала.

В эксперименте на животных (крысы) исследованы особенности распределения 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина и трифлуралина в организме теплокровных.

Изучена сохраняемость рассматриваемых отравляющих агентов в зависимости от температурного режима и продолжительности сохранения в гнилостно-разлагающемся трупном материале.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований предложено 2 варианта общей схемы исследования биоматериала при отравлении 2-нитроанилином, 2-нитро-4-метиланилином и трифлуралином.

Внедрение результатов работы:

методика идентификации трифлуралина методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного национального исследовательского университета с 13 декабря 2010 года);

методика очистки трифлуралина методами жидкость-жидкостной экстракции и нормальнофазовой колоночной хроматографии (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного национального исследовательского университета с 13 декабря 2010 года);

методика изолирования трифлуралина из ткани печени и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 08 ноября 2010 года);

методика изолирования трифлуралина из крови и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 08 ноября 2010 года);

методика идентификации 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры общей и биоорганической химии Курского государственного медицинского университета с 04 октября 2010 года);

методика очистки 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина методами жидкость-жидкостной экстракции и обращеннофазовой колоночной хроматографии (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры общей и биоорганической химии Курского государственного медицинского университета с 04 октября 2010 года);

методика изолирования 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина из ткани печени и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры фармацевтической химии и клинической фармации Воронежской государственной медицинской академии с 18 октября 2010 года):

методика изолирования 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метилаиилина из крови и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры фармацевтической химии и клинической фармации ВГМА с 18 октября 2010 года);

методика изолирования 2,6-динитро-4-(трифторметил)-М,М-

дипропиланилина из мочи и определения методами ТСХ и ВЭЖХ при судебно-химическом исследовании биологического материала (апробирована в экспертно-криминалистическом центре УМВД России по Орловской области, акт апробации от 14 февраля 2011 года).

методика изолирования 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина из мочи и определения методами ТСХ и ВЭЖХ при судебно-химическом исследовании биологического материала (апробирована в экспертно-криминалистическом центре УМВД по Орловской области, акт апробации от 14 февраля 2011 года).

Основные положения, выносимые на защиту:

- особенности поглощения анализируемыми веществами электромагнитного излучения в УФ-, видимой и ИК- областях спектра;

- результаты исследования хроматографического поведения отдельных 2-нитропроизводных анилина в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностями;

- методики идентификации и количественного определения рассматриваемых веществ методами хроматографии, фотометрии и хромато-масс-спектрометрии;

- результаты исследования особенностей очистки 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина, трифлуралина методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии;

- методики изолирования объектов исследования из тканей органов и биожидкостей на основе настаивания с ацетоном и очистки от соэкстрактивных веществ биоматериала;

- особенности распределения 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина, трифлуралина в организме теплокровных животных;

- сохраняемость 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина, трифлуралина в трупном материале.

Апробация работы. Основные положения работы представлены и доложены на II Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология. Биомедицинская инженерия и технология современных социальных практик» (Курск, 2009 г.), на III Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология и биомедицинская инженерия, посвященной 75-летию Курского государственного медицинского университета» (Курск, 2010 г.), на международной научно-практической конференции «Фитодизайн в современных условиях» (Белгород, 2010 г.), на IV Международной конференции «Экстракция органических соединений» (Воронеж, 2010 г.), на областной научно-практической конференции «Белгородская область: прошлое, настоящее и будущее» (Белгород, 2011 г.)

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ кафедры фармацевтической,

токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета и соответствует проблеме «Фармация» межведомственного научного совета № 36 РАМН и научной проблеме 35.04 «Научные проблемы судебно-медицинской токсикологии, токсикологической и судебной химии» по специальности «Судебная медицина» при РАМН. Номер государственной регистрации 01.2.00960873.

Личный вклад. Автором составлен план и разработана структура исследований, проведён анализ источников литературы по теме диссертации, выполнены экспериментальные исследования, проанализированы совместно с руководителем полученные результаты, проведены статистическая обработка и анализ данных, сделаны выводы и обобщения. В работах, выполненных в соавторстве, использованы результаты исследования с долей участия автора 7595 %.

Публикации. Основное содержание работы отражено в 20 публикациях, 5 из которых в журналах, рекомендуемых ВАК для опубликования материалов диссертационных исследований.

Объём и структура диссертации. Диссертация включает введение, обзор литературы, пять глав, содержащих результаты экспериментальных исследований, общую схему исследования, общие выводы, список цитируемых литературных источников и приложение. Работа изложена на 173 страницах, содержит 32 рисунка и 59 таблиц. Список литературы состоит из 240 источников, 110 из которых на русском и 130 - на иностранных языках.

В первой главе (обзор литературы) излагается известная информация о 2-нитроанилине, 2-нитро-4-метиланилине, трифлуралине (2,6-динитро-4-(трифторметил)-1\1,1\|-ди11ро11илапилине) как объектах химического и химико-токсикологического исследования.

В главах со второй по шестую (включительно) приводятся результаты собственных экспериментальных исследований.

Во второй главе рассмотрены особенности идентификации рассматриваемых соединений методами фотометрии, хромато-масс-спектрометрии, хроматографии. Третья глава включает результаты исследований по количественному определению 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина, трифлуралина. В четвертой главе рассматриваются вопросы выделения и очистки анализируемых веществ с применением жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии. Пятая глава посвящена изучению особенностей изолирования 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина, трифлуралина из биологического материала и определения рассматриваемых соединений в получаемых извлечениях. В шестой главе приводятся результаты изучения распределения изучаемых 2-нитропроизводных анилина в организме теплокровных и их сохраняемости в трупном материале.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе был использован 2-нитроанилин (фирма «Across Organic», содержание основного вещества 99,8%), 2-нитро-4-метиланилин (ОАО «Заволжский химический завод им. М.В. Фрунзе», содержание основного вещества 99,3%), трифлуралин ((2,6-динитро-4-(трифторметил)-Ы,М-дипропиланилии) ФГУП «ВНИИХСЗР», НПК «БЛОК-1» ГСО 7722-99,

содержание основного вещества не менее 99,2 %).

Применены методы тех, жидкостной колоночной хроматографии низкого давления, ВЭЖХ, электронной и ИК- спектрофотометрии, хромато-масс-спектрометрии. Методики определения разработаны на модельных смесях с известным содержанием определяемого вещества. Обработка результатов проводилась в соответствии с установленными требованиями с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Excel».

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Исследована хроматографическая подвижность рассматриваемых веществ в тонких слоях и колонках нормальнофазовых и обращённофазовых сорбентов.

По результатам хроматографирования анализируемых соединений методом ТСХ рассчитаны значения абсолютной (Rf) и относительной (Rs) (по отношению к Rf анилина - «базовая» структура) подвижности (табл. 1).

Таблица 1 - Параметры хроматографирования 2-ннтроанилина (2-НА), 2-нитро-4-метила нилина (2-Н-4-МА) и трифлуралина (ТФ) в присутствии внутреннего стандарта анилина (Ан) в тонких слоях

Системы растворителей Ан 2-Н-4-МА 2-НА ТФ

Rf Rf 1 Rsa„ Rf 1 Rsa» Rf 1 Rsah

Нормальнофазовый вариант (пластины «Сорбфил»)

Гексан-ацетон (7:3) 0,76 0,73 0,96 0,69 0,72 0,91 1,19

Гексан-диэтиловый эфир (5:5) 0,55 0,60 1,10 0,59 1,08 0,89 1,62

Хлороформ-тетрахлорметан (2:8) 0,39 0,53 1,35 0,55 1,38 0,87 2,21

Гексан-хлороформ (2:8) 0,43 0,58 1,35 0,56 1,29 0,90 2,08

Пропанол-2-гексац (8:2) 0,15 0,22 1,45 0,23 1,50 0,74 4,79

Гексан-толуол (5:5) 0,14 0,15 1,10 0,16 1,20 0,66 4,85

Обрашеннофазовый вариант (пластины «Сорбфил», обработанные вазелиновым маслом)

Вода-ацетонитрил (5:5) 0,78 0,61 0,79 0,68 0,87 0,18 0,23

Буферный раствор с рН2-диоксаи-1,4 (2:8) 0,73 0,59 0,80 0,67 0,92 0,75 1,03

Вода-метанол (5:5) 0,91 0,46 0,49 0,61 0,67 0,02 0,02

Вода-ацетон (2:8) 0,90 0,91 1,01 0,93 1,03 0,44 0,49

Вода-этанол (2:8) 0,90 0,90 1,00 0,90 1,00 0,40 0,44

Вода-диоксан-1,4 (2:8) 0,87 0,88 1,01 0,87 1,00 0,73 0,84

Как свидетельствуют данные табл. 1, наиболее оптимальные условия хроматографирования 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина в тонких слоях сорбента с гидроксилированной поверхностью (силикагель СТХ-1ВЭ с размером частиц 8-10 мкм на пластинах «Сорбфил» с люминесцентным индикатором) достигаются при использовании элюентов гексан-ацетон (7:3), гексан-диэтиловый эфир (5:5); при хроматографирования трифлуралина -пропанол-2-гексан (8:2), гексан-толуол (5:5). При этом хроматографическая подвижность анализируемых соединений изменяется в ряду: анилин < 2-нитроанилин < 2-нитро-4-метиланидин < трифлуралин.

При хроматографировании методом жидкостной колоночной хроматографии низкого давления с учетом найденных объёмов удерживания (Уи) исследуемых веществ, объёма удерживания неудерживаемого вещества (У0) и скорости элюирования (у) для каждого анализируемого соединения

рассчитаны значения времени удерживания ширины гшка у основания (<а), коэффициента ёмкости (к'), числа теоретических тарелок (¡4) (табл. 2).

Таблица 2 - Параметры хроматографнрования отдельных нитропронзводных анилина в макроколонке енликагеля Ь 40/100 мкм_

Элюемт V., V, о, V*. к' N

мл мл/мин мин мл мин

2-нитроанилин

Гексан - ацетон (9:1) 4,8 0,27 88,89 29,5 5,15 109,26 24

Гексан - ацетон (8,5:1,5) 4,5 0,24 52,08 27,1 5,02 112,92 75

Гексан - ацетон (8:2) 4,6 0,23 24.78 13,5 1,93 58,70 90

Ацетон 4,1 0,20 10,00 5,7 0,39 28,5 130

2-нитро-4-метиланилин

Гексан - ацетон (9:1) 4,8 0.27 118,52 46,2 8,63 171,11 33

Гексан - ацетон (8,5:1,5) 4,5 0,24 40,83 23,3 4,18 97,08 90

Гексан - ацетон (8:2) 4,6 0,23 43,04 14,8 2,22 64,35 36

Ацетон 4,1 0,20 11,00 6,2 0,51 31,00 127

Трифлур алии

Гексан 4,2 0,19 321,05 107,4 24,57 565,26 50

Гексан - ацетон (9,5:0,5) 4,0 0,26 29,61 27,6 5,9 106,15 206

Гексан - ацетон (9:1) 4,8 0,27 17,78 18,7 2,90 69,26 243

Гексан - ацетон (8,5:1,5) 4,5 0,24 18,75 14,2 2,16 59,17 159

Гексан - ацетон (8:2) 4,6 0,23 8,70 8,7 0,89 37,83 303

Ацетон 4,1 0,20 9,0 5,3 0,29 26,5 139

Как свидетельствуют полученные результаты, оптимальной для хроматографирования 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина методом нормальнофазовой колоночной хроматографии является система гексан-ацетон (8,5:1,5), для хроматографирования трифлуралина - гексан-ацетон (9,5:0,5).

Система растворителей гексан-диоксан-1,4-пропанол-2 (40:5:1) явилась наиболее приемлемой для определения объектов исследования методом нормальнофазовой ВЭЖХ (колонки размерами 64><2 мм типа КАХ-1, заполненных сорбентом «Силасорб-600») и позволяет надежно разделить и идентифицировать рассматриваемые вещества (табл. 3).

Таблица 3 - Параметры хроматографирования отдельных нитропронзводных анилина методом нормальнофазовой ВЭЖХ (подвижная фаза- гексан-дноксан-пропанол-2(40:5:1))___

Хро.матографируемые вещества 1ц I к' N К,

Трифлуралин 2,07 207 0,23 801 9,25

2-нитро-4-метиланилин 5,27 527 2,14 2791 2,96

2-нитроанилин 6,51 651 2,88 3520

При хроматографировании 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина методом обращеннофазовой ТСХ на пластинах «Сорбфил» с люминесцентным индикатором, обработанных вазелиновым маслом (модель привитой фазы С]4 -

С)5), наиболее оптимальной подвижной фазой явилась система растворителей вода-ацетонитрил (5:5), при хроматографировании трифлуралина - система вода-ацетон (2:8) (табл. I). В данных условиях характер хроматографической подвижности рассматриваемых соединений прямо противоположен характеру

таковой в тонком слое гидроксилированного сорбента и изменяется в ряду: трифлуралин < 2-нитро-4-метиланилин < 2-нитроанилин < анилин.

Как свидетельствуют данные табл. 4, оптимальными для хроматографирования в макроколоике обращеннофазового сорбента явились подвижные фазы ацетонитрил-вода (5:5) (определение 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина) и ацетонитрил-вода (8:2) (определение трифлуралина).

Таблица 4 - Параметры хроматографирования отдельных нитропроизводных анилина в макроколонке силасорба Ci8 30 мкм _

Элюент v„, мл V, мл/мин Ф, мин Vr„ мл к' tR, мин N

2-нитроанилин

Ацетонитрил-вода (5:5) 4,6 0,30 16,80 22,0 3,78 73,33 304,86

Ацетонитрил-вода (6:4) 4,5 0,40 9,68 15,71 2,48 39.28 263,66

Ацетонитрил-вода (7:3) 4,3 0,55 6,58 14,6 2,40 26,55 259,85

Ацетонитрил 4,2 1,00 1,80 9,15 1,20 9,15 413,44

2-нитро-4-метиланилин

Ацетонитрил-вода (5:5) 1 4,6 0,30 23,50 24,60 4,35 82,00 194,81

Ацетонитрил-вода (6:4) 1 4,5 0,40 10,93 13,61 2,02 34,03 155,19

Ацетонитрил-вода (7:3) 4,3 0,55 5,38 11,63 1,70 21,15 247,00

Ацетонитрил 4,2 1,00 2,28 9,90 1,36 9,80 295,60

Трифлуралин

Ацетонитрил-вода (5:5) 4,6 0,30 220,00 421,40 90,61 1404,67 651,27

Ацетонитрил-вода (8:2) 4,2 0,70 5,63 26,45 5,30 37,79 720,39

Ацетонитрил-вода (9:1) 4,2 0,90 3,20 14,6 2,48 16,22 411,28

Ацетонитрил 4,2 1,00 2,26 10,85 1,61 10,85 368,64

При хроматографировании в колонках размерами 80><2 мм с сорбентом «Separen SGX RPS», зернистостью 5 мкм, на приборе «Милихром-5», снабженным УФ-детектором (метод обращеннофазовой ВЭЖХ), рассчитаны: время удерживания (tR), коэффициент емкости (к'), относительный коэффициент емкости (к'от„.) (по отношению к анилину), число теоретических тарелок (N), изменение свободной энергии при адсорбции (A(AG)), разрешение (Rs) и степень разделения (¡вэжх)-

Исходя из полученных данных, оптимальной подвижной фазой при хроматографировании 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина явилась система растворителей ацетонитрил - вода (3:7), для хроматографирования трифлуралина - ацетонитрил-вода (8:2) (табл. 5).

Результаты изучения особенностей хроматографической подвижности рассматриваемых соединений указывают на возможность их идентификации методами ТСХ и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Открываемый минимум 2-нитроанилина методом нормальнофазовой ВЭЖХ составляет 0,01 мкг в хроматографируемой пробе, 2-нитро-4-метил-анилина и трифлуралина - 0,02 мкг. Методом обращеннофазовой ВЭЖХ открываемый минимум 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина составляет 0,01 мкг в хроматографируемой пробе, трифлуралина - 0,02 мкг.

Таблица 5 - Параметры хроматографнрования рассматриваемых отдельных нитропроизводных анилина методом обращеннофазовой ВЭЖХ

Хроматографируемые ^ оти. N Д(ДС) К,

вещества 'ВЭЖХ

Подвижная ф аза ацетошприл -вода (3:7)

Анилин 4,55 1,93 1 694 0

3,89 3,86

2-нитроанилин 7,36 3,75 1,94 1501 -1614

5,26 5,22

2-нитро-4-метиланилин 13,30 7,58 3,93 1258 -3334

Подвижная фаза ацетонитрил-вода (8:2)

Анилин 2,10 0,35 1 293 0

2,62 2,64

Трифлуралин 3,51 1,26 3,60 566 -3120

Разработаны методики количественного определения 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина и трифлуралина методом нормально- и обращеннофазовой ВЭЖХ. Результаты представлены в табл. 6.

Таблица б - Результаты количественного определения отдельных нитропроизводных анилина хроматографическими и спектральными методами (п=6; Р=0,95)____

Анализируемое вещество Найдено,%

X в Дх є

Нормальнофазовая ВЭЖХ (колонка 64x2 мм с сорбентом «Силасорб 600»)

2-нитроанилин 100,13 1,33 0,54 1,39 1,39

2-нитро-4-метил анилин 98,98 1,39 0,57 1,46 1,48

Трифлуралин 99,10 1,28 0,52 1,34 1,35

Обращённофазовая ВЭЖХ (колонка 80*2 мм с сорбеїггом «Берагоп БвХ ЯРБ»)

2-нитроанилин 99,95 1,10 0,45 1,16 1,16

2-нитро-4-метиланилин 99,87 1,31 0,53 1,37 1,37

Трифлуралин 99,89 1,15 0,47 1,21 1,21

Спектрофотометрия по поглощению в среде ДМФА

2-нитроанилин 99,44 0,80 0,33 0,85 0,86

2-нитро-4-метил анилин 99,94 0,72 0,29 0,76 0,76

Трифлуралин 99,70 ! 0,70 0,29 0,75 0,75

Как свидетельствуют полученные данные, методики отличаются достаточно высокой воспроизводимостью и правильностью. Относительная ошибка среднего результата составляет не более 1,48 % (п=6; Р=0,95).

Изучены особенности электронных спектров рассматриваемых соединений в различных растворяющих средах: этаноле, ацетонитриле, гексане, диметилформамиде (ДМФА), диоксане, этилацетате, хлороформе, толуоле, диэтиловом эфире (для всех трех изучаемых веществ), воде, 0,1 н. растворе соляной кислоты и гидроксида натрия (для 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина). Рассчитаны оптические характеристики электронных спектров.

В ИК-спектрах исследуемых веществ присутствуют достаточно информативные полосы колебаний различных участков молекул рассматриваемых соединений.

Показана возможность идентификации 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина и трифлуралина по электронным и ИК-спектрам.

Разработаны методики количественного фотометрического определения рассматриваемых нитропроизводных анилина на основе поглощения УФ- и видимого излучения в среде ДМФА (табл. 6). Как свидетельствуют данные табл. 6 относительная ошибка среднего результата не превышает ±0,86%. Определение методом хромато-масс-спектрометрии (ГХ MC) осуществляли в капиллярной колонке диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой HP-5/MS.

В масс-спектре 2-нитроанилина присутствуют сигналы характерных осколков 41, 65, 92, 138 m/Z, наиболее интенсивным из которых является осколок 138 m/Z. В масс-спектре 2-нитро-4-метиланилина обнаруживаются сигналы осколков 52, 77, 106, 133, 152 и 179 m/Z, наиболее интенсивен осколок 152 m/Z, трифлуралина - 43, 248, 264, 290, 306 и 335 m/Z, наиболее интенсивны осколки 264 и 306 m/Z.

В целом сочетание сигналов характерных осколков масс-спектра и времени удерживания обеспечивает достаточно высокую селективность идентификации рассматриваемых соединений методом ГХ MC.

Для очистки исследуемых веществ рассмотрена возможность применения методов жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии.

В частности, исследованы особенности экстрагирования анализируемых соединений из водных (2-нитроанилии и 2-нитро-4-метиланилин) и водно-ацетонитрильных (все три изучаемых соединения) растворов гидрофобными (гексан, толуол, хлороформ, этилацетат, диэтиловый эфир) и гидрофильными (ацетонитрил, пропанол-1, пропанол-2, диоксан-1,4) органическими растворителями в зависимости от природы экстрагента, pH среды, насыщения экстрагентов водой и электролитами, а также соотношения объёмов воды и ацетонитрила для экстракции из водно-ацетонитрильных растворов. Установлено отсутствие заметного влияния реакции среды в интервале pH 1-12 на степень извлечения 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина, трифлуралина рассмотренными экстрагентами. Показано, что оптимальные условия экстрагирования исследуемых нитроанилинов могут быть достигнуты в диапазоне pH 1-12 при использовании в качестве экстрагента этилацетата. насыщенного водой.

По результатам изучения хроматографической активности рассматриваемых нитропроизводных анилина предложены способы их очистки от соэкстрактивных веществ биоматериала в колонках силикагеля L 40/100 мкм и силасорба С-18 30 мкм, на пластинах «Сорбфил» с люминесцентным индикатором и на этих же пластинах, обработанных вазелиновым маслом (модель привитой фазы CH-Ci5). Потери анализируемого вещества при моделировании очистки хроматографическими методами не превысили 1 %. В случае моделирования очистки вещества сочетанием жидкость-жидкостной экстракции и колоночной хроматографии потери составляли не более 2,7%.

В опытах с контрольными образцами биоматериала показана достаточная эффективность очистки извлечений хроматографическими методами и сочетанием методов жидкость-жидкостной экстракции и жидкостной колоночной хроматографии низкого давления.

Проведено сравнительное изучение изолирования 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина, трифлуралина из биоматериала изолирующими

агентами различной природы. Полученные результаты представлены на рис. 1.

Как свидетельствуют полученные данные, наиболее высокий процент извлечения рассматриваемых соединений достигается ацетоном.

Рис. 1 - Значения степени изолирования 2-нитроанилина (2-НА), 2-нитро-4-метиланилина (2-Н-4-МА) и трифлуралина (ТФ) из биологического материала различными изолирующими агентами

Исследование зависимости степени извлечения 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина, трифлуралина ацетоном от объема изолирующего агента и кратности изолирования показали, что для достижения достаточно полного извлечения анализируемых веществ из биологического материала необходимо, по крайней мере, двукратное настаивание при условии, что количество изолирующей жидкости (по массе) в каждом случае должно превышать количество биологического материала как минимум в два раза. Максимальные значения степени извлечения данных веществ из ткани трупной печени достигаются уже при настаивании в течение 30 минут.

Установлено, что увеличение содержания рассматриваемых 2-нитроанилинов в модельных смесях в достаточно широком интервале концентраций (2,5-50,0 мг) при постоянной массе навески ткани трупной печени (25 г) сопровождается изменением степени извлечения, не превышающим 2,4 %.

На основе предварительных исследований разработаны методики определения рассматриваемых соединений в ткани трупных органов, крови и моче на основе изолирования ацетоном и последующей очистки методами колоночной хроматографии, тонкослойной хроматографии и сочетанием жидкость-жидкостной экстракции и колоночной хроматографии.

Результаты определения представлены в табл. 7.

Таблица 7 Результаты количественного определения изучаемых

веществ в биоматериале методом ВЭЖХ после изолирования ацетоном и очистки различными методами ( п=5; Р=0,95)____

Анализируемые Содержание, Найдено, %

соединения мг в 25 г Ткань печени Кровь Моча

биоматериала д: Дх X Дх X Ах

1 2 3 4 5 6 7 8

Метод колоночной хроматоі-рафии с силикагелем Ь 40/100 мкм

2-нитроанилин 12,5 84,43 3,06 88,05 2,92 94,29 2,20

5,0 83,85 3,64 87,52 3,31 94,08 2,47

2,5 82,07 4,81 86,59 4,67 93,87 3,31

2-нитро- 12,5 82,59 2,89 85,31 2,95 90,70 1,67

4-метиланилин 5,0 82,31 3,39 85,09 3,36 90,47 1,78

2,5 81,44 4,84 84,30 4,78 90,43 3,28

Трифлуралин 12,5 85,87 3,03 88,19 3,09 93,00 1,78

5,0 85,12 3,42 87,78 3,28 92,54 2,25

2,5 84,79 5,17 87,23 4,39 92,17 2,86

Метод колоночной хроматографии с «Силасорбом С-18» 30 мкм

2-ннтроанилии 12,5 82,86 2,92 86,62 2,64 93,11 2,28

5,0 82,16 3,48 85,34 3,14 92,78 2,61

2,5 80,22 4,59 84,93 4,95 92,19 3,45

2-нитро- 12,5 82,47 2,81 83,80 2,70 89,34 1,58

4-метил анилин 5,0 80,89 3,34 83,19 3,11 89,17 1,89

2,5 79,68 4,92 82,87 5,14 88,66 3,25

Трифлуралин 12,5 85,02 3,06 87,65 2,84 91,43 1,64

5,0 84,81 3,59 86,82 3,42 91,15 2,22

2,5 84,22 4,81 86,13 4,78 90,42 3,03

Метод ТСХ на пластинах «Со) эбфил» с УФ-индикатором

2-нитроанилин 12,5 84,43 2,86 88,05 2,84 94,35 2,03

5,0 83,85 3,45 87,52 3,50 94,08 2,25

2,5 82,07 5,17 86,67 4,95 93,87 3,36

2-нитро- 12,5 83,59 3,17 85,31 3,03 90,65 1,95

4-метиланилин 5,0 82,31 3,56 85,09 3,36 90,37 2,22

2,5 81,54 5,25 84,30 3,98 90,23 3,28

Трифлуралин 12,5 88,75 3,00 92,43 3,06 96,20 2,28

5,0 88,32 3,42 91,68 3,28 95,54 2,64

2,5 87,79 5,28 91,19 4,14 94,83 3,36

Метод ТСХ на пластинах «Сорбфил» с УФ-индикатором, обработанных вазелиновым

маслом

2-нитроанилин 12,5 84,75 2,89 88,35 2,70 94,77 1,89

5,0 83,66 3,53 87,48 3,48 94,17 2,33

2,5 82,23 4,89 86,34 5,00 93,60 3,53

2-нитро- 12,5 82,44 3,00 85,56 3,06 90,83 1,83

4-метиланилин 5,0 82,75 3,48 85,39 3,50 90,15 2,39

2,5 81,32 5,12 84,70 4,20 90,11 3,20

Трифлуралин 12,5 88,81 2,89 92,02 2,81 96,86 2,06

5,0 87,52 3,53 91,34 3,17 95,68 2,95

2,5 86,82 5,14 90,74 4,73 95,21 3,45

1 | 2 |3|4|5|6|7|8

Сочетание жидкость-жидкостной экстрак хроматог] ции и нормальнофазовой колоночной эафии

2-нитроашшин 12,5 5,0 2,5 77,54 76,73 76,11 3,48 4,31 5,78 79,53 78,88 78,16 3,17 3,89 4,95 85,98 84,92 84,40 2,14 2,95 3,70

2-нитро-4-метиланилин 12,5 5,0 2,5 74,19 73,58 72,81 3,28 4,17 5,39 76,68 75,94 75,30 3,14 3,98 5,14 83,27 82,77 82,04 1,92 2,84 3,61

Трифлуралин 12,5 5,0 2,5 81,24 80,44 79,96 3,11 3,59 4,70 83,63 82,88 82,19 2,97 3,81 4,84 88,70 88,14 87,32 1,64 2,75 3,53

Сочетание жидкость-жидкостной экстрак хроматог] ции и обращённофазовой колоночной эафии

2-нитроанилин 12,5 5,0 2,5 77,32 76,48 75,23 3,50 4,09 5,06 79,73 78,42 77,84 3,20 3,86 4,70 85,30 84,86 83,96 2,00 2,72 3,56

2-нитро-4-метиланилин 12,5 5,0 2,5 74,47 73,43 72,78 3,70 4,34 5-, 17 76,51 75,58 74,89 2,89 3,39 5,03 83,04 82,48 81,31 1,86 2,61 3.67

Трифлуралин 12,5 5,0 2,5 81,53 80,42 79,90 2,97 3,67 4,73 83,71 83,48 82,82 2,92 3,78 4,75 89,10 88,54 87,23 1,61 2,81 3,48

Результаты определения низких концентраций рассматриваемых соединений в биологических объектах приведены в табл. 8.

Таблица 8 - Результаты определения малых концентраций изучаемых веществ в биоматериале после изолирования ацетоном и очистки экстракцией и обращённофазовой колоночной хроматографией

Анализируемый Экологический объект Внесено вещества, мг в 25 г биоматернала Найдено, %

Спектрофотометрня Нормальнофазовая вэжх

* 5 , Дх X в Лх

1 2 3 4 5 ! 6 7 8 9 10

2-нитроанилин

Трупная печень 1,25 75,44 3,93 1,76 4,89 75,27 3,88 1,74 4,84

0,5 75,09 5,37 2,40 6,67 74,85 4,73 2,12 5,89

0,2 74,78 6,70 3,00 8,34 74,36 5,56 2,49 6,92

0,1 74,46 7,32 3,27 9,09 73.73 6,59 2,95 8,20

0,05 73,84 7,88 3,52 9,79 73,42 7,42 3,32 9,23

Кровь 1,25 77,94 3,85 1,72 4,78 77,79 3,37 1,51 4,20

0,5 77,38 4,47 2,00 5,56 77,34 4,28 1,91 5,31

0,2 76,71 5,22 2,33 6,48 76,60 5,08 2,27 6,31

0,1 76,24 5,89 2,63 7,31 76,17 5,61 2,51 6,98

0,05 75,55 6,53 2,92 8,12 75,79 6,20 2,77 7,70

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10

Моча 1,25 84,14 2,78 1,24 "1,58 3,45 83,90 2,53 1,13 3,14

0,5 83,43 3,54 4,39 83,49 3.23 1,44 4,00

0,2 82,97 4,16 1,86 5,17 82,83 3,98 1,78 4,95

0,1 82,32 4,88 2,18 6,06 82,27 4,64 2,08 5,78

0,05 81,74 5,34 2,39 6,64 81,59 4,88 2,18 6,06

2-нитро-4-метиланилин

Трупная печень 1,25 71,68 3,86 1,73 4,81 71,31 3,95 1,77 4,92

0,5 71,13 4,78 2,14 5,95 70,99 ^4,49 2,01 5,59

0,2 70,47 5,32 2,38 6,62 70,54 5,16 2,31 6,42

од 69,78 6,75 3,02 8,40 69.83 6,25 2,80 7,78

0,05 69,36 8,38 3,75 10,43 69,32 7,39 3,30 9,17

Кровь 1,25 75,00 3,70 1,65 4,59 75,11 3,54 1,58 4,39

0,5 74,52 4,42 1,98 5,50 74,68 4,36 1,95 5,42

0,2 73,82 4,95 2,21 6,14 74,04 5,20 2,36 6,56

0,1 73,36 5,69 2,54 7,06 73,61 5,92 2,65 7,37

0,05 72,77 6,37 2,85 7,92 73,14 6,22 2,78 7,73

Моча 1,25 81,47 2,82 1,26 3,50 81,17 2,64 1.18 3,28

0,5 80,89 3,46 1,55 4,31 80,64 3,28 1,47 4,09

0,2 80,46 4,20 1,88 5,23 80,21 3,93 1,76 4,89

0,1 79,96 4,75 2,12 5,89 79,78 4,35 1,95 5,42

0,05 79,38 5,11 2,29 6,37 79,24 4,81 2,15 5,98

Трис ілуралин

Трупная печень 1,25 80,69 4,17 1,86 5,17 80,80 3,76 1,68 4,67

0,5 80,26 4,90 2,19 6,09 80,32 4,69 2,10 5,84

0,2 79,67 5,75 2,57 7,14 79,53 5,66 2,53 7,03

0,05 79,11 6,62 2,96 8,23 79,14 6,31 2,82 7,84

0,025 78,74 7,53 3,37 9,37 78,76 7,48 3,35 9,31

Кровь 1,25 82,97 3,74 1,67 4,64 82,74 3,56 1,59 4,42

0,5 82,43 4,29 1,92 5,34 82,32 4,18 1,87 5,20

0,2 81,99 5,24 2,34 6,51 81,80 4,85 2,17 6,03

0,05 81,58 5,82 2,60 7,23 81,67 5,47 2,45 6,81

0,025 81,22 6,20 2,77 7,70 81,06 6,11 2,73 7,59

Моча 1,25 88,71 2,71 1,21 3,36 88,58 2,64 1,18 3,28

0,5 88,12 3,54 1,58 4,39 88,00 3,26 1,46 4,06

0,2 87,38 3,90 1,74 4,84 87,47 3,89 1,74 4,84

0,05 86,94 4,58 2,05 5,70 86,83 4,06 1,82 5,06

0,025 86,41 5,04 2,25 6,26 86,30 4,97 2,22 6,17

Как свидетельствуют полученные данные, разработанные методики характеризуются достаточными воспроизводимостью и правильностью.

Определяемый минимум 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина в биологических объектах при использовании очистки сочетанием жидкость-жидкостной экстракции и колоночной хроматографии составляет 0,2 мг в 100 г трупного органа или биожидкости, трифлуралина - 0,1 мг в 100 г биологического объекта. Открываемый минимум 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина и трифлуралина в ткани трупного органа - 0,06-0,08 мг/100 г, в крови- 0,04-0,06 мг/100 г, в моче- 0,02-0,04 мг/100 г биологического объекта.

Изучены особенности распределения рассматриваемых

нитропроизводных анилина в организме теплокровных животных (крысы).

Экспериментальным животным (5 групп по 5 особей в каждой) массой 300-350 г внутрижелудочно вводили полуторную дозу ЬЭ5о 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина (2300 мг на 1 кг массы животного) и однократную ЬО50 трифлуралина (4600 мг на 1 кг массы животного) в виде водной суспензии. После гибели животных одинаковые органы и биожидкости, взятые от животных внутри каждой из групп, объединяли и исследовали на наличие в них рассматриваемых соединений. Результаты изучения распределения анализируемых веществ в организме теплокровных представлены в табл. 9.

Таблица 9 - Результаты изучения распределения рассматриваемых веществ в организме теплокровных (крысы) (п=5; Р=0,95)_

Орган или биожидкость Анализируемое вещество Найдено, %

X 8 Дх

1 2 3 4 5 6

Печень 2-нитроанилин 64,53 2,80 1,25 3,48

2-нитро-4-метиланилин 47,64 2,99 1,34 3,73

Трифлуралин 82,63 5,82 2,60 7,23

Почки с надпочечниками 2-нитроанилин 66,46 3,30 1,48 4,11

2-ниггро-4-метил анилин 50,62 3,59 1,61 4,48

Трифлуралин 40,28 40,28 1,83 5,09

Лёгкие 2-нитроанилин 11,47 1,05 0,47 1,31

2-нитро-4-метиланилин 10,67 0,98 0,44 1,22

Трифлуралин 78,31 4,13 1,85 5,14

Сердце 2-нитроанилин 11,27 0,84 0,38 1,06

2-нигро-4-метиланилин 23,64 1,88 0,84 2,34

Трифлуралин 104,45 9,26 4,14 11,51

Селезёнка 2-нитроанилин 23,10 0,94 0,42 1,17

2-нитро-4-метиланилин 39,27 1,99 0,89 2,47

Трифлуралин 499,48 47,10 21,06 58,55

Кровь 2-нитроанилин 10,38 0,52 0,23 0,64

2-нитро-4-метиланилин 12,25 1,27 0,57 1,58

Трифлуралин 28,82 1,40 0,63 1,75

Головной мозг 2-нитроанилин 11,20 1,00 0,44 1,22

2-нитро-4-метил анилин 22,22 1,39 0,62 1,72

Трифлуралин 86,86 4,57 2,04 5.67

Желудок с содержимым 2-нитроанилин 4273,07 298,27 133,39 370,82

2-нитро-4-метил анилин 4856,10 465,99 208,39 579,32

Трифлуралин 10857,28 748,22 334,61 930,22

Тонкий кишечник с содержимым 2-нитроанилин 184,49 11,42 5,11 14,21

2-нитро-4-метил анилин 176.96 8,06 3,60 13,41

Трифлуралин 2011,06 171,83 76,84 213,62

Толстый кишечник с содержимым 2-нитроанилин 73,45 3,67 1,64 4,56

2-нитро-4-метил анилин 94,63 5,41 2,42 6,73

Трифлуралин 320,91 27,50 12,30 34,19

Мочевой пузырь с мочой и мочеточниками 2-цитроанилин 51,78 4,09 1,83 5,09

2-нитро-4-метил анилин 54,21 ; 2,39 1,07 2,97

Трифлуралин 59,68 1 3,98 1,78 4,95

1 2 3 4 5 6

Яички с семенными канатиками 2-нитро анилин 8,77 0,36 0,16 0,44

2-нитро-4-метил анилин 57,13 4,08 1,82 5,06

Трифлуралин 41,81 3,53 1,58 4,39

Мышцы бедренные 2-нитро анилин 10,98 10,22 0,55 1,53

2-нитро-4-метил анилин 14,50 0,80 0,36 1,00

Трифлуралин 118,91 9,63 4,31 11,98

Забрюшшшая жировая клетчатка 2-нитроанилин 7,41 0,40 0,18 0,50

2-нитро-4-метил анилин 66,60 3,92 1,75 4,87

Трифлуралин 47,91 3,85 1,72 4,78

Как свидетельствуют полученные данные, наибольшие количества изучаемых веществ обнаруживаются в желудке, тонком и толстом кишечнике. Значительные количества 2-нитроаншшна содержится в печени, почках с надпочечниками и мочевом пузыре с мочой и мочеточниками. 2-нитро-4-метиланилин в больших количествах присутствует в печени, почках с надпочечниками, мочевом пузыре с мочой и мочеточниками, в яичках с семенными канатиками и забрюшинной жировой клетчатке. Большое содержание трифлуралина отмечается в селезенке, бедренных мыщцах и сердце.

Найдено, мг

7

—8-10°С

-•»-•12-15 "С

24-26 °С

36 °С

___

1 3 7 14 21 2В

-«- 8-10 °С

12-15 °С

—А — 24-26 °С

— ■• — 36 °С

-1 -1

2-нитроанилин

2-нитро-4-метиланилин

Время, сутки

Рис. 2 - Результаты изучения сохраняемости рассматриваемых нитроироизводных анилина в трупном материале

Исследованы особенности сохранения изучаемых нитропроизводных анилина в трупном материале (искусственных смесях с тканью трупной печени) при температурах от 8 до 36 °С. Результаты представлены на рис. 2.

Как свидетельствуют полученные данные, в предлагаемых условиях 2-нитроанилин сохраняется в трупном материале в течение 7-30 суток, 2-питро-4-метиланилин - 14-42 суток, трифлуралин - от 2-х до 4-х месяцев с момента начала эксперимента.

По результатам проведенных исследований предложено 2 варианта общей схемы исследования биологического материала при отравлении 2-нитроанилином, 2-нитро-4-метиланилином и трифлуралином, которые позволяют изолировать, очистить, идентифицировать и количественно определить исследуемые отравляющие вещества.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Изучены особенности поглощения УФ- и видимого света 2-нитроанилином, 2-нитро-4-метиланилином и трифлуралином в различных растворяющих средах. Рассчитан ряд оптических характеристик электронных спектров. Показана возможность идентификации данных веществ по их электронным спектрам. Установлена целесообразность использования для идентификации 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина, трифлуралина метода колебательной спектрофотометрии в диапазоне частот 4000-400 см"1.

На основе особенностей поглощения 2-нитроанилином, 2-нитро-4-метиланилином, трифлуралином УФ- и видимого излучения в среде ДМФА предложены методики их количественного спектрофотометрического определения. Относительная ошибка среднего результата при определении данными методиками в субстанциях (п = 6; Р = 0,95) не превышает 0,86 %.

2. Проведено изучение особенностей определения 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина и трифлуралина методом газо-жидкостной капиллярной хроматографии в сочетании с масс-селективным детектированием. Показана возможность применения хромато-масс-спектрометрии для идентификации рассматриваемых соединений.

3. Исследовано хроматографическое поведение 2-нитропроизводных анилина в тонких слоях и колонках неподвижных фаз с гидроксилированной и . привитой поверхностями с применением элюентов различной полярности. Рассчитаны параметры хроматографирования анализируемых соединений.

Установлено, что оптимальными для определения 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина в тонких слоях силикагеля (пластины «Сорбфил» с УФ-индикатором) являются подвижные фазы гексан-ацетон (7:3) и гексан-диэтиловый эфир (5:5), для определения трифлуралина - пропанол-2-гексан (8:2) и гексан-толуол (5:5). При определении в тонких слоях обращённофазового сорбента (модель привитой фазы Си - С15) оптимальными являются системы вода - ацетонитрил (5:5) и буферный раствор с рН2,0 -диоксан (2:8) при хроматографировании 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина и вода - ацетон (2:8) и вода- этанол (2:8) - при хроматографировании трифлуралина.

Показано, что оптимальной для определения рассматриваемых соединений методом нормальнофазовой ВЭЖХ является подвижная фаза гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1), для определения методом обращённофазовой ВЭЖХ (сорбент «Зерагоп ЭйХ ИРБ») оптимальными являются подвижные фазы ацетонитрил-вода (3:7) (хроматографирование 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина) и ацетонитрил-вода (8:2) (хроматографирование трифлуралина). Разработаны методики количественного определения рассматриваемых веществ методами нормальнофазовой и обращённофазовой ВЭЖХ. Относительная ошибка среднего результата при определении 2-нитроанилина в субстанции не превышает 1,39 %, 2-нитро-4-метиланилина- 1,48 %,трифлуралина- 1,35%.

4. Изучены особенности экстрагирования 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина из водных и водно-ацетонитрильных растворов органическими растворителями в зависимости от ряда факторов. Установлено, что наибольшие количества исследуемых веществ (99,4-99,6 %) при однократной экстракции из водных растворов (г=1), удаётся извлечь этилацетатом, насыщенным водой, при рН водного слоя 1-12 в условиях отсутствия электролита в водной фазе.

Наибольшие количества 2-нитроанилина (94,9-96,6 %), 2-нитро-4-метиланилина (93,5-94,8%), трифлуралина (96,0-99,0%) при однократной экстракции из водно-ацетонитрильных растворов (г=1) удаётся извлечь этилацетатом, насыщенным водой, в широком диапазоне рН, при отсутствии электролита и соотношении ацетонитрила и воды не менее 1:4 (по объему).

5. Исследованы особенности препаративного хроматографирования рассматриваемых соединений в макроколонках нормальнофазового (силикагель Ь 40/100 мкм) и обращённофазового («Силасорб С-18» 30 мкм) сорбентов. Оптимальным элюентом при хроматографировии 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина в колонках силикагеля Ь 40/100 мкм является система растворителей гексан-ацетон (8,5:1,5), при хроматографировании трифлуралина в тех же условиях - система гексан-ацетон (9,5:0,5). Оптимальной подвижной фазой при хроматографировании 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина в колонках сорбента «Силасорб С-18» 30 мкм является система растворителей ацетонитрил-вода (5:5), трифлуралина - ацетонитрил-вода (8:2)

Определён уровень потерь анализируемых веществ при хроматографировании в тонких слоях и колонках сорбентов. Показана достаточная эффективность разработанных способов очистки 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина, трифлуралина от соэкстрактивных веществ биоматериала методами хроматографии и сочетанием хроматографии с жидкость-жидкостной экстракцией.

6. Проведено сравнительное изолирование 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина, трифлуралина из биологического материала 18 изолирующими агентами различной химической природы в режиме настаивания. Установлено, что извлечение рассматриваемых веществ из биологического материала наиболее целесообразно проводить ацетоном. Оптимальные условия изолирования ацетоном можно достичь уже при двукратном настаивании в случае, если масса изолирующего агента как минимум в два раза превышает массу биоматериала, а продолжительность отдельного настаивания составляет не менее 30 минут.

Разработаны методики определения рассматриваемых соединений в тканях трупных органов и биожидкостях на основе изолирования ацетоном и последующей очистки методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии.

7. При содержании анализируемых соединений в количестве 50 мг в 100 г биоматериала разработанные методики позволяют определять в ткани печени крови и моче соответственно 75,23-84,75 %, 77,84-88,48 %, 83,96-94,77 % 2-нитроанилина, 71,83-83,84 %, 74,83-85,82 %, 81,11-90,83 % 2-нитро-4-метиланилина и 79,90-88,81 %, 82,19- 92,63 %, 87,23 - 96,86 % трифлуралина. Значения полуширины доверительного интервала (п=5; Р=0,95) при этом не превышают 3,70 % (исследование ткани печени), 3,31 % (исследование крови), 2,61 % (исследование мочи).

Определяемый минимум 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина и трифлуралина в ткани трупной печени, крови и моче составляет 0,1-0,2 мг в 100 г биологического объекта.

8. Исследован характер распределения рассматриваемых соединений в органах и биожидкостях теплокровных (на примере крыс) при летальных отравлениях после внутрижелудочного введения. Установлено, что в наибольших количествах 2-нитроанилин присутствует в желудке, тонком и толстом кишечнике печени, почках с надпочечниками и мочевом пузыре с мочой и мочеточниками. 2-нитро-4-метиланилин - в желудке, тонком и толстом кишечнике, печени, почках с надпочечниками, мочевом пузыре с мочой и мочеточниками, яичках с семенным канатиком и забрюшинной жировой клетчатке, трифлуралин - в желудке, тонком и толстом кишечнике, селезенке, бедренных мышцах и сердце животных.

9. В модельных опытах с тканью трупной печени изучена устойчивость рассматриваемых соединений в гнилостно разлагающемся биологическом материале в зависимости от продолжительности и температурного режима сохранения. Выявлено, что 2-нитроанилин определяется в течение 3 недель в условиях сохранения модельных смесей при температуре 8-15°С, при более высокотемпературном режиме (24-36°С) 2-нитроанилин возможно обнаружить в гнилостно измененном биоматериале в течение 1 недели. 2-нитро-4-метиланилин при температуре 8-15°С сохраняется как минимум 1 месяц, при температуре 24-36сС - в течение 2 недель. Трифлуралин определяется в сохраняемых при температуре 8-36 °С биологических объектах, по крайней мере, в течение 2 месяцев.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зайцева, A.C. Определение трифлуралина методом обращеннофазовой жидкостной колоночной хроматографии низкого давления / A.C. Зайцева, В.К. Шорманов // Белгородская область: прошлое, настоящее и будущее : материалы обл. науч.-практ. конф. (Белгород, 22 дек. 2010 г.). - Белгород, 2011. - Ч. 3. - С. 287-291.

2. Особенности определения отдельных нитропроизводных анилина в биологических объектах в тонком слое обращеннофазового сорбента / В.К.

Шорманов, A.C. Шилова, Ю.А. Сухомлинов, Д.А. Герасимов // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2011. - Т. 11, № 3. - С. 407-414.

3. Получение ацетильных производных анилина и ряда близких структур для дальнейшего химико-токсикологического анализа / В.К. Шорманов, Д.А. Герасимов, A.C. Шилова, О.И Гришечко // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов IV Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - Курск : Изд-во КГМУ, 2011. - С. 209-211.

4. Применение хроматографических методов для определения 2-нитропроизводных анилина в биологическом материале / В.К. Шорманов, A.C. Шилова, Ю.А. Сухомлинов [и др.] // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2011. - Т. 11, № 4. - С. 535-544.

5. Шилова, A.C. Количественное определение о-нитроанилина методом спектрофотометрии / A.C. Шилова, В.К. Шорманов // Биотехнология. Биомедицинская инженерия и технология современных социальных практик : сб. тр. Всерос. науч.-практ. конф. - Курск : Изд-во КГМУ, 2009. - С. 166-169.

6. Шилова, A.C. Количественное определение трифлуралина методом спектрофотометрии / A.C. Шилова, В.К. Шорманов // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов III Всерос. науч.-практ. конф. -Курск : Изд-во КГМУ, 2010. - С. 320-322.

7. Шилова, A.C. Особенности экстракции 2-нитро-4-метиланилина из водных и водно-ацетонитрильных растворов /A.C. Шилова // Экстракция органических соединений : каталог докл. IV Междунар. конф. (Воронеж, 20-24 сент. 2010 г.). - Воронеж : Изд-во ВГТА, 2010. - С. 228.

8.1Нилова, A.C. Спектрофотометрическое определение 2-нитро-4-метиланилина / A.C. Шилова, В.К. Шорманов // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов III Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 75-летию Курск, гос. мед. ун-та. - Курск : Изд-во КГМУ, 2010.-С. 318-320.

9. Шорманов, В.К. Изучение особенностей определения изомеров нитроанилина методом нормапьнофазовой ТСХ после переведения их в соответствующие полинитропроизводные / В.К. Шорманов, Д.А. Герасимов, A.C. Шилова // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов III Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 75-летию Курск, гос. мед. ун-та. - Курск : Изд-во КГМУ, 2010. - С. 323-325.

10. Шорманов, В.К. Изучение особенностей поглощения 2-нитроанилина электромагнитного излучения в УФ- и видимой части спектра / В.К. Шорманов, A.C. Шилова // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов III Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 75-летию Курск, гос. мед. ун-та. - Курск : Изд-во КГМУ, 2010. - С. 326-328.

11. Шорманов, В.К. Определение 2,6-динитро-4-(трифтор)-К,Ы-(дипропил)анилина методом электронной спектроскопии / В.К. Шорманов, A.C. Шилова // Университетская наука: теория, практика, инновации : сб. тр. 74-й науч. конф. КГМУ, сес. Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН и отделения РАЕН. - Курск : Изд-во КГМУ, 2009. - Т. 2. - С. 284-286.

12. Шорманов, В.К. Определение 2-нитро-4-метиланилина методом электронной спектрофотометрии / В.К. Шорманов, A.C. Шилова //

Биотехнология. Биомедицинская инженерия и технология современных социальных практик : сб. тр. Всерос. науч.-практ. конф. - Курск : Изд-во КГМУ, 2009.-С. 174-176.

13. Шорманов, В.К. Определение изомеров нитроанилина в тонком слое нормальнофазового сорбента / В.К. Шорманов, Д.А. Герасимов, A.C. Шилова // Биотехнология. Биомедицинская инженерия и технология современных социальных практик : сб. тр. Всерос. науч.-практ. конф. - Курск: Изд-во КГМУ, 2009.-С. 171-174.

14. Шорманов, В.К. Определение микроколичеств трифлуралина в фенхеле обыкновенном / В.К. Шорманов, A.C. Шилова // Фитодизайн в современных условиях : материалы Междунар. науч.-практ. конф. (Белгород, 14-17 июня 2010 г.). - Белгород : Изд-во БелГУ, 2010. - С. 406-408.

15. Шорманов, В.К. Определение отдельных нитропроизводных анилина в тонком слое нормальнофазового сорбента / В.К. Шорманов, A.C. Шилова, Д.А. Герасимов // Университетская наука: теория, практика, инновации : сб. тр. 74-й науч. конф. КГМУ, сес. Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН и отделения РАЕН. - Курск : Изд-во КГМУ, 2009. - Т. 2. - С. 287-289.

16. Шорманов, В.К. Особенности идентификации трифлуралина в биологическом материале с применением ИК-спектрофотометрии / В.К. Шорманов, A.C. Шилова // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов III Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 75-летию Курск, гос. мед. ун-та. - Курск : Изд-во КГМУ, 2010. - С. 328-330.

17. Шорманов, В.К. Особенности очистки 2,6-динитро-4-(трифторметил)-М,М-дипропиланилина, извлекаемого из биологических жидкостей, в колонке нормальнофазового сорбента / В.К. Шорманов, A.C. Шилова // Актуальные вопросы фармакологии и фармации : сб. тр. межвуз. науч. конф., посвящ. памяти проф. В.В. Пичугина и 75-летию КГМУ. - Курск : Изд-во КГМУ, 2009. -С. 371-372.

18.Шорманов, В.К. Экстракция 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина из водных растворов / В.К. Шорманов, A.C. Шилова // Судеб.-мед. экспертиза. - 2011. - Т. 54, № 1. - С. 45-47.

19. Шорманов, В.К. Экстракция трифлуралина из водно-ацетонитрильных растворов / В.К. Шорманов, A.C. Шилова // Судеб.-мед. экспертиза. - 2010. -Т. 53, №5.-С. 31-33.

20. Шорманов, В.К. Разработка методики химико-токсикологического определения трифлуралина / В.К. Шорманов, A.C. Зайцева // Судеб.-мед. экспертиза. - 2011. - Т. 54, № 3. - С. 50-52.

Сдано в набор 17.05.2012 г. Подписано в печать 17.05.2012 г. Формат 60x84 1/16. Бумага «Снегурочка». Гарнитура Times New Rom. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 1278.

Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3. Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г.

Отпечатано: ПБОЮЛ Киселева О.В. ОГРН 304463202600213

Оглавление диссертации Зайцева, Алина Сергеевна :: 2012 :: Курск

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. 2-НИТРОАНИЛИН, 2-НИТРО-4-МЕТИЛАНИЛИН И ТРИФЛУРАЛИН КАК ОБЪЕКТЫ ХИМИЧЕСКОГО И ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ.

1.1. Физические свойства изучаемых нитропроизводных анилина.

1.2. Получение объектов исследования и их применение.

1.3. Токсикологическая характеристика.

1.4. Идентификация объектов исследования и близких по структуре соединений.

1.5. Количественное определение.

1.6. Изолирование и очистка нитропроизводных анилина и сходных по структуре соединений.

1.7. Биотрансформация, метаболизм, распределение в теплокровных организмах и выведение нитроаминопроизводных ароматического ряда, их сохраняемость в окружающей среде и трупном материале.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ, ПРИБОРЫ, РЕАКТИВЫ, МАТЕРИАЛЫ, ПОСУДА.л.

ГЛАВА 2. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ОТДЕЛЬНЫХ НИТРО-ПРОИЗВОДНЫХ АНИЛИНА.

2.1. Идентификация по электронным спектрам.

2.2. Идентификация по колебательным спектрам

2.3. Идентификация хромато-масс-спектрометрическим методом.

2.4. Идентификация хроматографическими методами.

2.4.1. Метод тонкослойной хроматографии.

2.4.2. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии.

ГЛАВА 3. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАССМАТРИВАЕМЫХ СОЕДИНЕНИЙ.

3.1. Определение спектрофотометрическим методом в среде ДМФА.

3.1.1. Определение 2-нитроанилина.

3.1.2. Определение 2-нитро-4-метиланилина.

3.1.3. Определения трифлуралина.

3.2. Определение методом ВЭЖХ.

3.2.1. Нормальнофазовый вариант определения.

3.2.2. Обращеннофазовый вариант определения.

Выводы к третьей главе.

ГЛАВА 4. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ОБЪЕКТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.Л

4.1. Экстракционные методы очистки.

4.1.1. Экстрагирование 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина из водных растворов.

4.1.2. Экстрагирование 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина и трифлуралина из водно-ацетонитрильных растворов.

4.2. Очистка хроматографическими методами и особенности хроматографического поведения исследуемых веществ.

4.2.1. Использование метода жидкостной колоночной хроматографии низкого давления.

4.2.2. Использование тонкослойной хроматографии.

4.3. Оценка степени очистки извлечений из биологического материала в контрольных опытах.

4.3.1. Оценка эффективности очистки извлечений методом жидкостной колоночной хроматографии низкого давления.

4.3.2. Оценка эффективности очистки извлечений методом ТСХ.

4.3.3. Оценка эффективности очистки извлечений сочетанием жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии.

Выводы к четвёртой главе.

ГЛАВА 5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ 2-НИТРОАНИЛИНА, 2-НИТРО-4-МЕТИЛ-АНИЛИНА И ТРИФЛУРАЛИНА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ.

5.1. Изучение особенностей изолирования 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина и трифлуралина методом настаивания.

5.1.1. Сравнительное изучение изолирования исследуемых соединений из биологической ткани различными изолирующими агентами.

5.1.2. Определение изучаемых нитропроизводных анилина в биологическом материале при использовании оптимального изолирующего агента.

5.1.2.1. Поиск оптимальных условий изолирования исследуемых веществ.

5.1.2.2. Методики определения рассматриваемых соединений в тканях трупных органов и биожидкостях.

5.2. Выявление определяемого минимума 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина и трифлуралина в биологическом материале.

Выводы к пятой главе.

ГЛАВА 6. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ИССЛЕДУЕМЫХ СОЕДИНЕНИЙ В ОРГАНИЗМЕ ТЕПЛОКРОВНЫХ И ИХ СОХРАНЯЕМОСТЬ В ТРУПНОМ МАТЕРИАЛЕ.

6.1. Распределение 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина, трифлуралина в организме теплокровных животных.

6.2. Сохраняемость объектов исследования в трупном материале.

Выводы к шестой главе.

ОБЩАЯ СХЕМА ИССЛЕДОВАНИЯ БИОМАТЕРИАЛА ПРИ ОТРАВЛЕНИИ 2-НИТРОАНИЛИНОМ ИЛИ 2-НИТРО-4-МЕТИЛ-АНИЛИНОМ.

ОБЩАЯ СХЕМА ИССЛЕДОВАНИЯ БИОМАТЕРИАЛА ПРИ ОТРАВЛЕНИИ ТРИФЛУРАЛИНОМ.

Введение диссертации по теме "Фармацевтическая химия, фармакогнозия", Зайцева, Алина Сергеевна, автореферат

Актуальность темы. Многие нитропроизводные анилина обладают выраженной биологической активностью и широко применяются в медицине, ветеринарии и растениеводстве. Например, 2,6-динитро-4-(трифторметил)-М,Ы-дипропиланилин (трифлуралин) является лекарственным средством для лечения лейшманиоза, малярии, болезни Шагасса и системным почвенным гербицидом, применяемым, в частности, на посевах лекарственных растений. Отдельные нитропроизводные анилина (2-нитроанилин; 2-нитро-4-метиланилин) используют как полупродукты в фармацевтическом синтезе и синтезе пестицидов, например, при получении трифлуралина, производстве синтетических красителей, в текстильной, лакокрасочной и других отраслях промышленности.

Нитропроизводные анилина являются токсичными веществами, класс токсичности - 2. ЛД50 2-нитроанилина для белых крыс составляет 1500 мг/кг при пероральном приеме и 800 мг/кг при введении в брюшную полость, для мышей - 1070 -1290 мг/кг, для морских свинок - 2350 мг/кг. ЛД50 трифлуралина для крыс составляет 4600 мг/кг (по другим данным 10000 мг/кг), для белых мышей - 3300 мг/кг, для кроликов, собак, кур - 2000 мг/кг.

Нитропроизводные анилина относятся к метгемоглобинобразующим ядам.

Описаны случаи отравления соединениями данной химической группы, в том числе с летальным исходом.

Отравления могут происходить при непосредственном контакте с веществами в процессе их производства, хранения и применения, при необоснованном завышении доз в процессе лечения, ошибочном приёме, вследствие аварий, в условиях загрязнения объектов окружающей среды отходами химических производств, выбросами в атмосферу и сточными водами предприятий, а также при суицидальных попытках.

Широкое применение отдельных нитропроизводных анилина, их токсические свойства, наличие случаев отравлений с летальным исходом обуславливают необходимость изучения этих соединений в химико-токсикологическом отношении.

До настоящего времени остаются недостаточно разработанными вопросы изолирования этих соединений из биологического материала, их обнаружения, идентификации и количественного определения. В доступной литературе отсутствуют данные по вопросам сохраняемости рассматриваемых веществ в биологическом (трупном) материале.

Исходя из вышеизложенного, разработка методик химико-токсикологического исследования 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина и трифлуралина является актуальной.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка методики химико-токсикологического анализа отдельных нитропроизводных анилина: 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина, 2,6-динитро-4-(трифторметил)-Ы,Ы-дипропиланилина (трифлуралина).

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить особенности электронных и колебательных спектров 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина, трифлуралина;

- определить характер хроматографической активности исследуемых веществ в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностями в случае использования жидких подвижных фаз; исследовать хроматографическое поведение отдельных нитропроизводных анилина в капиллярных колонках при использовании газообразных подвижных фаз с последующим масс-селективным детектированием;

- исследовать особенности изолирования объектов изучения из биологического материала настаиванием с изолирующими агентами различной химической природы, разработать схему очистки извлечений;

- изучить распределение 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина и трифлуралина в органах и биожидкостях теплокровных животных;

- определить сроки сохранения рассматриваемых веществ в разлагающемся трупном материале.

Научная новизна. Изучены особенности поглощения 2-нитроанилином, 2-нитро-4-метиланилином, трифлуралином электромагнитного излучения в УФ-, видимой и ИК- областях спектра. Для повышения селективности определения рассматриваемых соединений методом электронной спектрофотометрии рассчитан ряд основных оптических характеристик.

Изучены особенности масс-спектров изучаемых веществ, полученных методом электронного удара. Показана возможность селективного и высокочувствительного определения данных соединений по совокупности характеристических сигналов осколков молекулы в масс-спектре и времени удерживания 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина, трифлуралина в капиллярной колонке при хроматографировании методом ГЖХ.

Исследованы закономерности хроматографической активности 2-нитропроизводных анилина в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностями в условиях применения различных элюентов; определены оптимальные условия и рассчитаны параметры хроматографирования исследуемых веществ методами ТСХ и жидкостной колоночной хроматографии низкого давления.

На основе предварительных исследований разработаны методики идентификации и количественного определения рассматриваемых соединений спектральными и хроматографическими методами.

Выявлены основные параметры и условия очистки биологических объектов, содержащих 2-нитроанилин, 2-нитро-4-метиланилин и трифлуралин от соэкстрактивных веществ методам жидкость-жидкостной экстракции и различными видами хроматографии.

Впервые для изолирования отдельных нитропроизводных анилина из биологического материала в качестве изолирующего агента предложен ацетон. На основе использования ацетона как изолирующего агента и очистки методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии в тонких слоях и колонках сорбентов разработаны оригинальные методики определения рассматриваемых соединений в ткани трупных органов и биожидкостях, приемлемые как для исследования свежего, так и гнилостно-измененного трупного материала.

В эксперименте на животных (крысы) исследованы особенности распределения 2-нитроанилина, 2-нитро-4-метиланилина и трифлуралина в организме теплокровных.

Изучена сохраняемость рассматриваемых отравляющих агентов в зависимости от температурного режима и продолжительности сохранения в гнилостно-разлагающемся трупном материале.

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований предложено 2 варианта общей схемы исследования биоматериала при отравлении 2-нитроанилином, 2-нитро-4-метиланилином и трифлуралином.

Внедрение результатов работы: методика идентификации трифлуралина методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного национального исследовательского университета с 13 декабря 2010 года); методика очистки трифлуралина методами жидкость-жидкостной экстракции и нормальнофазовой колоночной хроматографии (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского государственного национального исследовательского университета с 13 декабря 2010 года); методика изолирования трифлуралина из ткани печени и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 08 ноября 2010 года); методика изолирования трифлуралина из крови и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета с 08 ноября 2010 года); методика идентификации 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры общей и биоорганической химии Курского государственного медицинского университета с 04 октября 2010 года); методика очистки 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина методами жидкость-жидкостной экстракции и обращеннофазовой колоночной хроматографии (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры общей и биоорганической химии Курского государственного медицинского университета с 04 октября 2010 года); методика изолирования 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина из ткани печени и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры фармацевтической химии и клинической фармации Воронежской государственной медицинской академии с 18 октября 2010 года); методика изолирования 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина из крови и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии (внедрена в учебную (практические занятия) и научную работу кафедры а фармацевтической химии и клинической фармации ВГМА с 18 октября 2010 года);

I / методика изолирования 2,6-динитро-4-(трифторметил)-1Ч,1Ч-дипропиланилина из мочи и определения методами ТСХ и ВЭЖХ при судебно-химическом исследовании биологического материала (апробирована в экспертно-криминалистическом центре УМВД России по Орловской области, акт апробации от 14 февраля 2011 года). методика изолирования 2-нитроанилина и 2-нитро-4-метиланилина из мочи и определения методами ТСХ и ВЭЖХ при судебно-химическом исследовании биологического материала (апробирована в экспертно-криминалистическом центре УМВД по Орловской области, акт апробации от 14 февраля 2011 года).