Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Определение лекарственных средств производных бис-(β-хлорэтил)-амина в биологических объектах при химико-токсикологических исследованиях и в условиях нарушения выделительной функции почек

На правах рукописи

I

СТОЛЯРОВ МИХАИЛ ЛЕОНИДОВИЧ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ПРОИЗВОДНЫХ БИС-(Р-ХЛОРЭТИЛ)-ЛМИНА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ ПРИ ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ И В УСЛОВИЯХ НАРУШЕНИЯ ВЫДЕЛИТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИИ ПОЧЕК

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

005557802

1 5 2015

Курск-2014

005557802

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор Шорманов Владимир Камбулатович Научный консультант:

доктор медицинских наук, доцент Сипливый Геннадий Вячеславович Официальные оппоненты:

Калскин Роман Анатольевич - доктор фармацевтических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Минздрава России, лаборатория судебно-химических и химико-токсикологических научных и экспертных исследований, старший научный сотрудник

Гармонов Сергей Юрьевич - доктор химических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский национальный исследовательский технологический университет», профессор кафедры аналитической химии, сертификации и менеджмента качества

Ведущая организация:

Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Зашита диссертации состоится » 2015 г. в 7л часов на

заседании диссертационного совета Д 208.039.03 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, д. 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России (Ьир://\\'\у\у. kurskmed.com).

Автореферат разослан « 3 » йрЯ__2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Овод Алла Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Лекарственные вещества, производные бис-(Р-хлорэтил)-амина (хлорамбуцил, циклофосфан, ифосфамид), широко применяются в медицине. Они используются при лечении онкологических (лимфолейкоз, лимфогранулематоз, рак молочной железы, легкого, яичников, почки, шейки матки, саркома мягких тканей, костная ретикулосаркома, миеломная болезнь и др.) и аутоиммунных (диффузный иролифератиппый гломсрулонсфрит, волчаночный нефрит, ревматоидный артрит, системный некротический васкулит и др.) заболеваний.

Хлорэтиламины являются азотистыми аналогами иприта, обладают высокой токсичностью для теплокровных животных и человека. LD50 хлорамбуцила для крыс составляет 21-23 и 40 мг/кг при внутрибрюшинном и пероральном введении соответственно; LD50 циклофосфана для крыс - 200 и 100-160 мг/кг при внутрибрюшинном и внутривенном введении соответственно, для мышей - 158 и 100 мг/кг перорально и внутривенно соответственно; LD50 ифосфамида для крыс при пероральном введении - 143 мг/кг.

Описаны случаи отравления данными соединениями, в том числе с летальным исходом. Отравления могут возникать при непосредственном контакте с веществами при их производстве, при использовании завышенных доз в процессе лечения, ошибочном приеме.

Широкое применение производных бис-(Р-хлорэтил)-амина, их высокая токсичность, наличие случаев летальных отравлений определяют необходимость изучения данных соединений в химико-токсикологическом аспекте.

Степень разработанности темы исследования. Анализ литературных данных показал, что до настоящего времени не проводились систематические исследования по изучению хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида в химико-токсикологическом аспекте. Опубликованы тезисы (Мужановский Э.Б. и др., 1985), в которых отражены вопросы изолирования, идентификации и количественного определения в биологических объектах сарколизина, близкого по структуре к хлорамбуцилу. Рядом зарубежных исследователей (Baumann F. et al., 2003; Berger M.R. et al., 1985; de Jonge M.H. et al.. 2004) разработаны методики определения отдельных производных бис-(Р-х;юрэтил)-амина и их метаболитов в биологических жидкостях, однако отсутствуют данные об их специфичности и возможности применения в условиях химико-токсикологического анализа. Также в доступной литературе отсутствуют данные о распределении токсических доз изучаемых веществ в организме теплокровных животных и об их сохраняемости в гнилостно разлагающемся биологическом материале.

Исходя из вышеизложенного можно сделать вывод, что разработка методик химико-токсикологического исследования хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида является актуальной.

Цель исследования - разработка методик химико-токсикологического анализа отдельных производных бис-(Р-хлорэтил)-амина: хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида.

Задачи исследования:

1. Изучить особенности электронных и колебательных спектров хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида.

2. Определить особенности хроматографического поведения изучаемых соединений в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностями при использовании методов ТСХ, макроколоночной хроматографии низкого давления, ГХ-МС.

3. Изучить особенности изолирования объектов исследования из биологического материала изолирующими агентами различной химической природы, разработать схему очистки извлечений.

4. Изучить особенности распределения токсических доз исследуемых веществ в организме здоровых теплокровных животных и животных с нарушением выделительной функции почек.

5. Определить сроки сохранения хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида в гнилостно разлагающемся трупном материале.

Научная новизна. Изучены особенности поглощения рассматриваемыми соединениями электромагнитного излучения в УФ-, видимом и ИК- диапазоне в девяти различных растворителях, рассчитаны удельный и молярный коэффициенты поглощения.

Разработана оригинальная методика спектрофотометрического определения анализируемых веществ, основанная на получении их нитропроизводных.

Изучены особенности масс-спектров хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида, полученных методом электронного удара. Показана возможность идентификации исследуемых веществ по совокупности характеристических сигналов осколков молекулы в масс-спектре и времени удерживания в капиллярной колонке при исследовании методом ГХ-МС.

Исследованы закономерности хроматографического поведения хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностями. Определены оптимальные условия и рассчитаны параметры хроматографирования.

На основе предварительных исследований разработаны методики идентификации и количественного определения анализируемых соединений фотометрическими и хроматографическими методами.

Определены условия очистки биообъектов, содержащих хлорамбуцил, циклофосфан и ифосфамид, от соэкстрактивных веществ методом жидкость-жидкостной экстракции и различными видами хроматографии.

Впервые показана целесообразность использования ацетона для извлечения производных бис-((3-хлорэтил)-амина из объектов биологического происхождения методом настаивания. Разработаны оригинальные методики определения рассматриваемых соединений в ткани трупных органов и биожидкостях, в основе которых лежит изолирование ацетоном и очистка методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии в тонких слоях и колонках сорбентов.

Исследованы особенности распределения токсических доз хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида в организме здоровых теплокровных животных (крысы) и животных с нарушением выделительной функции почек.

Впервые установлены сроки сохраняемости изучаемых веществ в гнилостно разлагающемся трупном материале при различных температурных режимах (от -12°С до 36°С).

Теоретическая и практическая значимость работы. На основании проведенных экспериментальных исследований предложено два варианта практических рекомендаций к проведению химико-токсикологических исследований при отравлениях хлорамбуцилом, циклофосфаном и ифосфамидом.

Внедрены и апробированы результаты работы: методика количественного определения циклофосфана методом спектрофотометрии на основе получения его нитропроизводного в результате взаимодействия с 10% раствором калия нитрата в концентрированной серной кислоте внедрена в учебную и научную работу кафедры биологической и химической технологии Курского государственного медицинского университета (акт внедрения № 36 от 15.04.2013 г.); методика количественного определения ифосфамида методом электронной спектрофотометрии на основе реакции получения нитропроизводного внедрена в учебную и научную работу кафедры биологической и химической технологии Курского государственного медицинского университета (акт внедрения № 37 от 15.04.2013 г.); методика изолирования ифосфамида из животного биологического материала (тканей органов) путем настаивания с ацетоном и последующей очистки в колонке гидроксилированного сорбента внедрена в учебную и научную работу кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета (акт внедрения № 38 от 21.05.2013 г.); методика изолирования хлорамбуцила из биожидкостей и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии после очистки в колонке нормальнофазового сорбента внедрена в учебную и научную работу кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета (акт внедрения № 39 от 21.05.2013 г.); методика идентификации хлорамбуцила и ряда близких по структуре и свойствам соединений сочетанием методов нормальнофазовой ТСХ и электронной спектрофотометрии внедрена в учебную и научную работу кафедры общей и биоорганической химии Курского государственного медицинского университета (акт внедрения № 40 от 6.06.2013 г.); методика идентификации циклофосфана и ифосфамида сочетанием методов хроматографии в тонком слое гидроксилированного сорбента и электронной спектрофотометрии апробирована в испытательной лаборатории ФГБУ «Информационно-методический центр по экспертизе, учету и анализу обращения средств медицинского применения» Росздравнадзора (Курский филиал) (акт апробации № 45 от 11.02.2014 г.); методика определения хлорамбуцила в лекарственных формах методами ГХ-МС и УФ-спек-трофотометрии апробирована в испытательной лаборатории ФГБУ «Информационно-методический центр по экспертизе, учету и анализу обращения средств медицинского применения» Росздравнадзора (Курский филиал) (акт апробации № 46 от 11.02.2014 г.); методика определения хлорамбуцила в тканях внутренних органов лабораторных животных на основе изолирования ацетоном и

очистки хроматографичсскими методами внедрена в работу НИИ Экологической медицины КГМУ (акт внедрения № 315 от 12.11.2013 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

- особенности поглощения исследуемыми веществами электромагнитного излучения в УФ-, видимой и ИК- областях спектра;

- результаты исследования хроматографического поведения изучаемых веществ в тонких слоях и колонках сорбентов при использовании методов тонкослойной и макроколоночной хроматографии;

- методики идентификации и количественного определения анализируемых соединений хроматографическими, фотометрическими и хромато-масс-спектрометрическими методами;

- результаты исследования особенностей очистки изучаемых соединений методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии;

- методики изолирования исследуемых веществ из объектов биологического происхождения на основе настаивания с ацетоном и очистки от соэкстрактивных веществ биоматериала экстракционными и хроматографическими методами;

- распределение изучаемых производных бис-(Р-хлорэтил)-амина в организме здоровых теплокровных животных (крысы) и животных с нарушением выделительной функции почек;

- сохраняемость хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида в гнилостно разлагающемся трупном материале при различных температурах.

Степень достоверности и апробация работы. Достоверность полученных результатов диссертационного исследования обусловлена достаточным объемом экспериментального материала, использованием современных методов исследования, валидацией разработанных методик, статистической обработкой данных по требованиям ГФ XI с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Excel 2013».

Основные положения работы представлены и доложены на 77-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность» (Курск, 2012 г.); итоговой научной конференции сотрудников КГМУ, Центрально-Черноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН, посвященной 78-летию Курского государственного медицинского университета «Университетская наука: взгляд в будущее» (Курск, 2013 г.); 78-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с международным участием «Молодежная наука и современность», посвященной 78-летию КГМУ и 80-летию со дня рождения члена-корреспондента РАМН, профессора А.В. Завьялова (Курск, 2013 г.); XIV Всероссийской научно-практической конференции «Химия и химическая технология в XXI веке» (Томск, 2013 г.); V Всероссийском научно-практическом семинаре для молодых ученых с международным участием «Геномные и протеомные технологии при создании новых лекарственных средств» (Волгоград, 2013 г.); 79-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых с

международным участием «Молодежная наука и современность», посвященной 79-летию КГМУ (Курск, 2014 г.)

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских работ кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии Курского государственного медицинского университета и соответствует проблеме «Фармация» межведомственного научного совета № 36 РАМН и научной проблеме 35.04 «Научные проблемы судебно-медицинской токсикологии, токсикологической и судебной химии» по специальности «Судебная медицина» при РАМН. Номер госрегистрации 01201250552.

Личный вклад автора. Автор принимал непосредственное участие во всех этапах исследования: им составлен общий план и разработана структура исследований, проведен анализ отечественных и зарубежных литературных источников по теме диссертации, выполнены экспериментальные исследования, проведены статистическая обработка и анализ данных, сделаны выводы и заключения. В работах, выполненных в соавторстве, использованы результаты исследования с долей участия автора 80-95%.

Публикации. Основное содержание работы отражено в 13 публикациях, 4 из которых в журналах, рекомендуемых ВАК для опубликования материалов диссертационных исследований.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), экспериментальной части (главы 2, 3, 4, 5 и 6), выводов, списка литературы и приложения, изложенного на 50 страницах. Диссертационная работа изложена на 120 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц и 25 рисунков. Библиографический список состоит из 214 источников, в том числе 149 - на иностранном языке.

В автореферате используются следующие сокращения; БР - буферный раствор, ПЖХ - газо-жидкостная хроматография, ГХ-МС - газовая хроматография с масс-спектрометрическим детектированием, ДМФА - диметилформамид, ЖКТ -желудочно-кишечный тракт, ИК - инфракрасный, ИФ - ифосфамид, ТСХ -тонкослойная хроматография, УФ - ультрафиолетовый, ХБ - хлорамбуцил, ЦФ -циклофосфан, LD5o — полулетальная доза вещества.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основные объекты исследования: хлорамбуцил (фирма «Sigma-AIdrich», содержание основного вещества не менее 99,5%); циклофосфан (ОАО «Компания «Деко», содержание основного вещества не менее 99%); ифосфамид (ОАО «Верофарм», содержание основного вещества не менее 99%).

Применены методы ТСХ, жидкостной колоночной хроматографии, ГХ-МС, электронной и ИК-спектрофотометрии. Методики определения разработаны на модельных смесях с известным содержанием определяемого вещества. Статистическая обработка результатов проводилась в соответствии с установленными ГФ XI требованиями с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Excel 2013».

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Изучены особенности поглощения хлорамбуцилом, циклофосфаном и ифосфамидом электромагнитного излучения в различных растворяющих средах. Рассчитаны удельный и молярный коэффициенты поглощения. Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Отдельные оптические характеристики электронных спектров хлорамбуцила, циклофосфана, ифосфамида

Растворитель

Этанол

Ацетонитрил

Пропанол-2

Этилацетат

Хлороформ Диоксан

Вода

0,1 н. HCl

0,1 н. NaOH

Хлорамбуцил

^maxs HM

204,5 259,3 304,3

260,2 305,5

259,6 304,2

257,9 305,0

259.6 _305Д)_

259,8

305.7

259,1 305,9

212,0 260,8

259,6 307,6

I,

%

525 544 62

555 60

504 58

628 70

787 116

655 70

372 52

265 24

455 57

20352 21085 2412

21715 2361

19041 2202

21243 2361

16170 2401

20614 2202

11329 1573

8077 733

"Кпл: нм

Циклофосфан

201,5

201,9

13848 1731

10

258

293

^тах, НМ

Ифосфамид

201,5

201,9

ЕЩ

11

279

355

в данном растворителе не имеет полос

Примечание: «-» - раствор вещества поглощения в интервале длин волн 200-400 нм.

В электронных спектрах хлорамбуцила присутствуют три достаточно интенсивных полосы поглощения: 204,5-212,0 нм, 257,9-260,8 нм и 304,2307,6 нм. Электронные спектры циклофосфана и ифосфамида в большинстве рассмотренных растворителей не имеют выраженных полос поглощения (кроме этанола и 0,1 н. раствора кислоты хлороводородной).

Установлено, что в ИК-спектрах исследуемых веществ присутствуют достаточно информативные специфические наборы характеристических полос поглощения, которые могут использоваться для их идентификации.

Изучены особенности определения хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида методом газо-жидкостной капиллярной хроматографии (колонка DB-5 ms EVIDEX) с масс-селективным детектированием. Значения времени удерживания хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида составляют соответственно 15,37; 13,42 и 13,80 мин. Установлено, что в масс-спектре хлорамбуцила присутствуют сигналы характерных осколков 63, 90, 118, 132, 146, 181, 232, 268, 286 и 317 m/Z, в масс-спектре циклофосфана - 42, 56, 83, 111, 133,

147, 175 и 224 m/Z, в масс-спектре ифосфамида - 42, 70, 92, 118, 134, 154, 183 и 211 m/Z. Сочетание сигналов характерных осколков масс-спектра и времени удерживания обеспечивает высокую селективность идентификации изучаемых веществ методом ПХ-МС.

Разработаны методики количественного спектрофотометрического определения рассматриваемых соединений на основе поглощения электромагнитного излучения в среде этанола при аналитических длинах волн 259,3 нм (хлорамбуцил) и 201,5 нм (циклофосфан, ифосфамид). Как свидетельствуют полученные данные, представленные в таблице 2, относительная ошибка среднего результата не превышает 1,63%.

Таблица 2 - Результаты количественного определения хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида спектрофотометрическим методом (п=6; р=0,95)

Анализируемое вещество Аналитическая длина волны, нм Найдено,%

X S S,- ! Aï s

Спектрофотометрия на основе поглощения в среде этанола

Хлорамбуцил 259,3 99,68 0,73 0,30 0,77 0,77

Циклофосфан 201,5 99,85 0,67 0,27 0,69 0,69

Ифосфамид 201,5 99,68 1,55 0,63 1,62 1,63

Спектрофотометрия на основе поглощения нитропроизводных объектов исследования в среде 10% раствора натрия гидроксида

Хлорамбуцил 325 100,23 2,42 0,99 2,54 2,53

Циклофосфан 253,3 99,33 1,76 0,72 1,85 1,86

Ифосфамид 255,2 99,69 1,83 0,75 1,92 1,93

Открываемый минимум с использованием данной методики составляет 0,4; 50 и 40 мкг/мл для ХБ, ЦФ и ИФ соответственно.

Данная методика определения циклофосфана и ифосфамида может использоваться для анализа субстанций и лекарственных форм, но она непригодна для работы с извлечениями из биоматериала вследствие малой интенсивности и значительного влияния фонового поглощения эндогенных веществ биоматериала в коротковолновой области УФ-спектра.

Для работы с извлечениями из биообъектов разработана методика количественного определения изучаемых веществ на основе поглощения их нитропроизводных в среде 10% раствора натрия гидроксида. В качестве нитрующего агента применяли 10% раствор калия нитрата в концентрированной серной кислоте. Данная методика позволяет использовать для количественного определения аналитические максимумы при 325, 253,3 и 255,2 нм для хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида соответственно. Как видно из данных, представленных в таблице 2, относительная ошибка среднего результата разработанной методики не превышает 2,53%. Открываемый минимум при этом составляет 2, 3 и 4 мкг/мл для хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида соответственно.

Изучена хроматографическая подвижность рассматриваемых веществ в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностями.

По результатам хроматографирования анализируемых соединений методом ТСХ рассчитаны значения абсолютной (Я0 и относительной (Яб) (по отношению к ЯГ хлорамбуцила) хроматографической подвижности. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Параметры хроматографирования хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида методом ТСХ с использованием оптимальных подвижных фаз

Система растворителей Соотношение компонентов по объему ХБ ЦФ ИФ

ЯГ ЯГ Яэ

Нормальнофазовая ТСХ

Гексан-бутанол-1 2:8 0,36 0,55 1,54 0,54 1,51

Ацетон-гексан 8:2 0,34 0,86 2,40 0,85 2,50

2:8 0,16 0,73 4,56 0,70 4,38

Гексан-диоксан-пропанол-2 10:5:1 0,39 0,53 1,37 0,58 1,50

12,5:5:1 0,32 0,38 1,19 0,43 1,34

20:5:1 0,20 0,11 0,54 0,33 1,67

Гексан-диоксан-пропанол-2-ацетон 20:5:1:1 0,47 0,32 0,68 0,51 1,09

20:5:1:2 0,53 0,42 0,79 0,56 1,06

Обращеннофазовая ТСХ

Вода-ацетон 2:8 0,90 0,29 0,32 0,76 0,85

5:5 0,74 0,56 0,75 0,48 0,65

Вода-пропанол-1 8:2 0,70 0,56 0,81 0,41 0,59

Вода-диоксан 5:5 0,80 0,31 0,38 0,44 0,55

БР (рН=2,87) - пропанол-1 5:5 0,85 0,30 0,35 0,75 0,86

БР (рН=2,87) - ацетон 5:5 0,58 0,70 1,21 0,64 1,10

БР (рН=9,91) - диоксан 5:5 0,77 0,92 1,18 0,45 0,59

Как видно из данных таблицы 3, наиболее оптимальные условия хроматографирования хлорамбуцила в тонких слоях нормальнофазового сорбента достигаются при использовании элюентов гексан-диоксан-нропанол-2 (12,5:5:1) и ацетон-гексан (8:2), при хроматографировании циклофосфана и ифосфамида -гексан-диоксан-пропанол-2 (10:5:1) и ацетон-гексан (2:8).

При хроматографировании в тонких слоях обращеннофазового сорбента оптимальными для хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида являются системы растворителей вода-пропанол-1 (8:2) и буферный раствор (рН=9,91)-диоксан (5:5).

Хроматографирование методом нормальнофазовой колоночной хроматографии проводили в колонках с сорбентом «Силикагель КСК» с размером частиц 40/100 мкм. В качестве элюентов использовали системы растворителей ацетон-гексан, ацетон-бензол и гексан-диоксан-пропанол-2 в различных объемных соотношениях. Рассчитывали объемы удерживания (Ук) исследуемых веществ, объемы удерживания неудерживаемого вещества (У0), скорость элюирования (у), время удерживания Оя), ширину пика у основания (ш), коэффициент емкости (к'), число теоретических тарелок (Ы). Результаты хроматографирования хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида в оптимальных системах представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Параметры хроматографирования хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида в макроколонке силикагеля КСК 40/100 мкм с использованием оптимальных элюентов___

Исследуемое вещество Соотношение компонентов по объему У„, мл V, мл/мин <0, мин Уц.. мл к' мин N

Ацетон-бензол

ХБ 1:9 10,7 0,29 34,00 32,99 2,08 113,76 179

ЦФ 1:9 9,6 0,27 74,07 19,60 1,04 72,59 15

ИФ 1:9 9,6 1 0,24 96,83 17,67 0,84 73,63 9

Ацетон-гексан

ХБ 2:8 9,4 0,78 41,79 27,40 1,91 35,13 11

ЦФ 2:8 9,4 0,72 42,51 35,40 2,77 49,17 21

ИФ 2:8 9,4 0,70 56,06 27,76 1,95 39,66 8

Гексан-диоксан-пропанол-2

ХБ 22,5:5:1 9,8 | 0,88 25,57 35,00 2,57 39,77 39

ЦФ 20:0,5:1 9,1 1,03 25,24 30,28 2,33 29,40 22

ИФ 17,5:5:0,75 9,1 0,80 26,08 24,94 1,74 31,18 23

Как свидетельствуют полученные данные, для хроматографирования методом нормальнофазовой колоночной хроматографии оптимальной является подвижная фаза гексан-диоксан-пропанол-2 (22,5:5:1) для хлорамбуцила, (20:0,5:1) для циклофосфана и (17,5:5:0,75) для ифосфамида.

Хроматографирование методом обращеннофазовой колоночной хроматографии проводили в колонках, заполненных сорбентом «Силасорб С-18» с размером частиц 30 мкм. В качестве элюснта использовали пропапол-1 и его смеси с водой в различных объемных соотношениях. Рассчитывали те же параметры хроматографирования, что и для нормальнофазовой колоночной хроматографии. Результаты представлены в таблице 5.

Установлено, что для хроматографирования методом обращеннофазовой колоночной хроматографии оптимальным является элюент вода-пропанол-1 (8:2) для хлорамбуцила и (7:3) для циклофосфана и ифосфамида.

Таблица 5 - Параметры хроматографирования хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида в макроколонке силасорба С-18 30 мкм ___

Элюент V», мл V, мл/мин ш, мин Уя.. мл к' 1ц, мин N

1 2 3 4 5 6 7 8

Хлорамбуцил

Вода-пропанол-1 (8:2) 6,6 0,054 713,70 22,77 2,45 421,67 6

Вода-пропанол-1 (7:3) 6,7 0,062 583,71 16,92 1,53 272,90 4

Вода-пропанол-1 (6:4) 6,8 0,074 344,05 16,77 1,47 226,62 7

Вода-пропанол-1 (5:5) 6,5 0,097 126,91 15,70 1,42 161,86 26

Вода-пропанол-1 (2:8) 6,3 0,110 75,73 14,56 1,31 132,36 49

Пропанол-1 6,6 0,160 36,81 14,03 1,13 87,69 91

Циклофосфан

Вода-пропанол-1 (7:3) 6,3 0,067 291,19 20,30 2,22 302,99 17

Вода-пропанол-1 (6:4) 6,1 0,072 240,56 19,02 2,12 264,17 19

Вода-пропанол-1 (5:5) 6,2 0,098 155,71 17,62 1,84 179,80 21

1 2 3 4 5 6 7 8

Вода-пропанол-1 (2:8) 6,6 0,110 125,82 16,64 1,52 151,27 23

Пропанол-1 6,7 0,160 85,88 14,80 1,21 92,50 19

Ифосфамид

Вода-пропанол-1 (7:3) 6,5 0,066 434,39 27,84 3,28 421,82 15

Вода-пропанол-1 (6:4) 6,8 0,076 362,76 20,43 2,00 268,82 9

Вода-пропанол-1 (5:5) 6,3 0,099 240,61 16,76 1,66 169,29 8

Вода-пропанол-1 (2:8) 6,5 0,100 162,80 8,57 0,32 85,70 4

Пропанол-1 6,4 0,190 69,05 8,14 0,27 42,84 6

Исследованы особенности экстрагирования хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида из водных растворов гидрофобными (гексан, бензол, метиленхлорид, этилацетат, бутанол-1, диэтиловый эфир) и гидрофильными (ацетонитрил, ацетон, пропанол-1, пропанол-2, диоксан) органическими растворителями в зависимости от природы экстрагентов и насыщения их водой, рН среды, присутствия в водной фазе электролитов. Установлены оптимальные условия экстрагирования хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида, представленные в таблице 6.

Таблица 6 Оптимальные условия экстрагирования хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида из водных растворов методом жидкость-жидкостной экстракции

Исследуемое вещество Экстрагент Электролит Значения рН среды

Хлорамбуцил Этилацетат Натрия бромид рН 5-9

Циклофосфан Метиленхлорид Натрия сульфат

Ифосфамид Метиленхлорид Натрия хлорид

При использовании оптимального экстрагента в условиях насыщения водной фазы электролитом удается извлечь не менее 90,93% хлорамбуцила, 93,09% циклофосфана и 97,75% ифосфамида (при г=1).

На основе предварительных исследований предложены варианты очистки извлечений из биоматериала, содержащих хлорамбуцил, циклофосфан и ифосфамид, от соэкстрактивных веществ методами нормальнофазовой и обра-щеннофазовой колоночной хроматографии, нормальнофазовой и обра-щеннофазовой ТСХ, сочетанием жидкость-жидкостной экстракции и колоночной хроматографии и показана достаточная эффективность каждого из предлагаемых вариантов очистки.

Проведено сравнительное изучение изолирования хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида из биоматериала изолирующими агентами различной природы. Полученные результаты представлены на рисунке 1.

Установлено, что наиболее высокий процент извлечения рассматриваемых соединений достигается при изолировании ацетоном.

из биоматериала различными изолирующими агентами.

Изучена зависимость степени извлечения рассматриваемых веществ из биологического материала от продолжительности настаивания. Установлено, что максимальные значения степени извлечения из ткани трупной печени достигаются уже при настаивании в течение 30 (ХБ) или 45 минут (ЦФ, ИФ). Исследование зависимости степени извлечения от объема изолирующего агента и кратности изолирования показало, что для достижения достаточно полного извлечения анализируемых веществ из биологического материала необходимо, по крайней мере, двукратное настаивание при условии, что масса ацетона в каждом случае превышает массу биологического материала как минимум в два раза.

На основании предварительных исследований разработаны методики определения изучаемых соединений в тканях трупных органов и биологических жидкостях (крови, плазме крови, моче) спектрофотометрическим методом после получения нитропроизводных объектов исследования. Анализируемые вещества извлекали из биоматериала путем двукратного настаивания с ацетоном, получаемые извлечения очищали методами жидкостной колоночной хроматографии, тонкослойной хроматографии, сочетанием методов жидкость-жидкостной экстракции и колоночной хроматографии. Результаты представлены в таблице 7.

Как свидетельствуют полученные данные, при содержании анализируемых веществ в биоматериале в количестве 0,01-0,2% (хлорамбуцил) или 0,02-0,4% (циклофосфан, ифосфамид), значения степени извлечения составляют 66,9084,89% из ткани печени, 68,13-80,24% из крови, 71,16-86,56% из плазмы крови и 71,12-82,11% из мочи.

Таблица 7 - Результаты количественного определения изучаемых веществ в биологическом материале методом спектрофотометрии на основе реакции

нитрования после изолирования ацетоном и очистки различными методами (п-5; р=0,95) _;_____

г -I--/ Исследуемое вещество Содержание, мгв25 г биоматериала Найдено, %

Печень Кровь Плазма крови Моча

X Дх X Дх X Ах X Дх

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Очистка методом жидкостной колоночной хроматографии на сорбенте «Силикагель КСК» 40/100 мкм

Хлорам-буцил 2,5 82,99 3,91 78,69 3,84 84,33 4,06 75,21 2,93

12,5 83,97 3,19 79,15 2,84 85,43 3,17 76,11 2,43

50,0 84,89 2,62 80,24 2,28 86,25 2,26 77,11 1,86

Цикло-фосфан 5,0 72,68 3,34 74,82 2,98 75,71 2,68 80,18 2,37

25,0 74,01 2,53 75,53 2,35 76,51 2,29 81,05 2,03

100,0 75,59 2,18 75,91 2,04 77,21 1,94 81,90 1,78

Ифосфа-мид 5,0 70,91 3,20 72,94 3,04 75,89 2,81 78,11 2,39

25,0 71,91 2,64 73,97 2,48 77,06 2,36 79,09 2,03

100,0 72,78 2,19 74,79 2,08 77,86 1,94 79,51 1,72

Очистка методом жидкостной колоночной хроматографии на сорбенте «Силасорб С-18» 30 мкм

Хлорам-буцил 2,5 82,28 3,85 77,16 3,79 82,79 3,60 73,98 3,10

12,5 83,16 3,00 77,51 2,74 83,37 2,65 74,74 2,52

50,0 84,08 2,59 78,92 2,38 84,41 2,26 75,95 2,00

I (нкло-фосфан 5.0 70,71 3,30 2,55 2,15 72,29 2,92 73,89 2,64 78,19 2,33

25,0 71,95 73.74 73,59 74,20" 2,29 74,84 2,31 79,01 2,09

100.0 2,02 75,69 1,92 80,03 1,74

Ифосфа-мид 5,0 69,35 3,23 71,14 3,00 73,92 2,84 76,33 2,43

25,0 70,22 2,68 72,14 2,46 74,80 2,32 77,44 2,07

100,0 71,01 2,22 73,12 2,11 75,92 1,87 78,19 1,68

Очистка методом нормальнофазовой ТСХ

Хлорам-буцил 2,5 82,89 3,91 78,49 3,37 84,12 3,35 75,11 3,03

12,5 83,80 3,15 79,23 2,72 85,50 2,64 76,26 2,51

50,0 84,83 2,50 80,16 2,34 86,56 2,21 77,00 2,11

Цикло-фосфан 5,0 72,74 3,33 74,64 3,11 75,89 2,92 80,27 2,63

25,0 74,30 2,95 75,39 2,52 76,28 2,36 80,68 2,09

100,0 75,24 2,19 75,72 2,12 76,48 1,91 80,91 1,64

Ифосфа-мид 5.0 71,52 3,53 73,68 3,37 76,91 3,16 79,40 2,75

25,0 72,48 2,98 74,31 2,70 77,65 2,61 79,68 2,22

100,0 73,19 2,54 74,87 2,25 78,19 2,02 79,89 1,72

Очистка методом обращеннофазовой ТСХ

Хлорам-буцил 2,5 82,75 3,86 78,08 3,76 84,39 3,64 75,08 3,02

12,5 83,92 3,10 79,13 2,92 85,68 2,46 75,93 2,16

50,0 84,65 2,54 80,21 2,31 86,28 2,12 76,94 1,98

Цикло-фосфан 5,0 72,84 3,50 75,04 3,07 75,97 3,01 80,39 2,50

25,0 74,25 2,91 75,78 2,45 76,69 2,35 81,25 2,13

100,0 75,81 2,36 76,12 2,11 77,43 1,95 82,11 1,84

Ифосфа-мид 5,0 71,19 3,49 73,22 3,14 76,17 2,92 78,39 2,58

25,0 72,17 2,73 74,25 2,63 77,41 2,50 79,38 2,07

100,0 73,01 2,44 75,13 2,27 78,14 2,03 79,82 1,82

1 1 2 |3|4|5|6|7|8|9|10

Очистк Хлорам-буцил а сочетанием мет ж '" 2,5 12,5 одов Ж1 1ДК0СТН 79", 51 80,46 дкость-ой коло " 4,84" 4,04 жидкост ■очной 75.72 гной экс <ромато 4~67 " 3,85 тракцш графин 80,74 82,16 и норм 4,45 3,74 " алыюфа 71,59 72.69 73,75 130В0Й 4,35 "3,63" 2^50

76,18

50,0 81,51 2,97 77,69 2,77 82,69 2,67

Цикло-фосфан 5,0 68,59 3,69 70,35 3,38 71,60 3,13 76,23 2,82

25,0 69,74 3,00 71,45 2,92 72,73 2,72 77,00 2,54

100,0 71,12 2,61 72,34 2,52 73,55 2,39 77,91 2,26

Ифосфа-мид 5,0 67,44 3,72 69,10 3,44 72,05 3,29 74,31 2,91

25,0 68,21 3,09 70,12 2,91 72,93 2,82 75,26 2,48

100,0 69,40 2,70 71,24 2,59 73,88 2,46 76,13 2,16

Очистка сочетанием методов жидкость-жидкостной экстракции и обращеннофазовой жидкостной колоночной хроматографии

Хлорам-буцил 2,5 79,01 5,04 75,09 4,93 80,13 4,90 71,12 4,87

12,5 79,94 4,35 75,62 4,06 81,60 3,97 72,11 3,90

50,0 81,08 3,53 77,13 3,21 82,10 3,12 73,24 3,01

Цикло-фосфан 5,0 68,05 3,84 69,93 3,41 71,16 3,10 75,63 2,84

25,0 69,67 3,05 71,59 2,88 72,37 2,69 76,57 2,57

100,0 70,65 2,64 71,92 2,55 73,07 2.34 77,64 2,22

Ифосфа-мид 5,0 66,90 3,76 68,13 3,46 71,45 3,25 73,74 2,87

25,0 67,82 3,13 69,61 2,90 72,53 2,77 74,72 2,54

100,0 68,96 2,67 70,77 2,56 77,36 2,40 77,26 2,21

Исследования по выявлению определяемого минимума анализируемых веществ проводили на основе изолирования ацетоном и очистки извлечений сочетанием методов жидкость-жидкостной экстракции и нормальнофазовой колоночной хроматографии. Результаты представлены в таблице 8.

Таблица 8 - Результаты количественного определения хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида в биоматсриалс при исследовании определяемого минимума (п-5; р=0,95)__

Исследуемый биообъект Внесено вещества, мг в 25 г биоматериала Найдено, % Исследуемый биообъект Внесено вещества, мг в 25 г биоматериала Найдено, %

X Дх X Ах

1 2 3 4 5 6 1 8

Хлорамбуцил

Печень 0,025 1 77,23 5,95 Кровь 0,015 73,93 5,60

0,05 78,40 5,31 0,025 74,30 5,07

0,1 78,81 4,75 0,05 74,93 4,74

0,25 79,58 4,49 0,15 75,36 4,47

0,6 80,19 4,02 0,3 75,89 3,98

Моча 0,0075 70,61 4,41 Плазма крови 0,01 79,02 5,54

0,0125 71,25 3,97 0,02 79,73 4,98

0,025 71,84 3,67 0,04 80,08 4,65

0,075 72,50 3,26 0,1 80,64 4,21

0,15 72,96 2,99 0,2 81,13 3,80

1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8

Циклофосфан

Печень 0,05 67,84 5,84 Кровь 0,025 69,16 5,53

0,1 68,36 5,30 0,05 69,44 4,97

0,2 69,12 4,74 0,1 70,08 4,59

0,5 69,92 4,47 0,25 70,69 4,36

1,25 70,84 4,03 0,6 71,58 3,91

Моча 0,0125 0.025 ..... 0.05 74,34 74,59 75,27 4,72 Плазма крови 0,015 70,18 4,91

4,36 0,03 70,69 4,64

4,03 0,075 70,92 4,24

0,125 75,81 3,67 0,15 71,54 3,93

0,3 76,01 3,26 0,4 72,69 3,55

Ифосфамид

Печень 0,05 67,05 5,56 Кровь 0,025 67,69 5,47

0,1 67,62 5,26 0,05 68,65 5,02

0,2 67,93 4,54 0,1 69,21 4,42

0,5 68,54 4,30 0,25 69,85 4,10

1,25 68,72 4,08 0,6 70,04 3,86

Моча 0,0125 72,58 4,77 Плазма крови 0,015 70,19 5,02

0,025 72,88 4,54 0,03 70,42 4,84

0,05 73,55 4,07 0,075 70,84 4,34

0,125 74,29 3,75 0,15 71,53 3,83

0,3 74,63 3,18 0,4 71,97 3,44

При очистке извлечений из биологических объектов сочетанием жидкость-жидкостной экстракции и колоночной хроматографии определяемый минимум хлорамбуцила составляет 0,1 мг на 100 г ткани органа или 0,06 мг, 0,04 мг и 0,03 мг на 100 г крови, плазмы крови и мочи соответственно, а определяемый минимум циклофосфана и ифосфамида - 0,2 мг на 100 г ткани органа или 0,1 мг, 0,06 мг и 0,05 мг на 100 г крови, плазмы крови и мочи соответственно.

Изучены особенности распределения рассматриваемых соединений в организме теплокровных животных (крысы). Исследования проводили на здоровых животных и'животных с нарушением выделительной функции почек.

Почечную патологию моделировали, однократно вводя подопытным животным ртути дихлорид впутрижелудочно в дозе 2 мг/кг. О формировании нарушения выделительной функции почек судили на третьи сутки с момента начала эксперимента по концентрации креатинина и мочевины в сыворотке крови.

Экспериментальным животным (5 групп по 5 особей в каждой) массой 210260 г впутрижелудочно вводили тройные дозы и)5о хлорамбуцила (120 мг/кг), циклофосфана (600 мг/кг) и ифосфамида (430 мг/кг) в виде водной суспензии. Пяти особям контрольной группы в желудок вводили воду очищенную. После гибели животных одинаковые органы и биожидкости, взятые от крыс внутри каждой из групп, объединяли и исследовали на наличие в них рассматриваемых соединений. Результаты представлены на рисунках 2-4.

4 Здоровые животные * Животные с нарушением выделительной фунынш поча

Рис. 2. Распределение хлорамбуцила в организме теплокровных животных (здоровых и с нарушением выделительной функции почек (мг в 100 г органа/биожидкости)).

Кровь Печень Почти Мозг Мышпы Сердце

Легки Селезенка Мочевой путыръ

« Здоровые животные « Животные с нарушением выделительной фушсшш поте«

Рис. 3. Распределение циклофосфана в организме теплокровных животных (здоровых и с нарушением выделительной функции почек (мг в 100 г органа/биожидкости)).

пузырь

-1 Здоровые животные »'Жгаогеы« с нарушением «ыделггельиой функциишия

Рис. 4. Распределение ифосфамида в организме теплокровных животных (здоровых и с нарушением выделительной функции почек (мг в 100 г органа/биожидкости)).

Как видно из данных рисунка 2, в организме здоровых животных значительные количества хлорамбуцила содержатся в крови, мочевом пузыре, селезенке, а в организме животных с нарушением выделительной функции почек -в крови, печени, почках.

Циклофосфан в организме здоровых животных в наибольших количествах обнаруживается в почках, мочевом пузыре, легких, печени, а в организме животных с нарушением выделительной функции почек - в почках, крови, селезенке, сердце.

В организме здоровых животных наибольшие количества ифосфамида содержатся в печени, мочевом пузыре, почках, а в организме животных с нарушением выделительной функции почек - в печени, селезенке, сердце.

Общее количество находящихся в организме производных бис-(Р-хлорэтил)-амина у крыс с нарушением выделительной функции почек увеличено в 1,3-2,5 раза в сравнении со здоровыми при прочих равных условиях.

Исследованы сроки сохранения изучаемых соединений в гнилостно разлагающемся трупном материале при температурах от -12 до 36°С. Результаты представлены на рисунке 5.

1 3 7 14 21 28 35 42 49 Ифосфамид Время, сулеи

Рис. 5. Результаты изучения сохраняемости хлорамбуцила, циклофосфана и ифосфамида в гнилостно разлагающемся трупном материале.

Установлено, что изучаемые соединения = обнаруживаются в трупном материале при-12°С в течение 5-7 недель, при 2-10°С в течение 4-6 недель, при 18-36°С в течение 2-3 недель с момента начала эксперимента.

По результатам проведенных исследований предложено 2 варианта общей схемы исследования биологического материала при отравлении хлорамбуцилом, циклофосфаном и ифосфамидом, которые позволяют изолировать, очистить, идентифицировать и количественно определить исследуемые производные бис-ф-хлорэтил)-амина.

ВЫВОДЫ

1. Установлены особенности поглощения хлорамбуцилом (ХБ), циклофосфаном (ЦФ) и ифосфамидом (ИФ) электромагнитного излучения в УФ-, видимой и ИК- областях спектра в девяти различных растворителях, рассчитаны удельный и молярный коэффициенты поглощения. Предложены варианты идентификации исследуемых веществ по их электронным и колебательным спектрам.

Разработаны методики количественного спектрофотометрического определения рассматриваемых соединений на основе собственного поглощения в среде этанола и на основе поглощения их нитропроизводных в среде 10% раствора натрия гидроксида. Относительная ошибка среднего результата методик (п=6; р=0,95) не превышает 1,63% и 2,53% соответственно.

2. Установлены особенности хроматографического поведения ХБ, ЦФ и ИФ в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и привитой поверхностями. Оптимальными подвижными фазами для хроматографирования исследуемых веществ в тонких слоях сорбента являются гексан-диоксан-пропанол-2 10:5:1 и 12,5:5:1 (нормальнофазовая 'ГСХ) и вода-пропанол-1 8:2 (обращеннофазовая ТСХ), в колонках сорбента - гексан-диоксан-пропанол-2 22,5:5:1 (ХБ), 20:0,5:1 (ЦФ) и 17,5:5:0,75 (ИФ) (нормальнофазовый сорбент) и вода-пропанол-1 8:2 (ХБ) и 7:3 (ЦФ, ИФ) (обращеннофазовый сорбент). Разработана методика определения ХБ, ЦФ и ИФ с использованием газожидкостной капиллярной хроматографии с масс-селективным детектированием.

3. Установлены оптимальные условия экстрагирования исследуемых веществ из водных растворов (экстрагенты - этилацетат (ХБ) и метиленхлорид (ЦФ, ИФ), электролиты - натрия бромид (ХБ), натрия сульфат (ЦФ), натрия хлорид (ИФ)). В оптимальных условиях удается извлечь 90,93-98,28% ХБ, 93,0994,97% ЦФ и 97,75-99,34% ИФ.

4. Установлено, что лучшим изолирующим агентом для извлечения ХБ, ЦФ и ИФ из биоматериала методом настаивания является ацетон. Определены оптимальные условия изолирования (двукратное настаивание в течение 30 (ХБ) или 45 минут (ЦФ и ИФ) при массовом соотношении «ацетон-биоматериал» 2:1) и разработаны методики определения анализируемых веществ в тканях трупных органов и биожидкостях (крови, плазме крови, моче). Установлено, что при содержании анализируемых веществ в биоматериале в количестве 0,01-0,2% (ХБ) или 0,02-0,4% (ЦФ, ИФ), значения степени извлечения составляют 66,90-84,89% из ткани органа, 68,13-80,24% из крови, 71,16-86,56% из плазмы крови и 71,1282,11% из мочи.

Определяемый минимум ХБ составляет 0,1 мг на 100 г ткани органа или 0,06 мг, 0,04 мг и 0,03 мг на 100 г крови, плазмы крови и мочи соответственно, а определяемый минимум ЦФ и ИФ - 0,2 мг на 100 г ткани органа или 0,1 мг, 0,06 мг и 0,05 мг на 100 г крови, плазмы крови и мочи соответственно.

5. Установлены особенности распределения токсических доз рассматриваемых веществ в организме теплокровных животных (крысы). Исследуемые соединения в значительных количествах обнаруживаются в мочевом пузыре, крови, селезенке (ХБ), почках, мочевом пузыре, легких, печени (ЦФ), мочевом пузыре, почках, печени (ИФ).

При нарушении выделительной функции почек подопытных животных исследуемые соединения в наибольших количествах присутствуют в почках, печени, крови (ХБ), почках, селезенке, крови, сердце (ЦФ), печени, селезенке, сердце (ИФ). Также отмечается достоверное увеличение общего количества находящихся в организме изучаемых веществ в 1,3-2,5 раза в сравнении со здоровыми животными.

6. Установлены сроки сохранения ХБ, ЦФ и ИФ в модельных смесях с гнилостно разлагающейся трупной печенью при различных температурных режимах (от -12°С до 36°С). Изучаемые соединения обнаруживаются в трупном материале в течение 5-7 недель при -12°С, в течение 4-6 недель при 2-10°С и в течение 2-3 недель при 18-36°С.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шорманов, В.К. Идентификация хлорамбуцила методом электронной спектрофотометрии / В.К. Шорманов, М.Л. Столяров // Биотехнология и биомедицинская инженерия: сборник материалов V Все-российской научно-практической конференции с международным участием. - Курск : ГОУ ВПО КГМУ Минздравсоцразвития России, 2012. - С. 105-108.

2. Шорманов, В.К. Идентификация циклофосфамида и ифосфамида методом электронной спектрофотометрии / В.К. Шорманов, М.Л. Столяров // Биотехнология и биомедицинская инженерия: сборник материалов V Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. -Курск : ГОУ ВПО КГМУ Минздравсоцразвития России, 2012. - С. 102-105.

3. Выделение, хроматографическая очистка и определение хлорамбуцила при исследовании плазмы крови / МЛ. Столяров,

B.К. Шорманов, Г.В. Сипливый, И.Х. Яфарова // Фундаментальные исследования. - 2013. - № 9, (ч. 5). - С. 922-924.

4. Шорманов, В.К. Изолирование хлорамбуцила из биологического материала / В.К. Шорманов, М.Л. Столяров // Научные ведомости БелГУ. Серия Медицина. Фармация. - 2013. - № 25 (168). -

C. 249-253.

5. Столяров, М.Л. Сравнительное изолирование хлорамбуцила из крови / М.Л. Столяров // Материалы XIV Всероссийской научно-практической конференции имени профессора Л.П. Кулёва студентов и молодых учёных с международным участием «Химия и химическая технология в XXI веке». -

Томск : Изд-во Томского политехнического университета, 2013. - Т. 1. -С. 218-220.

6. Шорманов, В.К. Количественное определение хлорамбуцила методом электронной спектрофотометрии / В.К. Шорманов, М.Л. Столяров // Биотехнология и биомедицинская инженерия: сборник материалов VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. -Курск : ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России, 2013. - С. 81-83.

7. Шорманов, В.К. Количественное определение хлорамбуцила методом электронной спектрофотометрии на основе получения его нитропроизводного /

B.К. Шорманов, М.Л. Столяров // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сборник материалов VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Курск : ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России, 2013. -

C. 84-87.

8. Шорманов, В.К. Определение отдельных производных бис-(Р-хлорэтил)-амина в тонком слое обращеннофазового сорбента / В.К. Шор-манов, М.Л. Столяров // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сборник материалов VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. - Курск : ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России, 2013. — С. 79-81.

9. Шорманов, В.К. Определение отдельных производных бис-(Р-хлорэтил)-амина в тонком слое нормальнофазового сорбента / Университетская наука: Взгляд в будущее / В.К. Шорманов, Г.В. Сипливый, М.Л. Столяров // Материалы итоговой научной конференции сотрудников КГМУ, ЦентральноЧернозёмного научного центра РАМН и отделения РАЕН, посвящённой 78-летию Курского государственного медицинского университета (7 февраля 2013 года). -Курск : ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России, 2013.

Т. 2.-С. 165-168.

10. Шорманов, В.К. Определение хлорамбуцила в биологических жидкостях / В.К. Шорманов, М.Л. Столяров, Г.В. Сипливый // Фармация. -2014.-№2.-С. 3-6.

11. Шорманов, В.К. Спектрофотометрическое определение циклофосфана и ифосфамида на основе получения их нитропроизводных / В.К. Шорманов, М.Л. Столяров // Научные ведомости БелГУ. Серия Медицина. Фармация. - 2014.-№ 11 (182). - С. 256-259.

12. Шорманов, В.К. Экстракция ифосфамида из водных растворов / В.К. Шорманов, М.Л. Столяров, Г.В. Сипливый // Вестник ВолгГМУ : приложение (Материалы V Всероссийского научно-практического семинара молодых ученых с международным участием «Геномные и протеомные технологии при создании лекарственных средств»), - Волгоград: Изд-во ВолгГМУ, 2014. - С. 151-152.

13. Столяров, М.Л. Определение ифосфамида в плазме крови человека / М.Л. Столяров, В.К. Шорманов, Г.В. Сипливый // Вестник ВолгГМУ: приложение (Материалы V Всероссийского научно-практического семинара молодых ученых с международным участием «Геномные и протеомные технологии при создании лекарственных средств»). - Волгоград: Изд-во ВолгГМУ, 2014. - С. 129-130.

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 25.11.2014 г. Подписано в печать 28.11.2014 г. Формат 30x42'/8 Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 283(A). Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.