Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Характеристика поверхностного фенотипа лимфоцитов детей разных возрастных групп, страдающих бронхиальной астмой

На правах рукописи

СЫЧЕВА Ольга Валерьевна

- ^ НОЯ

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОВЕРХНОСТНОГО ФЕНОТИПА ЛИМФОЦИТОВ ДЕТЕЙ РАЗНЫХ

ВОЗРАСТНЫХ ГРУПП, СТРАДАЮЩИХ БРОНХИАЛЬНОЙ

АСТМОЙ

(14.00.36 - Аллергология и иммунология)

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

-МОСКВА 1999-

Работа выполнена в Российском Государственном медицинском Университете.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты: Профессор, доктор биологических наук Профессор, доктор медицинских наук

Ведущее учреждение:

ГНЦ-РФ - Инсппут имму нологии Минздрава России

Защита диссертации состоится" " 1999 г. в

" часов на заседании Специализированного Совета (Д-085-14.06) при Российском Государственном медицинском Университете по адрес}': 117869. г. Москва, ул. Островитянова 1.

Г.В.Порядин

Ж.М.Салмаси

В.М.Бержец В.И.Пыцкшг

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского Государственного медицинского Университета.

Автореферат разослан" " 1999 г.

Ученый секретарь специализированного совета доцент

Т.Е. Кузнецова

/О У 3 .3 2. 9.(1 О -¿СП

Общая характеристики работы

Актуальность темы.

Бронхиальная астма (БА) принадлежит к числу распространенных аллергических болезней детского возраста. причем, начавшись у детей, часто продолжается (в 60-80% случаев) в зрелом возрасте. становясь причиной инвалидности. а иногда и драматических исходов.

БА в детском возрасте характеризуется рядом особенностей. В определенной мере она может быть названа "переходной" - в части случаев заболевание несет черты, свойственные раннему детскому возрасту, у других приобретает отчетливые черты, свойственные "взрослой"" астме. У детей бронхиальная астма. как правило представлена атопической формой, в основе которой, как и у взрослых, лежат механизмы гиперпродукции реагиновых антител и друтие процессы, контролируемые регуляторными Т-лимфошгпши (Балаболкин И.И.. 1995; Новиков Д.К! ссоавт.. 1997).

Для оценки этих нарушений в настоящее время широко используется изучение поверхностного фенотипа лимфоцитов с использованием моноклоналъ-ных антител. В современной литературе, посвященной изучению поверхностных рецепторов лимфоцитов при бронхиальной астме, в том числе и у детей, в большинстве работ оцениваются преимущественно нарушения популяшгонного и субпопудяшюнного состава лимфоцитов (Hsieli . 19X2: Tsai et al.. 1990: Locar et al.. 1990; Geinou Engcsacth et 1.. 1994). В послсднисс время появились работы по изучения активационных процессов у детей с атопией. однако, этих работ немного. К тому же имеющиеся в литературе сведения ограничены небольшим спектром используемых моноклональных антител (Geniou Engesaeth et 1.. 1994; Gargo et al.. 1995: Abcrle et al.. 1997).

Известно, что на фоне успешного лечения атопической бронхиальной астмы у взрослых пациентов наблюдается изменение экспрессии поверхностных рецепторов лимфоцитов (Порядин Г.В. с соавт.. 1992: Салмаси Ж.М.. 1992; 1998). Очевидно, что выявление и определение характера изменений поверхностного фенотипа лимфоцитов у детей с атопической бронхиальной астмой позволит более детально изучить патогенез этого заболевания, дать обоснованное подтверждение использования специфической иммунотерапии у детей, исследовать действие разрабатываемых лекарственных препаратов, а также осуществлять контроль эффективности их применения.

В этой связи целью настоящей работы явилось изучение поверхностного фенотипа лимфоцитов детей, страдающих бронхиальной астмой в разных возрастных группах и влияние на него специфической гипосенсибилизации и отечественного фармакологического препарата "Сибусол".

Задачи исследования.

1. Изучить популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов детей с атопической бронхиальной астмой и здоровых детей.

2. Провести сравнительную характеристик) популяционного и субпопуля-ционного состава лимфоцитов детей и взрослых с атопичсской бронхиальной астмой.

3. Изучить экспрессию поверхностных активационных маркеров лимфоцитов детей , страдающих атопичсской бронхиальной астмой и здоровых детей.

4. Провести сравнительную характеристику поверхностных активационных маркеров лимфоцитов детей к взрослых, страдающих бронхиальной астмой.

5. Изучить влияние специфической иммунотерапии на экспрессию поверхностных маркеров лимфоцитов у детей с атопичсской бронхиальной.

6. Изучить влияние препарата СИБУСОЛ на экспрессию поверхностных маркеров лимфоцитов больных атопичсской бронхиальной астмой детей в условиях in vitro.

Научная повита исследований.

Впервые проведено экспериментальное исследование поверхностного антигенного состава лимфоцитов у детей разных возрастных групп, страдающих атопичсской бронхиальной астмой с использованием широкого спектра отечественных моноклональных антител (мАТ). Впервые проведен сравнительный анализ поверхностного антигенного состава лимфоцитов детей и взрослых с атопичсской бронхиальной астмой с использованием отечественных мАТ. Впервые выявлено, что специфическая иммунотерапия сопровождается усилением индукции апоптоза лимфоцитов у детей с атопичсской бронхиальной астмой. Изучен иммуномодулирующии эффект нового отечественного препарата сибусола в экспериментальной модели in vitro.

Практическая тачимость работы.

Полученные результаты работы расширяют представления о механизмах атопичсской бронхиальной астмы у детей и особенностях нарушения клеточного иммунитета по сравнению со взрослыми пациентами. Показано нормализующее влияние СИТ на показатели клеточного иммунитета у детей с атопичсской бронхиальной астмой.что может быть использовано в качестве дополнительного критерия при сущсствлении иммунологического контроля эффективности специфической иммунотерапии. Эти же изменения могут послужить дополнительным критерием эффективности лечения медикаментозными препаратами ее лечения медикаментозными препаратами. Изучение иммунотропно-го действия отечественного препарата "Сибусол" делают перспективным его использование у больных с аллергией.

Апробация работы.

Материалы диссертации были доложены на II Национальном Конгрессе Российской Ассоциации Аллергологов и клинических иммунологов (РААКИ) (г.Москва. 1998). на Всероссийской научно-практической конференции "Аллергические болезни у детей" (г. Москва. 1998). на научных конференциях кафедры патофизиологии РГМУ.

Публикации

По результатом днеертации опубликовано 4 печатные работы. Структура и от,см диссертации.

Диссертационная работа изложена на 102 страницах машинописного текста и состоит из введения, об'.ора литературы. 7 глав собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована IX таблицами и 11 рисунками. Указатель литературы включает IX1) названий (отечественных - 99. зарубежных - 90).

Содержание работы

Материалы и методы.

Настоящая работа выполнена на лимфоцитах периферической крови 51 ребенка. больного атопическои бронхиальной астмой в возрасте от 6 до 14 лет. В качестве контрольных исследований оценивали исследуемые показатели на лимфоцитах 20 практически здоровых детей и 3 1 взрослого больного атопическои бронхиальной астмой в возрасте от IX до 40 лет. Подбор больных детей осуществляли на базе стационара НИИ Педиатрии Научного Центра здоровья детей РАМН.

Диагноз АБА подтверждался, помимо наличия соответствующей симптоматики. выявлением реакций гнперчувствительности немедленного типа (ГНТ) при проведении кожного тестирования.

Степень тяжести заболевания (легкая, средне-тяжелая, тяжелая) и его период (мсжприступный. приступный. постприступный) определяли на основании критериев классификации бронхиальной астмы у детей (Национальной программы "Бронхиальная астма у детей. Стратегия лечения и профилактика" . 1997).

Обследование детей, больных атопнческой бронхиальной астмой проводили в мсжприступный период. У всех детей была выявлена поливалентная сенсибилизация к пыльце растений, домашней пыли и эпидермальным аллергенам разл1пной степени. Возраст 3 1 ребенка колебался от 6 до 11 лет и 20 детей - от 12 до 14 лет. 21 ребенок страдали астмой Л года или менее. 17 детей - более 3 лет. но меньше 5. и 1.1 детей имели длительность заболевания 5 и более лет. Тяжесть заболевания у 20 детей расценена как легкая, у 20 - как средне-тяжелая. и у 11 детей - тяжелая. Лечение проводили р:-адреномимстиками (дитек. сервент). метилксантинами - ингибиторами Арпуриновых рецепторов (теопек. эуфидлин). стабилизаторами мембраны тучных клеток (интал. кето-тифен). блокаторами Н|-гиста.миновых рецепторов (тавегил. клариназе. клари-тин). ингибиторами лейкотриеновых рецепторов (аколат). муколитиками (сем-

прскс. бизолвон). Специфическая и.мунотерапия была использована для лечения 12 детей с АБА. Лечение проводили по стандартной схеме (Балаболкин И.И. с соавт.. 19%) водно-солевыми экстрактами адтергенов домашней пыли и пыльцевых аллергенов. Помимо основного диагноза у ряда больных детей был поставлен сопутствующий диагноз: поллнноз у IX детей и атопический дерматиту 11.

Для проведения исследования кровь брали из локтевой вены натощак в утренние часы и стабилизировали раствором этилсндиамннтстраацетата натрия (ЭДТА). Лимфоциты выделяли в одноступенчатом градиенте плотности фи-кол-верографина по методу Воушп в стерильных условиях. Жизнеспособность лимфоцитов оценивали сразу после выделения из крови и в конце инку бации с испытуемым веществом методом исключения трипанового синего. В дальнейшем выделенные клетки ресуспензнровали в забуференном фосфатами физиологическом растворе (ЗФР).

Определение содержания в периферической крови и в культуре in vitro лимфоцитов, экспрсссирующих антигены CD.1. CD4. CDS. CD72. CD25. CD71. HLA-DR, CD23. CD95 проводили методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител серий ЛТ и И КО. Реакцию ставили в микроварианте на стекле. Препарат микроскопнровали в водной иммерсионной системе с использованием люминесцентного микроскопа "Люмам ИЗ". Оценивали наличие и специфичность флюоресценции не менее чем у 200 клеток. Клетки с морфологией моноцитов не учитывали.

Влияние сибусола на экспрессию лимфоцитами исследуемых антигенов изучали в концентрации:« 0.5- мкг/.мл. 5 мкг/мл и 50 мкг/мл до и после инкубации. Лимфоциты инкубировали с исследуемым препаратом в среде 199 в течение 16 часов.

Определение достоверности различий полученных результатов проводили при большой выборке с помощью критерия t Стьюдента. при малой выборке с ненормальным распределением, а также при сравнении попарно связанных вариант - с применением нспараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни (Лакин Г.Ф.. 1УУ0). Расчеты проводили на персональном компьютере с применением пакета прикладных программ "Statistica".

В таблицах укатаны среднее арифметическое значение соответствующего параметра и его средняя ошибка (М±ш). На рисунках также представлено среднее значение изучаемого показателя и его ошибка.

Результаты соЛстнснпых исследований и их обсуждение.

Исследования особенностей популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови детей страдающих бронхиальной астмой начали с изучения экспрессии мембранных гликопротеидны.х молекул CD3 (Т-

клетки). CD4 (Т-.\елпсры/индукторы). CDS (Т-супресеоры) и CD72 (маркер зрелых В-лимфоцитов).

Анализируя результаты, мы не выявили различий по используемым маркерам между группами здоровых детей (табл. 1).

Табл. 1.

Характеристика популшшонпого и субшшуляипошюго состава лимфоцитов периферической кропи здоровых детей и детей с АБА.

% клеток

Маркер Здоровые дети Дети с АБА

6-11.1С т 12-14 лет 6-11 лет 12-14 лет

(п=14) (п=6) (п=31) (п=20)

CD3 65.6Х±2,12 63,1б±2,68 6П,99±1.72 59,63±2,31

CD4 36,04±0,70 Ж<)5±2,71 36,7Ш.Х7 32,62±2,20

CD8 32.26±1.60 30,47±2.92 30.58±1.75 28.60±1.97

CD4/CD8 1.14±<).<)5 1.22±0.17 1,32±0,11 1.28±0,19

CD72 11.83±1,13 11,66±2,32 17,78±1.!)1" 22,17±2,63"

Примечание: *-р<0,05 *-р<(),01; р отражает достоверность различия с соответствующими группам» l ipoiii.ix детей

У детей, больных БА не наблюдалось достоверных изменений количества Т-лнмфоцнтов (CD3). Т-хелперов/индукторов (CD4) и Т-супрессоров (CD8). хотя наблюдалась тенденция к снижению количества CD3 "-лимфоцитов в пе-рш|)ерической крови больных детей в обеих возрастных группах по сравнению со здоровыми детьми, а также тенденция к снижению количества CD4'- и CDS'-лимфоцитов у детей старшей возрастной группы. Было обнаружено достоверное увеличение количества лимфоцитов, несущих С072-антиген в 1.5 раза в младшей возрастной группе (17.7Х±1.91%) (р<0.05) и в 2 раза в старшей возрастной группе (22.17±2.63%) (р<0.01) по сравнению со здоровыми детьми (11.79±1.00%) (рис.1).

Таким образом, наиболее характерным изменением популяционного состава лимфоцитов периферической крови при АБА у детей следует признать достоверное увеличение содержания В-лимфоцитов при тенденции к уменьшению как общего количества Т-клеток. так и клеток иммунорегуляторных субпопуляций.

115 110 105 % 100 95 90 85

□ Дети с АБА 6-11 лет И Дети с АБА 12-14 лет

¿Шщщ

СйЗ

СЕМ

СР8

С072

Рисунок- 1. Изменения величины экспрессии попудяционных и субпопуляци-онных маркеров лимфоцитами периферической крови детей с АБА (за 100% принята экспрессия маркеров у здоровых детей). По оси ординат - % клеток, экспрессируюший соответствующий антиген, по оси абсцисс - антигенный маркер.

Табл.2.

Характеристика поиуляшшшшн) и субиоиуляшюшшго состава лимфоцитов периферической кропи ипрошлх дегем н рашмх возрастных

% К. 1С ГПК

Маркер Здороиые доги Здоровые

6-11 .тег 12-14 лег щрослыс доноры

(п=14) (п=6) (п=18)

СЭЗ 65,68±2,12 63.1 (>±2.68 65.05±1.Ю

СЭ4 36,04±0,70 38.05±2,71 37,89±1,56

СЭ8 32.26± 1,60 30.47±2,92 26.32±0,92"

С04/СБ8 1.14±0.05 1.22±0.17 1,7Ч±1,83

СЭ72 11,83±1,13 11.66±2,32 9,39±0,80

Примечание: '-р<0,1)5

р- отражает достоверность различии между группам»

Далее нами было поведено сравнение основных регуляторных популяций и субпопуляций лимфоцитов детей с АБА в разных возрастных группах и взрослых больных с той же патологией. Группа взрослых больных включала паци-

ентов с легким и средне-тяжелым течением заболевания вне клинического обострения. Предварительно мы провели сравнение исследуемых показателей в группах здоровых детей и здоровых взрослых доноров. Достоверных отличий между группами по экспрессии маркеров CD."i. CD4. CD72 мы не выявили, хотя экспрессия маркера CD72 в группе здоровых взрослых доноров была несколько ниже, чем в группах здоровых детей. Количество Т-супрессорных клеток было достоверно ниже (табл.2).

При сравнении интересующих нас параметров у детей с АБА в двух возрастных группах и взрослых с той же патологией были получены следующие результаты (рис.2).

%

70 60 50 40 30 20 10 0

Œ7!

□ Взрослые с АБА

□ Дети с АБА 12-14 лет ШДети с АБА 6-11 лет

/—у

-Я

XVî&t

CD3

CD4

CD8

CD72

Рисунок 2. Сравнительная характеристика популяционного и субпопуляцион-ного состава лимфоцитов детей и взрослых с АБА. По оси ординат - % клеток, экспрессирующий соответствующий антиген, по оси абсцисс - антигенный маркер.

Обнаружено, что изученные показатели Т-клеточного звена иммунной системы у детей практически не отличались от показателей у взрослых, хотя у детей младшей возрастной группы количество клеток, экспрсссирующих эти антигены было несколько выше, чем у детей старшей возрастной группы и взрослых с АБА. Что касается экспрессии антигена С072. то он у детей с АБА в старшей возрастной группе (22.17±2.63%) оказался значительно выше, чем у взрослых больных (15.81±1.67%) и проявил тенденцию к росту у детей в младшей возрастной группе. Можно предположить, что при БА у детей изменения в В-клеточном звене играют более важную роль в развитии этой патологии. чем у взрослых.

Далее мы провели изучение экспрессии агитационных маркеров лимфоцитов. Определяли лимфоциты с маркерами ранней активации: СЭ25 (рецептор хтя ИЛ-2). С071 (рецептор для трансферрина). СЭ23 (низкоаффинный рецептор для Ис-фрагмента 1уЕ. маркер активации В-лимфоцитов) и количество лимфоцитов с маркерами поздней аыгтвации: НЬА-ЭЯ и С095(рецептор для запуска апоптоза) (табл.3).

Табл. 3.

Характеристика актннациоппмх маркеров лимфоцитов периферической

кропи здоровых детей и имей с АБА в разных возрастных группах.

% клеток

Маркер Здоровые лети Деги с АБА

6-11 лет 12-14 лет 6-11.лет 12-14 лет

<п=Ы) (п=й) (п=31) (п=20)

CD23 5.37±0.85 4.12±0,37 12,30±1.27" 11,97±1,29"

CD25 12,№±1.2Х 1().')7±1.41 24.2 1±I.W" 20.10±2,95*

CD7I 11.67±1.53 9.9,Ч± 1.70 23.63±2.24" 22 Л 7± 1,97'"

HLA-DR 21>.74±1,70 15.(il)±l.l)2 >2.17±2.(->1 "" 34.88±.3.68"

CD95 (>,74±1,01 5,50±1,Х1 12,8[±1,[9" 13 Л 9± 1,57"

Примечание: *-р<0,05 "*-р<0,01 "*-р«),001

р-отражаег достоверность различия с соответствующей группой здоровых детей

Как видно из рисунка 3 у детей больных бронхиальной астмой, независимо от возраста наблюдается достоверное повышение как ранних активацуонных маркеров CD25 и CD7l(no4Tii в 2 раза), так и поздних активационных маркеров HLA-DR (в 1.5 раза) по сравнению со здоровыми детьми. Наибольшие изменения были характерны хтя В-клеточного актнвационного маркера CD23 (у больных младшей возрастной группой 12.30+1.27%. и у больных старшей возрастной группы 11.97+1.29% против 4.16+0.80% у здоровых детей.(р<0,0()1). Характерно, что прирост количества активированных В-лимфошггов сопровождался приростом общего количества В-клеток. определяемых по экспрессии антигена CD72 в обеих возрастных группах больных астмой детей по сравнению со здоровыми, что может явиться основой хтя усиленного синтеза IgE при этом заболевании. Также для детей с БА было характерно повышение экспрессии рецептора апоптоза - антигена CD95 (р«).05). Возможно это связано с направленным апоптозом на Т-клеток.

Для сравнения экспрессии активационных маркеров лимфоцитами периферической крови детей и взрослых с АБА мы провели предварительные исследования интересу ющих нас показателей у здоровых детей и взрослых и обна-

рулили более высокий уровень активации по маркерам СЭ25. СЭ71 и НЬА-ОИ у детей (табл.4).

116 114 112 110 % 108 106 104 102 100

□Дети6-11лег ЕЗДети 12-14 лет

7

Сй23 СБ25 С071 Ш-А-йЯ

С095

Рисунок- 3. Изменение экспрессии активашюнных маркеров лимфоцитами периферической крови детей с АБА в разных возрастных группах (за 100% приняты аналогичные показатели у здоровых детей) По оси ординат - % клеток, экспрессируюши.х соответствующий антиген, по оси абсцисс - антигенный маркер.

Табл. 4.

Характеристика штерхностпых ак'пшашшнпмх маркеров лимфоцитов моропмх детей и рашых возрастных группах п здоровых взрослых

_доноров._

Маркер

% клеток

Здоровые дети

6-11 лет (п=14)

12-14 лет (п=6)

Здоровые взрослые доноры (п=18)

СР23 Сй25 СЭ71 НЬА-ОИ СБУ 5

5,37±0.85 l2.Kfcfcl.2S 11,67±|.53 20,74±1.70 6,74±1.01

4,12±0.37 10.97*1.41 9,9Х± 1.70 15.69±1,92 5,50±1.Х1

5,26±0.59 6.09±0.50" 6.31 ±0.40" И.93±0.55" 4,64±0,36

Примечание: -р<0,05

р- отражает достоверность различии между группами взрослых п де-

Сравнение экспрессии активашюнных маркеров лимфоцитами периферической крови детей и в ¡рослых, больных БА показало следующее (рис. 4). У детей с АБА экспрессия всех Т-клеточных .маркеров выражена больше, чем у взрослых больных.

Рисунок 4. Особенности экспрессии поверхностных активашюнных маркеров лимфоцитами детей и взрослых с АБА. По оси ординат - % клеток, экспрессирующих соответствующий антиген, по оси абсцисс - антигенный маркер.

Выявлены достоверные отличия в экспрессии ранних (СЭ25. С071) и поздних (НЬЛ-ОЯ. С095) активашюнных маркеров. Экспрессия позднего ак-тивационного маркера С095 у детей младшей возрастной группы составила 12.81±1.19%. в старшей возрастной группе 13.19*1.57% против 8.57±0.92% у взрослых (р<0.05). Как было сказано выше, экспрессия активашюнных маркеров у здоровых взрослых доноров и здоровых детей также различалась. Мы обнаружили более высокий уровень активации по маркерам С025. С071 и НЬА-ОЯ у здоровых детей по сравнению со здоровыми взрослыми донорами, однако экспрессия маркера СЭ95 практически не различалась. Так как экспрессия этих маркеров отражает определенные этапы активации лимфошггов. можно предположить, что клеточное звено имму нной системы у детей обладает большей пролиферативной активностью по сравнению со взрослыми.

Так как экспрессия различных активашюнных маркеров отражает разные этапы активации клетки, мы провели сравнение соотношений основных активашюнных маркеров С025/СЭ95 и НЬА-Э11/С095. Результаты сравнения представлены на рисунке 5.

Рисунок 5. Особенности соотношения активашгонных маркеров, экспресси-русмых лимфоцитами детей и взрослых с АБА. По оси ординат - величина соотношении активационных маркеров. по оси абсцисс - исследованные возрастные группы.

Как видно из рисунка у взрослых больных АБА эти соотношения выше, чем у детей. Уменьшение этих соотношений у детей происходит, прежде всего за счет более высокой экспрессии рецептора а по птоза CD95 (содержание клеток, несущих этот маркер увеличено в 2 раза по сравнению со здоровыми детьми, а экспрессия антигена HLA-DR увеличивается примерно в 1.5 раза). Возможно, что повышенная способность клеток вступать в Fas-зависимый апоптоз и соответственно большая вероятность активации клетки по пути, приводящему к удалению клона сенсибилизированных клеток у детей с АБА по сравнению со взрослыми с той же патологией отражает один из механизмов выхода в ремиссию при детской астме.

Таким образом, изменения в клеточном звене имму нной системы у детей с АБА и взрослых пациентов с той же патологией в определенной мере однотипны. Однако, для детей характерна большая выраженность изменений В-клеточного звена ( высокий прирост общего количества В-клеток) и более высокий уровень активации лимфоцитов, включая активацию апоптоза. С одной стороны, это может увеличивать вероятность процесса сенсибилизации у детей к определенному антигену, однако с другой стороны вероятность восстановления толерантности и соответственно выход в ремисию у детей с АБА по сравнению со взрослыми пациентами также более высокая. Это может означать,что высокая реактивность иммунной системы у детей придают определенные чер-

ты такому заболеванию как атопичсская бронхиалная астма и отчасти определяет особенности""детской" бронхиальной астмы.

Далее мы провели серию экспериментов по изучению механизмов объясняющих благоприятное влияние СИТ на течение бронхиальной астмы.

Исследование провели на лимфоцитах периферической крови 12 детей с атопической бронхиальной астмой в возрасте от 7 до 12 лет. которым проводили СИТ водно-солевыми экстрактами аллергенов домашней пыли и пыльцевых аллергенов. Изучение количества лимфоцитов, экспрсссирующих интересующие нас антигены проводили дважды, до начала СИТ и сразу же после окончания курса лечения.

При исследовании влияния СИТ на поверхностные маркеры, характеризующие основные популяции и субпопуляции лимфоцитов, нами была выявлена тенденция к повышению количества Т-лимфоцитов (рис. 6).

Рисунок (>. Влияние СИТ на относительное содержание CD3-. CD4-. CD8- и CD72- лимфоцитов в периферической крови детей с атопической бронхиальной астмой. По оси ординат - % клеток экспрсссирующих соответствующий антиген, по оси абсцисс - соответствующий антигенный маркер.

Существенных изменений в количестве В-лимфоцитов выявлено не было. Не было также обнаружено достоверных изменений в количество лимфоцитов, экспрсссирующих С04-антигсн. В то же время имел место достоверный прирост количества CDS'- клеток с 27.07±2.52% до 41.97±.\01% (р<0.05). Было обнаружено достоверное снижение и.ммунорегуляторного индекса после СИТ с 1.15±0.06 до 0.79±0.09 (р<0.05).

При изучении» влияния СИТ на активацнонные маркеры лимфоцитов детей с ЛБА получили прирост всех изучаемых активационых активационных маркеров Т-лимфоцитов. кроме НЬА-ОЯ (рис.7).

40 35 30 25 20 15 10 5 0

□ до СИТ 0 после СИТ

у.

И

СБ23 С025 СР71 НЦЫЭР? С095

Рисунок- 7. Влияние СИТ на количество лимфоцитов периферической крови больных атопической бронхиальной астмой, экспрессирующих активацнонные маркеры. По оси ординат - % клеток, экспрессирующих соответствующий антиген, по оси абсцисс - антигенный маркер.

Существенного изменения акгивационного маркера В-лимфоцитов СБ23 мы не наблюдали. Наиболее значительный и достоверный рост был характерен для позднего активационного маркера СЭ95 с 9.10±1.40 до 13.46±0.95 (р<0.()5). Количество лимфоцитов, экспрессирующих НЬА-ОЯ снижалось (р>0.05).Также наблюдалось достоверное снижение соотношения НЬА-0Я/С095 с 3.83±0.24 до 2.13±0.23. что свидетельствует о способности СИТ изменять активацнонные процессы в лимфоците в сторону индукции апоптоза.

Таким образом резу льтаты нашего эксперимента позволяют утверждать, что проведение СИТ сопровождается одновременным повышением количества лимфоцитов с супрессорной активностью и усилением индукции апоптоза лимфоцитов, что и обеспечивает его высокую эффективность. Возможно.что более высокий апоптотичсский потенциал лимфоцитов отчасти объясняет большую эффективность проводимой специфической имму нотерапии у детей с АБА по сравнению со взрослыми пациентами.

В следующей серии экспериментов с целью изучения имму нотропного эффекта отечественного препарата "СИБУСОЛ" (хлорида 3-(2,2.2-

триметилгидразнний) пропионата) было проведено исследование его влшшн; на количественное содержание иммунорегуляторных клеток и активационньи процессы в лимфоцитах in vitro. Исследование действия препарата провели н: лимфоцитах крови 12 детей в возрасте 7-12 лет с »топической формой бронхи альной астмы средней тяжести через 16 часов после инкубации с сибусолом i концентрациях 0.5 мкг/мд. 5.0 и кг/мл и 50.0 м кг/мл или без него.

При инкубации лимфоцитов больных детей с сибусолом в концентрации 0.: мкг/мл мы не наблюдали существенных изменений в экспрессии популяцион ных и субпопуляционных маркеров (табл.5).

Табл. 5

Влияние спПусола на экспрессию поиуляиноинмх н

субионуляинопиых маркеров у дегеи с АБА. _

Копией грации исследуемого препарата Маркеры

CD3 CD4 CDS CD72

% клеток

Контроль 58.93^2.41 29.78±3.28 30.57-2.1 1 18.36±2.09

Cnfiyco.i 0,5 мкг/мл 59.05-2.08 27.22=3.69 30.08=1.91 17.42±2.65

Сибусол 5,0 мкг/мл 63.33±3.74 30.04±4.26 33.21=2.66 12.42±1.29*

Сибусол 50,0 мкг/мл 64.37±2.92 34.11±3.17 40.97±3.85* 9.83±2.22*

Примечание: *- р<1),05

Концентрации 5 мкг/мл и 50 мкг/мл способствовали некоторому увелич( нию общего количества Т-лимфоцитов (как хелперных так и супрессорны клеток), причем под влиянием сибусола в концентрации 50 мкг/мл наблюл: лось увеличение экспрессии СОХ-антигсна лимфоцитами больных 30,57±2.11% до 40.97±3.85% (р<0.05). т.е. почти на 25% Параллельно прош ходило достоверное снижение количества лимфоцитов, несущих антиген СО" от 18.36+2.09% до 12.42±1.29% (сибусол 5.0 мкг/мл) и до 9.83+2.22% (сибусс 50 мкг/мл) (р<0.05).

Таким образом, сибусол оказывает дозо зависимый иммунотропный эффек который! выражается увеличением общего количества Т-клеток (особен! '-лимфоцитов) и уменьшением количества В-клеток.

При исследовании влияния сибусола на экспрессию активационнных ма керов С025. СЭ71. НЬА-ЭЯ и С023 не обнаружено изменений по всем ко центрация.м препарата. Сибусол в концентрации 50 мкг/мл достоверно пов! шал экспрессию антигена СБ95 с 12.96±1.49% до 20.68=1.58% (р<0.05). сиб

ол в концентрации 0.5 мкг/мл и 5 мкг/мл повышал экспрессию этого антигена лаоо. (табл.6).

Табл. 6.

Влияние спбусола па экспрессию актипашишимх маркеров V дегеп с АБА.

Сонцсптрация Маркеры

исследуемого СЭ23 СР25 С071 СЭ95

препарата % клеток

Контроль 12.10il.41 21.02±3.16 I7.72i2.87 33.74i2.8S I2.96il.49

Сибгсол 0.5 12.37i2.15 22.12±3.18 lS.4Si3.02 33.47i3.72 16.12i2.45

мкг/м.т

Сибусол 5,0 12.90il.90 16.X9il.97 1Н.60±3.50 33.5 из..34 15.70i2.28

мкг/мл

Сибусол 50.0 11.98±1.63 21.96i3.38 25.9Si2.S0 33.88i2.76 20.68il.58

мкг/мл *

Примечание: *- р<0,05

Таким образом сибусол в условиях /// \ itro способствует нормализации со-1тношсния Т- и В-клсток. увеличивает количество клеток с супрессорной функцией и увеличивает экспрессию рецепторов, опосредующих Ра 5-:ависнмый механизм индукции апоптоза лимфоцитов Одновременно эти воз-[ействия могут способствовать подавлению синтеза 1цЕ. что патогенетически юоеновывает использование этого препарата. К тому же мы не обнаружили ювышения аьстивационных маркеров С025. СЭ71 и НЬА-011 под влиянием :ибусола. что позволяет предпололагать. что препарат не вызывает побочных >ффсктов в иммунной системе. Все это позволяет сделать заключение о воз-южности его использования в качестве иммуномодулятора при лечении ато-шческой бронхиальной астмы.

Выводы:

1. Атопичсская бронхиальная астма у детей характеризуется повышенным содержанием В-лимфоцитов в периферической крови (маркера CD72) и более высоким уровнем активированных лимфоцитов, несущих маркеры ранней (CD25. CD71) и поздней (HLA-DR. CD95) Т-клсточной активации, а также маркер активации В-лимфоцитов (CD23).

2. Независимо от хзительности заболевания у детей с АБА выявляется повышение содержания С072~-лимфоцитов. При длительности заболевание более пяти лет наблюдается уменьшение общего количества Т-клеток. Чтс касается активационных маркеров, то уровень ранних активационны> маркеров CD25 и CD71 становится более высоким при длительности заболевания более трех лет.

3. Не обнаружено изменений в содержании популяционных. субпопуляцион-ных и активационных маркеров у детей больных АБА в зависимости оп степени тяжести заболевания.

4. У детей с АБА в сочетании с поллинозом или атопичсским дерматитом ж обнаружено отличий по экспрессии-популяционных и субпопуляционны> маркеров по сравнению с детьми с АБА без сопутствующих заболеваний Что касается экспрессии активационных маркеров, то для детей с АБА i поллинозом характерно повышение CD23"-лимфоцитов в периферическо! крови, а для детей с АБА и атопичсским дерматитом - повышение соотно шений CD25/CDV5 и HLA-DR/CD95.

5. Поверхностный фенотип детей с АБА по сравнению со взрослыми пациен тами с ток же патологией характеризуется более выраженными измене ниями со стороны В-клеточного звена иммунной системы (более высоки! уровень С072"-лимфоцитов в периферической крови), более высокой ак тивацией иммунной системы под влиянием антигенных стимулов, прояв ляющсйся более высоким уровнем содержания лимфоцитов, несущих мар керы ранней (CD25. CD71) и поздней (HLA-DR. CD5) активации.

6. Специфическая иммунотерапия оказывает выраженное нормализующе! влияние на показатели клеточного звена иммунной системы детей, стра дающих атопичсской бронхиальной астмой: повышается количеств« С08+-лимфоцитов в периферической крови: повышается количество лим фоцитов. экспрессирутощих ранние маркеры активации (CD25. CD71) i маркер запуска апоптоза CD95 при явной тенденции к снижению маркер; HLA-DR. Снижается соотношение HLA-DR/CD95.

7. Препарат "Сибусол" в испытанных концентрациях ш v/im оказывает дозо-зависимос иммунокорригируюшее действие на ли.м(|)ошггы детей с АБА: повышение содержания СОКЧти.мфоцитов. понижение содержания CD724" лим(|)0цит0в. повышение содержания С095~-лимфоцитов.