Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:Характеристика иммунного статуса на различных этапах естественного течения HCV-инфекции

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ НОВОСИБИРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

«На правах рукописи»

ДЬЯЧЕНКО АННА АНАТОЛЬЕВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУННОГО СТАТУСА НА РАЗЛИЧНЫХ ЭТАПАХ ЕСТЕСТВЕННОГО ТЕЧЕНИЯ НСУ-ИНФЕКЦИИ

14.00.10 - Инфекционные болезни 14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск 2002

Работа выполнена на кафедре инфекционных болезней < Новосибирск! государственной медицинской академии. ^

)

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Н.П. Толоконская

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Е.И. Краснова

доктор медицинских наук О.П.Колесникова

Ведущая организация:

Алтайский государственный медицинский университет

Защита состоится 2002г. в часов на заседа!

диссертационного совета Д 208.062.01 в Новосибирской государственной акаде\ МЗ РФ по адресу: 630091 г.Новосибирск, Красный проспект, 52.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирс

государственной медицинской академии.

Автореферат разослан я/& о^^2002г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Кандидат медицинских наук, доцент Н.Г.Патурина

Р ь ^ г О

ВВЕЛЕНИЕ

Актуальность темы

Длительное время науке были известны гепатиты A,B,D и большая группа гепатитов ни-А, ни-В. Диагностика последних основывалась в основном на исключении маркеров известных гепатитов. В середине 80-х годов развернулись исследования ло идемшфикации и изоляции »chjkcvihuio ¿ucntà. Результатом этих усилий было обнаружение нового вируса гепатита типа С (HCV). Несмотря на 15 лет интенсивных исследований в лабораториях всего мира, наши знания о природе вызываемых им заболеваний остаются все еще ограниченными. Течения HCV-инфекции варьирует от самоизлечивающегося заболевания до персистирутощей инфекции, приводящей у части больных к тяжелым поражениям печени. IICV является главной причиной парентеральных ни-А, ни-В гепатитов. Его распространенность в общей популяции колеблется от 0,15% (Скандинавия) до 44% (Египет, Камерун) (Houghton M. 1996). Большей частью острый гепатит С (ОГС) протекает в инаппарантной форме (по разным данным, от 50 до 90%). Вне зависимости от тяжести острой фазы в большинстве случаев заболевание переходит в хроническую форму. От 250 до 500 млн человек в мире сейчас хронически инфицированы эшм вирусом. До сих пор неясно, чем определяется исход заболевания: массивностью вирусной инвазии, характером специфического иммунного ответа, генотипом вируса генетическим дрейфом поверхностных иммунодоминантных эпитопов вируса, позволяющим ему отчасти избегать иммунного надзора хозяина, наконец, набором экспрессируемых HLA-антигенов или другими, еще неизвестными факторами.

Хронический гепатит С (ХГС) является ведущим фактором риска развития цирроза печени (ЦП) и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК). Примерно у 20% из числа инфицированных HCV процесс прогрессирует до цирроза (Honda M., et ai., 2000; De Francesco R., 1999; Wang C. et al., 1995). От 20 до 90% последних в течение 5 лет умирает от ГЦК (Shimotohno К., Hirowatari Y. et al. 1995; Hijikata M., Kato N. et al. 1991). Математическое моделирование, проведенное с учетом быстро увеличивающейся группы риска (инъекционные наркоманы), предсказывает -4-кратный рост смертности от связанной с HCV печеночной декомпенсацией и ГЦК (De Francesco R., 1999). Поэтому столь важным представляется найти ответ на следующие вопросы: каковы особенности антивирусного иммунного ответа в первые недели острой HCV-инфекции у индивидуумов с самоизлечивающимся заболеванием? В чем заключается успешная противовирусная иммунная стратегия организма? Наконец, каковы причины, приводящие к персистирующей инфекции?

В настоящее время изучены различные аспекты иммунного ответа организма при HCV-инфскции. HCV индуцирует сильные гуморальный и клеточный иммунные ответы (Grakoui A. et al., 1993; Mizushíma H. et al, 1994). Белки core, NS3 и NS4 являются наиболее иммуногенными антигенами как для В-клсток, так и для HLA-II-рестрицированных CD4+ Т-клеток. Ответы ЦТЛ на core и другие белки регистрируются в периферической крови больных хроническим гепатитом (ХГ). Хотя ответы HCV-специфических эффекторных В- и Т-клеток могут привети к элиминации вируса, в большинстве случаев они не способны воспрепятствовать переходу HCV-инфекции в хроническую форму. Специфика иммунного ответа играет фундаментальную роль в патогенезе повреждения печени при ХГ. В последние годы внимание исследователей привлекают вопросы, связанные с программируемой смертью гепатоцитов и иммуноцитов при ХГС.

Несомненно, исход заболевания зависит в значительной степени от состояния иммунной системы пациента, направленности и выраженности иммунного ответа. Исследования последних лет показали, что клеточное звено иммунной системы и, в частности, Т-хелперы играют ключевую роль в индукции эффективного противовирусного иммунитета (Курамшин Д.Х.,Толоконская Н.П.,Кожевников B.C. 2002; Grakoui A. et al., 1993; Hijikata M. et al., 1993). Если в отношении острой и хронической HCv'-инфекции накоплено достаточно большое количество фактического материала, то изучение тяжелейших последствий прогрессировать HCV-инфекции - ЦП и ГЦК, только начинается. В литературе имеются лишь единичные работы, посвященные иммунологии и иммунопатологии этих заболеваний.

Цель и задачи исследования Цель работы: изучить характер иммунного ответа организма на различных этапах естественного течения HCV-инфекции: при остром, хроническом ВГС, циррозе печени и гепатоцеллюлярной карциноме. В рамках этой цели решались следующие конкретные задачи:

1) провести анализ субпопуляционного состава лимфоцитов у пациентов с различными формами HCV-инфекции,

2) определить спектр иммунорегулягорных молекул — цитокинов в сыворотке крови больных острым и хроническим гепатитом с, циррозом печени и гепатоцеллюлярной карциномой,

3) произвести анализ некоторых показателей функциональной активности лимфоцитов периферической крови по спонтанной, индуцированной продукции цитокинов и в реакции бласттраксформации у больных хроническим гепатитом С,

4) изучить показатели алоптоза иммунокомпетентных клеток на разных этапах HCV-инфекции по: количества Т-клеток, экспрессирующих маркер готовности к апоптозу, и проценту клеток, находящихся в состоянии апотоза.

Научная новизна полученных результатов

Впервые в едином исследовании изучены и сопоставлены иммунологические аспекты различных этапов HCV-инфекции: от острого гепатита и хронической персистирующей инфекции до цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы.

Результаты комплексного исследования продемонстрировали значительное отличие в характере иммунного ответа при хроническом гепатите, где практически отсутствует морфологический субстрат болезни и хроническим гепатитом характеризующимся отчетливым структурным повреждением печени при подтвержденной в обоих случаях активностью инфекционного процесса. Изучение цитокиновото профиля в сопоставлении с функциональной активностью мононуклеаров периферической крови, клинико-лабораторными данными и показателями активности инфекционного процесса позволило установить характерные особенности иммунных реакций, протекающих на разных этапах HCV-инфекции.

Показана роль программируемой клеточной смерти в механизмах формирования персистирующей HCV-инфекции и патогенезе повреждения печени при хроническом гепатите, циррозе и гепатоцеллюлярной карциноме.

Представлена новая интерпретация известных науке и полученных автором фактов (изменение субпопуляционной структуры лимфоцитов, в спектре цитокинов, функциональной активности лимфоцитов, показателей алоптоза), способствующая комплексной оценке происходящих при HCV-инфекции изменениях и прогнозу тяжести повреждения печеночной ткани.

Практическая значимость работы

Результаты, полученные в настоящем исследовании, позволяют по иному оценить важные сдвиги в иммунореактивности, происходящие при НСУ-инфекции. Мы считаем, что главная составляющая иммунопатогенеза хронического гепатита С— это некомпетентность вирусоспецифических клопов Т-хелперив 2 тна, 01 вспушенных та индукцию гуморального иммунного ответа. Возможно, это связано с развивающимся при хроническом гепатите С апоптозом как Т-, так и В-эффекторов. В условиях слабого и неэффективного антительного ответа происходит гипериндукция клеточного звена иммунитета, что вызывает несбалансированно высокий уровень гибели инфицированных генатоцитов. Это, в свою очередь, с течением времени может привести к массированному развитию соединительной ткани в печени, т.е. к фиброзу и циррозу.

Комплексная оценка таких иммунологических показателей, как субпопуляционная структура, цитокиновый спектр, функциональная активность мононуклеаров периферической крови, экспрессия РавЯ (СИ 95+), количество апоатирующих клеток позволяет прогнозировать течение патологического процесса в печени.

В целях дифференцированного подхода в терапии хронических гепатитов следует выделять группу, характеризующуюся неактивным течением хронического гепатита С, характеризующуюся минимальными иммунологическими изменениями, отсутствием морфологического субстрата болезни при наличии НСУ-РНК

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Изменение основных субпопуляций иммунокомпетентных клеток свойственно веем этапам ПСУ-инфекции и характеризуется уменьшением содержания в крови Т-хелперов с фенотипом СВ4+- и увеличением количества цитотоксических клеток с фенотипами СВ8+ и СО 16+.

2. Установлено смещение балланса цитокинов в старону ТЫ-кдона Т-лимфоцитов на всех этапах поражения печени при одновременной сверхэкспрессии провоспалительных цитокинов, рассматриваемых как один из наиболее значимых факторов поражения печени.

3. Хронический гепатит, характеризующийся отсутствием признаков поражения печени, и хронический гепатит с морфологически доказанной активность патологического процесса, существенно различаются по характеру иммунного ответа при сходной активности инфекционного процесса.

4. Снижение при хронической НСУ-инфекции способности мононуклеаров периферической крови к продукции цитокинов в ответ на неспецифические поликлональные активаторы, так и на специфическую стимуляцию Т-клеточного рецептора и индукцию вирусными антигенами, рассматривается признаком снижения резервной способности клеток, что важно при оценке их функций.

5. На этапах хронического активного гепатита и его последствий показано усиление процессов апоптоза иммунокомпетентных клеток и рассматривается как один из факторов, влияющих на функции клеток и характер иммунного ответа в целом.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на: III съезде иммунологоваллергологов СНГ (Сочи, 2000г.), Научной сессии, посвященной 65-

летию НГМА (Новосибирск, 2000г.), IV съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Москва, 2001г.), Научно-практической конференции врачей «Актуальные вопросы современной медицины» (Новосибирск, 2002г.)

Апробация работы состоялась на расширенном заседании проблемной комиссии по инфекционным болезням НГМА 30.04.2002г.

По теме диссертации опубликовано 9 работ (из них 5 в центральных журналах).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследованная группа составила 129 человек, находившихся в 333 военном клиническом госпитале г.Новосибирск, областной клинической больнице и областном онкологическом диспансере г.Сумы, Украина. Критерием отбора для настоящего исследования служило наличие у пациентов маркеров HCV-инфекции.

Комплекс проведенных исследований включал анализ клинико-эпидемиологических, биохимических, серологических данных, патоморфологический анализ биоптатов печени, оценку иммунологического статуса пациентов с HCV-инфекцией.

Определение основных биохимических показателей.

Концентрацию билирубина (колориметрическим методом),активность аланиновой аминотрансферазы и щелочной фосфтазы, концентрацию иммуноглобулинов и альбумина (турбидиметрическим методом) определяли на биохимическом анализаторе фирмы «Labsystems» в соответствии с рекомендациями изготовителя оборудования и реактивов.

Определение вирусных маркеров.

Выявление противовирусных антител.

Наличие суммарных анти-HCV-IgG и анти-HCV-IgM антител к структурным (С22) и неструктурным белкам (NS3,NS4,NS5) HCV определяли при помощи иммуноферментного анализа с использованием тест-систем I1-II1 поколений («ИФА-анти-HCV, Диагностические системы»—Н.Новгород, «РекомбиБест анти-ВГС суммарная, РекомбиБест анти-ВГС спектр, Вектор Бест»—Новосибирск и «Abbott Lab.»). ИФА проводили в соответствии с инструкцией изготовителя наборов. Помимо маркеров HCV инфекции определяли наличие антител к вирусам ГА (анти-HAV-lgM) и ГВ (анти-HBc-IgM, HbsAg, анти-HBs, HbeAg).

Обнаружение и количественный анализ вирусного генома. Качественный анализ на вирусную РНК проводился с использованием обратнотранскриптазного варианта полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) при помощи набора «Roche Amplicor HCV kit» (E.Hoffmann La Roche, Ltd, Базель, Швейцария). Определение вирусной нагрузки (количественный нализ) проводили с использованием набора «Roche HCV Monitor kit» (E.Hoffmann La Roche, Ltd.). В случае, если результат находился за пределами линейной части калибровочной кривой метода (от 2»103 до 5«10s геномов/мл), соответствующий образец разводили и анализировали повторно. В каждом количественном эксперименте в качегве внутреннего стандарта использовали известное количество копий транскрипта. Если качественный анализ на HCV РНК проводили с использованием разведенной необработанной сыворотки, то для количественного определения из 100 мкл сыворотки предварительно экстрагировали РНК при помощи лизирующего буфера, содержащего гуанидишзотиоцианат.

Фенотипнческая характеристика лимфоцитов при помощи монокл опальных антител (МКАТ).

Окрашивание лимфоцитов моноклональными антителами в непрямом иммуиофлуоресцентном тесте.

0,-1 млн лимфоцитов в 50 мкл ФСР или раствора Хенкса вносили в центрифужные пробирки или лунки 96-луночного круглодонного планшета. К клеткам добавляли 5 мкл тестируемого IvíKAT и инкубировали 30-45 мин при 4°С или 20 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 150 мкл раствора Хеикса/ФСР и центрифугировали 5 мин при 200 об/мин. Супернтант удаляли, а осадок клеток суспендировали в 150 мкл того же раствора и промыку повторяли. К осадку отмытых клеток добавляли 50 мкл Р(аЬ')2-фрагментов овечьих/козьих антител к иммуноглобулинам мыши, меченных флуоресцеинзотиоцианагом (ФИТЦ) и разведены 1:100 ФСР или раствором Хенкса. Клетки суспендировали и инкубировали, как указано выше. После инкубации клетки дважды отмывали ФСР и фиксировали 1%-ным раствором параформальдегида на ФСР. Окрашенные, фиксированные клетки анализировали с помощью люминесцентного микроскопа под иммерсией (объектив х90, окуляр хЗ). Количество антиген-позитивных клеток определяли как процент флуоресцирующих клеток при просматривании 200 лимфоцитов за вычетом процента флуоресцирующих клеток, наблюдаемых в препарате отрицательного контроля. Последний готовился аналогичным образом, однако вместо МКАТ клетки обрабатывали нормальным иммуноглобулином мыши.

В работе была использована следующая панель МКАТ серий ICO и LT: анти-С1)3, анти-СП4, анти-СШ, анти-СШб, анти-С072, a¡rra-CD25 и анш-С095.

Проточная лазерная цитометрия (ПЛЩ.

Для одновременного анализа пары антигенных детерминант на поверхностной мембране лимфоцитов использовали метод проточной двухцветной цитофлуориметрии. При этом исследовании использовали МКАТ, конъюгированные с ФИТЦ или R-фикоэритрином (ФЭ) («Dako A/S» Дания).

Анализ клеточных субпопуляций осуществлялся методом проточной двухцветной цитофлуориметрии на лазерном клеточном сортере-аналюаторе FACSCalibur («Becton-Dickinson», США) с использованием программы CellQuest («Be cton-Dickinson», США). Уровни зеленой и оранжевой флуоресценции клеток, отнесенных к лимфоцитарному региону, выводились на двухмерную точечную гистограмму с логарифмической шкалой, подразделенную на квадраты после предварительной оценки негативных контролен. Результаты выражались в виде процентного соотношения позитивных клеток к общему количеству лимфоцитов.

Определение концентрации цитокинов в периферической крови in vivo и в культуральной жидкости in vitro.

Уровень цитокинов в периферической крови и культуральной жидкости устанавливали при помощи наборов для ИФА в соответствии с рекомендациями изготовителей наборов. Использовались следующие наборы: TNFa, IL-lp, IL-2, IL-4, IL-6 («Проконтур», С.-Петербург), IL-8, IL-10, INFy («R&D Systems Inc.», США).

Определение функциональной активности мононуклеаров периферической крови (МПК).

Функциональную активность оценивали по спонтанной и индуцированной продукции ряда цитокинов и в РБТЛ. Продукцию IFNy и TNFa индуцировали добавлением в среду на старте культивирования липополисахарида (ЛПС, Sigma, 5 мкг/мл), IL-8 — фитогемагглютинина (ФГА, Welcome, 10 мкг/мл). Активированные клетки инкубировали 48 ч, после чего в кондиционной среде при помощи коммерческих ИФА-наборов определяли концентрацию вышеуказанных цитокинов.

Анализ бласттрансформадии лимфоцитов.

Бласттрансформацшо лимфоцитов стимулировали ФГА (10 мкг/мл), форболмиристата ацетатом (ФМА, Sigma, 20 нг/мл), анти-СОЗ антителами (Медбиоспектр, 1 мкг/мл) и рекомбинантными вирусными антигенами (кора и NS4/NS5, Microgen, по 1 мкг/мл). За сутки до окончания культивирования в среду добавляли 40 кБк (1 мкКи) 3Н-тимидина. Пролиферативный ответ оценивали по включению радиоактивной мети в мслшоиерасторимую фракцию. Яндекс стимуляции рассчитывали по отношению индуцированной митогсном радиоактивности к спонтанно включенной радиоактивности. Положительным считалось значение ИС>2.

Определение лимфоцитов с признаками терминальной фазы апоптоза. Для подсчета числа клеток с признаками апоптоза клетки фиксировали на стекле 70% этиловым спиртом, высушивали и окрашивали в течение 30 мин раствором ядерного флуоресцентного красителя пропидиум йодида («Sigma», 1 мкг/мл), содержащим 100 ед/мл РНКазы К («Sigma»). Клетки с признаками апоптоза (конденсацией или фрагментацией ядра) подсчитывали в люминесцентном микроскопе при длине волны возбуждения 546 нм и длине волны пропускания 590 нм.

Патоморфологический анализ биоптатов печени.

Фрагменты печени, полученные при чрезкожной пункционной биопсии фиксировали 10% раствором формалина, заливали в парафин и обрабатывали по стандартной методике. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по ван Гизону.

При анализе патоморфологических изменений ипользовали классификацию хронических геиатитов по этиологии, по степени активности процесса и стадии фиброза (Desmet V.J. etal., 1994)

Статистический анализ результатов.

Полученные результаты обработаны статистически по стандартной программе с вычислением достоверности различия по критерию t Стьюдента. Взаимоотношения между некоторыми показателями оценивались при помощи корреляционно-регрессионного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НАБЛЮДЕНИЙ

Всего под наблюдением находилось 129 человек, 76 из которых были обследованы по подозрению на вирусный гепатит на основании клинических данных, 23 человека проходили обследование на маркеры вирусных гепатитов в качестве доноров, в остальных случаях НСУ- инфекция обнаруживалась при обследовании по поводу других заболеваний. Среди пациентов было 28 женщин и 101 мужчина. Средний возраст больных составлял 37,1+12,4 лет. У всех исследованных в крови были найдены маркеры НСУ-инфекции. На основании клинических, лабораторных и морфологических признаков были сформированы следующие группы: больные острым гепатитом С -15, больные хроническим гепатитом С - 76, циррозом печени -22 и гепатоцеллюлярной карциномой - 16 человек. В табл.1 суммировано распределение больных по возрасту и полу в пределах этих 4-х групп.

Таблица 1-Распределение больных по возрасту и полу

Возраст/пол ОГ ХГ ЦП гцк Всего

До 20 лег муж. 9 18 27

жен. 5 5

21-30 лет муж. 4 28 32

жен. 1 3 4

31-40 лет муж. 5 5

жен. 1 3 4

41-50 лет муж. 6 4 10

жен. 4 — 4

Свыше 50 лет муж. 3 15 14 32'

жен. 1 3 2 6

Всего муж. 13 60 19 14 101

жен. 2 16 3 2 28

Итого 15 76 22 16 129

У 12 пациентов 1-й группы (ОГС) заболевание протекало легко, у остальных наблюдалась среднетяжелая форма. Проявления продромального периода были довольно разнообразными: у 5-ти больных наблюдался диспептический синдром, у 2-х — катаральный, у 1-го — астеновегетативный, у 2-х — смешанный. Длительность преджелтушного периода колебалась от 1 до 9 дней. Желтуха чаще всего была незначительной по интенсивности. Уровень общего билирубина у 9-ти пациентов был в пределах между 25 и 85 мкмоль/л, у 5-ти—между 86 и 155 мкмоль/л. У одного больного уровень общего билирубина составлял 190 мкмоль/л. Ко времени выписки из стационара на 20-30 сутки уровень билирубинемии нормализовался у 11 -ти пациентов. Длительность желтушного периода в среднем составляла 20±2 дней. Так, от 1 до 14 дней желгушность сохранялась у 6-ти, от 14 до 22 дней—также у 6-ти, а свыше 23 дней—у 3-х больных.

Увеличение размеров печени наблюдалось у всех больных: до 1 см —у 7-ми, от 1,5 до 2 см —у 4-х, от 2,5 до 3,5 см—у 3-х и свыше 4 см—у одного. Увеличение размеров селезенки было выявлено у 2-х пациентов. Ко времени выписки из стационара генагомегалия сохранялась у 3-х реконвалесцентов, а спленомегалия не наблюдалась.

Степень цитолиза гепатоцитов принято оценивать по уровню активности АлАТ. При госпитализации активность АлАТ у 2-х пациентов не превышала 1 мкмоль/л в час, у 12-ти она составляла от 1 до 3 мкмоль/л в час и у одного превышала 3 мкмоль/л в час. На время выписки у 8-ми реконвалесцентов активность АлАТ превышала границы нормы, что говорило о продолжении воспалительного процесса и цитолиза гепатоцитов. Помимо АлАТ и билирубина исследовалась активность щелочной фосфатазы, которая у больных 1-й группы была также повышена. Средние значения этих показателей для пациентов на разных этапах HCV- инфекции приведены в табл.2.

Суммарные анти-HCV антитела обнаруживались у всех пациентов в острой фазе уже на 1-2-й неделе заболевания, причем у 12-ти из них присутствовали антитела как к белку core, так и неструктурным белкам NS3, NS4, NS5. У всех пациентов этой группы определялась вирусная РНК, концентрация в среднем составила 3,25 Meq/мл (106 геномов/мл).

Таблица 2-Основные биохимические показатели при острой и хронической ПСУ-инфекции и ее последствиях _ . __

Показатели Контроль ОГС ХГС ЦП ГЦК

АлАТ, мкмоль/л/час 0,48+0,05 2,49±0,03* 0,98±0,07* 0,61±0,02 0,5510,02

ЩФ, мкмоль/л/час 0,84±0,05 1,78+0,5'г 1,12+0,09 А ПЛ 1 Л ЛО О пп Л АГЧ V, / /

Билирубин, мкмоль/л 15,6±2,7 93,4+24,8* 29,8±5,6* 62,5±17,4* 124,7±46,2*

Альбумин, г/л 44,2+3,4 45,1±4,1 43,1+6,0 40,3±5,5 36,2±4,3*

Примечание: *) Достоверное отличие от контрольной группы, р<0,05.

2-ю группу составили 76 пациентов, у которых был диагностирован хронический вирусный гепатит С. 29 человек из этой группы были донорами, еще у 21-го из них диагноз был установлен во время обследования по поводу лечения интеркуррентного заболевания. У 16 (21%) в анамнезе оперативные вмешательства, у 6 (8%) -гемотрансфузии, 40 (53%) пациентов употребляли наркотические вещества, из них эпизодически - 29 (38%), постоянно - И (15%). У 8 (10%) в анамнезе медицинские манипуляции, 6 (8%) человек свое заболевание ни с чем не связывают. У 33-х (43%) пациентов с ХГС клинические проявления заболевания отсутствовали, причем у 25-ти из них активность АлАТ в сыворотке крови не превышала норму. В остальных случаях повышение АлАТ было умеренным. Тем не менее, гиперферментсмия чаще всего знаменует собой начальные проявления хронического ГС при отсутствии клинических данных. Для больных в клинически манифестной фазе наиболее характерны признаки астенизашш. Больные жалуются на общее недомогание, быструю утомляемость, снижение трудоспособности, вялость, эмоциональную лабильность, нарушение сна, аппетита. При этом отмечается снижение аппетита, потеря массы тела. Объективно отмечалась болезненность в правом подреберье и эпигастральной области, увеличение и уплотнение печени.

Все больные содержали в крови суммарные анти-НСУ антитела и были серонегативны в отношении вирусов ГА и ГВ, у всех пациентов определена ПСУ РНК Получены следующие данные: у всех пациентов отмечался умеренно выраженный астено-вегегативный синдром, желтуха, зуд кожи—у 23 (30%), повышенная раздражительность—у 55 (72%), изжога и горечь во рту—у 39 (51%), ноющая боль в правом подреберье, не связанная с приемом пищи—у 11 (14%). При физикальном обследовании у 9 (12%) больных отмечалась болезненность края печени. Нерезко выраженная гепатомегалия без сопутствующего увеличения селезенки наблюдалась у 35 (46%) больных ХГС.

Гистологические критерии активности процесса и степени фиброзных

изменений.

Сегодня все более очевидным становится тот факт, что хронический гепатит—не единая болезнь, а скорее клинический и морфологический синдромы, характеризующиеся различной степенью выраженности гепатоцеллюлярного некроза и воспалительного процесса. В литературе при оценке активности процесса пользуются индексом гистологической активности (ИГА), предложенным Кпос1е11 и соавт. и учитывающим степень выраженности перипортальных мостовидных

некрозов, интралобулярную деградацию и очаговые некрозы, воспалительную инфильтрацию в области портальных трактов и степень выраженности фиброза.

Согласно полученным нами данным (табл.4), ХГС с минимальной активностью был выявлен у 43 из 76 пациентов (57%), со слабой — у 28 (37%), умеренной — у 5 (6%).

Т.-.П 11111^1 3>Р2СПП'11,№.11>!""' ^II I1 III IV VI" пп !•> .11».111II т^гиоипцщ ПаТЛ^ЛГПППП1'П1«1

процесса н стадии фиброзиросания

Число больных Процент больных

Гистологическая активность (но КпосЗеН):

Минимальная (1 -3 балл) 43 57

Слабая (4-8 балла) 28 37

Умеренная (9-12 балла) 5 6

Выраженная (13-18) - -

Гистологический индекс печени фиброза

(по Веете!):

Фиброз отсутствует - 0 12 16

Слабый (портопортальный и 51 67

перипортальный) -1

Умеренный (порто-портальные септы) - 2 13 17

Выраженность фиброза по Цезте! и соавт. варьировала 0-2 стадии. Исходя из вышеуказанного, в группе больных ХГС было выделено две подгруппы пациентов: 1— 43 пациента с минимальной активностью (ИГА<3), т.е. у которых практически отсугствоват морфологический субстрат болезни. Во 2 подгруппу отнесены пациенты с явными морфологическими признаками хронического гепатита - 33 пациента со слабой и умеренной активностью патологического процесса (ИГА>3). Эти две подгруппы далее условно именовались соответственно как хронический неактивный гепатит (ХНГ) и хронический активный гепатит (ХАГ).

Группа исследованных пациентов с циррозом печени составила 22 человека. У всех больных определялись анти-НСУ и у 19 (86%) -обнаружена вирусная РНК. Средний уровень вирусной нагрузки составил 0,88*106 геномных копий в 1 мл сыворотки крови. У 12 (55%) цирроз определен при обследовании по поводу интеркурентных хронических заболеваний, у 10 (45%) - наличие в анамнезе желтухи. Из них 4 (18%) находились на диспансерном наблюдении по поводу хронического вирусного гептпта С, а 6 (27%) обследовались по поводу длительных болей в правом подреберье, периодической желтухи, анемии. 8 пациентов (36%) перенесли оперативные вмешательства, а 5 (23%) - гемотрансфузии 17 - 22 г. назад. У всех больных отмечался астенический синдром, диспептический (низкая толерантность к пищевым нагрузкам, тошнота, снижение аппетита), периодические боли в области печени, гепатоспленомегалия, внешние проявления цирроза - пальмарная эритема, звезчатые ангиомы, поредение волос и др. У 14 (63%) фиксировался геморрагический синдром, а у 8 (36%) анемический.

Согласно критериям СЫМ-Ри^, у 16 (73%) из 22 больных ЦП был диагностирован цирроз класса В, у 6 (27%) — класса С.

Группа пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой составила 16 человек. Все пациенты этой имели в крови антитела к ПСУ. НСУ РНК была обнаружена у 11 (69%). Концентрация вирусных частиц составила 1,15*106 геномных копий в 1 мл

сыворотки крови. У большинства больных ГЦК наблюдалась II-III стадия процесса по (классификации TNM). В 85% случаев зарегистрирована многофокусная микронодулярная опухоль, у 2 (15%) - мононодулярный рак. 6 (38%) человек наблюдались но поводу цирроза печени. У 7 (44%) диагноз установлен при обследовании по поводу жалоб на снижение массы тела, болей в животе, периодический подъем температуры тела, у 3 (18%) - случайная находка. 8 (50%) пациентов имели в анамнезе оперативные вменил слыл на и 1'емотрансфузвн, 2 (13%) -желтуху, у остальных эпидемиологический анамнез проследить не удалось. У всех пациентов этой группы регистрировались диспептические расстройства, быстрая потеря массы тела, субфибрилигст, гепатомегалия, сопровождающаяся болями в животе, чувством тяжести в правом подреберье, анемия, умеренный лейкоцитоз, а у 13 (80%) признаки портальной гипертевзии (асцит, геморрагический синдром, гипопротеинемия). Исследуемые биохимические показатели крови были умеренно повышены (см. таблицу 2). Все пациенты этой группы были анти-HCV положительны, кроме того у всех в крови выявлена HCV РНК. Контрольную грунпу составляли 25 здоровых доноров разного возраста и пола.

Определение вирусной РНК

Важнейшим арбитражным маркером HCV-инфекции является вирусная РНК, выявляемая при помощи ПЦР. HCV РНК была обнаружена у всех серопозитивных больных острым и хроническим ГС, а также в сыворотке 19 (86%) больных ЦП и 11 (69%) — ГЦК. Средний уровень вирусной нагрузки был невелик, составляя около 2,1.104 геномных копий в 1 мл сыворотки крови. Концентрация вирусной РНК в крови отдельных групп пациентов приведена в табл.4.

Таблица 4-Концентрацин НСУ РНК в сыворотке больных вирусным ГС и его осложнениями, Мед/ил (106 геиомов/мл) __

ог хг ХНГ ХАГ ЦП ГЦК

3,25+2,94 1,65+0,82 | 4,11+5,35 0,88±0,52 1,15±0,33

РЕЗУЛЬТАТЫ АНАЛИЗА СУБПОПУЛЯЦИОННОЙ СТРУКТУРЫ ИММУННОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК ПРИ РАЗНЫХ ФОРМЫ НСУ-ИНФЕКЦИИ

НСУ-инфекция приводит к значительным изменениям в иммунном статусе пациентов. У больных острым и хроническим (в активной фазе) ГС, циррозом печени, а также ГЦК общее число лимфоцитов меняется мало: лишь при остром гепатите оно достоверно выше, а при циррозе — ниже контроля. В то же время процентное содержание лимфоцитов при хроническом активном гепатите, циррозе и гепапоцеллюлярной карциноме существенно ниже нормы (табл.5). Лишь при ГЦК наблюдался лейкоцитоз. Количество СОЗ-клеток, представляющих в кровяном русле популяцию зрелых Т-лпмфоцитов, возрастая при остром гепатите, имеет отчетливую тенденцию к снижению при прогрессировании заболевания. При этом доля СШ-лимфоцитов в общей популяции лимфоцитов меняется мало, достоверно снижаясь лишь при ГЦК. Более отчетливо эта тенденция прослеживается в субпопуляции Т-хелперов, несущих маркер С04. Абсолютное количество этих клеток снижается в активной фазе хронического гепатита, при циррозе и первичном раке печени, в то время как относительное содержание С04-лимфоцитов значительно снижается лишь при ОГ. Напротив, наблюдается отчетливый количественный и относительный рост

субпопуляции Т-супрсссоров, распознаваемых апти-С08 МКАТ, при остром и хроническом активном гепатитах, циррозе и карциноме печени. Это приводит к достоверному снижению иммунорегуляторного индекса (ИРИ), то-есть, соотношения субпопуляций лимфоцитов с маркерами СГ)4/'СГ)8. При активной форме ХГ этот показатель ниже единицы.

Таблица ¿'Сравнительна» характеристика иммуиилшическш иика^ашлей

ри различных формах ш V шире Иммунол. | Норма 1 ОГС кции ХГС ЦП (п=22) 1

показатель (п=25) (n=I5) ХНГ (п=43) ХАГ (п=33) (п=16)

Лейк.абс. 5,73±0,16 7,95±0,85* 5,95±0,75 7,39±0,84* 5,41±0,46 8,68±0,85*

Лимф., % абс. 27,9±0,9 29,5±0,60 27,7±1,15 23,1±0,55* 21,2±1,3* 16,0±0,9*

1,6±0,06 2,35±0,35* 1,65±0,1 1,71±0,4 1,15±0,07* 1,39±0,15

CD3, % абс. 71,5±1,6 63,4±1,1 70,5±0,95 73,0±0,85 64,8±2,3 59,0±1,1*

1,14±0,03 1,48±0,1* 1,17±0,05 1,25±0,06 0,75±0,05* 0,82±0,07*

CD4, % абс. 44,5±1,3 27,7±1,8* 39,4±1,5 34,5±1,1 44,3±1,7 38,1±1,5

0,70±0,03 0,65±0,1 0,65±0,09 0,59±0,08* 0,51±0,05* 0,53±0,07*

CD8, % абс. 23,1±0,8 30,2±1,3* 27,2±0,95 38,6±1,65* 41,7±1,65* 36,7±2,1*

0,37±0,02 'ojiio.os* 0,45±0,04 0,66±0,07* 0,48±0,07* 0,51±0,08*

CD 16, % абс. 12,3±0,9 10,7±0,5 10,3±0,85 19,9±0,9* 19,1±0,85* 12,9±0,75

0,19±0,02 0,27±0,03* 0,17±0,03 0,34±0,05* 0,22±0,03 0,18±0,02

CD72, % абс. 14,4±0,8 18,7±1,2 15,7±1,15 17,5±0,98 27,8±1,1* 23,0±1,3*

0,26±0,02 0,44±0,1* 0,26±0,03 0,ЗОЮ,03 0,32±0,04 Х),32±0,06

CD4/CD8 1,92±0,05 0,92±0,04* 1,45±0,08* 0,89±0,05* 1,06±0,08* 1,04±б^06*

IgA, г/л 1,78±0,2 1,85±0,4 1,85±0,45 1,95±0,48 1,68±0,51 1,71±0,24

IgM, г/л 1,18±0,15 1,25±0,3 1,22±0,3 1,66±0,45* 1,25±0,4 1,11±0,15

ligG, г/л Tl3,5±0,9 (14,7±1,1 1 14,9±1,2 15,2±1,4 15,1±2,3 15,4±3,6

Примечание: *—достоверное отличие от нрмы.

При НСУ-инфекцин отмечаются нерезкие изменения содержания естественных киллеров (КК-клстки) с фенотипом СО 16. Абсолютное количество их увеличивается в остром периоде и при обострении хронического гепатита, а относительное — при ХАГ и ЦП. Наблюдается также умеренная активация гуморального иммунитета: абсолютное содержание В-лимфоцитов с фенотипом СП72 достоверно возрастает при остром гепатите, а относительное — в активной фазе хронического ГС, а также при ЦП и ГЦК. Выявляется также небольшое и недостоверное увеличение содержания иммуноглобулинов в крови пациентов, инфицированных НСУ. Лишь у больных хроническим активным гепатитом достоверно увеличивается концентрация иммуноглобулинов класса М.

В результате инфекции НСУ проникает в клетки, несущие на своей поверхности рецепторы СБ81, и начинает в них размножаться. Синтезируемые вирусные белки представляются па поверхностной мембране клетки, где они распознаются примированными Т-лимфоцитами. Антигенная стимуляция индуцирует пролиферацию и дифференцировку антигенспецифических клонов Т-клеток.

Активация клеток сопровождается коренными изменениями в их метаболизме, что вызывает экспрессию соответствующих антигенов на поверхностной мембране. Одним из важнейших активациоиных маркеров является рецептор интерлейкина 2 (С025). Связываясь с этим цитокином, рецептор передает в ядро клетки второй сигнал, необходимый для индукции пролиферации (первым является антигенный стимул). Вь-2 является ауто- и паракршшым ростовым фактором Т-клсток, поэтому экспрессия его рецептора определяет степень активации Т-лимфоцигов. Непрямой иммунофлуорссцентный анализ показал, что число клеток, реагирующих с анти-СИ25 МКАТ, в суммарной популяции лимфоцитов достоверно по сравнению с контролем повышено в крови почти всех групп пациентов (табл.6).

Таблица 6-Относительное содержание (%) субпопуляций циркулирующих мононуклеаров, экспрессирующих активационные маркеры _

Показатель Норма (п=12) ore (п=10) ХГС ХНГ ХАГ (п=8) (п=14) ЦП (п=14) ГЦК (п=7)

CD25 8,8±0,9 17,4+3,6* 12,5+1,6 19,2+4,5* 7,4+0,5 9,6+3.3

CD4/CD25 12,5±2,4 16,7+2,9 10,7+1,8 15,6+3,2 16,5+1.1 11,5+0,9

CD8/CD25 17,6+1,2 34,5110,1* 22,3 ±5,6 33,8±6,5* 25,4±8,3 27,6+9,9

Примечание: *—достоверное различие по сравнению с контролем (р<0,05)

Двухцветный анализ на проточном лазерном цитометре показал, что существенный рост числа СЭ25-клеток наблюдается как в популяции лимфоцитов, несущих маркер CD4, т.е. хелперных, так и среди CD8, т.е. цитотоксических Т-лимфоцитов (табл.6). Как видно из табл.5, абсолютное содержание В-лимфоцитов, несущих рецептор CD72, было выше, чем в норме при острой HCV инфекции, а процентное содержание повышалось при хроническом активном ГС, ЦП и ГЦК. В популяции CD 19 В-лимфоцитов количество клеток, экспрессируюших антиген CD5, при ХГС значительно превышало контрольные значения (табл.9, рис. 10-12). Обнаружена четкая обратная корреляция между процентом CD5+ В-лимфоцитов и индексом гистологической активности, г=-0,61, р<0,05 (рис.1).

Таблица 1-Относительное содержание (%) CD19 В-лимфоцитов,

экспрессируюших CD5 антиген

Норма (п=12) ore (п=10) ХГС ХНГ ХАГ (п=8) (п=14) ЦП (п=14) ГЦК (п=9)

11,5+0,9 12,411,1 19,6+1,7* 13,2+1,3 13,0±1,4 12,6+1,3

Примечание: *—достоверное отличие от контроля

ПРОДУКЦИЯ ЦИТОКИНОВ ПРИ ИНФЕКЦИИ ВИРУСОМ ГЕПАТИТА С

Определяющую роль в иммунном ответе играют цитокины. Они принимают участие в развитии воспалительного процесса и играют важную роль в повреждении печени, активируя цитотоксические эффекторные механизмы. По данным ряда авторов, HCV-инфекция приводит к стимуляции продукции цитокинов Thl типа— интерферона гамма и интерлейкина 2 (Bergella A.M. et al. 1998; Kawakami Y. et al., 2000). Повышенные уровни провоспалительных цитокинов интерлейкина-1 бета и

фактора некроза опухолей альфа установлены при хроническом гепатите С (Masumoto Т. ct al., 1998,Gramantieri L. Et al., 1999). Согласно другим данным (Толоконская Н.П. 1999, Ferrari С. et al., 1992), HCV и HBV-инфскции повышают сывороточную концентрации интелейкинов 4 и б, одновременно снижая уровень интерлейкина 2. При исследовании цитокинового профиля больных с маркерами HCV- инфекции обнаружены существенные и разнонаправленные изменения содержания многих цитокинов в сыворотке крови (табл.8). Обнаружено значительное повышение концентрации цитокинов Т-хелиерных лимфоцитов 1 типа (Thl): IFNy и IL-2, причем максимальный уровень этих цитокинов, в несколько раз превышающий контрольные значения, отмечен при ОГ. В сыворотке больных других групп концентрация IFNy меньше, тем не менее достоверно и значительно (примерно в 3 раза) превышает контрольные значения (р<0,01). Концентрация IL-2 достигает максимума при ОГС и несколько меньше у пациентов с серьезным поражением функции печени (ЦП и ГЦК), а при ХАГ увеличение концентрации не столь значительно. У больных с низким уровнем воспалительной активности (ХНГ) сывороточное содержание этих цитокинов близко к норме.

Таблица 8 - Концентрация цитокинов в сыворотке крови HCV инфицированные пациентов (пкг/мл)

ХГС

Цитоки- Норма ore ХНГ ХАГ ЦП ГЦК

ны (n=25) (n=10) (n=13) (n=23) (n=22) (n=16)

Thl-цитокины

1FN, 35,7±7,2 278,4+69,1* 45,3±13,4 138,2+46,7* 101,9115,7* 99.1±18,7*

1L-2 26,9±8,8 184,6125,7* 32,5±6,7 71,8115,6* 107,4116.6* 117.3112,1*

Про воспалительные цитокины

TNF„ 12,5±6,1 50,5+14,5* 24,2+8,1* 85,1+22,5* 129,4±32,90* 117,8127,5*

IL-le 41,7+16,4 78,4+21,2 55,1±15,2 105,1+19.9* 168,7+25,6* 151,3+17.4*

IL-6 14,8±9,3 85,4+17,1* 18,5+9,1 88,4117,8* 97,2+22,7* 84,1119,7*

IL-8 17,5±3,9 135,1+36,4* 24.8+5,5 55,1+16,2* 15,1±9,6 13,915,8

Противовоспалительные цитокины Th2

IL-4 42,1+8,2 35,6+17,4 21,1+10,5* 19,3+5,5* 11,5+7,3* 19,216,4*

IL-10 13,1 + 1,4 20,4±6,6* 17,4+3,8 20,1+4,9 12,3+4,5 16,719,3

Примечание: *—достоверные различия по сравнению с нормой.

**—достоверные различия по сравнению с ОГ. Анализ показателей сывороточной концентрации провоспалительных цитокинов показал значительный рост секреции всех иммуномедиаторов (ТКГа, 1Ир, 1Ь-б) исключая 1Ь-8 в большинстве групп. Концентрация цитокина ТМКа в сыворотке больных всех групп, в том числе и ХНГ была достоверно выше по сравнению с контролем, а при ЦП и ГЦК его уровень достоверно превышал значения концентрации, как в норме, так и при ОГ. Достоверное повышение концентрации 1Ь-ф по сравнению с нормой наблюдались только при ХАГ, ЦП и ГЦК, а при ОГ этот цитокин был умеренно повышен, но различие находилось за пределами достоверности. Значительно повышена концентрация 1Ь-6, примерно в равной степени во всех группах, кроме ХНГ. Уровень 1Ь-8 резко повышен при ОГС, и максимально увеличен при хроническом активном гепатите. При ЦП и ГЦК концентрация этого цитокина не отличалась от нормы. Отмечается связь этого

показателя со степенью гистологической активности процесса: у хронических больных в активной фазе концентрация IL-8 превышала контрольные значения (р<0,05), в то время как у пациентов с ХНГ достоверной разницы с контролем не выявлено.

Обращает на себя внимание, что у всех больных уровень IL-10 существенно не отличался от нормы, за исключением группы ОГ, где он превышал норму. Концентрация 1L-4 при ОГ имеет тенденцию к снижению, а во всех остальных группах значительно ниже нормы.

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ Т-ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ С

Важнейшую роль в разрешении острой HCV-икфекции играет сильный и адекватный ответ HCV-специфических Т-хелперных лимфоцитов. Сильная Т-клеточная реактивность в ответ на вирусные антигены обнаружена у пациентов, спонтанно освобождающихся от вируса (Enomoto N. et al.,1994), и слабый ответ — при прогрессировании болезни до хронической инфекции. Более того, сильный и мультиспецифический Т-хелперный ответ выявлен у серопозитивных пациентов в отсутствии виремии, что указывает на критическое значение вирусоспецифической Т-клсточной реактивности в долговременном контроле виремии. В большинстве исследований суждения о функциональной активности лимфоцитов при HCV-инфекции основываются в основном на сывороточном уровне цитокинов, который, однако, является интегральной функцией целого ряда клеток, продуцирующих различные иммуномедиаторы. Отсутствуют данные об эволюции вирусоспецифической Т-клсточной реактивности при прогрессировании заболевания.

В данной серии экспериментов нами исследовалась функциональная активность лимфоцитов больных хронической активной формой гепатита С. Оказалось, что HCV-инфекция приводит к значительным изменениям продукции цитокинов мононуклеарами периферической крови m vitro. Уровень спонтанной секреции IFN7 и IL-8 лимфоцитами больных ХГ примерно в 1,5 раза превышал таковой иммукоцитами здоровых доноров (табл.9), хотя эта разница и находилась за пределами достоверности. Лишь экспрессия TNFa при ХГ была достоверно выше, чем в норме. Таблица 9 - Продукция цитокинов мононуклеарными клетками периферической

крови (пг/мл)

Цитокины Группа Обследованных

Здоровые доноры Больные ХГС

IFNy сп. 356±122 524±178

инд. 834±275 699±183

ИС 2,3 1,3

TNFa сп. 117±34 286+71*

инд. 309±106 391±125

ИС 2,6 1,3

IL-8 сп. 156±48 247±72

инд. 192+55 389+106*

ИС 1,2 1,6

Примечание: сп.—спонтанная продукция,

инд,—индуцированная продукция, *—достоверные различия по сравнению с контролем.

Индукция приводила к существенному росту секреции №N7 и 'ШРа лимфоцитами здоровых людей (индексы стимуляции 2,3 и 2,6 соответственно) и мало влияла на экспрессию 11,-8 (ИС=1,2). Функциональная активность МПК больных ХГ была значительно угнетена. Индукция приводила лишь к незначительному росту секреции 1Р№/ (ИС=1,3). Столь же умеренной (ИС=1,3) оказалась стимуляция синтеза ЮТа. В то же время индукция Н.-8 оказалась достаточно энергичной (ИС=1,6). Только продукция этого цитокина стимулированными лимфоцитами больных ХГ оказалась достоверно выше, чем контрольными.

Анализ пролиферативного ответа на митогены показал, что спонтапиая пролиферация лимфоцитов больных ХГ людей мало отличалась от пролиферативной активности лимфоцитов доноров (табл.10). Исходные уровни включения метки очень близки. Наиболее сильным митогепом оказался ФГА. Он стимулировал включение метки в ДНК лимфоцитов всех здоровых и больных людей. Индекс стимуляции для лимфоцитов доноров составлял 51,8. Ответ на ФГА МПК больных людей был значительно снижен (ИС=22,2). Второй по силе индуктор бласттрансформации, ФМА, активировал синтез ДНК в лимфоцитах 72% доноров и 56% больных ХГ (ИС составляли23,0 и 6,9 соответственно). Антитела против Т-клеточного рецептора (анти-СОЗ) оказывали не столь существенное как поликлональные митогены влияние на синтез клеточной ДНК в лимфоцитах доноров (ИС=15,3) и больных ХГ (ИС>4,2). Пролиферативный ответ на вирусные антигены был гораздо слабее, чем при действии вссх остальных мптогенов. Только у 16 (64%) здоровых доноров индекс стимуляции превыша 2,0. И лишь у 2 из 18 пациентов с ХГ наблюдалась НСУ-специфическая лимфопролиферация.

Таблица 10 - Пролифсративная активность

лимфоцитов больных ХГС (ИМП/М11Н)

Индукторы Здоровые доноры ИС Больные ХГС ИС

Спонтанная пролиферация 925+315 1418±358

ФГА, 10 мкг/мл 47970+5162 51,8 31516+3104* 22,2

ФМА, 20 нг/мл 21304+3235 23,0 9840±1366* 6,9 •

Анти-СОЗ, 1 мкг 14178+1713 15,3 6032±571* - 4,2

Белок кора 1951+427 2,1 1995±448 1,4

Н54/К85 2128+501 2,3 1764+429 1,2

Примечание: *—достоверные различия по сравнению со здоровыми.

ЭКСПРЕССИЯ РАв-РЕЦЕПТОРА И АПОПТОЗ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ВИРУСНОМ ГЕПАТИТЕ С И ГЕПАТОЦЕЛЛЮЛЯРНОЙ КАРЦИНОМЕ

Приведенные выше результаты наших исследований показывают возникновение глубоких нарушений иммунного статуса при НСУ-инфекции. Среди них привлекает внимание значительный рост продукции ЮТа—плюрипогентного провоспалительного медиатора, обладающего высокой степенью гомологии с индуктором апоптоза Раз-лигандом. Можно полагать, что вторичный иммунодефицит, развивающийся при НСУ-инфекции, имеет в своей основе помимо прочих причин и

аномальный апоптоз иммуноцитов, связанный как с прямым действием ксенобиотика на клетку, так и с опосредованным нарушением иммунного гомеостаза. Целью представленных далее исследований был сравнительный анализ экспрессии Рая-антигена лимфоцитами периферической крови и количества клеток, находящихся на конечных этапах апоптоза, у пациентов с ХГ и ГЦК.

Хроническая активная НСУ-инфекцкя приводила к существенному и достоверному повышению экирессии Раь-ашшена (С095) на поверхностной мембране суммарной популяции лимфоцитов (табл.13). Значительно (в 1,7 раза) возрастал процент Т-хелперов, реагировавших с антн-СЭ95 антителами. Еще больше (в 2,7 раза) увеличивалась пропорция СБ95+ клеток в субпопуляции Т-супрессоров. Аналогичная картина наблюалась и при ЦП. У больных ГЦК экспрессия СГ)95 также превышала значения контроля, однако эти различия находились за пределами достоверности. В то же время доля С08+ Т-лимфоцитов, экспрессирующих маркер готовности к апоптозу, была достоверно выше контроля.

Таблица 13-Экспрессия Газ-антигена мононуклеарными клетками периферической крови и количество апоптирукицих клеток (%)_

п С095 С04/С095 С08/СБ95 Апоптирую-щие клетки

Доноры 12 12,4±1,56 3,44+0,51 1,29±0.18 6,55±3,17

ХАГ 14 18,7+3,41* 6,1211,35* 3,56+1,19* 11,07±5,84*

ХНГ 8 13,2+2,04 3,31±0,59 1,22±0,17 7,12±3,62

ЦП 14 20,914,07* 5,9911,42* 4,11+1,21* 13,66±7,51*

ГЦК 7 16,3±6,38 — 3,89±3,15* 16,25±8,37*

Анализ содержания клеток с морфологическими признаками апоптоза в периферической крови показал, что хроническая НСУ-инфекция и ее осложнения приводят к статистически значимому в сравнении с донорской группой увеличению содержания лимфоцитов с признаками терминальной фазы апоптоза. Параллельно нарастанию в периферической крови доли клеток, экспрессирующих Гаэ-рецентор и обнаруживающих морфологические признаки апоптоза, особенно в субпопуляции ЦТЛ, резко возрастает в крови уровень одного из провоспалительных цитокинов фактора некроза опухолей альфа (ТОТа), являющегося аналогом Рая-лиганда. В группе больных хроническим активным ГС концентрация этого лимфокина составляла 85,1122,5 пкг/мл по сравнению с 12,5±6,1 пкг/мл в контрольной группе. При ЦП и ГЦК она составляла 129,4132,90 и 129,4±32,90 пкг/мл соответственно, достоверно превышая значения контроля.

Хотя механизм персистенции НСУ до сих пор остается во многом загадочным, совершенно очевидно, что в основе этого явления лежит неадекватный иммунный ответ хозяина на инфекцию. Определенную роль в негативной регуляции иммунного ответа играет, по-видимому, апоптоз иммунных эффекторных клеток. Известно, что Рав-рецептор экспрессирован в норме в основном на примированных Т-лимфоцитах с фенотипом СЭЗ+С04+ и С1)3+С08+. Экспрессия этого антигена возрастает при активации иммунного ответа и отражает готовность соответствующих клеточных популяций к негативной селекции через последующий апоптоз. Показатель чмела СЁ95+ клеток в суммарной фракции лимфоцитов в наибольшей степени отражает экспрессию этого антигена на мембране Т-хелперных лимфоцитов, поскольку пропорция клеток данной субпопуляции, несущих Раз-рецептор, в 2-3 раза выше, чем в популяциях Т-супрессоров и В-лимфоцитов, в то время как К'К-клетки в норме

вообще не экспрессируют этот антиген. Обращает на себя внимание, что при ХГ и его осложнениях особенно резко возрастает чмело клеток фенотипа С08+С095+. Повышенная готовность к апоптозу реализуется через Кав-РавЬ взаимодействие. При этом апоптозу могут подвергаться вирусоспецифические С04+ и С08+ Т-лимфоциты с фенотипом клеток памяти (С045К0+). Помимо этого антиген-специфические С08+ ЦТЛ могут подвергаться апоптозу и через взаимодействие Т№а со своим рецептором

ТМ1:П(| -г----к „—— —I¿-ЧГЛО . тт-ггг---------------------г____ _____.ч ... ............

11X1 IV! I. 1 ш\\лл я}»! О 1 и^лп ' Ц1Л ини^ап 111 уши И МОЛЧС! иЫ)и и/1,1ШП ил причин

развития иммунодепрессии, консервирующей персистенцию вируса. Значительное повышение продукции ТО Ра при ХГ и его осложнениях свидетельствует в пользу этого предположения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При НСУ-инфекции главным органом-мишенью является печень. Это особый орган, помимо участия ее в пищеварении она осущестляет детоксикациониую барьерную функцию. Поэтому при ее поражении вирусом к «метаболической интоксикации», свойственной любой инфекционной болезни вследствие действия на организм возбудителя присоединяется тяжелая интоксикация, возникающая вследствие вирусного поражения основных структурных элементов печени— гепатоцитов и других. Это превращает ее в дополнительный источник интоксикации, лишая ее одновременно защитной функции.

Вирус инфицирует гепатоциты и В-лимфоциты и реплицируется в них, хотя и с низкой интенсивностью, не обеспечивая тем самым оптимальный уровень антигенной стимуляции. К тому же вирус нарушает функционирование профессиональных антиген-презентующих клеток, участвующих в процессинге антигена и его представлении наивным 'Г-лимфоцитам и реагирующим В-лимфоцитам, что сопровождается каскадом регуляторных событий, определяющих характер иммунного ответа организма. При этом, с одной стороны, развивается состояние гипореактивкости с низким титром вируснейтрализуюгцих антител вплоть до апоптоза эффекторных Т - и В-клеток. С другой стороны, нарушается баланс ТЫ ЛЪ2 субпопуляций Т-лимфоцитов, сопровождающийся повышенной продукцией, прежде всего П;Ыу и, возможно, 1Ь-2. Интерферон активирует макрофаги, вызывая интенсивную экспрессию ТОТ а и других микробицидных и цитотоксических факторов. Представляется, что высокий уровень именно этих двух цитокинов (интерферона гамма и фактора некроза опухолей) в сочетании с цитотоксическим действием СБ8+ ЦТЛ и макрофагов является непосредственной причиной прогрессирующего поражения печени при ХГ.

НСУ-инфекция, как правило, приводит к выраженным изменениям иммунной системы, характеризующимся слабостью и неэффективностью как клеточного, так и гуморального звеньев иммунного ответа. Одним из ключевых патогенетических феноменов является гиперактивация макрофагов, опосредованная дисфункцией регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов и изменением продукции цитокинов-регуляторов пролиферации различных типов клеток. Трудно переоценить также роль провоспалительных цитокинов, нарушения баланса цитокинов и апоптотической гибели Т-клеток в формировании иммунопатологии. Огромная роль в повреждении печени принадлежит процессам апоптоза гепатоцитов, которые индуцируются иммунными защитными механизмами и непосредственно вирусным агентом. Массовая гибель печеночных клеток не компенсируется сопутствующей пролиферацией, что постепенно приводит к развитию фиброза. Длительное напряжение пролиферативных процессов в условиях глубоких иммунологических нарушений может вызвать мутацию в одном из генов, контролирующих размножение

и дифференцировку клеток, с образованием и развитием клона малигнизированных клеток.

Сложность патогенеза, тесная взаимосвязь патологических процессов, глубина и разнообразие иммунных нарушений, вызванных действием возбудителя, указывают на необходимость длительного и комплексного лечения для достижения стойкой клияико-иммунологической ремиссии.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. На всех изучаемых этапах НСУ-инфекции значительно изменяется соотношение основных субпопуляций иммунокомпетентных клеток за счет уменьшения содержания в крови зрелых Т-лимфоцитов, несущих маркер СГ)3+, субпопуляции Т-хелперов с фенотипом СБ4+ и увеличения СЭ8+. Периоды наибольшей активности паталогического процесса (ОГ, ХАГ, ЦП) характеризуются увеличением N К-клеток с фенотипом СШ6+. Маркером повышенной активности ЦТЛ С08) является повышенная экспрессия рецептора к 1Ь-2 (С025).

2. Изменение в спектре изученных цитокинов на всех этапах НСУ-инфекции, заключается в дисбалансе уровня цитокинов ТЫ, ТЬ2-клона Т-лимфоцитов и противовоспалительных цитокинов. При ОГС и ХАГ доминируют цитокины ТЫ -клона, что свидетельствует о преобладании реакций клеточного типа в иммунном ответе. При ЦП и ГЦК наряду с повышенной продукцией цитокиновТЫ установлена сверхэкспрессия провоспалительных цитокинов.

3. Вариант хронического "гепатита,где при активном инфекционном процессе отсутствуют существенные1 признаки ' поражения печени, характеризуется минимальными иммунологическими изменениями иммунного статуса.

4. При нормальном или повышенном уровне спонтанной продукции цитокинов мононуклеарами периферической крови их способность адекватно отвечать как на неспецифические поликлональные активаторы, так и на специфическую стимуляцию Т-клеточного рецептора и индукцию вирусными антигенами значительно снижена.

5. При хронической активной НСУ-инфекции и ее последствиях (ЦП и ГЦК) выявлено значительное увеличение числа лимфоцитов, экспрессирукмцих маркер готовности к апоптозу—С095. При этом наиболее значительно возрастает число клеток с фенотипом С08+С095+. В 2-2,5 раза возрастает, также количество лимфоцитов, находящихся на конечных стадиях апоптоза. Мотив программируемой клеточной смерти играет определенную роль в патогенезе хронического ГС и цирроза печени.

Практические рекомендации:

1. В диагностике хронического гепатита С в целях уточнения характера тяжести течения болезни необходимо в оценке иммунного статуса считать наиболее информативным комплексное исследование предложенных структурных и функциональных свойств иммунокомпетентных клеток, спектра цитокинов и показателей апоптоза.

2. Считать признаком активности патологического процесса увеличение количества клеток с цитотоксическими свойствами (Сй8+ и Ж-клеток с фенотипом СБ 16+).

3. Установленное в нашем исследовании смещение баланса цитокинов в ползу ТЫ и повышенную экспрессию провоспалительных цитокинов следует учитывать в выборе ноценке иммунной терапии.

4. В целях дифференцированного подхода к терапии гепатита С рекомендовано выделять вариант ХГ, где при активности инфекционного процесса, отсутствуют признаки поражения печени и изменения в иммунном статусе.

значимыми в оценке характера болезни и прогноза гепатита С, чем обнаружение вирусной РНК.

6. Рекомендовать учитывать количество лимфоцитов, находящихся на конечных стадиях апоптоза и экспрессирующих готовность к апоотозу в комплексной оценке иммунного статуса при гепатите С.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Дьяченко A.A. Пролиферативная активность лимфоцитов и цитокиновый профиль при хронических гепатитах // Тезисы докл. Iii съезда иммунологов и аллергологов СНГ. - Сочи, 2000. - С.108.

2. Дьяченко A.A., Кулябин Ю.В. Цитокиновый профиль при хроническом вирусном гепатите С и его осложнениях // Тезисы докл. Науч. сессии посвящ. 65-лет. НГМА. - Новосибирск, 2000. - С. 279.

3. Дьяченко A.A., Дьяченко А.Г. Продукция цитокинов при инфекции вирусом гепатита С// Иммунопатология аллергология инфектология - 2001. - №1.-С.

4. Дьяченко A.A., Дьяченко А.Г. Гепатоцеллюлярная карцинома и вирус гепатита С// Онкология.-2001,-Т. 3. - №2-3.- С. 207-210.

5. Дьяченко A.A., Красовицкий З.И Вирус гепатита С: этиология и иммунопатология //Современные инфекции. - 2001.- №2. - С. 66-75.

6. Дьяченко A.A., Дьяченко А.Г. Мотив программированной клеточной смерти в патогенезе вирусного гепатита С//Вестник СумГУ. - 2001. - №11(32). - С. 151155.

7. Дьяченко A.A., Дьяченко А.Г. Дефиниции и феноменология апоптоза // Вестник СумГУ. - 2001. - №12(33). - С.5-15

8. Дьяченко A.A., Абу Нада И., Дьяченко А.Г. Экспрессия Fas-рецептора и апоптоз лимфоцитов периферической крови при хроническом гепатите С и его осложнениях // / Тезисы докл. IV съезда иммунологов и аллергологов СНГ. -Москва, 2001. - Т. 2. - №2. - С. 55-56.

9. Дьяченко A.A., Толоконская Н.П., Кулябин Ю.В. Функциональная активность Т-лимфоцитов при хронической инфекции вирусом гепатита С // Тезисы докл. 12 научно-практ.конф. "Актуальные вопросы современной медицины". Новосибирск. - 2002. -С. 360.

85-91.

Соискатель