Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Характеристика и механизмы иммунных нарушений у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией

На правах рукописи

СЕЛЕДЦОВА НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА И МЕХАНИЗМЫ ИММУННЫХ НАРУШЕНИЙ У БЕРЕМЕННЫХ С НАДПОЧЕЧНИКОВОЙ ГИПЕРАНДРОГЕНИЕЙ

14.00.36 - Аллергология и иммунология 14.00.01 - Акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

-1 окт 2009

Новосибирск 2009

003478298

Работа выполнена в Учреждении РАМН Научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицииских наук

доктор медицинских наук, профессор

Черных Елена Рэмовна Пасман Наталья Михайловна

Скосырева Галина Александровна Гайдуль Константин Валентинович

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова Росмедтехнологии

Защита состоится «*■<?уР^сУ^Л^с^/ 2009 года ъ/^О^ часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 НИИ Клинической Иммунологии СО РАМН по адресу: 6300099, г. Новосибирск, ул.Ядринцевская, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ Клинической Иммунологии СО РАМН

Автореферат разослан « г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук ^

Кудаева Ольга Тимофеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

В последнее время гиперандрогении (ГА) надпочечникового генеза уделяется юльшое внимание в связи с широкой распространенностью данной патологии среди кенщин репродуктивного возраста. Наличие ГА рассматривается как один из закторов риска ранних гестационных осложнений (Сидельникова В.М., 2005). В го se время особенности течения второй половины беременности и родов у женщин с [анной патологией исследованы недостаточно. Кроме того, неизученным остается вопрос о механизмах гестационных осложнений при ГА, особенно аспектах патогенеза, касающихся иммуно-эндокринных взаимодействий.

Как известно, физиологическое течение беременности происходит на фоне супрессорной перестройки иммунной системы, направленной на формирование и поддержание иммунологической толерантности к аллоантигенам плода. Важная роль в этом процессе отводится смещению цитокинового баланса в сторону доминирования ТЪ2/противовоспалительных цитокинов (IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13), а также увеличению количества естественных регуляторных CD4'CD25' Т-лимфоцитов (Шмагель К.В., 2003; Сотникова Н.Ю. 2005; Сидельникова В.М., 2005, Saito S., 2007; Zhao J.X., 2007). Кроме того, определенное иммунорегуляторнос влияние могут оказывать NK- клетки (Kitaya К.. 2008; Vacca Р., 2008). Нарушение супрессорной перестройки приводит к развитию осложнений, в частности, невынашиванию беременности и гестозу (Хонина Н.А., 2006; Raghupathy R, 2001; Quenby S., 2002; Xia X.Y., 2008; Yang H„ 2008; Faridi R.M.. 2009).

Данные о состоянии иммунитета у беременных с ГА надпочечникового генеза в литературе практически отсутствуют. В то же время хорошо известно, что течение беременности требует согласованного взаимодействия иммунной и эндокринной систем. Циркулирующие гормоны при беременности играют важную роль в формировании гестационной иммуносупрессии (Сидельникова В.М. 2002. Szekeres-Bartho J., 2001), и нарушение гормональной регуляции может приводить к развитию иммунных дисфункций.

Поскольку дегидроэпиандростерон и его сульфатированная форма (ДГЭАС) активируют цитотоксическую функцию NK-клеток (Solerte S.B., 2005). пролиферативный ответ Т-лимфоцитов (Pahlavani М.А., 1995) и продукцию Thl-цитокинов (Hernández-Pando R., 2005), повышение концентрации данного гормона может негативным образом сказываться на формировании иммуносупрессии и приводить к развитию осложнений беременности.

Согласно данным литературы, стимулирующее влияние ДГЭАС на Т-клетки и NK-клетки реализуется через специфические рецепторы (Okabe Т., 1995). В то же время не исключено, что действие гормона может опосредоваться через другие разновидности иммунокомпетентных клеток, например, дендритные клетки (ДК). Известно, что ДК обладают выраженной регуляторной активностью и могут не только активировать, но и подавлять иммунный ответ, в том числе индуцировать толерантность к аллоантигенам (Yamazaki S., 2007; Dolganiuc А., 2008). Кроме того, ДК способны участвовать в регуляции NK -клеток (Laskarin G., 2008).

Свойства ДК при беременности у человека исследованы недостаточно, а данные, характеризующие влияние ДГЭАС на ДК практически отсутствуют. Между тем, исследование влияния ДГЭАС на дифференцировку/созревание и функциональную активность ДК представляет большой интерес как в фундаментальном, так и практическом аспектах, поскольку раскрытие механизмов иммунорегуляторной активности ДГЭАС является основой для более полного осмысления иммуно-эндокринных взаимодействий и разработке новых подходов к диагностике, профилактике и лечению осложнений беременности, связанных с эндокринными дисфункциями.

Все вышесказанное определило цель и задачи исследования. Цель исследования. На основе клипико-иммунологического анализа и оценки влияния дегидроэпиандростерона сульфата на созревание/функции ДК in vitro изучить роль иммуно-эндокринных нарушений в патогенезе осложнений гестации у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией. Задачи исследования.

1. Провести сравнительный анализ параметров клеточного звена иммунитета и продукции ТЫ/ТЬ2-цитокинов в группах беременных с наличием и отсутствием надпочечниковой гиперандрогении.

2. Исследовать влияние ДГЭАС на созревание/дифференцировку (фенотип) и функциональную активность дендритных клеток беременных (способность индуцировать пролиферацию Т-клеток в CKJI, стимулировать Th 1 и Th2- ответ, влиять на активированные NK-клетки) в культуре in vitro.

3. Охарактеризовать дендритные клетки беременных (фенотип, продукцию цитокинов, аллостимуляторную и Thl/Th2 - стимулирующую активность) с нормальным и повышенным уровнем ДГЭАС в крови.

4. Провести ретроспективный анализ частоты поздних осложнений беременности и родов в группах с наличием и отсутствием надпочечниковой гиперандрогении.

Научная новизна.

Впервые охарактеризованы параметры иммунитета у беременных с надпочечниковой ГА. Установлено, что по сравнению с физиологической гестацией беременные с ГА характеризуются повышенной пролиферативной активностью Т-клеток в ответ на стимуляцию a-CD3MAT и аллоантигенами партнера, сниженным относительным содержанием естественных регуляторных Т-клеток (CD4+CD25+) и повышенным содержанием активированных (CD3"CD16+CD56+) NK-клеток. Также продемонстрировано, что течение беременности, осложненной ГА, ассоциировано с усилением КонА-индуцированной продукции IFN-y, TNF-a, GM-CSF клетками крови. При этом между выраженностью иммунных дисфункций и уровнем ДГЭАС в сыворотке крови выявлена достоверная взаимосвязь.

Установлено, что генерация интерферон-альфа-индуцированных дендритных клеток (ИФН-ДК) в культуре in vitro в присутствие ДГЭАС сопровождается увеличением содержания зрелых (CD83+) и активированных (CD25+) ДК и усилением их способности стимулировать пролиферативный ответ Т-клеток. При этом ДГЭАС усиливает способность ДК стимулировать продукцию Т-клетками IFN-

у, ингибирует способность Т-клеток к продукции IL-4 и подавляет способность ИФН-ДК индуцировать апоптоз активированных NK-клеток.

Впервые продемонстрировано, что у беременных с ГА ИФН-ДК характеризуются более высоким содержанием клеток с маркерами зрелых и активированных ДК (CD83 и CD25), причем возрастание С083-позитивных клеток обусловлено увеличением как зрелых миелоидных ДК (CD83+CD14"), так и CD83+ -клеток, ко-экслрессирующих маркер моноцитов/макрофагов (CD83+CD14+). Кроме того, по сравнению с физиологической беременностью ИФН-ДК беременных с ГА отличаются более высоким уровнем продукции IFN-y и низким уровнем IL-4, а также более высокой способностью стимулировать МНК к пролиферации и продукции IFN-y в СКЛ.

В процессе клинического анализа получены новые данные о повышенной частоте встречаемости поздних осложнений беременности (гестоза, преэклампсии и преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты) и родов (слабость родовой деятельности, несвоевременное излитие околоплодных вод) при ГА. Установлено, что у беременных с ГА регистрируется раннее появление симптомов гестоза, и чаще встречаются классические варианты гестоза. Теоретическая и практическая значимость.

Сравнительный анализ параметров иммунитета у беременных с нормальным и повышенным уровнем ДГЭАС позволил охарактеризовать иммунные дисфункции, свидетельствующие о нарушении гестационной иммуносупрессии у беременных с ГА.

Выявленные в культуре in vitro стимулирующие эффекты ДГЭАС на дифференцировку/созревание, аллостимуляторную активность и Thl-стимулирующую активность ДК беременных раскрывают новые механизмы иммуностимулирующего действия ДГЭАС, опосредованные ДК. Впервые установлен новый механизм негативной регуляции активированных NK-клеток со стороны ИФН-ДК и продемонстрировано ингибирующее действие ДГЭАС на способность ИФН-ДК стимулировать активационно-индуцированный апоптоз CD56+CD16+ NK-клеток. Полученные новые данные об особенностях фенотипических и функциональных свойств ДК при физиологической беременности (признаки незрелости, низкая аллостимуляторная активность, доминирование Th2-стимуляторной активности) и выраженных изменениях ДК у беременных с ГА (более зрелый фенотип, появление Thl-стимуляторной активности) свидетельствуют о вовлечении ДК в процессы перестройки иммунной системы при физиологической гестации и участии ДК в опосредованных ДГЭАС иммунных нарушениях при надпочечниковой ГА.

Практическая значимость работы заключается в выявлении иммунологических маркеров, которые могут служить критериями нарушений гестационной иммуносупрессии у беременных с надпочечниковой ГА. Обнаруженные в результате проведенного клинического анализа факты о повышенной частоте встречаемости тяжелых форм гестоза и более раннем возникновении данного осложнения у беременных с надпочечниковой ГА позволяют отнести этих женщин в группу риска по развитию гестоза.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Повышенный уровень дегидроэпиандростерона сульфата является причиной дефекта гестационной иммуносупрессии у беременных с надпочечниковой пшерандрогенией.

2. Иммунотропные эффекты дегидроэпиандростерона сульфата в культуре in vitro и in vivo реализуются с участием дендритных клеток.

3. Беременные с повышенным уровнем дегидроэпиандростерона сульфата составляют группу риска по развитию поздних гестационных осложнений, в первую очередь тяжелых форм гестоза.

Объем и структура диссертации. Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, практических рекомендаций и выводов. Материал изложен на 146 страницах машинописного текста, включающего 15 таблиц и 6 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 285 литературных источника (245 иностранных).

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва - 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск -2005); ежегодном конкурс - конференции студентов и молодых ученых «Авиценна - 2006» (Новосибирск -2006). Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Омск - 2007), XIII Всероссийском форуме с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург - 2009). Апробация диссертации состоялась 02 июля 2009 года на расширенном семинаре НИИ КИ СО РАМН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 28 печатных работ, из них 11 статей, из которых 10 опубликовано в журналах, рекомендованных ВАК, для публикации научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата наук.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ , Характеристика женщин, включенных в исследование.

Диссертационная работа основана на результатах иммунологического обследования женщин репродуктивного возраста и беременных, наблюдавшихся в женских консультациях МБУЗ КДЦ им.А.П.Гумилевского, МУЗ ДСКБ№5, МУЗ ГКБ№11, №3 за период 2004-2008 годы. Обследование проводилось на базе лаборатории клеточной иммунотерапии НИИ КИ СО РАМН (руководитель д.м.н., профессор Е.Р. Черных).

В исследование были включены 142 небеременные женщины, 190 беременных с физиологическим течением гестации и 101 беременная с надпочечниковой ГА. Группы беременных были сопоставимы по возрасту, срокам беременности (14,2±0,2 и 15,1±0,1 недель гестации, соответственно) и

соматическому статусу. Венозную кровь у небеременных забирали в фолликулярную фазу менструального цикла, у беременных - в сроки 9-20 недель.

Дополнительно проводили ретроспективный анализ сплошной выборки историй беременности женщин, наблюдавшихся в женской консультации МУЗ ДСКБ №5 г. Новосибирска в 2002-2004 годы (п=690). Для оценки степени тяжести гестоза использовали классификацию и критерии, разработанные кафедрой акушерства и гинекологии НГМИ 1990 г., дополненные в 1996 г (Серов В.Н. и др., 2001).

Иммунологические исследования. МНК культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических исследований (0,1 х 10^ клеток на лунку в 0,15 мл культуралыюй среды). Для стимуляции клеток использовали растворимые молоклональные анти-СОЗ антитела (aCD3 ICO-90, ТОО «Медбиоспектр», Москва, 1 мкг/мл). В отдельной серии экспериментов пролиферативный ответ клеток исследовали в однонаправленной смешанной культуре лимфоцитов (CKJI), где в качестве стимуляторов использовали лимфоциты партнера, инактивированные в течение 40 минут митомицином С (Serva, 40 мкг/мл). Интенсивность пролиферации оценивали через 72 часа (анти-СОЗ -индуцированные культуры МНК) или 120 часов (CKJI) по включению метки 3Н-тимидина.

Моноциты выделяли на чашках Петри 33 мм2 (Nunclon, Дания) путем прилипания к пластику МНК (2-5 х 106/мл) в присутствии 10% сыворотки крови AB(IV). ДК генерировали путем культивирования прилипающей фракции МНК в течение 3 сут в среде RPM1-1640, дополненной 10% сыворотки плодов коровы (БиолоТ, Санкт-Петербург), в присутствии GM-CSF (1000 Ед/мл, Leucomax, Шеринг-Плау, Швейцария) и IFN-a (1000 Ед/мл, Роферон-А, Rochc, Швейцария) с последующим дозреванием с липополисахаридом (10 мкг/мл, ЛПС E.colli 0114:В4, Sigma-Aldrich) 24 ч.

Для оценки продукции цитокинов гепаринизированную венозную кровь разводили 1:4 средой RPM1-1640, дополненной 100 мкг/мл гентамицина, и стимулировали конканавалином А (Кон A, Sigma, 15 мкг/мл) в течение 24 ч. Содержание цитокинов оценивали методом проточной флюориметрии на 2-лучевом лазерном автоматизированном анализаторе (Bio-Plex Protein Assay System, Bio-Racl, USA) с использованием коммерческих тест-систем 9-Р1ех. В ряде случаев концентрацию цитокинов в супернатантах и уровень ДГЭАС в сыворотке крови определяли методом ИФА, используя тест-системы производства «Вектор-Бест», г. Новосибирск (IFN-y), «Протеиновый контур», г.Санкт-Петербург (IL-4) и «ООО Хема-Медика», г. Москва (ДГЭАС).

Определение субпопуляций клеток проводили методом проточной цитофлуориметрии, используя меченные АРС анти-СОЗ и анти-CDllc мАТ (BD PharMingen, США), фикоэритрином (РЕ)-меченные aimi-CD4 и анти-С014 мАТ ("ЗАО Сорбент-сервис", г. Москва), анти-С056, анти-CDla, анти-С0123 мАТ (Phar-Mingen, США) и меченные FITC анти-С025, анти-С083 мАТ (BD PharMingen, США), aHTH-CD16 мАТ («Сорбент», Москва).

Определение фаз клеточного цикла и уровня апоптоза проводили с помощью окрашивания клеток Actinomycin D, 7-Amino (Calbiochem, Германия) методом

проточной цнтофлюориметрии. Оценку экспрессии внутриклеточных цитокинов проводили методом трехцветной проточной цитометрии (FASC Clibur, Becton Dickinson). Для этого МНК здоровых доноров, истощенные от прилипающих клеток, культивировали в присутствии и отсутствие ИФН-ДК в соотношении 10:1 в течение 5 сут. Затем проводили рестимуляцию аналогичными ИФН-ДК в течение 48 ч (вторичная CKJ1). За 18 ч до конца инкубации в культуру добавляли 10 мкг/мл брефелдина (ISN). МНК обрабатывали АРС-меченными airrii-CD3 мАТ и фиксировали 1% раствором параформальдегида. Пермеабилизацию клеток проводили с использованием 0,2% раствора Твин-20. Для идентификации внутриклеточных детерминант цитокинов клетки обрабатывали FITC-меченными анти-IFN-a мАТ и РЕ-меченными анти-1Ь-4 мАТ (Becton Dickinson, США).

Аллостимуляторную активность ИФН-ДК оценивали в CKJI при культивировании МНК доноров в присутствии ИФН-ДК небеременных и беременных с отсутствием и наличием ГА (10:1, 5 суток).

Статистическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной, параметрической и непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы «STATISTICA 5.0».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Характеристика параметров иммунитета у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией

Исследование параметров иммунитета показало, что по сравнению с небеременными, женщины с физиологической беременностью характеризовались снижением пролиферативного ответа МНК в аСОЗ-стимулированных культурах (табл.1). У беременных с ГА пролиферативный ответ Т-клеток на стимуляцию aCD3 мАТ был снижен, однако в гораздо меньшей степени и достоверно превышал таковой при физиологической беременности. При этом между концентрацией ДГЭАС в сыворотке крови и интенсивностью пролиферации Т-клеток в aCD3-стимулированных культурах в группе беременных выявлялась прямая корреляционная связь (rs=0,41, р<0,05, п=23).

Анализ ответа Т-клеток на стимуляцию аллоантпгенами выявил резкое снижение уровня пролиферации у женщин с физиологической беременностью по сравнению с небеременными женщинами (табл. 1). В то же время у беременных с ГА уровень пролиферации в CKJI значимо превышал таковой у женщин с физиологической беременностью. Интенсивность ответа в СКЛ также находилась в прямой корреляционной зависимости от концентрации ДГЭАС в крови беременных (rs=0,53,p<0,01,n=24).

Относительное содержание регуляторных С04+С025+Т-клеток при физиологической беременности в 3 раза превышало количество этих клеток у небеременных (табл.2). В группе с ГА содержание С04+С025+Т-клеток было достоверно ниже, чем у беременных с отсутствием ГА. При этом количество регуляторных Т-клеток у беременных обратно коррелировало с уровнем ДГЭАС (rs=-0,57, Р<0,001). Аналогичные изменения были выявлены в отношении CD4 -

позитивных клеток с высоким уровнем экспрессии СВ25-антигеиа (С04~С0251"-1'). Количество этих клеток при физиологической беременности в среднем в 2,5 раза превышало аналогичный показатель у небеременных.

Таблица 1

Характеристика пролифератнвного ответа Т-клеток у небеременных женщин,

беременных с наличием и отсутствием надпочечниковой гнперандрогении

Стимулированный пролиферативный ответ Т-клеток Исследуемые группы

Небеременные женщины Беременные ГА(-) Беременные ГА(+)

- аСОЗмАТ 34710 ±6420 п=29 14840 ± 2060* п=17 27630±3140" п=22

- МНК партнера 12818 ±607 п=11 2131 ±234* п=17 7284±1087#* п=12

Примечание: *Ри<0,01 -достоверность различий по сравнению с группой неберемеиных женщин; #Ри<0,01 - по сравнению с группой беременных с отсутствием ГА (и- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Таблица 2

Регуляторные Т-клетки в периферической крови у небеременных женщин,

беременных с наличием и отсутствием надпочечниковой гиперандрогенни

Содержание регуляторных Т-клеток Исследуемые группы

Небеременные женщины Беременные ГА(-) Беременные ГА(+)

С04+С025+(%) 4,4 ±0,4 (п=25) 12,9 ±1,4*(п=20) 7,6 ± 0,7*(п=26)

С04+С025+Ыб" 0,9 ±0,1 (п=12) 2,4±0,3*(п=12) 1,1 ±0,2*(п=11)

Примечание: *Рц<0,001 -достоверность различий по сравнению с группой небеременных; #Ри<0,01- по сравнению с группой беременных с отсутствием ГА (11- критерий Внлкоксона-Манна-Уитии)

В то же время у беременных с ГА содержание С04+С0251"8'1 Т-клеток практически не отличалось от такового у небеременных женщин (табл. 2).

Оценка количественного содержания различных субпопуляций клеток с естественной цитотоксической активностью показала, что беременные с ГА, так же как и женщины с физиологической беременностью, характеризовались сходным с небеременными количеством С03"С016"С056+, однако отличались от женщин с физиологической беременностью 2-кратным возрастанием количества активированных 1ЧК-клеток (С03"С016+С056+) (рис.1). Между концентрацией ДГЭАС в сыворотке крови и содержанием С03"СО1б+СО56+ - ЫК-клеток определялась достоверная прямая корреляционная взаимосвязь в общей группе беременных (г5=0,6; ри<0,01; п=24).

По сравнению с небеременными женщинами при физиологическом развитии беременности интенсивность КонА-стимулированной продукции

ТЫ/провоспалительных цитокинов (№N-7, ТОТ-а, ОМ-СБР) клетками крови была достоверно ниже (табл. 3).

СГО-СР16-С056+ С03-С016+С05б+

СОЗ+Сй56+

Рис.1. Субиоиуляшш киллериых клеток периферической крови небеременных женщин и беременных с наличием и отсутствием гиперандрогении. Количество человек в каждой группе - 12; *- Ри<0,01 - достоверность различий по сравнению с группой беременных с нормальным уровнем ДГЭАС, II- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни. Между концентрацией ДГЭАС в сыворотке крови и содержанием С03"С016+С05бт - ЫК-клеток определялась достоверная прямая корреляционная взаимосвязь в общей группе беременных (г5=0,6; ри <0,01; п=24).

По сравнению с небеременными женщинами при физиологическом развитии беременности интенсивность КонА-стимулированной продукции

ТЫ/провоспалительных цитокинов (№N-7, Т№-<х, вМ-СЗН клетками крови была достоверно ниже (табл. 3).

Таблица 3

Продукция цитокинов КонА-стимулированными клетками цельной крови небеременных женщин и беременных с наличием и отсутствием надпочечниковой гиперандрогении

Цитокины (пкг/мл) Исследуемые группы

Небеременные женщины (п=8) Беременные ГА (-) (п=6) Беременные ГА (+) (п=П)

1Ш-у 183,5 ±58,4 35,8 ±9,7* 111,6 ,± 20,0м

1Ь-2 131,3 ±47,6 72,2 ±22,1 84,7 ±18,8 .

Т№-сх 264,7 ± 63,2 26,9 ± 8,5** 64,7 ±21,4*

1И2 9,0 ± 1,5 6,1 ± 1,2 8,4 ± 0,6

ОМ-С5Р 13,9 ±1,5 8,5 ±0,9** 14,0 ± 1,8*

1Ь-4 6,5 ± 0,4 5,7 ±0,4 5,7 ±0,5

М-5 5,7 ±0,8 6,4 ± 1,9 8,6 ±2,1

1Ь-10 70,0 ± 11,6 40,2 ± 12,0 32,8 ± 10,6*

1ИЗ 5,4 ±1,0 7,9 ± 3,3 8,1 ±2,9

1Р>]-у/1Г-4 27,7 ±7,3 5,9 ± 1,2* 16,8 ± 3,7***

Примечание ,*Ри<0,05, **Ри<0,01 - достоверность различий по сравнению с группой небеременных; "Ри<0,05, ™Ри<0,01 -по сравнению с группой беременных с отсутствием ГА (II-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

У беременных с ГА уровень продукции IFN-y и GM-CSF в культурах клеток крови был достоверно выше, чем у женщин с физиологической беременностью. Корреляционный анализ показал наличие прямой взаимосвязи между концентрацией ДГЭАС в сыворотке крови беременных и уровнем продукции IFN-y клетками цельной крови (rs=0,73, р<0,01, п=17).

Таким образом, у беременных с надпочечниковой ГА отмечается нарушение гестационной иммуносупрессии, что проявляется усилением пролиферативного ответа в a-CD3 и аллоантиген - стимулированных культурах МНК крови и увеличением доли активированных CD3"CD16+CD56+ NK-клеток. В основе механизмов, приводящих к выявленным изменениям, может лежать сниженное количество естественных регуляторных CD4+CD25+ Т-клеток в циркуляции, а также нарушение Thl-Th2 переключения и сохранение активной продукции Thl/провоспалительных цитокинов. При этом причастность выявленных изменений с повышенным уровнем ДГЭАС у беременных с ГА подтверждается наличием достоверных корреляционных связей между концентрацией гормона и выраженностью изменений анализируемых иммунологических параметров.

Влияние ДГЭАС на дифференцировку/созревапие и функциональную активность дендритных клеток в культуре In vitro.

С целью исследования влияния ДГЭАС на дифференцировку и созревание ИФН-ДК оценивали эффект гормона на экспрессию поверхностных маркеров ДК (табл. 4).

Таблица 4

Влияние дегидроэпиандростерона сульфата на дифференцировку и

созревание ИФН-ДК беременных

Содержание клеток, экспрессирующих CD маркер (%) В отсутствие ДГЭАС (п=10) В присутствие ДГЭАС (1(Г6М)

В течение всего периода генерации ДК (п=10) На стадии дозревания ДК (п=10)

CD83 17,0±2,4 17,5±2,8 21,5±3,1**

CDla 4,1 ±0,3 4,9±0,7 6,3±0,8*

CDllc 18,4±2,8 19,6±3,0 19,3±3,0

CD 123 21,6±3,4 23,0±3,8 21,5±4,1

CD14 14,3±2,2 12,8±1,9 14,4±2,2

CD25 8,8±2,2 9,4±1,6 12,0±2,1*

Примечание: *Ри<0,05, **Рц<0,01 - достоверность различий по сравнению с ДК, полученными в стандартных условиях (II- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни в сопряженных парах)

Добавление ДГЭАС с первых суток культивирования достоверно не влияло на количество ДК, экспрессирующих исследуемые маркеры. В то же время, при добавлении ДГЭАС совместно с LPS (за 24 ч до окончания культивирования) регистрировалось увеличение доли как незрелых (CDla-позитивных), так и зрелых ДК (CD83+), в том числе активированных С025-позитивных клеток.

Из данных табл. 5 видно, что обработка ДК беременных ДГЭАС (10"6М) повышала их аллостимуляторную активность. Так, интенсивность пролиферации и индекс стимуляции в СКЛ, индуцированной ДГЭАС-модифицированными ДК были достоверно выше, чем в культурах, индуцированных интактными ДК.

Таблица 5

Влияние дегидроэпиандростерона сульфата на аллостимуляторную

активность ИФН-ДК беременных

Клеточные культуры Пролиферация (имп/мин) ИВ (усл.ед.)

МНК 425 ± 86

МНК+ДК„(10.Т) 4660 ±1007 13,1 ±3,7

МНК+ДКЩ-эас (10:1) 9354 ± 1916* 25,6 ± 6,0 *

Примечание: МНК доноров инкубировали в отсутствие и в присутствие ДК:женщин с физиологической беременностью (п~6), генерированных в стандартных условиях (МНК+ДКо) и с ДГЭАС (МНК+ДКдгэлс)- Тестирование всех ДК проводилось на МНК двух различных женщин - доноров. Индексы влияния (ИВ) рассчитывали как соотношение пролиферативного ответа МНК доноров при стимуляции ДК к уровню спонтанной пролиферации. *Ри<0,01 -достоверность различий по сравнению с ДКо; (и критерий Вилкоксона-Манна-Уитни в сопряженных парах).

На следующем этапе оценивали влияние ДГЭАС на ТЫ- и ТЬ2 -стимулирующую активность ДК беременных. Для этого сравнивали продукцию Т-клетками 1РМ-у и 1Ь-4 в супернатантах вторичной СКЛ, которую индуцировали интактными или ДГЭАС-модифицированными ДК, полученными от 9 женщин с физиологическим течением гестации (табл.6). Проведенные исследования показали, что продукция №N-7 в супернатантах СКЛ, индуцированной ДГЭАС-модифицироваиными ДК была в 2,2 раза выше, а концентрация 1Ь-4 - в 1,7 раза ниже, чем в культурах СКЛ, индуцированной интактными ДК (табл.6).

Таблица 6

Влияние дегидроэпиандростерона сульфата на ТЫ/ТЬ2-стимулирующую

активность ИФН-ДК беременных

Клеточные культуры (пкг/мл) ИВ (расч.ед.) 1Ь4 (пкг/мл) ИВ (расч.ед.)

МНК 41,8 ±28,7 1,0±0,0

МНК+ДК„ 145,4 ±79,5 6,0±3,4 117,0±34,4 117,0± 34,4

МНК+ДКдгмс 320,1 ± 142,2 * 15,1±1,8* 68,1±25,0* 68,1 ±25,0*

Примечание: ДКо - ДК женщин с физиологической беременностью (п=9), генерированные в стандартных условиях, ДКдгэлс - генерированные с ДГЭАС. Тестирование всех ДК проводилось на МНК двух различных женщин - доноров. Индексы влияния (ИВ) рассчитывали как соотношение уровня продукции цитокинов МНК доноров при стимуляции ДК к уровню спонтанной продукции. *Ри<0,0| - достоверность различий но сравнению с ДКо; (и критерий Вилкоксона-Манна-Уитни в сопряженных парах)

Исследования последних лет показали, что наряду с участием в регуляции ТЬI/ТЬ2 баланса ДК способны активно взаимодействовать с ЫК-клетками. В Этой связи представлялось важным исследовать влияние интактных и ДГЭАС-

модифицированных ДК на активированные МК-клетки. Добавление интактных ДК в культуры МНК не влияло на количество С1Э56*С016" МК-клеток (табл.7), однако приводило к достоверному снижению доли активированных С056"С016" МК-клеток.

Уменьшение относительного содержания С056+С016+ клеток не было связано со снижением экспрессии СО 16, поскольку средний уровень флюорисценции данной молекулы в контрольных культурах МНК и МНК, культивируемых в присутствие ДК, не различался (табл.7).

Таблица 7

Влияние ИФН-ДК беременных, генерируемых в присутствие и отсутствие

ДГЭАС, на относительное количество, пролиферацию и апоптоз NK-клеток

1 Анализируемые показатели МНК МНК+ДКо МНК+ДКд,-,«.- !

| ЫК-клетки (%; п= 18) !

1 - С056+С016'клеток 3,5±0,3 3,3±0,3 3,6±0,4

! - С056ДСТ>]6+ 10,6±0,8 6,6±0,5* 8,2±0,5*# i

| Средний уровень флуоресценции |

| СО 16 молекулы в популяции 1 С056+С016+клеток (усл.ед; п=18) 566±46,7 611±51,6 633,4±53,6 1

Клеточный цикл 1 1

' в СЭ56+С016+ клетках (%; п=10) 1

1 - С0/С1 75,7±11,3 51,2±8,7* 57,6±10,1*#

1 - БЮ2М 20,2±3,95 27,7±4.9 34.8±3.3* j

1 Содержание аноптотических клеток !(%) 4,1 ±0,67 21,1±5,0* 7,7±1,1*# i

Примечание: МНК доноров инкубировали в отсутствие ДК (МНК), в присутствие ДК, генерированных без добавления ДГЭАС (ДКо) и в присутствие ДК, генерированных с ДГЭАС (ДКдгэлс). *Ри<0,05 -достоверность различий по сравнению с культурой МНК, #Рц<0,05-достоверность различий по сравнению с культурой МНК+ДКо; (U- критерии Вилкоксоиа-Манна-Уитни в сопряженных парах)

В то же время добавление в культуры МНК интактных ДК сопровождалось уменьшением доли покоящихся (в G0/G1)- и увеличением доли пролиферирующих (в S.G2/M фазах клеточного цикла) CD56+CD16+ клеток и 5-кратным возрастанием уровня апоптоза в данной популяции. Культивирование МНК с ДГЭАС-модифицированными ДК не сопровождалось достоверным снижением относительного содержания CD56+CD16+ клеток, а индукция апоптоза CD56 CD16* клеток была достоверно ниже, чем в присутствии интактных ДК. Таким образом обработка ДК ДГЭАС достоверно снижала их ингибирующий эффект в отношении активированных NK-клеток. Таким образом, ДГЭАС в культуре in vitro стимулирует дифференцировку и созревание миелоидных ДК и оказывает выраженный эффект на функциональную активность ДК, в частности, усиливает аллостимуляторную- и Thl-стимулирующую активность ДК и подавляет их способность индуцировать апоптоз активированных NK-клеток. Выявленные эффекты гормона на ДК позволяют полагать, что изменение цитокинового баланса в

сторону продукции ТЫ-цитокинов и повышенное содержание активированных С056+СГ)16+ - ЫК-клеток в периферической крови беременных с ГА может быть следствием изменения функциональной активности ДК на фоне повышенного содержания ДГЭАС.

Характеристика дендритных клеток при иеосложненной беременности и надпочечниковой гиперандрогении

Сравнительный анализ ИФН-ДК показал, что по сравнению с небеременными женщинами при физиологической беременности относительное количество клеток с фенотипом зрелых (СБ83+) и активированных (СБ25+) ДК было снижено в два раза (табл.8). Относительное количество СБ83+ - и С025+ - ДК у беременных с ГА было в 2,5 раза выше, чем при иеосложненной беременности. Кроме того, беременные с ГА отличались повышенным содержания ДК с маркером моноцитов (С014+).

Таблица 8

Фенотип ИФН-ДК небеременных женщин и беременных с отсутствием и

наличием надпочечниковой гиперандрогении

Относительное содержание клеток, экспрессирующих СБ маркер (%) Исследуемые группы

Небеременные женщины Беременные ГА(-) Беременные ГА(+)

СБ14+ 19,9±2,7 (п=20) 16,7±2,4 (п=33) 31,1±5,8*# (п=10)

СБ83+ 25,2±3,0 (п=27) 10,7±1,2** (п=33) 25,9±1,8## (п=18)

СБ25+ 22,7±4,1 (п=17) 9,3±1,3** (п=18) 26,9±2,9Й* (п=13)

Примечание: *Рц<0,01, - достоверность различий по сравнению с группой небеременных женщин; #Рц<0,01 - ло сравнению с группой беременных с отсутствием ГА (и-критерий Вилкоксона-Макна-Уитни).

Чтобы объяснить одновременное возрастание клеток с фенотипом моноцитов и зрелых ДК, в отдельной серии экспериментов была исследована ко-экспрессия СБ 14 - и СБ83 - молекул в популяции ДК. У небеременных популяция ДК содержала небольшое количество клеток, экспрессирующих одновременно молекулы СБ 14 и СВ83. В группе женщин с физиологической беременностью количество СБ14+СБ83+ - клеток было 2-кратно снижено (4,3±0,9 иу 8,4±1,7% у небеременных, Ри<0,05), а у беременных с ГА - достоверно повышено (14,0±2,5 vs 4,3±0,9 % при физиологической беременности, Ри<0,01). Характерно, что наряду с возрастанием С014+СБ83+ клеток у беременных с ГА также отмечалось более высокое содержание С014~С083+-клсток, представляющих «классические» зрелые миелоидные ДК (10,6±2,5 га 4,3±0,5% при физиологической беременности). Таким образом, наблюдаемое возрастание СБ83+ ДК у беременных с ГА было обусловлено как за счет зрелых ДК, так и за счет популяции СБ14ЧЛ)83+

Чтобы выяснить, являются ли изменения ДК при ГА следствием повышенного уровня ДГЭАС в крови, в отдельной серии экспериментов исследовали влияние сывороток крови беременных на экспрессию дифференцировочных маркеров ДК доноров. Для этого ДК небеременных женщин на этапе созревания культивировали

либо с сыворотками беременных с неосложненной гестацией, либо беременных с ГА. Концентрация ДГЭАС в сыворотках крови женщин с физиологической беременностью (п=10) составила в среднем 0,63 ± 0,1 мкг/мл, у беременных с ГА (п=10) - 9,3±0,6 мкг/мл. Сыворотки крови женщин с неосложненной беременностью ингибировали созревание ДК, что проявлялось в снижении относительного количества С083-позитивных клеток (20,2±1,8 против 30,5±4,4% в контроле). В то же время сыворотки беременных с ГА не оказывали ингибирующего эффекта на содержание СЭ83+ДК и достоверно отличались по влиянию на количество С025+ДК от сывороток женщин с физиологической беременностью (25,8±3,8 против 18,8±3,4 %, Ри<0,05).

Согласно данным литературы, состояние зрелости ДК во многом определяет спектр продуцируемых ими цитокинов. Исследование продукции цитокинов показало, что концентрация 1П\'-у в культурах ДК у женщин с физиологической беременностью была достоверно ниже, а уровень И.-4 - 2-кратно выше, чем в культурах ДК небеременных женщин (табл.9).

Таблица 9

Содержание 1Р1Ч-у и 1Ь-4 в супернатантах ИФН-ДК небеременных женщин и

беременных с наличием и отсутствием гиперандрогении

Цитокин, Исследуемые группы - ~.

п кг/мл Небеременные женщины (п=7) Беременные ГА (-) (п=8) Беременные ГА (+) (» и»

IFN-y 340,1±63,2 33,6±7,5* 2303,1 ±518,0*"

IL-4 92,3±5,2 174,1±16,9* 31,4±8,9*#

Примечание: *Ри<0,01, - достоверность различий по сравнению с группой нсбеременных женщин; #Ри<0,01 - по сравнению с группой беременных с отсутствием ГА (и- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

У беременных с ГА концентрация IFN-y в супернатантах ДК была ущественно выше, а продукция IL-4 - значимо ниже, чем в группе здоровых еременных.

Анализируемые группы различались также по аллостимуляторной активности ,К. По сравнению с небеременными женщинами ДК женщин с физиологической еременностью обладали более низкой способностью стимулировать пролиферацию IHK в СКЛ (табл. 10). В группе беременных с ГА ИВ ДК был достоверно выше, чем ри физиологической беременности.

На следующем этапе было проведено исследование ТИ1/Т112-стимулирующей сгивности ДК. ДК небеременных женщин значимо стимулировали увеличение эличества CD3+IFN-y+ Т-клеток в СКЛ (Таблица 11). В то же время ДК женщин с ¡осложненной беременностью не вызывали увеличения CD3+lFN-y+ Т-клеток, :щако индуцировали увеличение относительного содержания CD3+IL-4+ Т-клеток. К беременных с ГА сохраняли способность активировать Т-клстки к (утрикл сточной продукции IFN-y, хотя стимулирующий эффект был значимо ниже э сравнению с ДК небеременных женщин. Одновременно с этим ДК беременных с А индуцировали увеличение доли CD3+IL-4+ Т-клеток.

Таблица 10

Аллостимуляторная активность ИФН-ДК небеременных женщин и беременных с отсутствием и наличием надиочечниковой гиперандрогении

Анализируемые показатели Исследуемые группы

Небеременные женщины (п=8) Беременные ГА(-)(п=13) Беременные ГА(+)(п=8)

Сп.прол.МНК, имп./мин. 422±66 473±58 259±45

МНК+ДК, имп/мин 8600±1033 3937±871* 4173±657*

ИВ, расч.ед. 23,7±3,9 7,6±0,9* 21,9±8,7#

Примечание. ДК культивировали в течение 5-ти суток с МНК доноров, ДК от каждой женщины протестированы в СКЛ на 2-х донорах; *Рц<0,01, - достоверность различий по сравнению с группой небеременных женщин; #Ри<0,01 - достоверность различии по сравнению с группой беременных с отсутствием ГА (17- критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Таблица 11

Относительное количество СОЗ+1Р1Ч-у+и СОЗ+1Ь-4+клеток и уровень продукции 1Ш-у во вторичной СКЛ с ИФН-ДК небеременных женщин и беременных с отсутствием и наличием гиперандрогении

Анализируемые Исследуемые группы

показатели Небеременные Беременные Беременные

женщины (п=11) ГА (-) (п=8) ГА (+) (п=8)

созЧпчу, %

в МНК 1,5±0,2 1,8±0,5 1,8±0,5

МНК+ДК 5,9±0,6 1,5±0,3** 2,5±0,3**#

ИВ 5,2±0,9 1,1 ±0,2** 2,0±0,4**#

СЭЗ+1Ь-4+, %

в МНК 1,7±0,1 2,6±0,4 3,3±0,5

МНК+ДК 2,1±0,4 8,6±1,0** 7,4±1,0**

ИВ 1,3±0,2 3,5±0,4** 2,4±0,5*

Уровень

продукции №N-7, 18,2±5,7 16,5±2,8 16,0±3,0

пкг/мл; МНК 353±40 63±27** 218±69*#

МНК+ДК 22,2±3,1 3,4±0,9** 13,5±3,1*#

ИВ

Примечание. ИВ-индекс влияния (отношение уровня продукции или относительного содержания клеток с внутриклеточным содержанием цитокина в культуре МНК после стимуляции ДК к аналогичному показателю в отсутствие стимуляции). *Ри<0,05, **Рц<0,01 -достоверность различий по сравнению с группой небеременных; #Ри<0,05 - достоверность различий по сравнению с группой беременных с отсутствием ГА (и- критерий Вилкоксона-Манна-Уитнй).

Наличие Т1т1 -стимулирующей активности ДК беременных с ГА

подтверждалась также более высоким уровнем продукции в СКЛ,

индуцированной этими клетками по сравнению с СКЛ, индуцированной ДК женщин с физиологической беременностью.

Таким образом, по сравнению с ДК женщин с физиологической беременностью популяция ИФН-ДК беременных с надпочечниковой ГА содержит большее количество зрелых, активированных клеток и характеризуется более высоким уровнем продукции 1Ж-у и низким уровнем 1Ь-4. Эти клетки более эффективно стимулируют пролиферацию МНК в СКЛ и сохраняют способность индуцировать ТЫ- ответ. Эти клетки более эффективно стимулируют пролиферацию МНК в СКЛ и сохраняют способность индуцировать ТЫ - ответ.

Сравнительная характеристика особенностей течения и исходов беременности .у женщин с наличием и отсутствием надпочечниковой гиперандрогении.

Ретроспективный анализ историй беременности и родов выявил, что синдром надпочечниковой ГА, подтвержденный наличием лабораторных признаков (повышенное содержание в крови ДГЭАС), встречался у 17,2% (119/690) беременных.

Оценка частоты развития наиболее значимых клинических осложнений беременности и родов, влияющих на перинатальные исходы, показала, что у женщин с ГА беременность достоверно чаще осложнялась угрозой прерывания, фетоплацентарной недостаточностью, гестозом, преждевременной отслойкой нормально расположенной плаценты, синдромом задержки развития плода (табл.12, 13,14).

Таблица 12

Частота развития гестациониых осложнений у беременных с наличием и

отсутствием надпочечниковой гиперандрогении

Осложнение беременности Исследуемые группы

Беременные ГА (-)(п=517) Беременные ГА (+) (п=119)

п % п %

Преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты 8 1,5 10 8,4*

Задержка внутриутроб. развития плода 15 2,9 23 19,3*

Угрожающий самопроизвольный аборт 93 18 101 84,8**

Преждевременные роды 31 6 30 25,2*

Истмико-цервикальн. недостаточность 10 1,9 46 38,6*

Примечание: п-количество женщин с осложнением, % рассчитан по отношению к количеству беременных в данной группе; достоверность различия частоты встречаемости признака определяли точным методом Фишера; *Рх2= 0,01, 0,001 - достоверность различий в

группе беременных с ГА по сравнению с оппозитной группой

Таблица 13

Частота развития и особенности течения гестоза у беременных с наличием и _отсутствием надпочечниковой гиперандрогении___

Параметры, Исследуемые группы

характеризующие Беременные ГА (-) Беременные ГА (+)

особенности течения гестоза п=517 л =119

п % п %

Гестоз средней степени 105 19,9 69 57,9*, ^

Гестоз тяжелой степени 2 0,4 . 18 15,1** ,..

Преэклампсия 0 0,0 3 •., 2,5*

Вариант гестоза: п= 59 п=44

отечный 39 66 18 40,9

отечно-протеинурический 19 32,2 9 20,45

отечно-гипертензивныи 1 1,8 4 9,1*

классическии 0 0 13 29,55**

Срок беременности на

котором развился гестоз, 29,2±0,5 25,9±0,8**

нед.

Вес новорожденных от

беременностей, 3537±45,4 3002±91,4**

осложненных гестозом

Вес<2800 г п=2 3,3% п=12 27,3%**

Примечание: п-количество беременных в группе, достоверность различия частоты встречаемости признака определяли точным методом Фишера; *Рх2= 0,01, ** Рх2= 0,001 -достоверность различий в группе беременных с ГА по сравнению с оппозитной группой

Примечательно, что в контрольной группе не было зарегистрировано ни одного случая преэклампеии, тогда как при ГА данное осложнение регистрировалось достоверно чаще, в частности, имело место у 3 беременных (2,5%). При ГА отмечено раннее появление клинических симптомов гестоза, диагностированных в большинстве случаев до 25 недель гестации и преобладание классического варианта (триады Цонгемейстера).

Одним из индикаторов показатели тяжести гестоза является масса новорожденного при рождении (табл.13). Вес новорожденных, рожденных от беременных с гестозом на фоне ГА был достоверно ниже, чем в группе сравнения (гестоз в отсутствие ГА).

У рожениц с ГА в 4 раза чаще встречалась слабость родовой деятельности, в 3 раза чаще несвоевременное излитие околоплодных вод, в 8 раз чаще интранатальная гипоксия плода (< 7 баллов по шкале Апгар на 5-ой минуте). Относительное количество оперативных родов (кесарево сечение) при ГА также было достоверно выше, чем при физиологической беременности. Подводя Итог' клйнико-иммунологическому исследованию можно заключить, что, ассоциированные с повышенным уровнем продукции ДГЭАС иммунные нарушения приводят к

развитию гестациоиных осложнений - формированию первичной плацентарной недостаточности и, как следствие, нарушению кровоснабжения плода и спонтанным выкидышам. При сохранении гестации в данной группе женщин на фоне плацентарной недостаточности во второй половине беременности развивается гестоз. Высокая частота гестационных осложнений при надпочечниковой ГА диктует необходимость разработки мероприятий проведения их эффективной профилактики с ранних сроков беременности и на этапе предгравидарной подготовки.

Таблица 14

Частота развития патологии родов у беременных с наличием и отсутствием надпочечниковой гиперандрогении

Осложнения родов Исследуемые группы

Беременные ГА (-) (п=517) Беременные ГА (+) (п=119)

п % п %

Слабость родовой деятельности 29 5,6 33 27,7*

Несвоевременное излитие околопл. вод 62 12 48 40,3*

Интранатальная гипоксия плода 9 1,7 24 13,9*

Оперативные роды (кесарево сечение) 102 19,7 50 42,0*

Примечание: п-количество женщин с осложнением родов, % рассчитан по отношению к количеству родильниц в группе; достоверность различия частоты встречаемости признака определяли точным методом Фишера; *Рх2= 0,01, ** Р^2= 0,001 - достоверность различий в группе беременных с ГА по сравнению с оппозитной группой

ВЫВОДЫ

1. Беременные с гиперандрогснией надпочечникового генеза отличаются повышенным уровнем пролиферативного ответа Т-клеток на стимуляцию а-CD3mAT и аллоантигенами партнера, возрастанием относительного содержания активированных (CD3"CD16+CD56+) NK-клеток и снижением количества естественных регуляторных Т-клеток (CD4+CD25h,gh), а также усилением КонА-индуцированной продукции Thl - цитокинов (IFN-y, TNF-a, GM-CSF) клетками цельной крови, что свидетельствует о нарушении клеточно-и цитокинопосредованных механизмов гестационной иммуносупрессии у беременных с повышенным уровнем ДГЭАС.

2. Обработка ИФН-ДК беременных ДГЭАС in vitro приводит к увеличению содержания CDla+, CD83+ и CD25+ дендритных клеток, а также усилению их способности стимулировать пролиферативныи ответ Т-клеток и продукцию IFN-y

и подавлению способности индуцировать продукцию IL-4 в СКЛ, чт свидетельствует о стимулирующем влиянии ДГЭАС на дифференцировку созревание, антигенпрезентирующую и Thl - стимуляторную активност дендритных клеток наряду с ингибирующим действием на ТЬ2-стимуляториу| активность.

3. Культивирование ИФН-ДК беременных с МНК сопровождается усиление! апоптоза и снижением количества CD56+CD16+ NK-клеток. При этом ДГЭАС и этапе созревания дендритных клеток ингибирует их апоптоз-ипдуцирующуь активность, что является одним из возможных механизмов повышенног содержания CD56+CD16+ NK-клеток у беременных с гиперандрогенией.

4. Популяция ИФН-ДК беременных с надпочечниковой гиперандрогенией (п сравнению с дендритными клетками женщин с неосложненной беременностью характеризуется повышенным содержанием CD83+ и CD25+ дендритных клето* более высоким уровнем продукции IFN-y и низким уровнем IL-4, и способности стимулировать Т-клетки к продукции IFN-y, что свидетельствует о более зрело: фенотипе дендритных клеток и наличии у них Thl-стимулирующей активности.

5. Иммунные дисфункции у беременных с гиперандрогенией ассоциированы повышенной частотой развития гестоза, преждевременной отслойки нормальн расположенной плаценты, задержки внутриутробного развития плода, чт подтверждает важную роль иммуно-эндокринных нарушений в патогенез поздних гестационных осложнений.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Высокая встречаемость синдрома надпочечниковой гиперандрогениг ассоциированная с повышенной частотой осложнений беременности, диктуе необходимость скринингового исследования уровня ДГЭАС в крови на этап планирования беременности или постановки беременной на учет в женскую консультацию. При выявлении повышенного уровня ДГЭАС в крови целесообразна профилактика не только ранних, но и поздних осложнений беременности (гестоза, преэклампсии и преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты) и родов (слабости родовой деятельности, несвоевременного излития околоплодных вод).

2. Проведение иммунологического исследования у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией позволяет оценить эффективность гестационной иммуносупрессии. Повышение пролиферативного ответа в a-CD3 и аллоантиген -стимулированных культурах МНК, увеличение относительного содержания CD3" CD16+CD56+ NK-клеток и снижение количества CD4¥CD25h'8h Т-клеток свидетельствует о нарушении гестационной иммуносупрессии и высокой вероятности осложнений, что диктует необходимость проведения мероприятий по их профилактики.

Список статей, опубликованных по теме диссертации.

1. Черных Е.Р., Семенова H.B. Н.М. Пасман Н.М., Хонина H.A., Дударева A.B., A.B. Дробинская А.Н.. Особенности иммунного статуса и диагностическая

ценность определения некоторых показателей иммунитета при гестозе // Вестник НГУ. Серия: биология, клиническая медицина. - 2004. - Т. 2. - В.4. - С.82-89.

2. Пасман Н.М., Черных Е.Р., Останин А.А, Дударева A.B., Дробинская А.Н, Хонина Н.А, Опарина М.П., Семенова Н.В. Роль дидрогестерона в профилактике гестационных осложнений // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии.-2004. -№3. -С.21-25.

3. Пасман Н.М., Дударева A.B., Демина С.Г., Семенова Н.В., Бухановская И.Р. Опыт применения поливитаминного комплекса "Элевчт Пронаталъ" в предгравидарной подготовке и во время беременности с целью профилактики гестационных осложнений при гинерандрогенных состояниях // Гинекология. -Том 07.- N 1. -2005. -С. 1-6.

4. Селедцова Н.В., Хонина H.A., Дударева A.B., Тихонова М.А, Останин А.А, Пасман Н.М, Черных Е.Р. Нарушение иммунорегуляторных механизмов у беременных с гиперандрогенией // Бюллетень СО РАМН. - №1(119), - 2006, стр. 35-40.

5. Хонина H.A., Дударева A.B., Пасман Н.М., Поздняков И.М., Селедцова Н.В., Тихонова М.А., Романовский Д.М., Останин A.A., Черных Е.Р. Влияние дидрогестерона на иммунный статус женщин с высоким риском преждевременного прерывания беременности // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии.-2006, №4.-С.20-25.

6. Селедцова Н.В.. Хонина H.A., Пасман Н.М., Черных Е.Р. Роль дегидроэпиандростерона в регуляции функциональной активности иммунокомпетентных клеток // Бюллетень СО РАМН. - 2007.-№1. - стр.40-46.

7. Селедцова Н.В., Хонина H.A., Дударева A.B., Тихонова М.А, Останин A.A., Пасман Н.М, Черных Е.Р. Характеристика естественных цитотоксических клеток и регуляторных Т-лимфоцитов у беременных с надпочсчниковой гиперандрогенией // Иммунология. - 2007. - т.28. - №3. - стр.151-155.

8. Селедцова Н.В.. Хонина H.A., Тихонова М.А., Останин А.А, Пасман Н.М., Черных Е.Р Возможная роль дендритных клеток в нарушении гестационной иммуносупрессии у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией // Вестник НГУ.-2007.-в.З. - стр.91-94.

9. Селедцова Н.В., Хонина H.A., Тихонова М.А., Останин A.A., Пасман Н.М., Черных Е.Р. Влияние дегидроэпиандростерона сульфата на фенотип и функции дендритных клеток in vitro // Мед.иммунология. - 2007. -Т.9. -№6. - стр. 589- 596.

10. Селедцова Н. В., Хонина Н. А., Тихонова М. А., Пасман H. М., Останин А. А., Черных Е. Р. Взаимодействие NK-клеток с дендритными клетками, модифицированными дегидроэпиандростерона сульфатом // Иммунология. -2008. - №2. - стр.80-84.

П.Леплина О.Ю., Селедцова Н.В.. Тихонова М.А., Сахно JI.B., Останин A.A., Пасман Н.М., Черных Е.Р. Эффект дегидроэпиандростерона сульфата на ТЫ/Т112-стимуляторную активность дендритных клеток. Вестник НГУ, серия: биология, клиническая медицина,- 2009.- Т.7, выпуск 2,- с.3-9.

Подписано к печати 11.09.2009 формат - 60x84 1/16, Усл. печ. л. 2

Бумага: офсетная Печать: трафаретная Тираж: 100 экз. Номер заказа № 710 ; Типография ООО "ЮГУС-ПРИНТ", ИНН 5402467637, г. Новосибирск, ул. Залесского, 4

Актуальность исследования:

В последнее время гиперандрогении (ГА) надпочечникового генеза уделяется большое внимание в связи с широкой распространенностью данной патологии среди женщин репродуктивного возраста. Особый интерес представляет наименее изученный вариант надпочечниковой ГА - «мягкая форма адреногенитального синдрома», который диагностируется в 30% случаев при бесплодии и невынашивании беременности [4, 17, 30]. Выявляемость указанного варианта ГА часто затруднена в связи с недостаточной выраженностью клинических проявлений (гирсутизма, acne vulgaris, себореи). Поэтому наиболее значимым в диагностике синдрома надпочечниковой ГА является повышенный уровень дегидроэпиандростерона сульфата (ДГЭАС) в крови [7, 25, 27, 233, 277].

Несмотря на то, что наличие ГА в настоящее время рассматривается как один из факторов риска ранних гестационных осложнений, в частности,, преждевременного прерывания беременности, особенности течения второй половины беременности и родов у женщин с данной патологией исследованы недостаточно. Кроме того, остается открытым вопрос о механизмах гестационных осложнений при ГА, особенно аспектах патогенеза, касающихся иммуно-эндокринных взаимодействий.

По последним данным успешное течение беременности на всех этапах требует согласованного взаимодействия иммунной и эндокринной систем. Как известно, физиологическое течение беременности происходит на фоне супрессорной перестройки иммунной системы, получившей название «гестационной иммуносупрессии (ГИ)». ГИ направлена на формирование и поддержание иммунологической толерантности к аллоантигенам плода. Данный процесс осуществляется с вовлечением различных гуморальных и клеточных механизмов, среди которых важная роль отводится смещению цитокинового баланса в сторону доминирования Игё/противовоспалительных цитокинов (IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13) [39, 40, 169], а также увеличению количества естественных регуляторных CD4+CD25+ Т-лимфоцитов [38, 43, 210, 239, 282]. Кроме того, определенное иммунорегуляторное влияние могут оказывать NK- клетки [142, 256]. Нарушение супрессорной перестройки приводит к развитию осложнений, в частности невынашиванию беременности и гестозу [45, 94, 148, 203, 204, 211, 214, 269, 276].

Данные о состоянии иммунитета у беременных с ГА надпочечникового генеза в литературе отсутствуют. Тем не менее, следует отметить, что поскольку циркулирующие гормоны при беременности играют важную роль в' формировании гестационной иммуносупрессии [30, 244, 245, 246], нарушение гормональной регуляции может приводить к развитию иммунных дисфункций. Исследования последних лет показали, что дегидроэпиандростерон и его сульфатированная форма оказывают активирующее влияние на цитотоксическую активность NK-клеток и пролиферативный ответ Т-лимфоцитов [237, 162, 192]. Кроме того, ДГЭАС стимулирует продукцию-Thl- и ингибирует продукцию ТЪ2-цитокинов [74, 125, 118, 119]. Таким образом, наличие иммуностимулирующей активности ДГЭАС при его повышенной концентрации может негативным образом сказываться на формировании иммуносупрессии и, соответственно, приводить к развитию осложнений беременности.

Согласно данным литературы, стимулирующее влияние ДГЭАС на иммунокомпетентные клетки реализуется через специфические рецепторы [190], что подразумевает прямой эффект гормона на Т-клетки и NK-клетки. В то же время не исключено, что действие гормона может опосредоваться через другие разновидности иммунокомпетентных клеток, например, дендритные клетки (ДК). Известно, что ДК обладают выраженной регуляторной активностью и могут не только активировать, но и подавлять иммунный ответ, а также индуцировать толерантность к аллоантигенам. Согласно современным представлениям толерогенная активность наиболее характерна для незрелых миелоидных ДК, которые способны индуцировать генерацию регуляторных

CD4+CD25+ T- клеток [87, 272], а также вызывать поляризацию Т-лимфоцитов в сторону Th2 [44]. Кроме того, показано, что ДК способны участвовать в регуляции пролиферации и секреторной активности NK -клеток [153].

Немногочисленные исследования, посвященные изучению ДК при беременности, показали, что локализованные в плаценте и периферической крови ДК отличаются от ДК небеременных женщин менее зрелым фенотипом [58, 122, 135, 152], что может свидетельствовать о наличии у них толерогенной активности. Однако функциональные свойства ДК при беременности остаются неисследованными, а данные, характеризующие влияние ДГЭАС на генерацию и активность дендритных клеток практически отсутствуют. Между тем, исследование влияния ДГЭАС на дифференцировку/созревание нефункциональную активность ДК представляет большой интерес как фундаментальном, так и практическом аспектах, поскольку характеристика я раскрытие механизмов иммунорегуляторной активности ДГЭАС является основой для более полного осмысления иммуно-эндокринных взаимодействий и разработке новых подходов к диагностике, профилактике и лечению осложнений беременности, связанных с эндокринными дисфункциями.

Цель исследования: на основе клинико-иммунологического анализа и оценки-влияния дегидроэпиандростерона сульфата на созревание/функции дендритных клеток in vitro изучить роль иммуно-эндокринных нарушений в патогенезе гестационных осложнений у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ параметров клеточного звена иммунитета и продукции ТЫ/1Ъ2-цитокинов в группах беременных с наличием и отсутствием надпочечниковой гиперандрогении.

2. Исследовать влияние ДГЭАС на созревание/ дифференцировку (фенотип) и функциональную активность ДК беременных (способность индуцировать пролиферацию Т-клеток в CKJI, стимулировать Thl и Th2 ответ, влиять на активированные NK-клетки) в культуре in vitro.

3. Охарактеризовать дендритные клетки беременных (фенотип, продукцию цитокинов, аллостимуляторную и Thl/Th2 - стимулирующую активность) с нормальным и повышенным уровнем ДГЭАС в крови.

4. Провести ретроспективный анализ частоты поздних осложнений беременности и родов в группах с наличием и отсутствием надпочечниковой гиперандрогении.

Научная новизна:

Впервые охарактеризованы параметры иммунитета у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией. Установлено, что по сравнению -с. физиологической гестацией беременные с ГА характеризуются повышенной;' пролиферативной активностью Т-клеток в ответ на стимуляцию a-CD3MAT и аллоантигенами партнера, сниженным относительным содержанием естественных регуляторных Т-клеток (CD4+CD25+) и повышенным содержанием активированных (CD3"CD16+CD56+) NK-клеток. Также продемонстрировано, что течение беременности, осложненной ГА. ассоциировано с усилением КонА-индуцированной продукции IFN-y, TNF-a, GM-CSF клетками крови. При этом между выраженностью иммунных дисфункций и уровнем ДГЭАС в сыворотке крови выявлена достоверная взаимосвязь.

Впервые установлено, что генерация интерферон-альфа — индуцированных дендритных клеток (ИФН-ДК) в культуре in vitro в присутствие ДГЭАС сопровождается достоверным увеличением относительного содержания зрелых (CD83+) и активированных (CD25+) ДК и усилением их способности стимулировать пролиферативный ответ Т-клеток в CKJI. При этом ДГЭАС усиливает способность ДК стимулировать продукцию

Т-клетками IFN-y, ингибирует способность Т-клеток к продукции IL-4 и подавляет способность ИФН-ДК индуцировать апоптоз активированных NK-клеток.

Впервые продемнстрировано, что у беременных с надпочечниковой ГА генерируемые ИФН-ДК характеризуются более высоким содержанием клеток с маркерами зрелых и активированных ДК (CD83 и CD25), причем возрастание CD83-позитивных клеток обусловлено увеличением как зрелых миелоидных ДК (CD83+CD14"), так и субпопуляции CD83+ -клеток, ко-экспрессирующих маркер моноцитов/макрофагов (CD83+CD14+). Кроме того, по сравнению с физиологической беременностью ИФН-ДК беременных с ГА отличаются более, высоким уровнем продукции IFN-y и низким уровнем IL-4, а также болеем высокой способностью стимулировать МНК к пролиферации и продукции IFN-у в СКЛ.

В процессе клинического анализа получены новые данные о повышенной частоте встречаемости у беременных с ГА поздних осложнений беременности (гестоза, преэклампсии и преждевременной отслойки нормально^ расположенной плаценты) и родов (слабость родовой деятельности, несвоевременное излитие околоплодных вод). Установлено, что у беременных с гиперандрогенией регистрируется более раннее появление симптомов гестоза, и чаще встречаются варианты гестоза, сопровождающиеся повышением артериального давления.

Теоретическая и практическая значимость:

Сравнительный анализ параметров иммунитета у беременных о t нормальным и повышенным уровнем ДГЭАС позволил охарактеризовать иммунные дисфункции, свидетельствующие о нарушении гестационной иммуносупрессии у беременных с гиперандрогенией.

Выявленные в культуре in vitro стимулирующие эффекты ДГЭАС на дифференцировку/созревание, аллостимуляторную активность и Thl-стимулирующую активность ДК беременных раскрывают новые механизмы иммуностимулирующего действия ДГЭАС, опосредованные дендритными клетками. Впервые установлен новый механизм негативной регуляции активированных NK-клеток со стороны ИФН-ДК и продемонстрировано ингибирующее действие ДГЭАС на способность ИФН-ДК стимулировать активационно-индуцированный апоптоз CD56+CD16+ NK-клеток.

Полученные новые данные об особенностях фенотипических к функциональных свойств ДК при физиологической беременности (признаки-незрелости, низкая аллостимуляторная активность, доминирование Th2-стимуляторной активности) и выраженных изменениях ДК у беременных с ГА (более зрелый фенотип, появление Thl-стимуляторной активности) свидетельствуют о вовлечении ДК в процессы перестройки иммунной системы при физиологической гестации и участии ДК в опосредованных ДГЭАС иммунных нарушениях при надпочечниковой гиперандрогении.

Практическая значимость работы заключается в выявлении -иммунологических маркеров, которые могут служить критериями нарушений гестационной иммуносупрессии у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией.

Обнаруженные в результате проведенного клинического анализа факты о повышенной частоте встречаемости тяжелых форм гестоза и более раннем возникновении данного осложнения у беременных с надпочечниковой гиперандрогении позволяют отнести этих женщин в группу риска по развитию гестоза.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Повышенный уровень дегидроэпиандростерона сульфата является причиной дефекта гестационной иммуносупрессии у беременных с надпочечниковой' гиперандрогенией.

2. Иммунотропные эффекты дегидроэпиандростерона сульфата в культуре in vitro и in vivo реализуются с участием дендритных клеток.

3. Беременные с повышенным уровнем дегидроэпиандростерона сульфата составляют группу риска по развитию поздних гестационных осложенений, в первую очередь, тяжелых форм гестоза.

Объем и структура диссертации:

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, практических рекомендаций и выводов. Материал изложен на 146 страницах машинописного. текста, включающего 15 таблиц и 6 рисунков. Прилагаемая библиография, содержит ссылки на 285 литературных источника, в том числе, 245 иностранных. Апробация работы:

ВЫВОДЫ

1. Беременные с гиперандрогенией надпочечникового генеза отличаются, повышенным уровнем пролиферативного ответа Т-клеток на стимуляцию а» CD3mAT и аллоантигенами партнера, возрастанием относительного содержания активированных (CD3"CD16+CD56+) NK-клеток и снижением количества естественных регуляторных Т-клеток (CD4+CD25hl8h), а также усилением КонА-индуцированной продукции Thl - цитокинов (IFN-y, TNF-а, GM-CSF) клетками цельной крови, что свидетельствует о нарушении клеточно - и цитокинопосредованных механизмов гестационной иммуносупрессии у беременных с повышенным уровнем ДГЭАС.

2. Обработка ИФН-ДК беременных ДГЭАС in vitro приводит к увеличению содержания CDla+, CD83+ и CD25+ дендритных клеток, а также усилению их способности стимулировать пролиферативный ответ Т-клеток и продукцию IFN-y и подавлению способности индуцировать продукцию IL-4 в СКЛ, что свидетельствует о стимулирующем влиянии ДГЭАС на дифференцировку/ созревание, антигенпрезентирующую и Thl - стимуляторную активность дендритных клеток наряду с ингибирующим действием на Th2-стимуляторную активность.

3. Культивирование ИФН-ДК беременных с МНК сопровождается усилением апоптоза и снижением количества CD56+CD16+ NK-клеток. При этом ДГЭАС на этапе созревания дендритных клеток ингибирует их апоптоз-индуцируюшую активность, что является одним из возможных механизмов повышенного содержания CD56+CD16+ NK-клеток у беременных с гиперандрогенией.

4. Популяция ИФН-ДК беременных с надпочечниковой гиперандрогенией (по сравнению с дендритными клетками женщин с неосложненной беременностью) характеризуется повышенным содержанием CD83+ и CD25+ дендритных клеток, более высоким уровнем продукции IFN-y и низким уровнем IL-4, и способностью стимулировать Т-клетки к продукции IFN-y, что свидетельствует о более зрелом фенотипе дендритных клеток и наличии у них Thl-стимулирующей активности. 5. Иммунные дисфункции у беременных с гиперандрогенией ассоциированы с повышенной частотой развития гестоза, преждевременной отслойки нормально расположенной плаценты, задержки внутриутробного развита» плода, что подтверждает важную роль иммуно-эндокринных нарушений в патогенезе поздних гестационных осложнений

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Высокая встречаемость синдрома надпочечниковой гиперандрогении, ассоциированная с повышенной частотой осложнений беременности, диктует необходимость скринингового исследования уровня ДГЭАС в крови на этапе планирования беременности или постановки беременной на учет в женскую консультацию. При выявлении повышенного уровня ДГЭАС в крови целесообразна профилактика не только ранних, но и поздних осложнений беременности (гестоза, преэклампсии и преждевременной, отслойки нормально расположенной плаценты) и родов (слабости родовой * деятельности, несвоевременного излития околоплодных вод).

2. Проведение иммунологического исследования у беременных с надпочечниковой гиперандрогенией позволяет оценить эффективность гестационной иммуносупрессии. Повышение пролиферативного ответа в а-CD3 и аллоантиген - стимулированных культурах МНК, увеличение относительного содержания CD3"CD16+CD56+ NK-клеток и снижение -г количества CD4+CD25h,gh Т-клеток свидетельствует о нарушении^ гестационной иммуносупрессии и высокой вероятности осложнений, что диктует необходимость проведения мероприятий по их профилактике.