Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Характеристика человеческого сывороточного γ-глобулина, модифицированного катионами цинка

На правах рукописи

Ж/-

Денисова Елена Александровна

Характеристика человеческого сывороточного у-глобулина, модифицированного катионами цинка

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

1 9 ФЕВ т

Москва - 2009

003462112

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф.Гамалеи Российской академии медицинских наук.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Сергей Борисович Чекнёв.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Валентин Николаевич Мигунов,

доктор медицинских наук, профессор Фируз Юсупович Гариб.

Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава.

Защита диссертации состоится 30 января 2009 г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.007.01 при ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН (123098, г.Москва, ул.Гамалеи, 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан 29 декабря 2008 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Е.В.Русакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Работы последнего времени позволяют предполагать, что иммуноглобулины, как и другие белки плазмы крови, способны связывать, транспортировать, донорствовать катионы металлов и влиять таким образом на эффекторные функции других макромолекул [Бабаева Е.Е. и др., 2006; Кульберг А .Я., Беркун Ю.Б., 1998; Чекнёв С.Б., Бабаева Е.Е., 2004; Чекнёв С.Б. и др., 2005, 2006].

Известно, что катионы цинка активно связываются белками, гликопротеинами и аминокислотами плазмы крови, что определяет достаточно стабильный уровень присутствия этих катионов в биологических жидкостях и тканях организма [Авцын А.П. и др., 1991; Aiken S.P. et al., 1992; Buxani-Rice S. et al., 1994; Jones A.L. et al., 2004]. При этом образование белковых металлокомплексов с цинком приводит к существенным изменениям в реализации функциональных свойств биополимеров [Borza D.-B., Morgan W.T., 1998; Gorgani N.N. et al., 1997; Handel T.M. et al., 1993; Rink L„ Kirchner H., 2000].

Катионы цинка входят в состав металлоферментов, где образуют поперечные связи в активных центрах, участвуют в формировании структуры активного центра и его конформационной динамики [Биркая В.Г. и др., 1990; Волькенштейн М.В., 1991; Кузнецова С.С. и др., 2005; Atanassova A., Zambie D.B., 2005].

Многообразна роль цинка в иммуногенезе. Он определяет биологическую активность тимулина, контролирует ранние стадии созревания Т-лимфоцитов, апоптоз, играет важную роль в обеспечении выработки и рецепции цитокинов, непосредственно участвует в основных иммунных реакциях [Bao В. et al., 2003; Carpentieri U. et al., 1988; Hopkins R.G., Failla M.L., 1999; Rink L., Kirchner H„ 2000; Ventura М.Т. et al., 1986].

Физиологическое содержание цинка в плазме оценивают на уровне 10-20 мкМ, а концентрация свободных, биологически активных катионов составляет порядка 0.2-1.0 нМ [Borza D.-B., Morgan W.T., 1998; Gorgani N.N., 1997, 1999]. Поэтому, хелатирование даже незначительных количеств катионов белками сыворотки может создавать дефицит цинка в микроокружении, изменяя тем самым интенсивность и динамику зависимых от присутствия металла гуморальных и клеточных иммунных реакций.

С другой стороны, сами белки, хелатирующие металл в ходе нормальных межмолекулярных взаимодействий, могут претерпевать конформационные и антигенные преобразования и обретать новые эффекторные свойства - не реализуемые ими в нативной конформации [Чекнёв С.Б., Бабаева Е.Е., 2004; Borza D.-B., Morgan W.T., 1998; Gorgani N.N. et al., 1997, 1999].

С этих позиций взаимодействие белков плазмы крови с катионами цинка ранее не рассматривалось, а структурное обеспечение, динамика и исход подобных процессов в клеточных системах остаются неизученными.

Целью работы явилась конформационная и ангигенная характеристика человеческого сывороточного у-глобулина, модифицированного связыванием катионов цинка, а также оценка эффекторных функций трансформированного металлом белка.

Решались следующие задачи.

1. Изучить конформационные преобразования человеческого сывороточного у-глобулина при взаимодействии с катионами цинка в растворе.

2. Оценить параметры связывания цинка с у-глобулином сыворотки крови человека.

3. Получить и охарактеризовать образцы модифицированного цинком у-глобулина, оценить конформационное состояние белка.

4. Провести иммунохимическое исследование модифицированного у-глобулина с использованием реакций радиальной иммунодиффузии и иммуноферментного анализа (ИФА).

5. Оценить способность модифицированного цинком у-глобулина индуцировать выработку интерферона (ИФН) клетками периферической крови человека.

Научная новизна исследования.

В работе впервые получены и исследованы образцы человеческого сывороточного у-глобулина, модифицированного присоединением катионов цинка. Описаны конформационные преобразования молекулы белка, вызываемые связыванием металла. Оценены оптические эффекты взаимодействия у-глобулина с катионами цинка в растворе, рассчитаны количественные характеристики этого взаимодействия - константы и число сайтов связывания. Установлено, что встраивание катионов цинка в молекулу белка происходит по нескольким группам неэквивалентных, различающихся пространственной локализацией и зависимых друг от друга участков связывания, заполнение которых металлом подчиняется динамике, определяемой количеством присоединенных катионов.

Обнаружено, что в результате связывания металла изменяется спектр экспрессируемых белком специфических антигенных детерминант. При этом установлено, что в условиях, приближенных к физиологическим, образования новых антигенных детерминант белка и формирования новой антигенной специфичности, которая могла бы индуцировать в организме выработку антител к собственному, модифицированному цинком, у-глобулину, с большой вероятностью, не происходит.

Впервые показано, что модифицированный цинком у-глобулин индуцирует выработку ИФН лейкоцитами периферической крови здоровых доноров in vitro. Уровень индукции ИФН - ниже, чем в присутствии контрольного белка и катионов цинка, примененных изолированно. По

совокупности оцененных свойств, ИФН, вырабатываемый в условиях индукции связавшим металл у-глобулином, правомочно относить к ИФН-у.

В работе впервые обоснованы представления о первичной трансформации в результате связывания катионов цинка Рс фрагментов молекул антител (запускающих внутриклеточную сигнализацию с активируемых лигандом Рс рецепторов).

Теоретическая значимость работы определяется получением данных об изменениях конформации и антигенных характеристик молекул антител, которые могут происходить за счет хелатирования катионов цинка в ходе нормального, физиологического обмена металлом между биомакромолекулами плазмы крови. Указанные изменения правомочно рассматривать как основу реализации новых эффекторных свойств белков у-глобулиновой фракции в отношении регулируемых ими функций клеток иммунной системы. Это подтверждается результатами, свидетельствующими об изменении функционирования клеток-продуцентов ИФН в условиях индукции модифицированным цинком у-глобулином.

Практическая значимость результатов состоит в обосновании принципиальной возможности разработки алгоритмов для получения (путем модификации катионами цинка) иммуноглобулинов с заданными эффекторными свойствами.

Результаты исследования указывают на ограничение возможностей использования в диагностической практике реакции Манчини: в условиях изменения транспорта и обмена катионов металлов или белкового спектра плазмы крови показатели содержания связавших цинк белков (в частности -антител), определяемые методом одномерной радиальной иммунодиффузии, могут не соответствовать их реальному количеству в сыворотке крови обследуемого. Учет результатов реакции Манчини должен тогда осуществляться с использованием поправочных коэффициентов.

Внедрение полученных результатов.

По материалам исследования подготовлены методические рекомендации «Особенности использования реакции одномерной радиальной иммунодиффузии по Манчини в условиях нарушения метаболических процессов». Утверждены на основании решения Совета по внедрению научных достижений в практику ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН от 5 декабря 2008 г. (протокол №7).

Апробация работы.

Результаты исследования доложены на IX, X и XI Всероссийских научных форумах с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2005, 2006 и 2007), II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2005), V конференции иммунологов Урала (Оренбург, 2006), Научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири» (Томск, 2008).

Апробация диссертации состоялась на научной конференции отделов иммунологии, интерферонов, структуры и функции микроорганизмов ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН 25 ноября 2008 г.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ.

Объем и структура работы.

Диссертационная работа изложена на 139 страницах, иллюстрирована 26 рисунками и таблицей, состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы (175 источников, из которых 67 отечественных и 108 иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований.

Для изучения взаимодействия у-глобулина с катионами цинка в растворе использовали препарат человеческого сывороточного у-глобулина (Serva) в 0.15 М растворе NaCl (pH 7.14-7.2) с концентрацией белка 50, 100, 150 и 200 мкг/мл. Освобожденные от крупных ассоциатов белка пропусканием через мембранные фильтры с диаметром пор 0.45 мкм (Millipore) образцы инкубировали в течение 1 час при 37°С с хлоридом цинка, примененным в концентрациях металла от 0.1 до 12.0 мкг/мл. В качестве контроля использовали образцы у-глобулина, инкубированные с водным сульфатом цинка, и пробы, не содержавшие солей цинка.

Реакцию учитывали спектрофотометрией в ультрафиолете (УФ) в диапазоне длин волн от 190 до 320 нм с шагом 10 нм, с использованием дифференцирующего спектрофотометра PU 8730 UV/VIS (Philips). Расчет показателей изменения оптической плотности и молярных отношений в растворе, как и во всей работе, осуществляли на основании концентраций у-глобулина, определенных по уровню поглощения при длине волны 280 нм (коэффициент экстинкции 0.7).

Опыты с отдельными концентрациями солей цинка воспроизводили дважды или трижды. Кислотность раствора контролировали с помощью электронного рН-метра-иономера Эксперт-001 (Эконикс-Эксперт).

Оценку параметров связывания у-глобулина с катионами цинка производили с использованием препарата человеческого сывороточного у-глобулина (Serva) в 0.15 М растворе NaCl (pH 7.12-7.19) с концентрацией белка 100 мкг/мл. Образцы у-глобулина, освобожденные от крупных ассоциатов (см. выше) инкубировали в течение 1 час при 37°С с осветленным (мембраны 0.22 мкм, Millipore) хлоридом цинка, содержавшим от 0.25 до 2.5 мкг/мл металла. В качестве контроля использовали образцы у-глобулина, инкубированные в тех же условиях, но без добавления хлорида цинка.

По истечении срока инкубации опытные и контрольные образцы подвергали двукратной молекулярной ультрафильтрации на конусах CF-25 (Amicon) в режиме 300 g, 10-15 мин, с умеренным охлаждением. Образцы белка осторожно поднимали из конусов, доводили до исходного объема, тщательно перемешивали и анализировали спектрофотометрически в УФ-свете (см. выше).

Содержание свободного цинка в фильтрате оценивали реакцией комплексообразования с о-фенантролином (3.5-7.0 х 10"3 М) в 0.15 М растворе NaCl при нейтральном pH, с использованием спектрофотометрии при длине волны 226 нм.

Для получения экспериментальных образцов у-глобулина, модифицированного присоединением катионов цинка, использовали препарат человеческого сывороточного у-глобулина (ICN) в 0.15 М растворе NaCl (pH 7.15-7.19) с концентрацией белка 100 мкг/мл. Осветленные (см. выше)

образцы у-глобулина с хлоридом цинка или без него (контроль) инкубировали в течение 1 час при 37°С. Концентрация цинка в растворе составляла 2.5; 0.5 и 0.25 мкг/мл.

По истечении срока инкубации опытные и контрольные образцы подвергали двукратной молекулярной ультрафильтрации на конусах CF-25 (Amicon) в указанном выше режиме или в ячейках Ultracel-30k (Millipore) в режиме 1700 g, 5 мин, с умеренным охлаждением. Затем проводили спектрофотометрическое исследование восстановленных в исходном объеме раствора образцов белка и определение содержания свободного металла в фильтрате.

Иммунохимическое исследование образцов, модифицированных присоединением катионов цинка, включало постановку реакций радиальной иммунодиффузии, а также прямого и «сэндвич» вариантов ИФА.

Реакции радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони и Манчини осуществляли общепринятыми методами в геле 0.75% агарозы (Sigma) с использованием в качестве тест-антигена нативного у-глобулина (ICN). Применяли козьи антитела против IgG (H+L) человека (Медгамап): в концентрации 0.5 об.% в реакции Манчини и в разведении препарата 1:10 в реакции Оухтерлони.

Учет результатов производили после отжимания геля агарозы на стеклах по Лореллю и их окрашивания 0.5% раствором бриллиантового синего Кумасси R-250 (Serva).

Примененные образцы у-глобулина содержали: в реакции Оухтерлони -60 мкг/мл белка, в реакции Манчини - 60 или 70 мкг/мл белка.

В ИФА использовали меченные пероксидазой кроличьи анти-IgG (H+L) человека антитела (Медгамал). В качестве субстрата применяли ортофенилендиамин (Sigma) - 0.05% раствор в 30 мМ цитратном буфере (рН-5.0), с перекисью водорода (4.0 мкл 30%-ной перекиси на 10 мл раствора). Учет результатов производили с использованием ELISA Processor II (Behring) при длине волны 450 нм.

В прямом варианте ИФА планшеты сенсибилизировали исследуемыми и контрольными образцами у-глобулина в фосфатном буферном растворе в течение 18 час при комнатной температуре. Меченные пероксидазой анти-IgG (H+L) человека антитела применяли в разведениях коммерческого препарата 1:500, 1:1000 или 1:2000.

При постановке «сэндвич» варианта ИФА планшеты сенсибилизировали козьими анти-IgG (H+L) человека антителами (Медгамал), примененными в конечном разведении 1:500. Сорбцию антител на твердой фазе проводили в условиях, аналогичных прямому ИФА. Исследуемые и контрольные образцы у-глобулина наносили на содержащую антитела твердую фазу и инкубировали в принятом режиме. Разведение конъюгата составляло 1:500.

Полученные белки применяли в прямом варианте ИФА в диапазоне концентраций от 1.0 до 10.0 мкг/мл; в «сэндвич» варианте ИФА - от 0.4 до 32.0 мкг/мл.

При использовании прямого варианта ИФА опыты сопровождали исследованием образцов нативного у-глобулина. Их приготовление ограничивалось получением необходимой концентрации в 0.15 М растворе ИаС1 и последующим осветлением через мембранные фильтры с диаметром пор 0.45 мкм (МПНроге).

Индукцию ИФН проводили в суспензиях лейкоцитов, полученных от 8 здоровых доноров. Суспензии содержали 106 клеток в 1 мл полной питательной среды, приготовленной на основе среды Игла с двойным набором аминокислот и витаминов (ФГУП Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова РАМН), дополненной 2% плазмы донорской крови, Ь-глутамином, гентамицином и гепарином.

Исследуемые образцы модифицированных и контрольных белков вносили в суспензию лейкоцитов до получения конечных концентраций 5.0; 0.5 и 0.05 мкг/мл с последующим инкубированием в течение 24 или 48 час при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% С02.

Параллельно оценивали действие хлорида цинка в 0.15 М растворе ЫаС1. Содержание цинка в растворе соответствовало количеству металла, присоединенного исследуемым образцом у-глобулина.

В качестве стандартных индукторов выработки ИФН применяли вирус болезни Ньюкасла (10 ЦПД на лейкоцит) и фитогемагглютинин (ФГА Р, Б^со, 1.0 мкг/мл).

Титрование ИФН проводили на монослойной культуре диплоидных фибробластов эмбриона человека (получена из лаборатории клеточных культур Медико-генетического научного центра РАМН) против подобранной дозы 1-10 ЦПД50 вируса энцефаломиокардита мышей.

За титр ИФН принимали последнее (максимальное) разведение содержащего ИФН супернатанта, обеспечивающее защиту 50% клеток от цитопатического действия вируса.

В независимых опытах проводили оценку возможного прямого противовирусного действия исследуемых образцов.

Для определения кислотолабильности (стабильности) ИФН содержащие ИФН супернатанты лейкоцитов, отобранные после 24 или 48 час инкубации клеток с исследуемыми образцами, подвергали обработке 20% НС1 до получения рН-2.0 с последующей экспозицией в течение 24 час при 4°С и восстановлением рН до 7.2-7.4 добавлением 40% раствора КаОН. Далее проводили титрование ИФН. Контролем служила вторая часть отобранных супернатантов, не подвергавшаяся обработке кислотой, но поддерживавшаяся в тех же экспериментальных условиях, что и опытная.

С целью установления типа ИФН проводили постановку реакции его нейтрализации с использованием анти-ИФН-а антител (НПФ Интекор или ГИСК им.Л.А.Тарасевича МЗСР РФ).

К исследуемым пробам, доведенным до 10 ЕД/мл активности ИФН, добавляли равный объем нейтрализующих антител в разведении от 1:100 до

1:800 с последующей инкубацией в течение 2 час при 37°С. Затем проводили титрование ИФН (см. выше).

В качестве контролен использовали: референс-препарат ИФН-а (НПФ Интекор) в дозе 10 ЕД/мл и исследуемые супернатанты с активностью ИФН 10 ЕД/мл, которые не подвергали обработке анти-ИФН-а антителами.

Математическую обработку результатов проводили с использованием общепринятых методов вариационной статистики. Для спрямления концентрационных зависимостей использовали метод наименьших квадратов. Достоверность различия средних величин устанавливали с помощью ¿-критерия Стьюдента.

Взаимодействие человеческого сывороточного у-глобулина с катионами цинка в растворе.

Особенности взаимодействия у-глобулина с катионами цинка в растворе и конформационное состояние модифицированного белка оценивали с использованием дифференциальной спектрофотометрии в УФ-свете (рис.1).

230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 длина волны, нм

Как видно на рисунке, присутствие в растворе катионов цинка вызывает выраженные изменения спектра поглощения у-глобулина. При этом использование цинка в диапазоне концентраций металла от 12.0 мкг/мл (превышающей содержание катионов в нормальной сыворотке крови) до

Результаты исследований и их обсуждение.

0,8

Рисунок 1.

Спектры поглощения в УФ-свете человеческого сывороточного

у-глобулина (100 мкг/мл) в присутствии катионов цинка в диапазоне длин волн 240-320 нм.

На линиях указаны концентрации цинка, мкг/мл.

Штриховая линия - спектр поглощения контрольного у-глобулина, представленный по совокупности наблюдений.

1.0 мкг/мл (соответствующей физиологической) приводит к нарастанию оптической плотности раствора белка. Снижение концентрации металла до 0.5 мкг/мл вызывает гипохромию спектра поглощения (рис.1).

Следовательно, в надфизиологических концентрациях катионы цинка способствуют снижению компактности упаковки молекулы белка и ее развертыванию во внемолекулярное пространство. В концентрациях меньших, чем физиологические, металл встраивается во внутренние компартменты белковой глобулы, формирует внутримолекулярные координационные связи и компактизует молекулу белка.

Анализ дифференциальных и разностных УФ-спектров обнаруживает гипсохромию (сдвиг длинноволновой полосы поглощения у-глобулина с 280 нм в область 250-270 нм) и батохромию (смещение коротковолновой полосы поглощения белка с 210-220 нм в область 230-250 нм), а также гипохромию коротковолновой полосы. Наблюдаемые изменения спектра поглощения свидетельствуют о перемещении гидрофобных хромофоров из гидрофобной среды в белковой матрице в водную или солевую среду раствора [Мартин Р., 1966; Чанг Р., 1980], о появлении заряда на аминокислотных остатках, образовании металлокомплексов, повышении степени упорядоченности внутримолекулярных структур [Кульберг А.Я. и др., 1992; Кульберг А.Я., Родникова A.A., 1998].

Полученные в работе результаты выявляют свидетельства кооперативности исследуемого взаимодействия. Присоединение катионов цинка частью аминокислотных остатков создает конформационные предпосылки к экспонированию большего числа участков, способных взаимодействовать с металлом. Поскольку такая кооперативность характерна для эффектов компакизации молекулы белка, она указывает на проявление тропности цинка к внутриглобулярным компартментам.

Полученные данные обнаруживают также насыщаемость белка металлом, подтверждающую наличие у белков у-глобулиновой фракции определенного числа метаплосвязывающих сайтов.

Связывание катионов цинка с человеческим сывороточным у-глобулином.

Спектральные изменения в растворе у-глобулина, вызываемые присутствием различных концентраций цинка, позволяли предполагать, что основу взаимодействия белка с металлом составляет связывание катионов поверхностными и внутриглобулярными сайтами макромолекулы.

Зависимость прироста оптической плотности в растворе у-глобулина, связавшего цинк, от количества связанного металла, свидетельствует о последовательном заполнении катионами белковых сайтов разной

Рисунок 2.

Изменение показателей поглощения в растворе человеческого сывороточного у-глобулина, связавшего катионы цинка. Оценка при длине волны 280 нм.

Как видно на рисунке, связывание начинается с внутренних районов молекулы белка и вызывает ее выраженную компактизацию. Последующее присоединение металла внешними сайтами белковой глобулы приводит к развертыванию структуры во внемолекулярное пространство с одновременным

пространственной локализации (рис.2).

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 концентрация связанного металла, мкг/мл

нарастанием поглощения в растворе у-глобулина. Дальнейшее связывание катионов вновь происходит по внутренним участкам молекулы, которые становятся доступными металлу в результате конформационных перестроек, и заполняет внутренние области белковой глобулы. Оптическая плотность раствора снижается за счет естественной при этом компактизации (рис.2).

Сказанное подтверждают зависимости, определенные расчетом графиков Скэтчарда (рис.3).

I

1,5

'I 6

т л

4,0 8,0 12,0 16,0 20,0 24,0 28,0 32,0 концентрация связанного металла, мкМ

Рисунок 3.

График Скэтчарда, полученный при связывании катионов цинка с человеческим сывороточным у-глобулином.

Константы связывания цинка: 1 -2.1 х 105 М"'; 2-3.4х 105 М '; 3 - 5.2 х 105 М1.

Эти зависимости обнаруживают присутствие в составе белковой глобулы, как минимум, трех групп металлосвязывающих сайтов, характеризующихся различными, хотя и достаточно близкими константами связывания. Проекции полученных отрезков на ось абсцисс не перекрываются. Следовательно, присоединение металла определенной группой участков связывания происходит только после заполнения катионами более доступных в исходной конформации металлосвязывающих центров у-глобулина.

Рассчитанные константы имеют порядок 105 М"1, что говорит об относительно слабом связывании и непрочности образуемых у-глобулином с

цинком комплексов. В то же время, результаты независимых исследований говорят о способности белков у-глобулиновой фракции присоединять до 60 катионов цинка на молекулу, что в 2-3 раза превышает емкость белка для катионов меди [Бабаева Е.Е. и др., 2006].

Полученные данные свидетельствуют о том, что у-глобулин связывает цинк. Структурную основу взаимодействия формируют: металлосвязывающие аминокислотные последовательности тяжелых цепей; богатые цистеином, гистидином и пролином сайты междоменного пространства; экспонированные на поверхность глобулы разветвленные антенны олигосахаридов, ковалентно присоединенных к каркасу молекулы в области Сн2 доменов [Пол У. (ред.), 1987; Сыкулев Ю.К., Еронина Т.В., 1990].

Иммунохимическое исследование образцов человеческого сывороточного у-глобулина, модифицированного катионами цинка.

С использованием молекулярной ультрафильтрации получены образцы человеческого сывороточного у-глобулина, модифицированного в условиях нагрузки белка значительным (40 катионов на молекулу), умеренным (4-12 катионов) молярным избытком металла и в условиях эквимолярного связывания катионов цинка.

Иммунохимическое исследование образцов у-глобулина, связавшего значительный молярный избыток катионов, обнаруживает, что реаранжировка связывающих металл и стабилизируемых им сайтов молекулы белка расширяет полосу преципитации в реакции Оухтерлони и не выявляет признаков изменения антигенной специфичности. В реакции Манчини кольца преципитации опытных образцов анти-^С антителами более четкие и имеют больший диаметр, чем их контроли. Очевидно, присоединяя металл, молекула белка переходит в конформационное состояние, способствующее экспрессии и стабилизации скрытых в нативной конформации белка специфических антигенных детерминант.

Результаты прямого варианта ИФА свидетельствуют о выраженных изменениях в представленности специфических антигенных детерминант на поверхности у-глобулина, связавшего цинк. Одновременно они обнаруживают, что связывание белком катионов цинка, вероятно, меняет степень поляризации группировок Рс фрагментов, за счет которых происходит сорбция молекул на твердой фазе. Интенсивность реакции со специфическими антителами у модифицированного цинком у-глобулина снижается, в сравнении с контрольным белком, в 1.5-2.3 раза (рис.4).

2.5

1,5-

о с; с

к ■т

¡5 1,0 ■ ■

■"I

о 0,5- ■

j И п

1,0 5,0

концентрация белка, мкг/мл

Рисунок 4.

Характеристика образцов у-глобулина, модифицированного значительным молярным избытком цинка, в прямом варианте ИФА.

Использованные образцы у-глобулина (столбики): темные - нативный; серые - контрольный; светлые -модифицированный цинком. Разведение конъюгата 1/500.

Результаты «сэндвич» варианта ИФА не выявляют существенной разницы антигенных характеристик модифицированного цинком и контрольного у-глобулина. Это видится следствием того, что катионы цинка в меньшей степени преобразуют группировки, участвующие в образовании экспрессируемых Fab регионами антигенных детерминант, чем структуры, входящие в состав Fc фрагмента молекулы.

Исследование образцов у-глобулина, модифицированного умеренным молярным избытком цинка, в прямом варианте ИФА обнаруживает, что такое связывание менее выраженно, нежели форсированная нагрузка металлом, изменяет степень поляризации группировок Fc фрагментов. Реакция со

специфическими антителами у модифицированного цинком у-глобулина протекает более интенсивно, чем в контроле (рис.5).

0,8 -,

Рисунок 5.

Характеристика образцов у-глобулина, модифицированного умеренным молярным избытком цинка, в прямом варианте ИФА.

Использованные образцы у-глобулина (столбики): темные - нативный; серые - контрольный; светлые — модифицированный цинком. Разведение конъюгата 1/1000.

5,0

10,0

концентрация белка, мкг/мл

Следовательно, и ограниченного числа катионов цинка, присоединенных у-глобулином, достаточно для стабилизации молекулы белка в конформации, обеспечивающей экспрессию дополнительных антигенных детерминант известной специфичности.

В условиях эквимолярного связывания дифференциальная спектрофотометрия обнаруживает свидетельства компактизации белковой глобулы, вызываемой присоединением единичных катионов цинка (рис.6).

Компактизация происходит, как отмечено выше, за счет встраивания катионов во внутриглобулярные компартменты, формирования там поля стабилизируемых металлом лигандов и повышения степени упорядоченности внутримолекулярных структур.

Несмотря на компактизацию молекулы белка, кольца преципитации опытных образцов антикв антителами в реакции Манчини не уменьшаются в диаметре и сохраняют четкость контрольных.

Применение прямого варианта ИФА позволяет установить, что связывание единичных катионов практически не меняет поляризацию

Спектры поглощения в УФ-свете образцов контрольного (1) и модифицированного присоединением единичных катионов цинка (2) человеческого сывороточного у-глобулина.

2,0 и

—I-Г-

180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 длина волны, нм

группировок Рс фрагментов, обусловливая, по-видимому, стабилизацию как самого Ис региона молекулы, так и его основных антигенных детерминант, распознаваемых антивидовыми антителами (рис.7).

На рисунке видно, что интенсивность реакции со специфическими антителами у модифицированного цинком у-глобулина практически не меняется в сравнении с контрольным белком.

1,0 п

0,8 ■

0,6

5,0 10,0

концентрация белка, мкг/мл

Рисунок 7.

Характеристика образцов у-глобулина, модифицированного эквимолярньш связыванием цинка, в прямом варианте ИФА.

Использованные образцы у-глобулина (столбики): темные - нативный; серые - контрольный; светлые - модифицированный цинком. Разведение конъюгата 1/1000.

Полученные с использованием «сэндвич» варианта ИФА данные, в целом, подтверждают сходство антигенных характеристик модифицированного металлом и контрольного у-глобулина (рис.8).

0,30

Характеристика образцов

у-глобулина,

модифицированного

эквимолярным связыванием цинка, в «сэндвич» варианте

ИФА.

0,00

Линия 1 и темные кружки -контрольный у-глобулин; линия 2 и светлые кружки - у-глобулин,

0,0 5,0 10,0 15,0 20,0

концентрация белка, мкг/мл

25,0

30,0 модифицированный цинком.

Разведение конъюгата 1/500.

В то же время, они указывают на то, что катионы цинка, встраиваясь во внутренние компартменты молекулы белка и компактизуя глобулу, по-видимому, способствуют погружению части антигенных детерминант с поверхности у-глобулина. Тангенс угла наклона прямой, описывающей распознавание у-глобулина, включившего цинк, в 2.5 раза снижается по сравнению с контрольным белком. Это подтверждает положение о тропности цинка к внутриглобулярным структурам белка (рис.8).

В совокупности, полученные данные свидетельствуют о том, что конформационные преобразования у-глобулина, вызываемые встраиванием даже единичных катионов цинка в структуру молекулы белка, могут изменять представленность антигенных детерминант на поверхности глобулы. В то же время, как и результаты постановки реакции Оухтерлони, эти данные не обнаруживают указаний на образование новых антигенных детерминант белка и формирование новой антигенной специфичности, которая могла бы индуцировать в организме выработку антител к собственному, связавшему металл у-глобулину.

Оценка эффекторных функций модифицированного цинком у-глобулина.

Динамика продукции ИФН, индуцированного в использованной системе оценки, показывает, что ИФН, вырабатываемый в присутствии у-глобулина, цинка и модифицированного цинком белка, появляется одновременно с

индуцированным ФГА. Нарастание его титров в культуральной жидкости лейкоцитов тоже соответствует наблюдаемому в присутствии ФГА.

Титры ИФН в течение срока наблюдения (от 24 до 48 час) увеличиваются в 1.2-1.6 раза. К 48 час они оказываются сопоставимыми для цитокина, индуцированного экспериментальными образцами и - ФГА (рис.9).

Рисунок 9.

Выработка ИФН лейкоцитами крови человека в присутствии у-глобулина, модифицированного катионами цинка (М±т, п=8). Инкубация в течение 48 час.

ЕД/мл

50,0 г-

40,0

30,0

20,0

10,0

ФГА

у-глобулин

5,0 0,5 0,05 5,0 0,5 0,05 35,0 3,5 0,35 0,1

мкг/мл мкг/мл нг/мл мкг/мл

концентрация индуктора

Связавший металл у-глобулин реализует, в среднем, в 1.3 раза меньший потенциал индуктора ИФН, чем неизмененный белок, и в 1.6 раза менее активен в сравнении со свободными катионами цинка (рис.9).

Индивидуальные различия между донорами по уровню выработки ИФН лейкоцитами крови не позволяют получить статистически достоверный результат. В то же время, снижение ИФН-индуцирующей активности у-глобулина в результате связывания цинка отмечено в 60% отдельных наблюдений; снижение активности катионов цинка в результате их хелатирования белком - в 58-67% случаев. Следовательно, взаимодействие у-глобулина с катионами цинка снижает собственный эффекторный потенциал белка в индукции ИФН и одновременно способствует ослаблению выработки ИФН под влиянием цинка, за счет перехода свободных катионов в связанное с белком состояние.

Во всех исследованных образцах супернатантов, отобранных спустя 48 час инкубации, включая индуцированные ФГА, обнаружено присутствие кислотолабильной и стабильной составляющих. Доля кислотолабильного ИФН в общем пуле вырабатываемого цитокина составила для ФГА - 58%, контрольного у-глобулина - 68%, для цинка - 61% и «цинкового» у-глобулина - 56%. Индивидуальный анализ подчеркивает преимущественное содержание в пуле индуцируемого ИФН - кислотолабильного цитокина, соответствующего характеристикам ИФН-у.

Результаты реакции нейтрализации, проведенной с использованием анти-ИФН-а антител, свидетельствуют о том, что ИФН, вырабатываемый в присутствии экспериментальных образцов, как и в опытах с ФГА, не связывается и не нейтрализуется анти-ИФН-а антителами.

По совокупности оцененных свойств его правомочно относить к ИФН-у.

Поскольку использованная схема индукции ИФН предполагала возможность десорбции катионов молекулами связавшего металл белка с последующим образованием через цинковые мостики димеров ИФН,

обладающих сниженной, по сравнению с мономерами, противовирусной активностью, такую десорбцию необходимо было исключать.

О возможности десорбции катионов цинка связавшим металл у-глобулином (т.е. о наличии в реакционной смеси свободных или легко обмениваемых катионов) можно судить, оценивая прямо или косвенно агрегирование в этих условиях самого у-глобулина, являющееся металлозависимым процессом [Чекнёв С.Б. и др., 2005].

В работе получены свидетельства, что хелатируемый белком в молярном избытке цинк препятствует агрегированию у-глобулина. Следовательно, он не десорбируется связавшим его белком. Именно такие образцы у-глобулина использованы для индукции ИФН.

Поэтому, свободных катионов в культуральной жидкости, с большой вероятностью, не появлялось, димеров ИФН не образовывалось и снижение титров цитокина определялось только особенностями его индукции. Регуляция опосредуется, таким образом, воздействием на Fe рецепторы лейкоцитов у-глобулина, трансформированного связыванием металла, и запуском внутриклеточных сигнальных путей, отличных от реализуемых при активации рецепторов Fe фрагментами в их нативной конформации.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что человеческий сывороточный у-глобулин взаимодействует с катионами цинка в растворе. В зависимости от концентрации металла молекула белка развертывается в периглобулярное пространство или компактизуется. Обнаружены свидетельства тропности цинка к внутренним компартментам белковой глобулы.

2. Определено, что основу взаимодействия у-глобулина с катионами цинка и последующих конформационных преобразований молекулы белка составляет присоединение катионов несколькими группами неэквивалентных и

зависимых друг от друга металлосвязывающих сайтов. Константы связывания цинка имеют порядок 105 М"1.

3. Получены и исследованы оригинальные образцы человеческого сывороточного у-глобулина, модифицированного цинком в условиях нагрузки белка значительным и умеренным молярным избытком катионов, а также в условиях эквимолярного связывания металла.

4. Обнаружено, что вызываемые связыванием катионов цинка конформационные преобразования молекулы белка сопровождаются изменениями в спектре экспрессируемых у-глобулином специфических антигенных детерминант. При этом указаний на образование новых антигенных детерминант белка не получено.

5. Показано, что новое конформационное состояние у-глобулина является достаточно стабильным и определенно проявляется изменением характеристик Бс фрагментов молекул антител.

6. Установлено, что модифицированный связыванием цинка белок обладает менее выраженной ИФН-индуцирующей активностью в сравнении с контрольным у-глобулином и катионами цинка, примененными изолированно. Вырабатываемый при этом ИФН по совокупности оцененных свойств правомочно характеризовать как ИФН-у.

7. В целом, результаты исследования создают методическую основу перспективных разработок по целенаправленному изменению эффекторных функций антител - за счет модификации катионами металлов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Воробьёва У. А., Денисова Е.А., Бабаева Е.Е., Чекнёв С.Б. Конформационные изменения у-глобулина при взаимодействии с катионами цинка // Мед. иммунология. - 2005. - Т.7, №2-3. - С.110.

2. Чекнёв С.Б., Бабаева Е.Е., Воробьёва У.А., Денисова Е.А. Особенности взаимодействия человеческого сывороточного у-глобулина с катионами цинка // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. - 2005. - Т.140, №8. - С.177-180.

3. Чекнёв С.Б., Бабаева Е.Е., Воробьёва У.А., Денисова Е.А. Конформационные изменения человеческого сывороточного у-глобулина в

присутствии катионов цинка // Мед. иммунология. - 2005. - Т.7, №4. -С.375-380.

4. Денисова Е.А., Бабаева Е.Е., Медведева Д.А., Чекнёв С.Б. Изменения конформации у-глобулина в присутствии катионов цинка // Тез. докл. II Междунар. конфер. «Молекулярная медицина и биобезопасность», Москва, Россия, 20-21 октября 2005 Г.-С.118-119.

5. Бабаева Е.Е., Воробьёва У.А., Денисова Е.А., Медведева Д.А., Чекнёв С.Б. Связывание катионов цинка с человеческим сывороточным у-глобулином // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. 2006. - Т.141, №5. - С.540-543.

6. Чекнёв С.Б., Бабаева Е.Е., Денисова Е.А., Воробьёва У.А., Монгуш Э.М. Иммунохимическая характеристика человеческого сывороточного у-глобулина, модифицированного цинком и медью II Мед. иммунология. - 2006. - Т.8, №2-3. - С.187-188.

7. Чекнёв С.Б., Бабаева Е.Е., Денисова Е.А., Воробьёва У.А., Монгуш Э.М. Получение человеческого сывороточного у-глобулина, модифицированного цинком и медью, и оценка его антигенной специфичности // Иммунология Урала. -2006. -№1(5). - С. 180-181.

8. Чекнёв С.Б., Бабаева Е.Е., Денисова Е.А., Воробьёва У.А., Монгуш Э.М. Получение образцов человеческого сывороточного у-глобулина, модифицированного медью и цинком, и их иммунохимическая характеристика // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. - 2006. - Т. 142, №12. -С.666-670.

9. Чекнёв С.Б., Бабаева Е.Е., Голуб А.Е., Денисова Е.А., Воробьёва У.А. Эффекты меди и цинка при связывании с человеческим сывороточным у-глобулином // Мед. иммунология. - 2006. - Т.8, №5-6. - С.615-622.

10. Чекнёв С.Б., Бабаева Е.Е., Денисова Е.А., Воробьёва У.А., Монгуш Э.М. Антигенная специфичность образцов человеческого сывороточного у-глобулина, полученных в условиях эквимолярного связывания катионов меди и цинка // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. - 2007. -Т. 143, №2. - С. 170-174.

11. Денисова Е.А., Монгуш Э.М., Чекнёв С.Б. Исследование образцов человеческого сывороточного у-глобулина, связавшего катионы меди и цинка в различных экспериментальных условиях // Мед. иммунология. - 2007. -Т.9, №2-3. - С.132-133.

12. Чекнёв С.Б., Бабаянц A.A., Денисова Е.А. Индукция интерферона человеческим сывороточным у-глобулином, модифицированным катионами металлов // Мед. иммунология. - 2007. - Т.9, №2-3. - С. 170-171.

13. Чекнёв С.Б., Бабаянц A.A., Денисова Е.А. Выработка интерферона, индуцированного у-глобулином, связавшим катионы металлов, и его первичная характеристика // Омский научный вестник. - 2007. - №3(61), прилож.2. -С.341-342.

14. Чекнёв С.Б., Денисова Е.А., Монгуш Э.М., Шуховцева Ю.В. Катионы металлов изменяют результаты серологических тестов // Там же. - С.343-344.

15. Чекнёв С.Б., Денисова Е.А., Бабаева Е.Е., Воробьёва У.А., Монгуш Э.М. Конформационное состояние и антигенные характеристики у-глобулина человека, модифицированного связыванием катионов меди и цинка // Иммунология. - 2007. - Т.28, №5. - С.274-280.

16. Чекнёв С.Б., Ефремова И.Е., Денисова Е.А., Юшковец E.H. Иммуноферментный анализ модифицированного катионами металлов у-глобулина на низких концентрациях образцов // Росс, иммунол. журнал. -2008. - Т.2(11), №1. - С.55-62.

17. Чекнёв С.Б., Денисова Е.А., Монгуш Э.М., Шуховцева Ю.В. Результаты постановки реакции Манчини зависят от наличия в составе определяемого белка катионов связанного металла // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. - 2008. - Т. 145, №4. - С.437-440.

18. Чекнёв С.Б., Бабаянц A.A., Денисова Е.А. Установление типоспецифичности интерферона, вырабатываемого в присутствии модифицированных металлами белков у-глобулиновой фракции плазмы крови // Росс, иммунол. журнал. - 2008. - Т.2(11), №2-3. - С. 137.

19. Чекнёв С.Б., Бабаянц A.A., Ефремова И.Е., Юшковец E.H., Денисова Е.А. Комплексная характеристика пула интерферона, вырабатываемого в присутствии белков у-глобулиновой фракции плазмы крови // Сибирский медицинский журнал. - 2008. - Т.23, №3, вып.1. - С. 123.

20. Чекнёв С.Б., Бабаянц A.A., Денисова Е.А. Индукция выработки интерферона конформационно измененными белками у-глобулиновой фракции плазмы крови // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. - 2008. - Т.146, №11. -С.526-530.

Список сокращений.

ИФА - иммуноферментный анализ.

ИФН - интерферон.

УФ - ультрафиолет.

ФГА - фитогемагглютинин.

ЦПД - цитопатическая доза (вируса).

Автор благодарит кандидата биологических наук Е.Е.Бабаеву и кандидата медицинских наук А.А.Бабаянц за обучение современным методам исследований, большую помощь в работе, ценные замечания и рекомендации, высказанные при обсуждении полученных данных.

Для заметок

Заказ №204/12/08 Подписано в печать 2S.12.2008 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5

¡£=4 \ ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 (У*)} www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru